KR101983654B1 - Therapeutic composition capable of alleviating the inhibition of development of CFC syndrome patients - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 CFC 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬)의 발달 저해를 완화할 수 있는 치료용 조성물로서, 특히 골세포 분화 촉진 및 약제학적 조성물로서의 용도에 대한 것이다. The present invention relates to a therapeutic composition capable of alleviating developmental disruption of cardiofaciocutaneous syndrome (CFC syndrome), particularly to promote bone cell differentiation and its use as a pharmaceutical composition.
CFC 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬)은 심장 기형, 특징적 얼굴 형태 피부 이상 및 발달 지연이 동반되는 유전 질환으로, 심장 기형으로는 폐동맥 판막 협착증, 심방 또는 심실 중격 결손, 비후성 심근병증 부정맥이 있을 수 있으며, 얼굴 형태는 상대적 대두증, 전두부 돌출, 옅은 눈썹, 안구 돌출의 특징을 보이고, 피부의 이상으로 건조증, 과각화증, 어린선, 습진 및 성긴 두피의 증상을 나타낸다 (Roberts A et al. J Med Genet (2006) 43:833-42; Armour CM and Allanson JE. J Med Genet (2008) 45:249-54). CFC 증후군은 누난(Noonan) 증후군과 임상 양상이 유사하며, 코스텔로(Costello) 증후군 및 레오파드(LEOPARD) 증후군과 함께 누난-관련 질환으로 분류된다. CFC 증후군은 BRAF, MEK1, MEK2라고 이름 지어진 세 개의 유전자 중에 하나의 유전자에 돌발적으로 일어나는 이상에 의하여 생기는 상염색체 우성의 유전 질환이다. 이 유전자들은 Ras/MAPK(mitogen-activated protein kinase)라고 불리는 세포 성장과 세포 분할에서 중요한 경로의 일부분이며, 상기 유전자들의 변이로 인해 성장 인자의 자극을 통한 세포의 성장 및 분화에 관련된 증상이 나타나는 것이 보고되어 있다. MAPK 신호전달은 포유동물의 배아 발생에서 분화, 증식 및 세포 주기를 조절함으로써 중요한 역할을 한다 (Aoki Y et al. Hum. Mutat. 2008;29:992-1006.; Yoon S et al., Growth Factors. 2006;24:21-44.). 이 중 ERK 신호전달에서의 생식 계통 돌연변이가 신경섬유종증 1형(neurofibromatosis type-1), 레오파드 증후군, 누난 증후군, 코스텔로 증후군 및 CFC 증후군을 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환(RASopathy)들과 관련되어 있다 (Rauen K.A et al., Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 2013;14:355-369; Jindal G.Aet al., Dis. Model. Mech. 2015;8:769-782.). 상기 유전자의 변이를 통한 누난 증후군 및 누난-관련 증후군의 감별 및 진단에 대한 연구가 보고되었으나 (Jorge AA et al. Horm Res (2009) 71:185-93), CFC 신드롬이 상기 유전자의 변이와 관련된 구체적인 원인 또는 치료 방법에 대하여는 알려진 바가 없다. Cardiofaciocutaneous syndrome (CFC syndrome) is a genetic disorder associated with cardiac anomalies, characteristic facial skin abnormalities, and developmental delay. The heart anomaly may be pulmonary valve stenosis, atrial or ventricular septal defect, or hypertrophic cardiomyopathy arrhythmia , Facial features are characterized by relative soybean hyperpigmentation, facial protrusion, pale eyebrow, and protrusion of the eye, and symptoms of dry skin, hyperkeratosis, jaundice, eczema, and spongy scalp are abnormalities of the skin (Roberts A et al. J Med Genet 2006) 43: 833-42; Armor CM and Allanson JE. J Med Genet (2008) 45: 249-54). CFC syndrome is similar in clinical appearance to Noonan syndrome and is classified as anonin-associated disease with Costello syndrome and Leopard syndrome. CFC syndrome is an inherited autosomal dominant disorder caused by an abnormality in one gene among three genes named BRAF, MEK1, and MEK2. These genes are part of an important pathway in cell growth and cell division called Ras / MAPK (mitogen-activated protein kinase), and the symptoms associated with cell growth and differentiation through stimulation of growth factors due to mutations in these genes Reported. MAPK signaling plays an important role in differentiation, proliferation and cell cycle regulation in mammalian embryogenesis (Aoki Y et al. Hum. Mutat. 2008; 29: 992-1006 .; Yoon S et al., Growth Factors 2006; 24: 21-44.). Among them, the mutation of the reproductive system in ERK signal transduction is associated with Rasopathy associated with the Ras-MAPK signaling pathway including neurofibromatosis type-1, Leopard syndrome, Noonan syndrome, Costello syndrome and CFC syndrome. (Rauen KA et al., Annu. Rev. Genom. Hum Genet., 2013; 14: 355-369; Jindal G.A et al., Dis. Model, Mech., 2015; 8: 769-782 .). (Jorge AA et al. Horm Res (2009) 71: 185-93) have reported that the CFC syndrome is associated with the mutation of the gene No specific cause or treatment method is known.
