KR101983216B1 - Antibodies for determining an activity of botulinum toxin and a method for using the same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to an antibody for determining botulinum toxin activity and an antibody composition including the antibody. The development needs of a cell-based potency analyzing (CBPA) method is required to replace a mouse LD_50 bioassay in an existing botulinum toxin potency measurement field. The antibody for determining botulinum toxin activity by the present invention is a monoclonal antibody with high binding affinity and specificity about SNAP25 as an antibody for CPBA to replace MLD_50. The antibody of the present invention is expected to be actively used in pharmaceutical and aesthetic fields by overcoming limits that a conventional CPBA has and enabling effective CBPA development. The antibody is specifically combined with synaptosomal nerve-associated protein 25 (SNAP25), wherein the SNAP25 is SNAP25FL or SNAP25197.

Description

보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체, 및 이를 이용한 활성 측정방법{Antibodies for determining an activity of botulinum toxin and a method for using the same}An antibody for determining botulinum toxin activity, and a method for measuring activity using the same,

본 발명은 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체, 및 이를 이용한 활성 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to an antibody for determining botulinum toxin activity, and a method for measuring activity using the antibody.

현재 마우스 LD50 생물검정(MLD50)은 식품, 임상, 또는 환경 시료에 존재하는 보툴리눔 독소(BoNT)의 검출을 위해 일반적으로 인정되는 방법이다. 특히, 제약 분야에서는 미학적 또는 의학적 용도로 사용되는 보툴리눔 독소의 역가를 측정하기 위한 표준 분석법으로 MLD50을 이용한다. 그러나 MLD50을 이용한 보툴리눔 독소의 역가 측정은 시험자, 시험 기관, 및 시설 등에 영향을 많이 받으므로, 보툴리눔 독소의 생물학적 효능을 정확하고 재현적으로 정량화하기에 어려움이 있는 실정이다. 이에, 실험에 사용되는 동물의 수와 고통을 최소화하고 보툴리눔 독소 역가 측정법을 표준화하고자, MLD50 대안 측정법의 개발을 장려하기 위해 ZEBET 회의가 개최되었다(Altern Lab Anim. 2010 Aug;38(4):315-30). 다양한 국가에서 많은 연구소와 산업체가 특이성, 민감성, 및 재현성 측면에서 MLD50을 대체하기에 만족할만한 세포 기반 역가 분석법(CBPAs), 또는 세포 기반 생물 검정법(CBB)을 개발하고자 다양한 연구에 착수하였다. 성공적인 CBPA 또는 CBB의 구축을 위해 고려되는 사항은 ① SNAP25197 에 특이적인 단일 클론, 또는 다클론 항체 항체, 및 ② 저농도(~pM)의 보툴리눔 독소에 높은 민감성을 나타내는 신경 세포주를 획득하는 것이다. 2004년 초 Chapman 박사와 그의 동료들은 두 개의 형광 단백질과 융합된 보툴리눔 독소를 이용하는 형광 리포터 분석을 발명하였고(Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 12;101(41):14701-6), BoCellTM 분석법으로 명명하여 상업화하였다(BioSentinel Inc). 그러나 BoCellTM 분석이 98-웰 배양 접시에서 배양되는 동물 세포로 보툴리눔 독소의 엔도펩티다아제 활성을 검출 할 수 있는 최초의 분석법이라는 의의에도 불구하고, 마우스를 이용한 분석보다 2-3배 민감도가 떨어지는 문제점이 있었다(Appl Environ Microbiol vol. 78,21 (2012): 7687-97). The current mouse LD 50 bioassay (MLD 50 ) is a generally accepted method for the detection of botulinum toxin (BoNT) present in food, clinical, or environmental samples. In particular, the pharmaceutical sector uses MLD 50 as a standard method for measuring the potency of botulinum toxins used for aesthetic or medical purposes. However, the measurement of the potency of botulinum toxin using MLD 50 is highly influenced by the tester, testing institute, and facilities, and thus it is difficult to accurately and reproducibly quantify the biological efficacy of botulinum toxin. A ZEBET meeting was held to encourage the development of the MLD 50 alternative measurement method to minimize the number and pain of the animals used and to standardize botulinum toxin titers (Altern Lab Anim. 2010 Aug; 38 (4): 315-30). Many laboratories and industries in various countries have undertaken various studies to develop cell-based titration assays (CBPAs) or cell-based bioassays (CBBs) that are satisfactory to replace MLD 50 in terms of specificity, sensitivity, and reproducibility. Considerations for the successful construction of CBPA or CBB are to obtain a nerve cell line that exhibits high sensitivity to the monoclonal or polyclonal antibody specific for SNAP25 197 and the botulinum toxin for low concentration (~ pM). In early 2004 Dr. Chapman and his colleagues invented a fluorescent reporter assay using a botulinum toxin fused to two fluorescent proteins (Proc Natl Acad Sci USA 2004 Oct 12; 101 (41): 14701-6), BoCell TM assay (BioSentinel Inc). However, despite the significance of the BoCell ™ assay being the first method to detect the endopeptidase activity of botulinum toxin as an animal cell cultured in a 98-well culture dish, the problem of 2-3 times less sensitivity than the analysis using a mouse (Appl Environ Microbiol vol. 78, 21 (2012): 7687-97).

상기 기술한 바와 같이 MLD50을 대체하기 위한 CBPA를 개발하고자 전 세계적인 노력이 지속되고 있으므로, 궁극적으로 동물을 이용한 분석법은 제거될 것으로 보인다. 효과적인 CPBA 개발을 위해 해결해야할 과제들이 남아 있으나, 효과적인 CBPA 개발은 다양한 보툴리눔 독소 제품의 활용성 확장을 용이하게 하고, 품질 관리 수준을 향상시키며, 소비자에게 보다 높은 수준의 신뢰를 제공하므로써 보툴리눔 독소 제품의 경쟁력을 고취시킬 것이다. As described above, worldwide efforts are underway to develop CBPA to replace MLD50, and ultimately animal-based assays are likely to be eliminated. Effective CBPA development remains a challenge for effective CPBA development, but the development of effective botulinum toxin products facilitates the extension of the use of botulinum toxin products, improves quality control levels, and provides consumers with a higher level of confidence. It will boost competitiveness.

따라서 본 발명은 마우스 LD50 생물검정(MLD50)을 대체하기 위한 CPBA용 항체에 관한 것으로서, 본 발명의 항체는 SNAP25에 대한 결합 친화력과 특이성이 현저하게 높은 단일 클론 항체이다. 본 발명의 항체는 종래의 CPBA가 가진 한계점을 극복하고, 보다 효과적인 CBPA 개발을 가능하게 하므로, 제약 및 미용 분야에서 활발하게 이용될 것으로 기대된다.Accordingly, the present invention relates to an antibody for CPBA for replacing the mouse LD 50 bioassay (MLD 50 ), and the antibody of the present invention is a monoclonal antibody having remarkably high binding affinity and specificity for SNAP25. The antibody of the present invention is expected to be actively used in the pharmaceutical and cosmetic fields because it overcomes the limitations of conventional CPBA and enables more effective development of CBPA.

본 발명의 일 목적은 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체를 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide an antibody for determining botulinum toxin activity.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 이용한 세포 기반 보툴리눔 독소의 역가 측정 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for measuring the activity of a cell-based botulinum toxin using the antibody.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.Hereinafter, various embodiments described herein will be described with reference to the drawings. In the following description, for purposes of complete understanding of the present invention, various specific details are set forth, such as specific forms, compositions and processes, and the like. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and techniques of manufacture are not described in any detail, in order not to unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to " one embodiment " or " embodiment " means that a particular feature, form, composition, or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the invention. Accordingly, the appearances of the phrase " in one embodiment " or " an embodiment " in various places throughout this specification are not necessarily indicative of the same embodiment of the present invention. In addition, a particular feature, form, composition, or characteristic may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless defined otherwise in the specification, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

Botox® 제조업체인 Allergan사는 SNAP25197에 특이적인 단일 클론 항체와 보툴리눔 독소에 매우 민감한 이상적인 숙주 세포인 인간 신경종 세포주 SiMa(human neuroblastoma SiMa)를 성공적으로 구축하였다(PLoS One. 2012;7(11):e49516). 상기 항체와 세포로 Allergan사는 새로운 CBPA 분석법을 개발하여 MLD50을 대체 가능한 첫번째 CBPA로 2010년 FDA 승인받았다(US8455213B2, 및 US2010/0204559A1). 또 다른 보툴리눔 독소 제조업체인 독일 MERZ사는 2014년에 CBA-ELISA를 개발하였고(WO2014/207109A1), 2015년 FDA 승인을 획득하였다. CBA-ELISA는 차별화된 신경 세포 고정법(in-situ)을 사용하고, 세포막을 침투하여 내인성 SNAP25을 면역학적으로 검출한다. Allergan사의 CBPA와 MERZ사의 CBA-ELISA는 마우스 바이오 분석법과 동등하게 피코몰 이하 농도(i.e. <1.0 U/well)의 EC50에서도 탁월한 감도를 나타낸다. Allergan사와 MERZ사의 기술은 일반적인 상업용 토끼 다클론 항체 항체(Sigma S9684)를 사용하여 최적 조건에서 SNAP25를 검출한다. 세포의 경우, Allergan사의 CBPA에서는 분화된 인간 신경종 세포주 SiMa를 독점적으로 사용하고, MERZ사의 CBA-ELISA는 인간의 분화된 유도다능성 줄기세포(iPS)를 표준화되고 최적화된 숙주 세포로 사용한다. SiMa는 매우 천천히 증식하여 일반적으로 세포수가 2배가 되는데 필요한 시간(population doubling time; PDT)이 70시간 이상이고, iPS 생성 또한 매우 시간 소모적이고, 저장은 더욱 어렵다. 따라서, 보툴리눔 독소에 매우 민감하면서도 PDT가 짧고, 쉽게 보관될 수 있는 CBPA용 신경 세포주 개발의 필요성이 제기되었다. 더하여 위스콘신 대학 David Beebe 박사의 연구 그룹은 SiMa가 운동신경과 유사한 특징을 보이지 않기 때문에 CBPA용 세포로서 SiMa의 적합성에 문제가 있다고 지적하였고(J Biomol Screen. 2016 Jan;21(1):65-73), 7.9pM 이하 농도의 EC50에서도 민감성을 나타낸는 운동신경 유사 세포주 NG108-15으로 대체 CBPA를 개발하였다. 그러나 상기 개발된 CBPA들은 웨스턴 블랏팅 분석법을 이용하여 SNAP25197 및 SNAP25FL의 내인성 수준을 결정하므로, 고 처리량 분석(high-throughput assay) 시에는 이용이 어려운 실정이다.Allergan the maker of Botox® living human cell lines neuroma SiMa (human neuroblastoma SiMa) is very sensitive to the ideal host cell specific monoclonal antibody and the SNAP25 197 botulinum toxin was successfully established (PLoS One 2012; 7 (11 ):. E49516 ). With these antibodies and cells, Allergan developed the new CBPA assay and received the 2010 FDA approval as the first CBPA to replace MLD50 (US8455213B2, and US2010 / 0204559A1). Another botulinum toxin manufacturer, Germany MERZ, developed the CBA-ELISA in 2014 (WO2014 / 207109A1) and obtained FDA approval in 2015. The CBA-ELISA immunologically detects endogenous SNAP25 using differentiated neuronal cell staining (in-situ) and penetrates the cell membrane. Allergan's CBPA and MERZ's CBA-ELISA exhibit excellent sensitivity even at EC 50 of sub-picomolar concentrations (ie <1.0 U / well) equivalent to mouse biosensor assays. Allergan and MERZ technologies detect SNAP25 under optimal conditions using a common commercial rabbit polyclonal antibody (Sigma S9684). In the case of cells, Allergan's CBPA exclusively uses the differentiated human neuroma cell line SiMa and the MERZ CBA-ELISA uses human differentiated inducible pluripotent stem cells (iPS) as standardized and optimized host cells. SiMa proliferates very slowly and generally requires more than 70 hours of population doubling time (PDT) to double the number of cells, iPS production is also very time consuming and storage is more difficult. Therefore, there is a need to develop a CBPA neuronal cell line that is very sensitive to botulinum toxin, but short in PDT and easy to store. In addition, Dr. David Beebe's group at the University of Wisconsin noted that SiMa is not compatible with CBPA cells because it lacks motor neurons (J Biomol Screen. 2016 Jan; 21 (1): 65-73 ), An alternative CBPA was developed with the motoneuron-like cell line NG108-15, which was also sensitive to EC 50 at concentrations below 7.9 pM. However, since the developed CBPAs determine the endogenous levels of SNAP25 197 and SNAP25 FL using Western blotting analysis, they are difficult to use in high-throughput assays.

본 발명의 일 구체예에서 “보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)”란, 클로스트리디움 보툴리눔 세균이 만드는 신경독 단백질이다. 클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독을 생산한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과할 수 있는 것으로 보이며 콜린성 운동 뉴런에 대해 높은 친화도를 나타낸다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 죽음으로 증상이 진행될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 상업적으로 입수 가능한 보툴리눔 독소 타입 A(정제된 신경독 복합체)의 LD50은 약 50 피코그램이다(즉, 1 유닛). 몰(M)을 기준으로 할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브라 독(cobra toxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD50으로서 정의할 수 있다. 일반적으로 면역학적으로 구별되는 7개의 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G로 특징 지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 야기하는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 랫드에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD50의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다. 식세포작용 및 음세포작용 뿐 아니라, 낮은 친화도 수용체를 통하여 추가로 흡수될 수 있다. 세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫 번째 단계에서는, 독소의 중쇄(H 사슬 또는 HC)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스 전 막에 결합하는 것이며, 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 중쇄의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.In one embodiment of the present invention, &quot; Botulinum Toxin &quot; is a neurotoxin protein produced by Clostridium botulinum bacteria. The Clostridium genus is more than 127 species and is classified according to its form and function. The anaerobic, gram-positive bacterium Clostridium botulinum produces botulinum toxin, a potent polypeptide neurotoxin that causes botulism in humans and animals. Spores of Clostridium botulinum are found in soil and can be cultured in sealed, home-canned food containers that are not properly sterilized, which causes many botulism. Symptoms of botulism typically occur 18 to 36 hours after eating food from Clostridium botulinum culture or spore-infected food. The botulinum toxin appears to pass through the intestinal lumen without decreasing its toxicity and exhibits high affinity for cholinergic motor neurons. Symptoms of botulinum toxin poisoning may include symptoms of walking, dysphagia and speech disorders, respiratory muscle paralysis and death. Botulinum toxin type A is the most deadly natural biologic agent known to humans. The LD50 of commercially available botulinum toxin type A (purified neurotoxin complex) is about 50 picograms (i.e., one unit). On a molar basis, botulinum toxin type A is 1.8 billion times more damaging than diphtheria, 600 million times more damaging than sodium cyanide, 30 million times more damaging than cobra toxin, and 12 million times more damaging than cholera. Botulinum toxin 1 unit (U) can be defined as an LD50 via intraperitoneal injection in female Swiss Webster mice weighing 18-20 g each. Seven botulinum neurotoxins, which are generally immunologically distinctive, are characterized by their respective neuropeptide serotypes A, B, C1, D, E, F and G, which are differentiated by type-specific antibodies. The different vertical types of botulinum toxin differ depending on the species and the degree and duration of paralysis caused. For example, botulinum toxin type A was measured to be 500 times more potent than botulinum toxin type B when measured by ratios occurring in rats. In addition, botulinum toxin type B was determined to be non-toxic when administered to primates at 480 U / kg, which is about 12 times that of botulinum toxin type A primate LD50. Botulinum toxin binds with strong affinity to cholinergic motor neurons, and enters neurons and is thought to inhibit the release of acetylcholine. Can be further absorbed through low affinity receptors as well as phagocytic and acellular effects. Regardless of the vertical type, the molecular mechanism of toxic poisoning is similar and appears to consist of at least three stages. In the first step of the process, the specific interaction of the cell surface receptor with the heavy chain (H chain or HC) of the toxin binds the toxin to the synaptic membrane of the target neuron, which is the botulinum toxin type and the tetanus It is considered different depending on each type of toxin. It is believed that the carboxyl end fragment of the heavy chain, Hc, is important for targeting the toxin to the cell surface.

두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 보툴리눔 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 중쇄의 아미노 말단 단편, HN에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소(또는 최소한 경쇄)는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다. 보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 중쇄와 경쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 및 파상풍 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 경쇄에 포함되며; 경쇄는 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 파상풍 신경독, 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 세로타입 A 및 E는 SNAP-25를 절단한다. 세로타입 C1은 원래 신택신을 절단하는 것으로 여겨졌으나, 신택신 및 SNAP-25를 절단하는 것으로 밝혀졌다. 동일한 결합을 절단하는 타입 B(및 파상풍 독소)를 제외하고는, 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다. 각각의 이러한 절단은 소포-막 도킹의 과정을 방해하여 소포 내용물의 엑소시토시스를 막는다.In the second step, the toxin passes across the plasma membrane of the poisoned cell. Initially, botulinum toxin is enveloped by cells through receptor-mediated endocytosis, resulting in endosomes containing toxins. The toxin then exits the endosome and enters the cytoplasm of the cell. This step is believed to be mediated by the amino terminal fragment, HN, of the heavy chain that causes structural changes in the toxin at about pH 5.5 or lower. Endosomes are known to have proton pumps that reduce endogenous internal pH. The structural displacement can expose the hydrophobic residues of the toxin, allowing the toxin to be surrounded by the endosomal membrane. The toxin (or at least light chain) is then displaced to the cytosol through the endosomal membrane. The last step in the botulinum toxin activation mechanism is believed to involve the reduction of disulfide bonds linking the heavy and light chains. The total toxic activity of botulinum and tetanus toxin is contained in the light chain of holotoxin; Light chains are zinc (Zn ++ ) endopeptidases that selectively recognize and cleave proteins essential for recognition and docking of neurotransmitter-containing vesicles with the cytoplasmic surface of the plasma membrane and fusion between the plasma membrane and vesicles. Tetanus neurotoxins, botulinum toxin types B, D, F and G cause the degradation of synaptobrevin (or vesicle-associated membrane protein (VAMP)) and synaptosome membrane proteins. VAMP present on the cytoplasmic surface of synaptic vesicles is largely eliminated as a result of one of these degradation actions. Vertical types A and E cut SNAP-25. Vertical type C1 was originally thought to cleave syntactic ginsenosides but was found to cleave syntactic and SNAP-25. Except for type B (and tetanus toxin) that cleaves the same linkage, each toxin specifically cleaves a different linkage. Each such cleavage interferes with the process of vesicle-membrane docking and blocks exocytosis of vesicle contents.

보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애(즉, 운동 장애)의 치료를 위해 임상에서 사용되고 있다. 1989년에, 보툴리눔 독소 타입 A 컴플렉스는 미국 식품의약청에 의해서, 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었다. 이어서, 보툴리눔 독소 타입 A는 또한 FDA로부터 경부 디스토니아의 처치 및 미간 주름의 처치에 대해 승인되었고, 보툴리눔 독소 타입 B도 경부 디스토니아의 처치에 대하여 승인되었다. 독소 타입 A 이외의 보툴리눔 세로타입들은 보툴리눔 독소 타입 A와 비교할 때, 활성에 있어서 더 낮은 효력 및/또는 더 짧은 지속시간을 가지는 것으로 보인다. 말초 근육내 주사된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 일주일 이내에 나타난다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육 내 주사에 의한 증상 구제의 전형적인 지속시간은 평균 약 3 개월이나, 상당히 더 긴 기간 동안의 치료 활성이 보고되었다.Botulinum toxin has been used clinically for the treatment of neuromuscular disorders characterized by activity-mediated skeletal muscles (i. E., Movement disorders). In 1989, the botulinum toxin type A complex was approved by the US Food and Drug Administration to be used in the treatment of essential blepharospasm, strabismus, and hemifacial spasm. Subsequently, botulinum toxin type A was also approved for the treatment of cervical dilatation and the treatment of wrinkles from the FDA, and botulinum toxin type B was also approved for the treatment of cervical dilatation. Botulinum serotypes other than toxin type A appear to have lower potency and / or shorter duration of activity as compared to botulinum toxin type A. The clinical effect of injected botulinum toxin type A in the peripheral intima usually appears within one week of injection. The typical duration of symptom relief by intramuscular injection of once-a-bottle botulinum toxin type A is on average about 3 months, although therapeutic activity for a significantly longer period has been reported.

모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근육 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 보인다 하더라도, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 예를 들어, 보툴리눔 타입 A 및 E는 모두 25kDa 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C1은 신택신 및 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다. 특히, 보툴리눔 독소의 기질을 여러 상이한 세포 타입에서 발견할 수 있다.Although all botulinum toxin serotypes seem to inhibit the release of the neurotransmitter acetylcholine at neuromuscular junctions, they act on different neurotransmitter proteins and cleave this protein at different sites. For example, botulinum types A and E all cleave the 25 kDa synaptosome related protein (SNAP-25), but target different amino acid sequences of this protein. Botulinum toxin types B, D, F and G act on vesicle-associated proteins (VAMP, so-called synaptobrevin), each of which truncates different regions of the protein. Finally, botulinum toxin type C1 appears to cleave both syntactic and SNAP-25. This differential mechanism of action will affect the relative potency and / or duration of action of various botulinum toxin serotypes. In particular, substrates for the botulinum toxin can be found in a variety of different cell types.