한편, 포유동물의 골격 발달은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)의 응축으로 시작되며, 골격 발달 동안, 골 분화(osteogenic differentiation)는 세포외기질 석화 작용(extracellular matrix mineralization)을 수반하며, 이는 HA(hydroxyapatite)를 형성하는 복잡한 과정이다 (Terkeltaub R.Aet al., Am. J. Physiol.-Cell Physiol. 2001;281:C1-C11). HA는 주로 칼슘과 인산염으로 구성되며, HA의 형성은 다양한 인자에 의해 엄격하게 조절된다. HA 합성에서 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (alkaline phosphatase, ALP)는 피로인산염 (pyrophosphate, PPi)을 무기 인산으로 가수 분해한다. 또한, OPN(osteopontin)은 HA 결정 형성을 억제하는 반면, BSP(bone sialoprotein)은 HA 결정 형성의 개시를 촉진한다. 이와 같은 인자들의 골기질 석화 작용에서의 역할은 부분적으로 알려져 있으나, 이 인자들이 CFC 증후군에서의 골기질 석화 작용에 어떻게 영향을 미치는지, CFC 증후군의 뼈 발생에서의 결함 원인 등은 알려져 있지 않다. On the other hand, the skeletal development of mammals begins with the condensation of mesenchymal stem cells (MSCs), and during skeletal development, osteogenic differentiation involves extracellular matrix mineralization, This is a complex process for forming hydroxyapatite (Terkeltaub R.A et al., Am. J. Physiol.-Cell Physiol. 2001; 281: C1-C11). HA is mainly composed of calcium and phosphate, and the formation of HA is strictly controlled by various factors. In HA synthesis, alkaline phosphatase (ALP) hydrolyzes pyrophosphate (PPi) to inorganic phosphoric acid. In addition, OPN (osteopontin) inhibits HA crystal formation while BSP (bone sialoprotein) promotes initiation of HA crystal formation. The role of these factors in bone mineralization is partly known, but it is not known how these factors affect bone mineralization in CFC syndrome and causes of bone defect in CFC syndrome.
이에 본 발명자들은 CFC 환자 유래 줄기세포로부터 골아세포로 분화를 회복시칼 수 있는 물질을 발굴하기 위하여 고효율 스크린 플랫폼(high-throughput screening, HTS) 방식을 활용한 CFC 증후군 환자의 체세포로부터 역분화된 줄기세포의 골세포 분화 회복 치료 약물 스크리닝 연구를 진행하였다. 이러한 방법으로 신경발달질환 치료제 개발에 대한 연구를 진행하던 중, CFC 증후군, 특히, 이의 골결함에 치료 또는 증상 완화 효과를 가지는 물질로서, 비타민 유도체를 선별하였으며, 이들이 상기 CFC 증후군에 대한 치료 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, the inventors of the present invention found that stem cells derived from CFC patients suffering from CFC syndrome, which are derived from high-throughput screening (HTS) We studied the drug screening of osteocyte differentiation recovery of cells. In the course of research on the development of therapeutic agents for neurodevelopmental diseases in this way, vitamin derivatives were selected as CFC syndromes, particularly substances having therapeutic or symptomatic effects on bone defects thereof, and their therapeutic effect on the CFC syndrome The present invention has been completed.
본 발명의 목적은 상기 비타민 유도체를 유효성분으로 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 치료 또는 개선용 약학조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating or ameliorating a neurodevelopmental disorder associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising the vitamin derivative as an active ingredient.
아울러, 본 발명의 목적은 비타민 유도체를 유효성분으로 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 발달 저해 개선용 약학조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for improving the inhibition of development of a neurodevelopmental disease associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising a vitamin derivative as an active ingredient.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 비타민 유도체를 유효성분으로 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 치료 또는 개선용 약학조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or ameliorating a neurodevelopmental disorder associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising a vitamin derivative as an active ingredient.
아울러, 본 발명은 비타민 유도체를 유효성분으로 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 발달 저해 개선용 약학조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for improving the inhibition of development of a neurodevelopmental disease associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising a vitamin derivative as an active ingredient.
본 발명에 따른 비타민 유도체는, CFC 환자 유래의 유도 만능 줄기세포로부터 골아세포로의 분화 촉진 효과를 가지며, 결과적으로는 골형성 촉진을 통한 CFC 증후군 환자의 발달저해를 완화함으로써 CFC 증후군에 대한 치료 및 증상의 개선 효과를 가진다. The vitamin derivative according to the present invention has the effect of promoting the differentiation of induced pluripotent stem cells derived from CFC patients into osteoblasts and consequently the development of CFC syndrome through the promotion of osteogenesis, It has the symptom improvement effect.
도 1은 CFC 환자의 체세포로부터 유도만능 줄기세포를 역분화하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 CFC 환자 유래 유도만능 줄기세포를 중간엽 줄기세포(MSC) 및 골아세포로 분화시키는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 비타민 유도체를 포함하는 임상 화합물 라이브러리에서 CFC 환자 유래 MSCs의 골아세포로의 분화 촉진 효과를 가지는 물질을 스크리닝하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 비타민 유도체인 칼시포트리엔의 WT 대비 상대적인 ALP 활성화 정도 효과를 PNPP 분석으로 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 칼시포트리엔의 ALP 활성을 405nm에서의 OD값을 측정하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 CFC에 비해 일반인에서 증가한 유전자 722 종의 경로 분석(pathway analysis) 결과를 나타낸다:
빨간색 박스: 골형성 및 여러 가지 발달 과정에 관여하는 유전자.
도 7은 칼시포트리엔 처리시 CFC 환자 유래 MSCs에서 증가하는 유전자들을 나타낸 도이다.
도 8은 일반인 유래 MSCs 및 칼시포트리엔을 처리한 CFC 환자 유래 MSCs에서 대조군에 비해 공통적으로 증가되어 있는 유전자들을 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 비타민 유도체인 칼시포트리엔의 WT 대비 상대적인 ALP 활성화 정도 효과를 6웰 포멧으로 진행하여 PNPP 분석으로 확인한 도이다. FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of de-differentiating induced pluripotent stem cells from somatic cells of a CFC patient.
2 is a schematic diagram showing a process of differentiating CFC patient-derived induced pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells (MSCs) and osteoblasts.
FIG. 3 is a schematic diagram showing a process of screening a substance having the effect of promoting the differentiation of MSCs derived from CFC patients into osteoblasts in a library of clinical compounds containing the vitamin derivatives of the present invention.
FIG. 4 shows the results of confirming the relative ALP activation degree effect of calcipotriene, a vitamin derivative of the present invention, relative to WT, by PNPP analysis.
FIG. 5 shows the result of checking the ALP activity of calcipotriene of the present invention by measuring the OD value at 405 nm.
Figure 6 shows pathway analysis results of 722 genes increased in the general population compared to CFC:
Red box: genes involved in osteogenesis and various developmental processes.
FIG. 7 is a graph showing genes that increase in CFC patient-derived MSCs when treated with calcipotriene.
FIG. 8 shows the results of analysis of genes that are commonly increased in MSCs derived from general-derived MSCs and CFC patients treated with calcipotriene compared to the control group.
FIG. 9 is a graph showing the relative ALP activation level effect of calcipotriene, a vitamin derivative of the present invention, in a 6-well format and confirmed by PNPP analysis.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. It is to be understood, however, that the following embodiments are provided by way of illustration of the invention and, where it is believed that a detailed description of known techniques or configurations well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, , Whereby the present invention is not limited thereto. The present invention is susceptible to various modifications and applications within the scope of the appended claims and their equivalents.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Also, terminologies used herein are terms used to properly represent preferred embodiments of the present invention, which may vary depending on the user, intent of the operator, or custom in the field to which the present invention belongs. Therefore, the definitions of these terms should be based on the contents throughout this specification. Throughout the specification, when an element is referred to as " comprising ", it means that it can include other elements as well, without excluding other elements unless specifically stated otherwise.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. Also, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications referred to herein are incorporated herein by reference.
일 측면에서, 본 발명은 비타민 유도체를 유효성분으로 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환(RASopathy)의 치료 또는 개선용 약학조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or amelioration of neurodevelopmental disorder (RASopathy) associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising a vitamin derivative as an active ingredient.
일 구현예에서, Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환은, 누난 증후군(Noonan syndrome), 누난 증후군 유사 질환(Noonan syndrome-like disorder), 코스텔로 증후군(Costello syndrome), CFC 증후군(Cardiofaciocutaneous syndrome), 신경섬유종증 1형(neurofibromatosis type-1) 및 레구스 증후군(Legius syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, CFC 증후군인 것이 더욱 바람직하다.In one embodiment, the neurodevelopmental disorder associated with the Ras-MAPK signaling pathway is selected from the group consisting of Noonan syndrome, Noonan syndrome-like disorder, Costello syndrome, Cardiofaciocutaneous syndrome, , Neurofibromatosis type-1, and Legius syndrome. It is more preferable that the CFC syndrome is CFC syndrome.
일 구현예에서, 비타민 유도체는 티아민 하이드로클로라이드(Thiamine hydrochloride), 티아민 디-라우릴 설페이트(Thiamine Di-lauryl Sulfate), 피리독신(pyridoxine), 피리독살(pyridoxal), 피리독사민(pyridoxamine), 아다팔렌(Adapalene), 레티닐 에스터(retinyl ester), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 토코페롤 에스터(tocopherol ester), 에틸 아스코르빌 에테르(ethyl ascorbyl ether), 아스코빌테트라이소팔미테이트(Ascorbyl Tetraisopalmitate), 칼시포트리엔(Calcipotriene), 칼시포트리올(Calcipotriol), 칼시트리올(Calcitriol), 독세르칼시페롤(Doxercalciferol), 세칼시톨(secalcitol), 맥사칼시톨(Maxacalcitol), 세오칼시톨(Seocalcitol), 타칼시톨(Tacalcitol) 및 파리칼시톨(paricalcitol)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 칼시포트리엔인 것이 가장 바람직히다.In one embodiment, the vitamin derivative is selected from the group consisting of Thiamine hydrochloride, Thiamine Di-lauryl Sulfate, pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine, Retinol palmitate, tocopherol ester, ethyl ascorbyl ether, Ascorbyl Tetraisopalmitate, and the like may be used. Calcipotriene, Calcipotriol, Calcitriol, Doxercalciferol, secalcitol, Maxacalcitol, Seocalcitol, Tacalcitol, and paricalcitol, and most preferably is calcipotriene. [0040] The term " calcipotriene "
일 구현예에서, 칼시포트리엔은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:In one embodiment, calcipotriene can be a compound represented by the following formula:
일 구현예에서, 비타민 유도체는 골아세포로의 분화를 촉진시킴으로써 골형성(osteogenesis)을 촉진시킬 수 있다.In one embodiment, the vitamin derivative can promote osteogenesis by promoting differentiation into osteoblasts.