보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kDa이다. 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 관련된 비독성 단백질과 함께 150kDa 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900kDa, 500kDa 및 300kDa 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C1은 700kDa 또는 500kDa 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kDa 및 500kDa 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kDa 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kDa 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kDa 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다. 따라서 본 발명에 있어서, 보툴리눔 독소는 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태를 모두 포함할 수 있다. 자연적으로 형성하는 복합체화 단백질을 함유하지 않으며 A, B, C, D, E, F 또는 G형 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 유래되는 보툴리눔 독소 단백질의 분자량은 대략 150kDa이다. 하지만 클로스토리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서 독소 단백질이 생산될 때 보툴리눔 독소 단백질은 보툴리눔 독소 단백질의 작용을 보조 및 보호하는 여러가지 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질 및 비헤마글루티닌 단백질과 다양한 복합체를 형성하여 생산된다. 자연적으로 형성하는 복합체화 단백질을 함유하는 보툴리눔 독소 세로타입 A는 대략 900kDa, 500kDa, 또는 300kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이고, 세로타입 B와 C는 대략 500kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이고, 세로타입 D는 대략 300kDa, 또는 500kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이며, 세로타입 E와 F는 대략 300kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이다.The molecular weight of the botulinum toxin protein molecule is about 150 kDa in all seven known botulinum toxin longitudinal types. The botulinum toxin is released as a complex comprising a 150 kDa botulinum toxin protein molecule with non-toxic proteins associated by Clostridium bacteria. Thus, the botulinum toxin type A complex can be produced by Clostridium bacteria at 900 kDa, 500 kDa and 300 kDa types. Botulinum toxin type B and C1 appear to be produced only as a 700 kDa or 500 kDa complex. Botulinum toxin type D is produced as a 300 kDa and 500 kDa complex. Finally, botulinum toxin types E and F are produced only as a 300 kDa complex. These complexes (i.e. those with a molecular weight greater than about 150 kDa) are believed to include non-toxic erythrocyte aggregation proteins and non-toxin and non-toxic non-red cell aggregation proteins. These two non-toxin proteins (including related neurotoxin complexes along with botulinum toxin molecules) will serve to provide stability to botulinum toxin molecule denaturation and protection against peptic acid when the toxin is ingested. In addition, the greater the botulinum toxin complex (molecular weight greater than about 150 kDa), the more slowly the botulinum toxin will diffuse from the site of injection of the botulinum toxin complex. Thus, in the present invention, the botulinum toxin may comprise both a form that does not contain a complexed protein or a complex that contains a complexed protein. The molecular weight of the botulinum toxin protein, which does not contain a naturally occurring complexing protein and is derived from A, B, C, D, E, F or G-type Clostridium botulinum is approximately 150 kDa. However, when the toxin protein is produced by the Clostridium botulinum bacteria, the botulinum toxin protein forms various complexes with various hemagglutinin proteins and behemagglutinin proteins which assist and protect the action of the botulinum toxin protein do. Botulinum toxin type A containing naturally occurring complexing protein is in the form of a complex having a molecular weight of about 900 kDa, 500 kDa, or 300 kDa, and longitudinal types B and C are in the form of a complex having a molecular weight of about 500 kDa, Is a complex form with a molecular weight of approximately 300 kDa, or 500 kDa, and the longitudinal types E and F are in the form of complexes with a molecular weight of approximately 300 kDa.

또한 in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP, 물질 P(Substance P) 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서, 적당한 농도로 사용하는 경우, 보툴리눔 독소에 의해서 대부분의 신경전달물질의 자극-유발 방출이 억제된다. Also, in vitro studies have shown that botulinum toxin inhibits potassium cation-induced release of acetylcholine and norepinephrine from primary cell cultures of brain stem tissue. In addition, the botulinum toxin inhibits the induced release of glycine and glutamate in primary cultures of spinal cord neurons and inhibits the release of glycine and glutamate from the brain synaptosomal specimens in the presence of the neurotransmitters acetylcholine, dopamine, norepinephrine, CGRP, Substance P, Lt; / RTI &gt; Thus, when used at moderate concentrations, the stimulatory-induced release of most neurotransmitters is inhibited by the botulinum toxin.

보툴리눔 독소 타입 A는 발효조에서 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 만들어 배양한 다음, 발효 혼합물을 공지의 방법으로 수확 및 정제하여 얻을 수 있다. 처음에는 모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는, 비활성 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C1, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 이미 알려진 바와 같이, 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B는 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 동일한 투여량 레벨에서 보툴리눔 독소 타입 B는 보툴리눔 독소 타입 A에 비하여, 근육 주사시, 활성의 지속시간이 더 짧고 또한 효력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.Botulinum toxin type A can be obtained by culturing a culture of Clostridium botulinum in a fermentation tank and then harvesting and purifying the fermented mixture by a known method. Initially, all botulinum toxin longitudinal types are synthesized as inactive single chain proteins, which must be nicked and nerve activated by proteases. The bacterial strains that produce botulinum toxin serotypes A and G carry an endogenous protease, and therefore, types A and G can be recovered primarily from the bacterial culture as an active form. In contrast, botulinum toxin serotypes C1, D, and E are synthesized by non-degradable strains and are therefore typically inactivated when recovered from the culture. Since serotypes B and F are produced by both proteolytic and non-degradable strains, they may be recovered in an active or inactive form. However, for example, a proteolytic strain that produces the botulinum toxin type B serotype only cleaves a portion of the resulting toxin. The exact ratio of nicked molecules to non-nicked molecules depends on the incubation time and the temperature of the culture. Thus, as is already known, botulinum toxin type B toxins will be inactive, for example, in some specimens of a given percentage, as botulinum toxin type B is much less effective than botulinum toxin type A. The presence of an inert botulinum toxin molecule in a clinical sample will contribute to the overall protein load of the sample, which is associated with an increase in antigenicity without contributing to clinical effects. Also, at the same dose level, botulinum toxin type B is known to have a shorter duration of activity and less efficacy in muscle injection than botulinum toxin type A.

클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A 종(Hall A strain)으로부터 ≥3 X 107U/㎎이고, A260/A278이 0.60 이하이고, 겔 전기영동에서 독특한 밴드 패턴을 보이는 특징을 가지는, 질 높은 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻을 수 있다. 공지의 산츠 프로세스(Shantz process)를 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 적절한 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 배양한 혐기성 발효물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 공지의 프로세스는 또한, 예를 들어: 분자량이 약 150kDa이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/㎎ 이상인 보툴리눔 독소 타입 A를 정제하거나; 분자량이 약 156kDa이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/㎎ 이상인 보툴리눔 독소 타입 B를 정제하거나; 분자량이 약 155kDa이고, 특이적인 효력이 1-2 X 107 LD50 U/㎎ 이상인 보툴리눔 독소 타입 F를 정제하는 등의, 비독소 단백질들로부터 순수한 보툴리눔 독소들을 분리하여 얻는데 사용할 수 있다.A high-quality crystalline botulinum toxin having a characteristic of showing a band pattern of 3 X 10 &lt; 7 &gt; U / mg from the Hall A strain of Clostridium botulinum, A260 / A278 of not more than 0.60 and exhibiting a unique band pattern on gel electrophoresis Type A can be obtained. The known Shantz process can be used to obtain crystalline botulinum toxin type A. In general, botulinum toxin type A complexes can be isolated and purified from anaerobic fermentations cultured with Clostridium botulinum type A in a suitable medium. Such a known process may also include, for example: purifying botulinum toxin type A having a molecular weight of about 150 kDa and a specific potency of 1-2 x 10 8 LD50 U / mg or more; Purifying botulinum toxin type B having a molecular weight of about 156 kDa and a specific effect of 1-2 x 10 8 LD50 U / mg or more; Can be used to isolate pure botulinum toxins from non-toxin proteins, such as purifying botulinum toxin type F having a molecular weight of about 155 kDa and a specific efficacy of 1-2 x 10 &lt; 7 &gt; LD50 U /

보툴리눔 독소 및/또는 보툴리눔 독소 복합체를 당업계에 공지된 화합물 제조업체로부터 상업적으로도 입수할 수 있으며, 순수한 보툴리눔 독소를 또한 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다.Botulinum toxin and / or botulinum toxin complexes are also commercially available from compound manufacturers known in the art, and pure botulinum toxins can also be used to prepare pharmaceutical compositions.

일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 아주 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 적합한 안정화제 또는 안정화 버퍼를 사용하여 안정화하여야만 한다. As with enzymes in general, the biological activity of botulinum toxins (which are intracellular peptidases) depends, at least in part, on their three-dimensional structure. Therefore, botulinum toxin type A can be eliminated by toxicity by heat, various chemicals, surface scratching and surface drying. It is also known that when the toxin complexes obtained by known cultivation, fermentation and purification are diluted to very low toxin concentrations and used in pharmaceutical formulation preparations, the toxin toxicity is rapidly eliminated without suitable stabilizing agents. Diluting large quantities with a solution containing a few nanograms per milliliter is quite difficult because of the rapid loss of specific toxicity. The toxin must be stabilized using a suitable stabilizing agent or stabilizing buffer, since it can be used for months or years after producing the pharmaceutical composition containing the toxin.

하기와 같이, 임상 세팅에서 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하는 것이 보고되었다:It has been reported to use botulinum toxin type A in clinical settings, as follows:

생체 내에서 일회성으로 투여된 보툴리눔 독소에서 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내지 4개월이다. 그러나 경우에 따라 A 아형은 12 개월 이상 효능을 지속할 수 있으며, 다한증과 같은 선(gland)의 치료에 사용되는 경우, 어떤 상황에서는 27 개월 동안 지속될 수 있다. The typical duration of intramuscular injection in a botulinum toxin administered in a single dose in vivo is typically about 3 to 4 months. However, in some cases, the A subtype may persist for more than 12 months and, if used in the treatment of glands such as hyperhidrosis, may last for 27 months under certain circumstances.

보툴리눔 독소는 말초 부위에서 약리학적 작용을 나타낼 뿐 아니라, 중추 신경계에서도 억제 효과를 나타낼 수 있고, 역행 수송에 의해서 척수 영역으로 거슬러 올라갈 수 있다. 따라서 말초 부위에, 예를 들어 근육내로, 투여된 보툴리눔 독소는, 척수로 역행 수송될 수 있다.Botulinum toxin not only exhibits pharmacological action at the peripheral site, but also inhibits the central nervous system and can be traced back to the spinal cord area by retrograde transport. Thus, the botulinum toxin administered to the peripheral site, for example into the muscle, can be retrograde to the spinal cord.