일 구현예에서, 비타민 유도체는 조성물 내에 0.1 내지 30 μM의 농도로 포함될 수 있다.In one embodiment, the vitamin derivative may be included in the composition at a concentration of 0.1 to 30 [mu] M.
일 측면에서, 본 발명은 비타민 유도체를 유효성분으로 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 발달 저해 개선용 약학조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving the inhibition of development of a neurodevelopmental disease associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising a vitamin derivative as an active ingredient.
본 발명은 비타민 유도체뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.The present invention encompasses not only vitamin derivatives, but also pharmaceutically acceptable salts thereof, possible solvates, hydrates, racemates or stereoisomers thereof which may be prepared therefrom.
본 발명의 비타민 유도체들은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디아이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.The vitamin derivatives of the present invention can be used in the form of pharmaceutically acceptable salts. As salts, acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acids are useful. Acid addition salts include those derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid, and aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxyalkanoates, Dioleate, aromatic acid, aliphatic and aromatic sulfonic acids. Such pharmaceutically non-toxic salts include, but are not limited to, sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogenphosphate, diiodogenphosphate, Butyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, succinate, maleic anhydride, maleic anhydride, , Sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzene sulfonate, toluene sulfonate, chlorobenzene sulfide Sulfonate, methanesulfonate, propanesulfonate, naphthalene-1-sulphonate, naphthalene-1-sulphonate, , Naphthalene-2-sulfonate or mandelate.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 비타민 유도체들을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.The acid addition salts according to the invention can be prepared by conventional methods, for example by dissolving the vitamin derivatives in an excess of the aqueous acid solution and precipitating the salts with a water-miscible organic solvent, for example methanol, ethanol, acetone or acetonitrile . It is also possible to prepare the mixture by evaporating a solvent or an excess acid in the mixture, or by suction filtration of the precipitated salt.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로는 나트륨, 칼륜 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. The alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess amount of an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is preferable for the metal salt to produce sodium, a wax or a calcium salt from the viewpoint of the pharmaceutical. The corresponding silver salt is also obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable salt (such as silver nitrate).
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 비타민 유도체들 이외에 공지된 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환 치료제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise, as an active ingredient, a therapeutic agent for neurodevelopmental diseases associated with a known Ras-MAPK signaling pathway in addition to the vitamin derivatives of the present invention, Can be used together.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 비타민 유도체들 중에서 선택되는 하나 이상, 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.In the present invention, the term " prevention " means any action that inhibits or delays the development, spread and recurrence of a neurodevelopmental disorder associated with the Ras-MAPK signaling pathway by the administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, Quot; is intended to mean that the administration of one or more of the vitamin derivatives of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a composition comprising the same, may ameliorate or improve the symptoms of a neurodevelopmental disorder associated with the Ras- It means all the acts. Those skilled in the art will be able to ascertain the precise criteria of the disease for which the composition of the present invention is effective by referring to the data presented by the Korean Medical Association, will be.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.The term " therapeutically effective amount " used in combination with the active ingredient in the present invention means an amount effective to prevent or treat a subject disease, and the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may be determined by various factors, , The target site, the patient's condition, and the like. Therefore, when used in the human body, the dosage should be determined in consideration of safety and efficacy. It is also possible to estimate the amount used in humans from the effective amount determined through animal experiments. Such considerations in determining the effective amount are described, for example, in Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman ' s Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; And E.W. Martin ed., Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 종류, Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 발병 원인, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and not causing side effects, Health status, types of neurodevelopmental diseases associated with Ras-MAPK signaling pathway, cause of neurodevelopmental disease associated with Ras-MAPK signaling pathway, severity, drug activity, drug sensitivity, administration method, administration time Route and rate of excretion, duration of treatment, factors involved in the formulation or concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiply. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 약학조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may include carriers, diluents, excipients, or a combination of two or more thereof commonly used in biological formulations. As used herein, the term " pharmaceutically acceptable " means that the composition is free of toxicity to cells or humans exposed to the composition. The carrier is not particularly limited as long as the composition is suitable for in vivo delivery, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Inc. A buffered saline solution, a buffer solution, a dextrose solution, a maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components may be mixed and used, and if necessary, an antioxidant, a buffer, Conventional additives may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules or tablets. Further, it can be suitably formulated according to each disease or ingredient, using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990) in a suitable manner in the art.
일 구현예에서, 상기 약학조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 경구형 또는 주사 제형이 더욱 바람직하다. In one embodiment, the pharmaceutical composition may be one or more formulations selected from the group comprising oral formulations, external preparations, suppositories, sterile injectable solutions and sprays, and more preferably oral form or injectable formulations.
적합한 제형 형태들은, 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, (마이크로) 캡슐, 마이크로과립, 발포성 분말 또는 과립, 좌약, 앰플 형태의 주사액 및 또한 유효 화합물들의 연장된 방출을 갖는 제형들이며, 이 제형들에서 부형제, 희석제 또는 담체는 상기 기술된 바와 같이 관례적으로 사용된다. 다른 제형들은 본 분야의 당업자에게 널리 공지된 유효 성분들의 다른 방출 프로필들을 나타내는 것들일 수 있다. 예를 들어, 서방성, 지속성(sustainedaction), 지연 방출성(extended-release), 시한 방출성(time-release 또는 timed-release), 조절 방출성(controlled-release), 변이 방출성(modified release) 또는 연속 방출성(continuous-release)을 포함한다. 이들 모두는 본 분야의 당업자에게 널리 공지된 것이다.Suitable formulations are, for example, those with extended release of injectable solutions in the form of granules, powders, tablets, coated tablets, (micro) capsules, microgranules, effervescent powders or granules, suppositories, ampoules, In these formulations, excipients, diluents or carriers are conventionally employed as described above. Other formulations may be those that represent other release profiles of the active ingredients well known to those skilled in the art. For example, sustained action, sustained action, extended-release, time-release or timed-release, controlled-release, modified release, Or continuous-release. All of which are well known to those skilled in the art.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 개체 또는 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.The term " administering " as used herein means providing a predetermined substance to an individual or a patient by any appropriate method, and may be administered orally or parenterally (for example, by intravenous, subcutaneous, The dosage may vary depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, and severity of the disease. Examples of the liquid preparation for oral administration of the composition of the present invention include suspensions, solutions, emulsions, syrups, and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, Etc. may be included together. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered by any device capable of moving the active substance to the target cell. The preferred modes of administration and formulations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and drip injections. The injectable solution may be a non-aqueous solvent such as an aqueous solvent such as a physiological saline solution or a ring gel solution, a vegetable oil, a higher fatty acid ester (e.g., oleic acid), an alcohol (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.) (For example, ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrophosphate, BHA, tocopherol, EDTA and the like), an emulsifier, a buffer for pH control, a microbial growth inhibitor And a pharmaceutical carrier such as a preservative (e.g., mercury nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.).
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 상기 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.The term " individual " used in the present invention refers to a monkey, a cow, a horse, a sheep, a pig, a chicken, a turkey, a quail, and the like, including a human capable of developing or developing a neurodevelopmental disease disease associated with the Ras- , Cat, dog, mouse, rat, rabbit or guinea pig, and the diseases can be effectively prevented or treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention to the individual. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in parallel with existing therapeutic agents.
본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, Wherein the starch is selected from the group consisting of lactose, mannitol, sugar, arabic gum, pregelatinized starch, cornstarch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, opaques, sodium starch glycolate, carnauba wax, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, Calcium, white sugar, dextrose, sorbitol and talc may be used. The pharmaceutically acceptable additives according to the present invention are preferably included in the composition in an amount of 0.1 to 90 parts by weight, but are not limited thereto.
일 측면에서, 본 발명은 비타민 유도체를 포함하는 Ras-MAPK 신호전달경로와 연관된 신경발달질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the invention relates to a food composition for preventing or ameliorating a neurodevelopmental disorder associated with a Ras-MAPK signaling pathway comprising a vitamin derivative.
본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 비타민 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.When the composition of the present invention is used as a food composition, the vitamin derivative can be added as it is, or it can be used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to ordinary methods. The composition may contain a food-acceptable food-aid additive in addition to the active ingredient, and the amount of the active ingredient to be mixed may be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment).
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term " food-aid additive " refers to a component that can be added to foods in a supplementary manner, and is appropriately selected and used by those skilled in the art as added to produce health functional foods of each formulation. Examples of food-aid additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, , a pH adjusting agent, a stabilizer, a preservative, a glycerin, an alcohol, and a carbonating agent used in a carbonated drink. However, the types of the food auxiliary additives of the present invention are not limited by these examples.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있다.A health functional food may be included in the food composition of the present invention. The term " health functional food " as used in the present invention refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and rings using raw materials and components having useful functions in the human body. Here, 'functional' refers to the structure and function of the human body to obtain nutritional effects and obtain useful effects for health use such as physiological action. The health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components which are usually added in the conventional technical fields. In addition, the formulations of the above health functional foods may also be manufactured without limitations as long as they are acceptable as health functional foods. The food composition of the present invention can be manufactured into various types of formulations.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for the purpose of illustrating the present invention, and thus the present invention is not limited thereto.