보툴리눔 독소는 또한 피부, 뼈 및 건의 상처, 동통, 다한증을 포함하는 다양한 자율신경계 신경 기능장애, 긴장성 두통, 편두통 통증, 수술-후 통증 및 내장 통증, 모발 성장 및 모발 유지, 건선 및 피부염, 손상된 근육, 다양한 암, 평활근 장애, 신경 포착 증후군, 좌창, 신경성 염증, 안과질환, 췌장질환; 전립선 비대증, 전립선 암 및 요실금을 포함하는 전립선 질환; 섬유조직염, 이상근 증후군 등을 치료하기 위하여 제안되었거나 시도되었다. 또한, 특정 표적 잔기에 화학적으로 컨쥬게이트되거나, 재조합적으로 융합된 변형 클로스트리디움 신경독 또는 이의 단편, 바람직하게는 보툴리눔 독소를, 척수에 투여하여, 통증을 처치하는 데 사용될 수 있음이 공지되었고, 다양한 질환을 처치하는 데 있어서 표적화된 보툴리눔 독소(즉, 비-천연 결합 잔기를 가짐)가 사용될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 또한 보툴리눔 독소를 흉근에 주사하여 흉근경련을 조절하는 기술도 공지되었고, 경피 보툴리눔 독소 투여의 경우와 같이, 제어 방출 독소 임플란트가 공지되어 있다. 보툴리눔 독소를, 입의 씹거나 무는(biting) 근육을 약화시켜 자신이 입히는 상처 및 얻어지는 궤양을 치료하고, 양성 담낭 손상 또는 종양을 치료하고, 치열을 치료하고, 또는 특정 형태의 아토피성 피부염을 치료하기 위하여 사용할 수 있다는 것이 알려져 있다. 추가적으로, 보툴리눔 독소는 랫드 포르말린 모델에서 유도된 염증 통증을 감소시키는 효과를 가질 수 있다. 또한, 보툴리눔 독소 신경 저해가 상피 두께의 감소를 가져올 수 있다고 보고되어 있다. 마지막으로, 과도한 발의 발한, 경직성 발가락, 특발성 발가락 보행을 치료하기 위하여 발에 보툴리눔 독소를 투여하는 것이 알려져 있다.The botulinum toxin can also be used to treat a variety of autonomic nervous system dysfunctions including skin, bones and gunshot wounds, pain, hyperhidrosis, tension headaches, migraine pain, post-operative pain and visceral pain, hair growth and hair retention, , Various cancers, smooth muscle disorders, nerve entrapment syndrome, acne, neurogenic inflammation, ophthalmic diseases, pancreatic diseases; Prostate diseases including prostate hyperplasia, prostate cancer and urinary incontinence; Fibromyalgia, rhabdomyosarcoma, and the like. It is also known that a modified Clostridium neurotoxin or fragment thereof, preferably chemically conjugated to a specific target moiety or recombinantly fused, preferably a botulinum toxin, can be administered to the spinal cord to treat pain, It is known that a targeted botulinum toxin (i. E., Having a non-native binding moiety) can be used in treating various diseases. Techniques for controlling muscle spasms by injection of botulinum toxin into the pectoral muscles are also known and controlled release toxin implants are known, as is the case with transdermal botulinum toxin administration. Botulinum toxins can be used to treat biting and biting muscles of the mouth to heal wounds and resulting ulcers, to treat benign gallbladder injuries or tumors, to treat the dentition, or to treat certain forms of atopic dermatitis Lt; / RTI &gt; Additionally, the botulinum toxin may have the effect of reducing the inflammatory pain induced in the rat formalin model. It has also been reported that botulinum toxin nerve inhibition can lead to a decrease in epithelial thickness. Finally, it is known to administer botulinum toxin to the feet to treat excessive foot sweating, stiff toes, and idiopathic toe walking.

파상풍 독소(tetanus toxin)와, 이의 유도체(즉, 비-천연 표적 잔기를 가진), 단편, 하이브리드 및 키메라를 또한 치료에 사용할 수 있다. 파상풍 독소는 보툴리눔 독소와 많이 유사하다. 따라서, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 모두 가깝게 연관 된 종의 클로스트리디움(각각, 클로스트리디움 테타니 및 클로스트리디움 보툴리눔)에 의해 생성되는 폴리펩티드이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 단일 디설파이드 결합에 의해서 중쇄(분자량 약 100kDa)에 공유 결합된 경쇄(분자량 약 50kDa)로 구성된 2중 사슬 단백질이다. 그리고, 파상풍 독소 및 각각 7가지 보툴리눔 독소(비-복합체)의 분자량은 약 150kDa이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 모두에서, 경쇄는 세포내 생물학적(프로테아제) 활성을 가지는 도메인을 포함하는 반면에, 중쇄는 수용체 결합(면역원성) 및 세포 막 전위 도메인을 포함한다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 시냅스전 콜린성 뉴런 표면의 갱글리오사이드 수용체에 대하여 크고, 특이적인 친화도를 나타낸다. 말초 콜린성 뉴런에 의한, 파상풍 독소의, 수용체 매개 엔도시토시스로 인하여, 축색돌기 역행수송, 중앙 시냅스로부터의 억제성 신경전달물질 방출 차단 및 경련성 마비가 나타난다. 이에 반하여, 말초 콜린성 뉴런에 의한, 보툴리눔 독소의 수용체 매개 엔도시토시스는 역행 수송, 중독된 말초 운동 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스의 억제 및 이완성 마비를 거의 일으키지 않는다. 끝으로, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 생합성 및 분자 구성 모두에 있어 서로 닮아있다. 따라서, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 타입 A는 단백질 서열이 전체에 걸쳐 34% 동일하며, 몇몇 기능성 도메인에서는 서열이 62%나 동일하다.Tetanus toxin and its derivatives (i.e., with non-natural target residues), fragments, hybrids and chimeras can also be used for treatment. Tetanus toxins are very similar to botulinum toxins. Thus, tetanus toxin and botulinum toxin are all polypeptides produced by Clostridium (Clostridium tetany and Clostridium botulinum, respectively) of closely related species. In addition, both tetanus toxin and botulinum toxin are double chain proteins composed of light chains (molecular weight about 50 kDa) covalently linked to a heavy chain (molecular weight about 100 kDa) by a single disulfide bond. The molecular weight of the tetanus toxin and each of the seven botulinum toxins (non-complex) is about 150 kDa. Further, in both tetanus toxin and botulinum toxin, light chains include domains with intracellular biological (protease) activity, while heavy chains include receptor binding (immunogenicity) and cell membrane potential domains. In addition, both tetanus toxin and botulinum toxin exhibit a large, specific affinity for the ganglioside receptor on the surface of pre-synaptic cholinergic neurons. Due to receptor-mediated endocytosis of the tetanus toxin by peripheral cholinergic neurons, axillary dendritic transport, blockade of inhibitory neurotransmitter release from the central synapse, and spastic paralysis occur. In contrast, receptor-mediated endocytosis of the botulinum toxin by peripheral cholinergic neurons causes little inhibition of acetylcholine exocytosis and relaxation paralysis from retrograde transport, poisoned peripheral motor neurons. Finally, the tetanus toxin and the botulinum toxin resemble each other in both biosynthesis and molecular organization. Thus, tetanus toxin and botulinum toxin type A are 34% identical throughout the protein sequence and 62% identical in some functional domains.

본 발명의 일 구체예에서 “아세틸콜린”이란, 콜린과 아세트산의 에스테르로 처음으로 발견된 신경전달물질로, 뉴런 전체에 분포하며 화학식은 C7H16NO2, 분자량은 146.21 이다.In one embodiment of the invention a "Acetylcholine" means, a neurotransmitter first discovered as an ester of acetic acid and choline substance, distributed over the neurons, and the formula is C 7 H 16 NO 2, molecular weight of 146.21.

몇몇 신경조절물질이 동일한 뉴런에 의해 방출될 수 있는 것을 제시하는 증거가 있지만, 전형적으로 포유류 신경계에서는, 각각의 형태의 뉴런에 의해서 단일 형태의 작은 분자 신경전달물질만이 방출된다. 이 신경전달물질 아세틸콜린은 뇌의 여러 부위의 뉴런, 특히, 운동피질의 큰 피라미드 세포, 대뇌핵의 몇 가지 상이한 뉴런, 골격근에 분포하는 운동 뉴런, 자율신경계(교감신경계 및 부교감신경계 모두)의 신경절이전 뉴런, 근방추 섬유의 bag 1 섬유, 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 뉴런 몇가지에 의해서 분비된다. 본래, 대부분의 교감신경계의 신경절이후 뉴런은 신경전달물질인 노르에피네프린을 분비하는데 비하여, 땀샘, 기모근 및 몇몇 혈관으로의 신경절이후 교감신경 섬유만이 콜린성이다. 대부분의 경우, 아세틸콜린은 흥분효과를 나타낸다. 그러나, 아세틸콜린이 몇몇 말초 부교감신경 말단에서는 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 미주신경에 의한 심장박동의 억제). 자율신경계의 원심성 신호는 교감신경계 또는 부교감신경계를 통하여 몸에 전달된다. 교감신경계의 신경절이전 뉴런은 척수의 중간외측각에 위치하는 신경절이전 교감 뉴런 세포체로부터 뻗어 나온다. 세포체로부터 뻗어 나온 신경절이전 교감신경 섬유는, 척추주위 교감 신경절 또는 척추전 신경절에 위치하는 신경절이후 뉴런과 시냅스를 이룬다. 교감신경계 및 부교감신경계의 신경절이전 뉴런은 모두 콜린성이므로, 신경절에 아세틸콜린을 적용하면 교감 및 부교감 신경절이후 뉴런을 흥분시킬 것이다. 아세틸콜린은 두가지 형태의 수용체, 무스카린성 수용체 및 니코틴성 수용체를 활성화시킨다. 무스카린성 수용체는 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 콜린성 뉴런에 의해서 자극된 모든 효과기(effector) 세포에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 부신 수질뿐 아니라, 교감신경계 및 부교감신경계 모두의 신경절이전과 신경절이후 뉴런 사이의 시냅스에서 신경절이후 뉴런의 세포 표면에 있는 자율신경절 내에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 또한 많은 비자율 신경말단, 예를 들어, 신경근육 접합부의 골격근 섬유의 막에서 발견된다. 아세틸콜린은, 작고 투명한, 세포내 소포가 시냅스전 뉴런성 세포막과 융합될 때, 콜린성 뉴런으로부터 방출된다. 부신수질(또한, PC12 세포라인) 및 췌장의 섬세포과 같은, 광범위한 비-뉴런성 분비 세포는 큰 고밀도 중심 소포(large densecore vesicle)로부터 각각 카테콜아민 및 부갑상선 호르몬을 방출한다. PC12 세포라인은 교감신경부신 발달(sympathoadrenal develpoment) 연구를 위한 조직 배양 모델로서 광범위하게 사용되는 랫드 크롬친화성세포종 세포의 클론이다. 탈신경된 세포에 독소를 투과 가능하게 하거나(전기충격법 등에 의해서), 직접 주사하면, 보툴리눔 독소는 in vitro에서 두 가지 세포종류 모두에서 두 가지 화합물 종류의 방출을 모두 억제한다. 보툴리눔 독소는 또한 피질의 시냅토솜 세포 배양물로부터 신경전달물질인 글루타메이트가 방출되는 것을 억제하는 것으로 알려져 있다. 신경근육 접합부는 근육세포의 주변 축색돌기에 의해서 골격근에서 형성된다. 신경계를 통하여 전달된 신호는 말단 축색돌기에서 작용 전위가 되고, 이온 채널을 활성화하며, 그 결과로 예를 들어, 신경근육 접합부의 운동 종판에서, 뉴런내 시냅스성 소포로부터 신경전달물질인 아세틸콜린이 방출된다. 아세틸콜린은 세포외 공간을 가로질러 근육 종판 표면의 아세틸콜린 수용체 단백질과 결합한다. 일단 충분하게 결합되면, 근육 세포의 작용 전위가 특이적인 막 이온 채널 변화를 일으키고, 그 결과로 근육세포가 수축한다. 그리고 나서, 아세틸콜린은 근육세포로부터 방출되어, 세포외 공간에서 콜린에스테라아제에 의해서 대사된다. 대사생성물은 다시 아세틸콜린으로 재생하기 위해서 말단 축색돌기로 다시 회수된다.There is evidence to suggest that some neurotransmitter can be released by the same neuron, but typically in the mammalian system, only a single form of small molecule neurotransmitter is released by each type of neuron. This neurotransmitter, acetylcholine, is involved in the neurons of various parts of the brain, especially the large pyramidal cells of the motor cortex, several different neurons of the cerebral nucleus, motor neurons distributed in the skeletal muscle, ganglia of the autonomic nervous system (both sympathetic and parasympathetic) Previous neurons, bag 1 fibers of the spinal fibers, postganglionic neurons of the parasympathetic nervous system, and some postnegative neurons of the sympathetic nervous system. Originally, most post-ganglion neurons in the sympathetic nervous system secrete norepinephrine, norepinephrine, whereas only the sympathetic nerve fibers after the ganglion to the sweat glands, the paraplegia and some blood vessels are cholinergic. In most cases, acetylcholine exhibits an exciting effect. However, it is known that acetylcholine has an inhibitory effect on some peripheral parasympathetic nerve terminals (e. G., Inhibition of vasopressing by the vagus nerve). The efferent signal of the autonomic nervous system is transmitted to the body through the sympathetic or parasympathetic nervous system. The preganglionic neurons of the sympathetic nervous system extend from the ganglion neuron cell body located at the medial lateral angle of the spinal cord. The preganglionic sympathetic nerve fibers extending from the cell body synapse with the posterior ganglion neurons located in the perierves sympathetic ganglia or the spinal ganglia. Because the preganglionic neurons of the sympathetic and parasympathetic nerves are all cholinergic, applying acetylcholine to the ganglia will excite neurons after sympathetic and parasympathetic ganglia. Acetylcholine activates two types of receptors, muscarinic receptors and nicotinic receptors. Muscarinic receptors are found in all effector cells stimulated by post-ganglion neurons of the parasympathetic nervous system and post-ganglionic cholinergic neurons of the sympathetic nervous system. Nicotinic receptors are found in the autonomic ganglia on the cell surface of postganglionic neurons in synapses between preganglionic and postganglionic neurons as well as adrenal medulla, both sympathetic and parasympathetic. Nicotinic receptors are also found in the membranes of many non-autonomic nerves, for example skeletal muscle fibers of neuronal junctions. Acetylcholine is released from cholinergic neurons when small, clear, intracellular vesicles fuse with pre-synaptic neuronal cell membranes. Extensive non-neuronal secretory cells, such as the adrenal medulla (also the PC12 cell line) and pancreatic islet cells, release catecholamines and parathyroid hormones from large, large densecore vesicles, respectively. The PC12 cell line is a clone of rat chromaffin cell line extensively used as a tissue culture model for the study of sympathoadrenal develpoment. Botulinum toxin inhibits the release of both types of compounds in both cell types in vitro by allowing the toxin to permeate into the denervated cells (by electroporation) or by direct injection. Botulinum toxin is also known to inhibit the release of glutamate, a neurotransmitter, from synaptosomal cell cultures of the cortex. The neuromuscular junction is formed in the skeletal muscle by the peripheral axons of muscle cells. Signals transmitted through the nervous system become action potentials in the distal axons and activate the ion channels. As a result, for example, in the motor end plate of the neuromuscular junction, the neurotransmitter acetylcholine from neuronal synaptic vesicles . Acetylcholine binds to the acetylcholine receptor protein on the surface of the muscle endplate across the extracellular space. Once fully conjugated, the action potential of the muscle cell causes a specific membrane ion channel change, which results in muscle cell contraction. The acetylcholine is then released from the muscle cells and metabolized by the cholinesterase in the extracellular space. Metabolite products are recovered again as apical axons for regeneration with acetylcholine.