<실시예 1>≪ Example 1 >
CFC 환자 유래 체세포를 이용한 유도만능 줄기세포(iPSC) 제작Production of induced pluripotent stem cells (iPSC) using somatic cells derived from CFC patients
CFC 환자의 피부 섬유아세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen)을 포함하는 DMEM (Welgene) 배지에서 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 트립신-EDTA (Invitrogen)을 2분간 처리하여 상기 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 1 x 105 cells/well (35mm dish 기준)로 분주하여 1일간 배양한 뒤, OCT4, SOX2, C-MYC 및 KLF4 바이러스를 첨가한, 8㎍/ml 폴리브렌(polybrene)을 포함한 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 그 후, 10% FBS 및 1% PS를 포함한 DMEM 배지에서 3일간 배양한 뒤, 트립신-EDTA로 2분간 처리하여 10% FBS를 포함한 DMEM으로 섬유아세포를 수득하여 MEF(Mouse embryonic fibroblast) 위에 1 x 104 cells/well (35mm dish 기준)로 분주하여 배양하였다. 배양 1일 후부터 20% 혈청 대체제, 10 ng/ml bFGF (R&D systems), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비 필수 아미노산 (Invitrogen) 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올 (Sigma)을 포함한 DMEM/F-12 (Invitrogen)로 배지를 매일 갈아주면서 2 내지 3주간 배양하였다. iPSC 콜로니가 생성되면, 이를 새 MEF에 분주하여 유지하였다. 상기 실험 과정은 도 1에 도식화하였다. The skin fibroblasts of CFC patients were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C in DMEM (Welgene) medium containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), then trypsin-EDTA (Invitrogen) The cells were treated with different treatments to obtain the cells. The obtained cells were divided into 1 x 10 5 cells / well (35 mm dish), cultured for 1 day, and then incubated with 8 μg / ml polybrene supplemented with OCT4, SOX2, C-MYC and KLF4 virus DMEM medium for 1 day. Then, the cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS and 1% PS for 3 days, treated with trypsin-EDTA for 2 minutes, and fibroblasts were obtained with DMEM containing 10% FBS. 10 4 cells / well (35 mm dish standard). From 1 day after the culture, the cells were cultured in DMEM / F (1 ml) containing 20% serum substitute, 10 ng / ml bFGF (R & D systems), 1% penicillin-streptomycin, 1% nonessential amino acid (Invitrogen) and 0.1 mM? -Mercaptoethanol -12 (Invitrogen) for 2 to 3 weeks. Once the iPSC colonies were generated, they were kept aliquoted in fresh MEFs. The experimental procedure is illustrated in FIG.
<실시예 2>≪ Example 2 >
HTS 플랫폼에서 사용 가능한 유도만능 줄기세포의 분화 방법 확립Establishment of differentiation method of inducible pluripotent stem cells available on HTS platform
HTS 플랫폼(High throughput screening platform)에 사용하기 위하여, 도 2와 같은 과정으로 iPSCs를 골세포로 분화시키는 방법을 확립하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 생성한 iPSC 콜로니를 초퍼(chopper)를 이용하여 4 내지 9개의 클럼프로 기계적 분리를 하고 (대략 0.5 mm x 0.5 mm 크기), 10 mg/ml 디스파제(dispase) (Invitrogen)를 4분간 처리하여 떼어내었다. 떼어낸 클럼프를 코팅되지 않은 패트리-디쉬에 옮겨, 배양체(embryoid body, EB) 배지 (10% 혈청 대체제, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 비-필수 아미노산을 포함한 DMEM/F-12)에서 1일간 배양하여 EB를 제조하였다. 그 후, EB를 10 μM SB-431542 (Abcam)을 포함한 EB 배지에 8일간 부유 배양하였다. 배양한 EB는 피브로넥틴 코팅 접시에 붙이고, 1% B27 보충제(supplement) (Invitrogen), 1% 인슐린-트렌스페린-셀레늄 액상 배지 보충제 (Sigma), 1% 화학적 지질농축물(chemically defined lipid concentrate) (Invitrogen), 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F-12에서 4일간 배양한 뒤, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서 약 2주간 배양하여 중간엽줄기세포(MSC)로 분화 유도하였다. 참고로, EB 밀도(confluency)가 80~90%일 때, 트립신-EDTA를 2분간 처리하여 서브 컬쳐하면서 유지 하거나, LN2 탱크에 얼려서 보관하였다. 그 후, FACS를 이용하여 표면 마커 발현이 정상인지를 확인함으로써 MSC의 분화 효율을 검증하고, 검증된 MSC를 젤라틴으로 코팅된 접시에 2x104 cells/cm2로 분주하여 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서 3일간 배양하였다. 그 후, StemProⓡ Osteogenesis Supplement를 포함한 StemProⓡ Osteocyte/Chondrocyte Differentiation Basal Medium에서 배양하여 골아세포(osteoblast)로 분화 유도하였다. For use in the HTS platform (high throughput screening platform), a method of differentiating iPSCs into osteocytes was established as shown in FIG. Specifically, the iPSC colonies generated in Example 1 were subjected to mechanical separation (approximately 0.5 mm x 0.5 mm size) with 4 to 9 clumps using a chopper, and 10 mg / ml dispase ( Invitrogen) for 4 minutes. The removed clumps were transferred to uncoated Patri-dishes and cultured in an embryoid body (EB) medium (DMEM / F-12 containing 10% serum substitute, 1% penicillin-streptomycin and 1% The EBs were cultured for one day. Thereafter, EB was suspended in EB medium containing 10 μM SB-431542 (Abcam) for 8 days. The cultured EBs were attached to a fibronectin-coated dish and stained with 1% B27 supplement (Invitrogen), 1% insulin-trainsperin-selenium liquid medium supplement (Sigma), 1% chemically defined lipid concentrate ), Cultured in DMEM / F-12 containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin for 4 days and then cultured in a-MEM containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin for about 2 weeks, (MSC). For reference, when the EB density (confluency) was 80 to 90%, trypsin-EDTA was treated for 2 minutes and subcultured, or stored in an LN2 tank. Then, the MSCs were examined for their differentiation efficiency by confirming whether the surface marker expression was normal using FACS, and the MSCs were fractionated at 2 × 10 4 cells / cm 2 on a gelatin-coated plate and cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin Lt; RTI ID = 0.0 > a-MEM < / RTI > containing streptomycin for 3 days. Then, cultured in StemPro ⓡ Osteogenesis StemPro ⓡ Osteocyte / Chondrocyte Differentiation Basal Medium containing the Supplement to induce differentiation into osteoblasts (osteoblast).