본 발명의 일 구체예에서 “독소의 활성”이란, 표준 검정 방식인 마우스 LD50 생물검정(mLD50)으로 측정하였을 때, 1U(1 unit)의 보툴리눔 독소가 18-20g 중량 쥐의 50% 치사율을 나타내는 것으로, 보툴리눔 독소가 갖는 고유의 역가(potency)를 의미한다. 상기 보툴리눔 독소, 특히 보툴리눔 독소 세로타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제로서, 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브라 독(cobra toxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이므로, 보툴리눔 독소에서 약 20%의 역가 차이는 디프테리아 3.6억배, 또는 콜레라 240만배와 같은 현저한 효과 차이를 야기한다.In one embodiment of the present invention, &quot; activity of a toxin &quot; means that 1U (1 unit) of botulinum toxin has a 50% mortality rate of 18-20g weight rats when measured by a mouse LD50 bioassay (mLD50) Quot; means the inherent potency of the botulinum toxin. The botulinum toxin, especially botulinum toxin type A, is the most deadly natural biologic agent known to humans. It is 1.8 billion times greater than diphtheria, 600 million times more than sodium cyanide, 30 million times more than cobra toxin, One million times more lethal, the approximately 20% potency difference in botulinum toxin results in significant differences in efficacy such as Diphtheria 3.6 million times, or cholera 2.4 million times.

의학 또는 미용 목적의 보툴리눔 독소 제제는 통상적으로 동결 건조, 또는 액상 제형으로 유통되는데, 보툴리눔 독소 자체가 단백질이므로 온도, pH, 빛, 물리적 충격, 또는 gas(공기, 질소, 산소 등)에 의해 활성이 매우 불안정한 문제점이 있다. 이와 같이 보툴리눔 독소의 역가가 감소되는 경우에는 보툴리눔 독소에 의한 기대 효과를 나타내기 어려우므로, 제조단계, 또는 사용단계에서 보툴리눔 독소의 역가를 정확하게 예측하는 것이 반드시 필요하다.The botulinum toxin preparation for medical or cosmetic purposes is usually distributed in a lyophilized or liquid form. Since the botulinum toxin itself is a protein, its activity is affected by temperature, pH, light, physical impact, or gas (air, nitrogen, There is a very unstable problem. As such, when the potency of the botulinum toxin decreases, it is difficult to predict the expected effect of the botulinum toxin. Therefore, it is necessary to accurately predict the potency of the botulinum toxin at the stage of production or use.

본 발명의 일 구체예에서 “항체(antibody)” 란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 SNAP25 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체 항체, 단일 클론 항체, 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의　항체는 경쇄(Light chain) 및 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.&Quot; Antibody &quot; in one embodiment of the present invention refers to a specific protein molecule, as is known in the art, directed to an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a SNAP25 protein, and such antibodies can be prepared by conventional methods. The antibody of the present invention also includes partial peptides that can be made from the protein, and the partial peptides of the present invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, and more preferably 12 amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and any polyclonal antibody, monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof may be included in the antibody of the present invention and include all immunoglobulin antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies. The antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms with light and heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.

본 발명의 일 구체예에서 “키트(kit)”란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는　보툴리눔 독소의 활성을 측정하기 위해서 SNAP25FL 또는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체가 포함하거나, 상기 항체가 포함된 조성물이 포함하거나, 또는 상기 항체가 코팅된 세포 배양용 접시가 포함될 수 있다.In one embodiment of the invention, a &quot; kit &quot; refers to a collection of compositions and accessories necessary for a particular purpose. For purposes of the present invention, the kit of the present invention comprises or comprises an antibody that specifically binds to SNAP25 FL or SNAP25 197 to measure the activity of the botulinum toxin, or the composition comprises the antibody May be included.

본 발명의 일 구체예에서, SNAP25(Synaptosomal nerve-associated protein 25)에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 SNAP25는 SNAP25FL 또는 SNAP25197인 것이고, 상기 항체는 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 11 내지 13, 28 내지 33, 및 55 내지 56로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나이고, 중쇄 CDR2 영역은 서열번호 14 내지 16, 34 내지 39, 및 57 내지 58로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나이며, 중쇄 CDR3 영역은 서열번호 17 내지 19, 40 내지 46, 및 59 내지 60으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나이며, 경쇄 CDR1 영역은 서열번호 20 내지 22, 47 내지 49, 및 61 내지 62로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나이며, 경쇄 CDR2 영역은 서열번호 23 내지 24, 50 내지 51, 및 63 내지 64로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나이며, 경쇄 CDR3 영역은 서열번호 25 내지 27, 52 내지 54, 및 65 내지 66으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 항체를 제공한다.In one embodiment of the present invention, the antibody that specifically binds to SNAP25 (SNAP25) is SNAP25 FL or SNAP25 197 , wherein the heavy chain CDR1 region is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-13, 28 to 33, and 55 to 56, and the heavy chain CDR2 region is any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14 to 16, 34 to 39, and 57 to 58, and the heavy chain CDR3 The light chain CDR1 region is any one selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 17 to 19, 40 to 46, and 59 to 60, and the light chain CDR1 region is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 20 to 22, 47 to 49, and 61 to 62 The light chain CDR2 region is any one selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 23 to 24, 50 to 51, and 63 to 64, and the light chain CDR3 region is any one selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 27, 52 to 54, and 65 to 66. The antibody according to any one of &lt; 1 &gt;

보다 구체적으로, 상기 항체는 SNAP25FL에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 11, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 14, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 17, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 20, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 23, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 25로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 83, 및 84로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.More specifically, the antibody specifically binds to SNAP25 FL , wherein the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 11, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 14, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 17, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: It is preferable that the light chain CDR2 region is the SEQ ID NO: 23 and the light chain CDR3 region is the antibody represented by SEQ ID NO: More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 83 and 84, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25FL에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 12, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 15, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 18, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 21, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 24, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 26으로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 87, 및 88로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.The antibody specifically binds to SNAP25 FL , wherein the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 12, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 15, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 18, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: SEQ ID NO: 24, and light chain CDR3 region are preferably the antibody represented by SEQ ID NO: 26. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NOS: 87 and 88, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25FL에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 13, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 16, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 19, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 22, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 24, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 27로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 89, 및 90으로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.The antibody specifically binds to SNAP25 FL , wherein the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 16, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 19, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, and light chain CDR3 region are preferably the antibodies represented by SEQ ID NO: 27. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 89 and 90, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 28, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 34, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 40, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 47, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 71, 및 72로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 28, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 34, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 40, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 47, a light chain CDR2 region And the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 52. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 71 and 72, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 29, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 35, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 41, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 48, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 73, 및 74로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 29, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 35, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 41, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 48, a light chain CDR2 region And the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 52. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NOs: 73 and 74, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 29, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 36, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 42, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 47, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 75, 및 76으로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 29, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 36, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 42, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 47, a light chain CDR2 region And the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 52. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 75 and 76, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 33, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 35, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 43, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 48, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 77, 및 78로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 33, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 35, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 43, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 48, a light chain CDR2 region And the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 52. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 77 and 78, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 30, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 37, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 44, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 48, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 79, 및 80으로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 30, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 37, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 44, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 48, a light chain CDR2 region And the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 52. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 79 and 80, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 31, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 38, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 45, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 47, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 53으로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 81, 및 82로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 31, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 38, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 45, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 47, a light chain CDR2 region And the light chain CDR3 region is the antibody represented by SEQ ID NO: 53. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NO: 81 and 82, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 32, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 39, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 46, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 49, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 51, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 54로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 85, 및 86으로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 197, heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 32, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 39, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 46, a light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 49, a light chain CDR2 region SEQ ID NO: 51, and light chain CDR3 region is preferably an antibody represented by SEQ ID NO: 54. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NOS: 85 and 86, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25FL 및 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 55, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 57, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 59, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 61, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 63, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 65로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 67, 및 68로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody is an antibody specifically binding to SNAP25 FL and SNAP25 197, a heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 55, a heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 57, a heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 59, a light chain CDR1 region SEQ ID NO: 61, It is preferable that the light chain CDR2 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 63 and the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 65. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NOS: 67 and 68, but is not limited thereto.