<실시예 3>≪ Example 3 >
비타민 유도체들의 골아세포 분화 촉진 효과 확인Promotion of osteogenic differentiation promoting effect of vitamin derivatives
상기 실시예의 방법으로 일반인과(WT) CFC환자 (CFC7) 체세포에서 역분화한 중간엽 줄기세포(MSCs)를 사용하여, 한국 화합물 은행에서 공급받은 비타민 유도체들 (임상 Ⅰ내지 Ⅲ상에 있거나 승인받은 비타민 유도체들) 중 골아세포 분화 촉진 효과를 나타내는 비타민 유도체들을 스크리닝하였다 (도 3). 구체적으로, 미분화된 MSCs에 트립신-EDTA (Invitrogen)를 2분간 처리하여 10% FBS를 포함하는 α-MEM으로 수득하고, 골아세포 분화 배지 (Invitrogen)로 균일하게 재현탁하여 1.25 × 105 cell/well로 세포 밀도를 조절하여 384 웰에 5000개의 MSCs (40㎕)를 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 웰에 한국 화합물 은행에서 공급받은 비타민 유도체 라이브러리를 각각 1 mM이 되도록 DMSO (sigma)와 약 1:5로 희석한 후, 희석된 화합물을 다시 골 세포 분화 배지와 1:20의 비율로 희석하여 각 웰에 첨가하여 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 6일간 배양하였다. 상기 배양된 배양액에서 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) 분석 키트 (ThermoFisher Scientific, 37621, 1-StepTM PNPP)를 이용하여 측정하였다. 상대적인 ALP 활성화 정도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하고, DMSO 대조군과 대비하여 계산하였다. 모든 실험은 동일한 조건으로 2회 반복 수행하였다. 각 플레이트에서 Z-score 를 계산하여 > 1.5인 비타민 유도체들을 1차 선별한 뒤, Z-score 또는 A405 ≥양성대조군으로 나타난 비타민 유도체들을 2차 선별한 결과, 비타민 D 유도체인 칼시포트리엔(Calcipotriene)이 선발되었다.(MSCs) that were differentiated from somatic cells in general (WT) CFC patients (CFC7) somatic cells by the method of the above-mentioned example, vitamin derivatives supplied from the Korean Chemical Bank (Clinical I to III, Vitamin derivatives) were screened (Fig. 3). Specifically, undifferentiated MSCs were treated with trypsin-EDTA (Invitrogen) for 2 minutes to obtain α-MEM containing 10% FBS, and homogenously resuspended in an osteoblast differentiation medium (Invitrogen) to obtain 1.25 × 10 5 cells / 5000 MSCs (40 μl) were plated in 384 wells and cultured for 24 hours. The wells were diluted with DMSO (Sigma) to a ratio of 1: 5 to 1 mM each of the vitamin derivative library supplied from the Korean Chemical Bank, and the diluted compounds were further diluted with the bone cell differentiation medium at a ratio of 1:20 Added to each well, and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 6 days. ALP (Alkaline phosphatase) activity was measured in the cultured culture using p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) assay kit (ThermoFisher Scientific, 37621, 1-Step TM PNPP). The relative degree of ALP activation was calculated by measuring the absorbance at 405 nm using a microplate reader and compared to the DMSO control. All experiments were repeated twice under the same conditions. Calcipotriene (Calcipotriene), a vitamin D derivative, was firstly screened for Z-scores of each of the plates, and the vitamin D derivatives were selected first, followed by Z-score or A 405 ≥ positive control. ) Was selected.
선발된 비타민 D 유도체인 칼시포트리엔의 ALP 활성은, CFC 환자 유래 MSC (CFC-DMSO)의 ALP 활성화 정도에 비하여, 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 상기 결과로부터, 비타민 D 유도체인 칼시포트리엔이 ALP 활성 증진을 통한 골아세포 분화 촉진 효과를 통해 CFC 증상을 완화시킬 수 있음을 알 수 있다. The ALP activity of calcipotriene, a selected vitamin D derivative, was significantly increased compared to the degree of ALP activation of CFC-derived MSC (CFC-DMSO) (FIG. 4). From the above results, it can be seen that calcipotriene, a vitamin D derivative, alleviates CFC symptoms through promoting osteoblast differentiation through promotion of ALP activity.
<실시예 4><Example 4>
선발된 비타민 유도체의 농도별 골아세포 분화 촉진 효과 확인Identification of osteogenic differentiation promoting effect of selected vitamin derivatives
상기 실시예 3에서 선발한 비타민 유도체 칼시포트리엔의 농도별 (0 내지30μM) 골아세포 분화 촉진 효과를, 상기 실시예 3의 방법과 동일하게 ALP 활성화 정도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 모든 실험은 동일한 조건으로 3회 반복 수행하였다. The osteoclast differentiation promoting effect of the vitamin derivative calcipotriene concentration (0 to 30 μM) selected in Example 3 was evaluated by measuring the degree of ALP activation using a microplate reader at 405 nm in the same manner as in Example 3, . All experiments were repeated three times under the same conditions.
그 결과, ALP 활성은 약 10μM까지 농도의존적으로 ALP 활성이 증가하였다 (도 5). 이를 통해 칼시포트리엔의 EC50는 0.3635μM로 나타났다.As a result, ALP activity was increased in a dose-dependent manner up to about 10 μM (FIG. 5). Thus, the EC50 of Calcifferriene was 0.3635 μM.
<실시예 5>≪ Example 5 >
선발된 비타민 유도체 처리에 의한 전사체 변화 분석Analysis of Transcript Transformation by Selected Vitamin Derivatives Treatment
비타민 유도체 칼시포트리엔을 일반인(WT) 및 CFC 환자 (CFC7) 체세포에서 역분화한 중간엽 줄기세포(MSCs)에 각각 처리한 후, RNA 시퀀싱을 수행하였다. 구체적으로, 칼시포트리엔 또는 칼시포트리엔을 녹일 때 사용한 용매 (대조군)만 처리한 중간엽 줄기세포를 골세포 분화 조건에서 배양한후, RNA를 분리하여 Nextseq500 기기에서 75bp single-end RNA sequencing을 수행하였다.Vitamin derivative calcipotriene was treated with mesenchymal stem cells (MSCs), which were differentiated from normal (WT) and CFC patient (CFC7) somatic cells, respectively, and RNA sequencing was performed. Specifically, the mesenchymal stem cells treated with only the solvent (control) used to dissolve calcipotriene or calcipotriene were cultured under osteoclast differentiation conditions, and RNA was isolated and subjected to 75 bp single-end RNA sequencing in Nextseq 500 instrument Respectively.
그 결과, 일반인에 비해 CFC 환자 유래 MSCs에서 2배 이상 증가(up) 또는 감소(DN)되어 있는 유전자, 및 DMSO 대조군에 비해 각각의 약물을 처리한 세포에서 증가/감소한 유전자들을 발굴하였으며 (표 1), 상기에서 CFC에 비해 일반인에서 증가한 유전자 722 종을 경로 분석(pathway analysis)한 결과, 골형성 및 여러 가지 발달 과정에 관여하는 유전자들이 enrich 되어 있는 것으로 나타났다 (도 6). 또한, 칼시포트리엔 처리시 CFC 환자 유래 MSCs에서 증가하는 유전자들을 분석한 결과 (도 7) 및 일반인 유래 MSCs 및 칼시포트리엔을 처리한 CFC 환자 유래 MSCs에서 대조군에 비해 공통적으로 증가되어 있는 유전자들을 분석한 결과 (도 8), 골형성(ossification), 근육발달(muscle structure development), 배아 발달 조절 및 골형성(bone morphogenesis)에 관여하는 유전자들이 증가되는 것으로 나타났다. 이에, 상기 실시예에서와 같이 칼시포트리엔의 WT 대비 상대적인 ALP 활성화 정도 효과를 스케일업하여 6웰 플랫폼에서도 확인한 결과, 동일한 결과를 나타냈다 (도 9). 이를 통해, 칼시포트리엔이 CFC 환자 체세포 유래 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화를 회복시키는 것을 알 수 있었다. As a result, genes that were twice or more increased (up) or decreased (DN) in MSCs derived from CFC patients than those in the general population, and genes that were increased / decreased in the cells treated with each drug compared to the DMSO control group ). As a result of pathway analysis of 722 genes increased in the general population compared to CFC, genes involved in osteogenesis and various development processes were enriched (FIG. 6). In addition, an analysis of genes that increase in MSCs derived from CFC patients at the time of treatment with calcipotriene (FIG. 7) and MSCs derived from CFC patients treated with CMCs and calcipotriene There was an increase in genes involved in one outcome (Fig. 8), ossification, muscle structure development, embryonic developmental regulation and bone morphogenesis. As a result, the ALP activation effect of the calcipotrienes relative to the WT was scaled up and confirmed on a 6-well platform as in the above example (FIG. 9). This suggests that calcipotriene restored the differentiation of mesenchymal stem cells derived from CFC patient somatic cells into osteoblasts.
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