또한 상기 항체는 SNAP25FL 및 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체로서, 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 56, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 58, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 60, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 62, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 64, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 66으로 표시되는 항체인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 69, 및 70으로 표시되는 항체일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.In addition, the antibody specifically binds to SNAP25 FL and SNAP25 197 , wherein the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 56, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 58, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 60, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: It is preferable that the light chain CDR2 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 64 and the light chain CDR3 region is an antibody represented by SEQ ID NO: 66. More specifically, the antibody may be an antibody represented by SEQ ID NOS: 69 and 70, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 항체를 포함하는 항체 조성물, 상기 항체로 코팅된 배양접시, 또는 상기의 항체 조성물이나 배양접시를 포함하는 키트를 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided an antibody composition comprising the antibody, a culture dish coated with the antibody, or a kit comprising the antibody composition or the culture dish.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 항체를 생산 가능한 하이브리도마 세포를 제공하고, 상기 하이브리도마 세포는 서열번호 1 내지 10으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 주사된 마우스의 비장세포와 골수종 세포가 융합된 것인 하이브리도마 세포를 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided a hybridoma cell capable of producing the above antibody, wherein the hybridoma cell is a mouse wherein at least one peptide selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 10 Wherein the spleen cells and the myeloma cells are fused.

본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 신경세포에 보툴리눔 독소를 처리하는 단계; 및, (b) 상기 신경세포에 서열번호 67 내지 90으로 표시되는 항체 중 어느 하나 이상의 항체로 SNAP25FL 또는 SNAP25197을 측정하는 단계;를 포함하는 보툴리눔 독소의 활성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 활성을 결정하는 방법을 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided a method of treating a neurological disorder comprising: (a) treating a neuron with a botulinum toxin; And (b) measuring SNAP25 FL or SNAP25 197 with at least one of the antibodies represented by SEQ ID NOS: 67 to 90 in the neuron, wherein the activity of the botulinum toxin is determined by: Wherein the botulinum toxin is a botulinum toxin type A. &lt; Desc / Clms Page number 12 &gt;

본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 신경세포에 목적하는 시료를 처리하는 단계; (b) 상기 신경세포에 서열번호 67 내지 82, 서열번호 85, 또는 서열번호 86으로 표시되는 항체 중 어느 하나 이상의 항체로 SNAP25197을 측정하는 단계; 및, (c) SNAP25197이 측정되는 경우에 상기 시료에 보툴리눔 독소가 존재한다고 판단하는 단계;를 포함하는 보툴리눔 독소의 검출 방법을 제공하고, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 검출 방법을 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided a method of treating a neuronal cell, comprising: (a) treating a neural cell with a sample of interest; (b) measuring the SNAP25 197 to any one or more antibodies of the antibody shown in SEQ ID NO: 67 to 82, SEQ ID NO: 85, or SEQ ID NO: 86 to the nerve cells; And (c) determining that a botulinum toxin is present in the sample when SNAP25 197 is measured, wherein the botulinum toxin is botulinum toxin type A, A method for detecting toxins is provided.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

최근 의료 및 미용 목적에서의 보툴리눔 독소 수요가 급격히 증가하고 있으나, 보툴리눔 독소의 역가 측정을 위한 안정적으로 재현성 높은 세포 기반 역가 분석법이 부재한 실정이다. 보툴리눔 독소는 매우 강력한 신경독 단백질이므로, 정밀한 세포 기반 역가 측정을 위해 무엇보다 특이성 및 감수성이 높은 항체의 개발이 요구된다.Recently, there has been a rapid increase in demand for botulinum toxin for medical and cosmetic purposes, but there is no stable reproducible cell-based potency assay for the measurement of potency of botulinum toxin. Because botulinum toxin is a very powerful neurotoxin protein, the development of antibodies with high specificity and sensitivity is required for precise cell-based titration.

본 발명은 보툴리눔 독소 활성 검정용 항체, 및 이를 포함하는 항체 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 항체는 ①SNAP25FL, ②SNAP25197, 또는 ③SNAP25FL, 및 SNAP25197에 결합 특이성을 가지는 단일 클론 항체로서 특이성 및 감수성이 현저히 우수하므로, 제약 및 미용 분야에서 활발하게 이용될 것으로 기대된다.The present invention relates to an antibody composition comprising an antibody, and for botulinum toxin activity assay this, the botulinum toxin antibody according to the present invention is a monoclonal antibody having a binding specificity to ①SNAP25 FL, ②SNAP25 197, or ③SNAP25 FL, and SNAP25 197 It is expected to be used actively in the field of pharmaceuticals and cosmetics since it has remarkably excellent specificity and sensitivity.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 합성 펩타이드를 이용한 단일 클론, 또는 다클론 항체 항체 생성을 위한 SNAP25 항원 펩타이드의 위치를 표시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단일 클론 항체 제조를 위한 하이브리도마 세포 형성, 및 스크리닝 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 단일 클론 항체 제조를 위해 ELISA를 이용한 초기 하이브리도마 세포 스크리닝의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 초기 하이브리도마 세포 스크리닝의 결과로부터 단일세포 클론 제조를 위해 세포를 재선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단일세포 클론 제조를 위한 2차 재선별 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 단일세포 클론 제조를 위한 3차 재선별 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 다클론 항체 항체 제조를 위한 토끼 혈청 단백질로부터 분리된 IgG의 패턴을 나타낸 것이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조한 단일 클론 항체의 동역학 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조한 단일 클론 항체를 단계적으로 희석된 재조합 GST-SNAP25와 결합/해리시켜 동역학 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조한 단일 클론 항체의 항원 결합 특이성을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조한 단일 클론 항체를 HRP 접합시킨 후, 항원 결합 특이성을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조한 단일 클론 항체를 바이오틴과 접합시킨 후, SDS-PAGE에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조한 다클론 항체 항체를 AP와 가교 결합시킨 후, SDS-PAGE에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing the position of a SNAP25 antigen peptide for producing a monoclonal or polyclonal antibody antibody using a synthetic peptide according to an embodiment of the present invention.
2 is a schematic diagram illustrating hybridoma cell formation and screening for monoclonal antibody production according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the results of an initial hybridoma cell screening using an ELISA for the production of monoclonal antibodies, according to one embodiment of the present invention.
Figure 4 shows the results of re-selection of cells for the production of single cell clones from the results of initial hybridoma cell screening, according to one embodiment of the present invention.
FIG. 5 shows the result of secondary screening for the production of a single cell clone, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 shows results of third-order screening for single cell clone production according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows a pattern of IgG isolated from rabbit serum protein for the production of polyclonal antibody antibodies, according to one embodiment of the present invention.
FIG. 8 shows the results of the kinetic analysis of monoclonal antibodies prepared in the present invention, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 shows the results of a kinetic analysis of a monoclonal antibody prepared according to an embodiment of the present invention by binding / dissociation with a stepwise diluted recombinant GST-SNAP25.
FIG. 10 shows the result of Western blotting of the antigen binding specificity of the monoclonal antibody prepared in the present invention, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 11 shows the result of HRP-conjugation of a monoclonal antibody prepared in the present invention and Western blotting of antigen binding specificity according to an embodiment of the present invention.
FIG. 12 shows the result of SDS-PAGE electrophoresis after conjugating the monoclonal antibody prepared in the present invention with biotin according to an embodiment of the present invention.
FIG. 13 shows the result of SDS-PAGE electrophoresis after cross-linking the polyclonal antibody antibody prepared in the present invention with AP according to an embodiment of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예.Examples.

제조예 1. 항체 제조용 재료의 준비Preparation Example 1. Preparation of materials for producing antibodies

본 발명에서 사용된 재료를 하기 표 1에 기재하였다.The materials used in the present invention are shown in Table 1 below.

재료명Name of material 재료정보Material Information 2-머켑토에탄올(2-mercaptoethanol)2-mercaptoethanol &lt; / RTI &gt; Sigma M3148Sigma M3148 4-요오드페닐보론산(4-iodopheylboronic acid)4-iodophenylboronic acid Sigma 471933Sigma 471933 10x TBS10x TBS BIO-RAD 170-6435BIO-RAD 170-6435 10x Tris/글라이신/SDS 완충액10x Tris / glycine / SDS buffer Bio-Rad 161-0772Bio-Rad 161-0772 12% Mini-PROTEAN® TGXTM 12% Mini-PROTEAN® TGX TM Bio-Rad 456-1046Bio-Rad 456-1046 아세트산(acetic acid)Acetic acid Merck 100063Merck 100063 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)Alkaline phosphatase (alkaline phosphatase) Sigma P0114Sigma P0114 AMICON Ultra-15, Ultracel 30KAMICON Ultra-15, Ultracel 30K Millipore UFC903024Millipore UFC903024 100x 항생제 항균제 용액100x Antibiotic Antimicrobial Solution Sigma A5955Sigma A5955 브로모페놀블루(bromophenol blue)Bromophenol blue Sigma B0126Sigma B0126 DMEMDMEM GibcoTM 11995065Gibco TM 11995065 DMSODMSO Sigma D2650Sigma D2650 DMSODMSO Sigma 472301Sigma 472301 EZ-link NHS-PEG4-BiotinEZ-link NHS-PEG 4 -Biotin Thermo Fisher Scientific 21329Thermo Fisher Scientific 21329 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)Ethylene glycol sigma 324558sigma 324558 소 태아 혈청(fetal bovine serum)Fetal bovine serum YI Frontier US-FBS-500YI Frontier US-FBS-500 글리세롤(glycerol)Glycerol Affymetrix USB 16374Affymetrix USB 16374 글라이신(glycine)Glycine Bioshop GLN001Bioshop GLN001 글루타르알데하이드 용액(glutaraldehyde solution)A glutaraldehyde solution (glutaraldehyde solution) Sigma G7651Sigma G7651 HRP(horseradish peroxidase)HRP (horseradish peroxidase) Sigma P6782Sigma P6782 과산화수소수(hydrogen peroxide solution)Hydrogen peroxide solution sigma 216763sigma 216763 루미놀(luminol)Luminol sigma 123072sigma 123072 염화마그네슘(magnesium chloride)Magnesium chloride &lt; RTI ID = 0.0 &gt; Sigma M8266Sigma M8266 100x MEM non-essential amino acid100x MEM non-essential amino acid GibcoTM 11140050Gibco TM 11140050 메탄올(methanol)Methanol Merck 106009Merck 106009 PCR® STRIP TUBEPCR® STRIP TUBE Axygen PCR-0208-CP-CAxygen PCR-0208-CP-C 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인A polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Millipore ISEQ00010Millipore ISEQ00010 염화칼륨(potassium chloride)Potassium chloride Sigma P9333Sigma P9333 Precision plus proteinTM dual color standardsPrecision plus protein TM dual color standards Bio-Rad 1610374Bio-Rad 1610374 SDS 용액 20% (w/v)SDS solution 20% (w / v) Bio-Rad 161-0418Bio-Rad 161-0418 스킴밀크(skim milk)Skim milk BD DifcoTM 232-100BD Difco TM 232-100 초산나트륨(sodium acetate)Sodium acetate Sigma W302406Sigma W302406 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)Sodium bicarbonate Sigma S6014Sigma S6014 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)Sodium borohydride &lt; RTI ID = 0.0 &gt; Sigma 452882Sigma 452882 염화나트륨(sodium chloride)Sodium chloride Merck 106404Merck 106404 (메타)과옥소산염(sodium (meta)periodate)(Meta) and sodium (meta) periodate) Sigma S1878Sigma S1878 제1인산나트륨(sodium phosphate monobasic)Sodium phosphate monobasic &lt; RTI ID = 0.0 &gt; Sigma S5011Sigma S5011 제2인산나트륨 (sodium phosphate dibasic)Sodium phosphate dibasic &lt; RTI ID = 0.0 &gt; Sigma S7907Sigma S7907 3수화물 주석산 나트륨(sodium stannate trihydrate)Sodium stannate trihydrate &lt; RTI ID = 0.0 &gt; sigma 336262sigma 336262 테트라부틸암모늄 붕화수소(tetrabutylammonium borohydride)Tetrabutylammonium borohydride &lt; / RTI &gt; sigma, 230170sigma, 230170 T75 플라스크T75 flask SPL 70375SPL 70375 T175 플라스크T175 Flask SPL 74175SPL 74175 TrisTris Bioshop TRS001Bioshop TRS001 염화아연(zinc chloride)Zinc chloride Sigma 229997Sigma 229997

제조예 2. 항체 제조 방법의 세팅Preparation Example 2. Setting of antibody preparation method

제조예 2-1. 합성 펩티드를 이용한 단일 클론, 또는 다클론 항체 항체의 생성Production Example 2-1. Generation of monoclonal, or polyclonal antibody antibodies using synthetic peptides

합성 펩타이드는 도 1에 모식도를 기재한 바와 같이 C-, 또는 N- 말단을 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin; KHL)과 접합시켰다. 이를 위해, 첫번째로 토끼 두마리를 폴리펩타이드 항원으로 면역화시켜 다클론 항체 혈청을 생성시키고, 초기 주사 후 6주 동안 주기적으로 부스팅시켰다. 토끼의 혈청을 수득하여 웨스턴 브랏팅, 및 ELISA 분석으로 반응성과 특이성을 시험하고, -80 ℃에서 보관하였다. 두번째로 단일 클론 항체를 생성하기 위해 네 마리의 마우스에게 펩티드 항원을 주사하고, 마우스의 비장 세포를 채취하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 형성시킨 후, 도 2에 나타낸 바와 같이 단일 세포 클론 선택을 3 회 수행하였다. 간략하게, 펩타이드 항원을 사용하는 ELISA로 먼저 하이브리도마를 스크리닝한 후, 재조합 SNAP25 단백질(GST-SNAP25FL, 및 GST-SNAP25197), 또는 신경세포(SiMa)로부터 유래된 전체 세포 용해물을 이용한 웨스턴 블랏팅 분석으로 스크리닝하였다. 항체 생산을 위한 하이브리도마는 항체 생산에 이용될 때까지 액체 질소에서 보존하였다.The synthetic peptides were conjugated with C- or N-terminus as keyhole limpet hemocyanin (KHL) as shown in the schematic diagram in Fig. To do this, two rabbits were first immunized with polypeptide antigens to generate polyclonal antibody sera and periodically boosted for 6 weeks after the initial injection. The rabbit serum was obtained and tested for reactivity and specificity by Western blotting and ELISA analysis and stored at -80 ° C. Second, to generate monoclonal antibodies, four mice were injected with peptide antigens, and mouse spleen cells were collected and fused with myeloma cells to form hybridomas. Then, single-cell clone selection Was performed three times. Briefly, hybridomas were first screened with an ELISA using peptide antigens followed by the use of whole cell lysates derived from recombinant SNAP25 proteins (GST-SNAP25 FL and GST-SNAP25 197 ) or neurons (SiMa) And screened by Western blotting analysis. Hybrids for antibody production were preserved in liquid nitrogen until used for antibody production.

제조예 2-2. SNAP25-친화성 컬럼의 제조Production Example 2-2. Preparation of SNAP25-affinity column

재조합 SNAP25197을 AMICON Ultra-15 튜브를 이용하여 4℃, 1000x g(중력)에서 10분간 원심분리하고, 나노 분광광도계(Nano spectrophotometer, Drawell Scientific Instrument Co., Ltd, Shanghai)로 단백질 농도를 측정하여 10㎎/㎖로 농축하였다. AMICO Ultra-15 내에서 3㎖로 분액한 SNAP25197을 12㎖의 커플링 완충액(coupling buffer, 0.1 M HEPES, pH 7.5, 0.1 M NaCl)과 혼합한 후 1000x g에서 원심 분리하여 재농축하고, 완충액 교환을 6 회 반복한 후, 탈이온수(deionized H2O)에 용해한 Affi-Gel 15(Bio-Rad) 슬러리 1㎖을 첨가하였다. 이를 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 4℃, 1000x g에서 10분간 원심분리하여 Affi-Gel 15를 농축하였다. 상기 SNAP25197-접합된 Affi-Gel 15(SNAP25- AffiGel)를 10㎖의 10 mM 에탄올아민 염산염(pH 8.0)에 재현탁시키고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 1x PBS로 세척하고, 사용 전까지 0.2% 아지드화 나트륨을 포함하는 1x PBS에서 저장하였다.Recombinant SNAP25 197 was centrifuged for 10 minutes at 4 ° C and 1000xg (gravity) using an AMICON Ultra-15 tube, and the protein concentration was measured with a nano spectrophotometer (Drawell Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai) And concentrated to 10 mg / ml. SNAP25 197 fractionated into 3 ml in AMICO Ultra-15 was mixed with 12 ml of coupling buffer (0.1 M HEPES, pH 7.5, 0.1 M NaCl), centrifuged at 1000 x g for re-concentration, after the exchange was repeated six times, it was added to the Affi-Gel 15 (Bio-Rad ) slurry 1㎖ dissolved in deionized water (deionized H 2 O). After stirring at room temperature for 1 hour, Affi-Gel 15 was concentrated by centrifugation at 1000 x g for 10 minutes at 4 ° C. The SNAP25 197 -conjugated Affi-Gel 15 (SNAP25-AffiGel) was resuspended in 10 ml of 10 mM ethanolamine hydrochloride (pH 8.0) and reacted at room temperature for 1 hour. Then washed with 1x PBS and stored in 1x PBS containing 0.2% sodium azide until use.

제조예 2-3. 다클론 항체 항체의 정제Production Example 2-3. Purification of Polyclonal Antibody Antibodies

토끼 혈청을 10mM Tris-HCl(pH 7.5)로 10배 희석시키고, 4℃에서 10,000x g로 10 분간 원심분리하였다. 이를 0.45㎛ 기공의 필터(Nalgene™)로 여과한 후, 정화된 혈청 희석액을 SNAP25-AffiGel에 3회 통과시켰다. 상기 SNAP25-AffGel을 20 CV(10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 및 0.5 M NaCl)로 세척하고, 결합된 단백질을 0.1 M sodium acetate(pH 5.5), 0.1 M glycine(pH 4.0), 0.1 M glycine(pH 2.5), 및 0.1 M trimethylamine(pH 11.5)의 12 CV로 순차적으로 용출시켰다. 용출 과정 동안, 단백질 시료는 0.1㎖의 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 수집하였다. 단백질을 함유한 피크 분획을 수집하여 1㎖의 AMICON Ultra-15로 농축하고, 90분마다 1x PBS와 10% 글리세롤 (0.5L)로 4회 여막한 후, SDS-PAGE와 ELISA로 분석하였다.The rabbit serum was diluted 10-fold with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes at 4 占 폚. This was filtered through a 0.45 μm pore filter (Nalgene ™) and the purified serum diluent was passed three times through SNAP25-AffiGel. The SNAP25-AffGel was washed with 20 CV (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 0.5 M NaCl) and the bound protein was eluted with 0.1 M sodium acetate (pH 5.5), 0.1 M glycine glycine (pH 2.5), and 12 CV of 0.1 M trimethylamine (pH 11.5). During the elution procedure, the protein samples were collected with 0.1 ml of 1 M Tris-HCl (pH 8.0). Protein-containing peak fractions were collected, concentrated with 1 mL of AMICON Ultra-15, and quenched four times with 1x PBS and 10% glycerol (0.5 L) every 90 min and analyzed by SDS-PAGE and ELISA.

제조예 2-4. 항체와 HRP(horseradish peroxidase) 접합Production Example 2-4. Antibody and HRP (horseradish peroxidase) junction

HRP와의 접합을 위해, AMICON Ultra-15를 사용하여 4℃에서 10,00x g로 15분간까지 원심분리를 반복하되, 각각의 원심분리 말기에 과량의 접합 완충액(0.1M NaHCO3, pH 9.5, 0.9 % NaCl)을 충분히 공급하는 방법으로 정제된 B4 또는 C16 IgG를 10㎎/㎖로 농축하였다. HRP는 5㎎을 1.2㎖의 탈이온수에 용해하고, 이를 10mM 인산 나트륨(pH 7.0)에 용해한 0.1 M 과옥소산염 0.3㎖과 혼합하였다. 상온에서 20분간 반응시킨 후에, HRP 용액을 4℃에서 1 mM 아세트산 나트륨(pH 4.0)으로 6시간동안 여막을 4회 진행하였다. 이후 5㎎의 농축된 항체와 동량의 반응성 HRP를 혼합하고, 상온 암소에서 2시간 동안 반응시켰다. 접합 반응은 0.1㎖의 수소화붕소나트륨(4㎎/㎖ in 탈이온수)를 첨가하여 정지시켰고, HRP-항체 접합체를 Pur-A-Lyzer Maxi 50000을 이용해서 4℃에서 1시간 간격으로 1x PBS 3회, 및 1x PBS/50% 글리세롤 1회 여막하였다. HRP-항체 접합체는 사용 전까지 4℃에서, 보관이 장기화될 경우 -80℃에서 저장하였다.For the conjugation with HRP, centrifugation was carried out at 4 ° C and 10,00x g for 15 minutes using AMICON Ultra-15, and an excess amount of conjugation buffer (0.1 M NaHCO 3 , pH 9.5, 0.9 % NaCl) was concentrated and the purified B4 or C16 IgG was concentrated to 10 mg / ml. 5 mg of HRP was dissolved in 1.2 mL of deionized water and mixed with 0.1 M of the solution dissolved in 10 mM sodium phosphate (pH 7.0) and 0.3 mL of oxalate. After reacting at room temperature for 20 minutes, the HRP solution was treated 4 times at 4 ° C with 1 mM sodium acetate (pH 4.0) for 6 hours. Then, 5 mg of the concentrated antibody and the same amount of reactive HRP were mixed and reacted for 2 hours at room temperature. The conjugation reaction was stopped by adding 0.1 ml of sodium borohydride (4 mg / ml in deionized water) and the HRP-antibody conjugate was washed with 1 x PBS 3 times at 1 hour intervals at 4 ° C using Pur- , And 1x PBS / 50% glycerol once. HRP-antibody conjugates were stored at 4 ° C until use and at -80 ° C when storage was prolonged.

제조예 2-5. 활성화된 바이오틴(biotin)과의 항체 접합Production Example 2-5. Antibody conjugation with activated biotin

1㎎/㎖의 A15 IgG를 Pur-A-Lyzer Maxi 20000으로 전이하고, 4℃ 암소에서 1시간 간격으로 반응성 완충액(0.1 M 인산염, pH 7.2, 및 0.15 M NaCl)으로 4회 여막하였다. 활성화된 바이오틴(EZ-Link NHS-PEG4-Biotin, 10 mM in the reaction buffer)을 50 μg 액분된 A15 IgG과 혼합하여 최종 농도 0.1 mM, 0.25 mM, 또는 0.5 mM가 되도록 준비하고, 이를 100㎕ 반응성 완충액과 혼합하여 4℃ 암소에서 2시간 동안 반응시켰다. 2㎕의 0.1 M 글라이신을 첨가하고, 혼합액을 4℃에서 1시간 간격으로 1x PBS 3회, 및 1x PBS/50% 글리세롤 1회 여막한 후, 사용 전까지 -20℃에서 저장하였다. IgG의 바이오틴화 정도를 Pierce Biotin Quantitation Kit (Thermo Scientific 28005)로 검정하였고, 바이오틴화 IgG(biotinylated IgG)의 반응성 및 특이성을 샌드위치 ELISA로 검사하였다.1 mg / ml of A15 IgG was transferred to Pur-A-Lyzer Maxi 20000 and quenched four times at 4 ° C in 1 hour intervals with a reactive buffer (0.1 M phosphate, pH 7.2, and 0.15 M NaCl). The activated biotin (EZ-Link NHS-PEG4-Biotin, 10 mM in the reaction buffer) was mixed with 50 μg of A15 IgG to prepare a final concentration of 0.1 mM, 0.25 mM, or 0.5 mM. And the mixture was reacted in a dark place at 4 DEG C for 2 hours. 2 μl of 0.1 M glycine was added and the mixture was stored at 4 ° C for 1 hour at 1 hour intervals and then at 1 ° C for 3 times and 1x PBS / 50% glycerol once and then stored at -20 ° C until use. The degree of biotinylation of IgG was assayed by Pierce Biotin Quantitation Kit (Thermo Scientific 28005) and the reactivity and specificity of biotinylated IgG was examined by sandwich ELISA.

제조예 2-6. AP와 항체의 가교 결합Production Example 2-6. Crosslinking of AP with antibody

알칼라인 포스파타아제(AP)와 항체의 접합은 반응성 완충액(0.1M 인산 나트륨, pH 6.8), 50㎍의 AP(2.2 ㎎/㎖, Sigma-Aldrich P0114-10KU), 및 100㎍의 정제된 IgG(예를 들면, 단일 클론 항체 A15, 다클론 항체 항체 rA15 IgG, 또는 다클론 항체 항체 anti-SNAP25 IgG(Sigma-Aldrich S9684))의 혼합물 20㎕에 0.25%의 글루타르알데하이드를 첨가하는 방법으로 수행하였다. 얼음 내 암소에서 1시간 동안 반응시킨 후에, 1㎕의 1M 에탄올아민을 첨가하고, 실온 암소에서 1시간 동안 반응시켰다. AP-IgG 접합체를 4℃에서 1시간 간격으로 1x PBS 3회, 및 저장용 완충액(25mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM MgCl2, 0.1mM ZnCl2, 및 50% 글리세롤) 1회 여막한 후, AP-IgG 접합체의 항원 결합 특이성 및 AP 활성을 ELISA로 분석하였다.The conjugation of the alkaline phosphatase (AP) and the antibody was performed in a reaction buffer (0.1 M sodium phosphate, pH 6.8), 50 μg of AP (2.2 mg / ml, Sigma-Aldrich P0114-10KU), and 100 μg of purified IgG For example, 0.25% glutaraldehyde was added to 20 μl of a mixture of monoclonal antibody A15, polyclonal antibody antibody rA15 IgG, or polyclonal antibody anti-SNAP25 IgG (Sigma-Aldrich S9684) . After reacting for 1 hour in an ice cow, 1 μl of 1 M ethanolamine was added and reacted for 1 hour at room temperature. The AP-IgG conjugate was subjected to 1 × PBS 3 times at 1 hour intervals at 4 ° C., and once for storage buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl 2 , 0.1 mM ZnCl 2 and 50% glycerol) , Antigen binding specificity of AP-IgG conjugate and AP activity were analyzed by ELISA.

제조예 2-7. OCTET RED96에 의한 KProduction Example 2-7. K by OCTET RED96 DD 측정 Measure

항체의 동역학 분석을 위해 Bio-Layer Interferometry (BLI) 분석을 제조사의 권장 가이드에 따라 ForteBio® Octet Red96 장비를 사용하여 30분간 수행하였다. 간단하게, 재조합 GST-SNAP25FL, 또는 SNAP25197을 1x 동역학 완충액(kinetics buffer; KB)/1x PBS을 이용하여 125 또는 250 nM로 희석하고, 피분석물(예를 들면, 정제된 IgG)을 단계적으로 1x 동역학 완충액으로 3.9, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125, 및 250 nM로 희석하였다. 1x 동역학 완충액에서 1분간 평형시킨 후, 항-GST 프로브(Fort

Figure 112018119430281-pat00001
Bio 18-5096)에 GST-SANP25FL 또는 GST-SNAP25197을 30분간 로딩하고, 1x 동역학 완충액에서 10분간 침지시켰다. 피분석물의 10분간의 결합 및 해리에 대한 동역학 곡선을 수득하였고, ForteBio® Octet 분석 소프트웨어를 사용하여 K D (평형 해리 상수)를 추정하였다.Bio-Layer Interferometry (BLI) analysis was performed for 30 minutes using the ForteBio® Octet Red 96 instrument according to the manufacturer's recommended guidelines for antibody kinetic analysis. Briefly, recombinant GST-SNAP25 FL , or SNAP25 197 is diluted to 125 or 250 nM with 1x kinetic buffer (KB) / 1x PBS and the analyte (e.g., purified IgG) Diluted to 3.9, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125, and 250 nM with 1x kinetic buffer. After 1 minute equilibration in 1x kinetic buffer, anti-GST probe (Fort
Figure 112018119430281-pat00001
Bio 18-5096) was loaded with GST-SANP25 FL or GST-SNAP25 197 for 30 minutes and immersed in Ix kinetic buffer for 10 minutes. A kinetic curve for binding and dissociation of the analyte for 10 minutes was obtained and the K D (equilibrium dissociation constant) was estimated using ForteBio® Octet analysis software.

대체 동역학 분석으로, 항 마우스 IgG Fc 포획(AMC) 바이오센서에 항체를 로딩하고 단계적으로 희석된 GST-SNAP25와 결합/해리시켰다. 간단하게, 정제된 IgG를 100 또는 200 nM로 희석하고, GST-SNAP25FL, 또는 SNAP25197를 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 또는 100 nM로 단계적으로 희석하였다. 1x 동역학 완충액에서 1분간 평형시킨 후, AMC 바이오센서에 IgG를 10분간 로딩하고, 1x 동역학 완충액에서 10분간 침지시켰다. 피분석물의 10분간의 결합 및 해리에 대한 동역학 곡선을 수득하여 상기 기술한 방법으로 K D (평형 해리 상수)를 추정하였다.In an alternative kinetic analysis, the antibody was loaded onto an anti-mouse IgG Fc capture (AMC) biosensor and bound / dissociated with the stepwise diluted GST-SNAP25. Briefly, purified IgG was diluted to 100 or 200 nM and GST-SNAP25 FL , or SNAP25 197 was stepwise diluted to 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, or 100 nM. After equilibrating for 1 minute in 1x kinetic buffer, IgG was loaded onto the AMC biosensor for 10 minutes and immersed in 1x kinetic buffer for 10 minutes. A kinetic curve for binding and dissociation of the analyte for 10 minutes was obtained and the K D (equilibrium dissociation constant) was estimated by the method described above.

제조예 2-8. Direct ELISA 분석Production Example 2-8. Direct ELISA analysis

Immunoplate(Thermo Fisher Scientific A71125)를 37℃에서 2시간 동안 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.5)에 희석한 1㎍의 GST-SNAP25FL, 또는 GST-SNAP25197로 코팅하고, 1x PBS로 세척한 후에, 300㎕의 블로킹 완충액(5% nonfat dried milk in 1x PBS)으로 실온에서 15분간 반응시켰다. 1x PBST(1x PBS/0.05% Tween-20)로 3회 세척 후, 마이크로플레이트에 100㎕의 하이브리도마 배양 상층액(1:20~10,000 희석), 또는 유세포액(1:1,000~312,500 희석)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 마이크로플레이트를 다시 1x PBST로 3회 세척하고, 100㎕의 염소 항-마우스 IgG-HRP 접합체(1: 1000 희석액, Ab Frontier LF-SA8001)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 1x PBST로 3회 세척하고, 50㎕의 1-StepTMUltra TMB-ELISA(Thermo Fisher Scientific 34028)를 첨가하여 실온에서 3 내지 25분간 HRP 반응을 수행하였다. 50㎕의 1M H2SO4를 첨가하여 HRP 반응을 정지시키고, Bio-Tek SynergyNeo2 장비로 450 nm에서 ELISA 신호를 측정하였다.Immunoplate (Thermo Fisher Scientific A71125) was coated with 1 의 of GST-SNAP25 FL , or GST-SNAP25 197 diluted in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.5) for 2 hours at 37 째 C, washed with 1x PBS, Mu] l of blocking buffer (5% nonfat dried milk in 1x PBS) at room temperature for 15 minutes. After washing three times with 1x PBST (1x PBS / 0.05% Tween-20), 100 μl of hybridoma culture supernatant (1: 20 ~ 10,000 dilution) or flow cytometer (1: 1,000 ~ 312,500 dilution) Was added and reacted at room temperature for 1 hour. The microplate was then washed three times with 1x PBST, and 100 μl of goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (1: 1000 dilution, Ab Frontier LF-SA8001) was added and reacted at room temperature for 1 hour. This was washed three times with 1x PBST, and 50 μl of 1-Step ™ Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher Scientific 34028) was added and HRP reaction was performed for 3 to 25 minutes at room temperature. The HRP reaction was stopped by adding 50 μl of 1 M H 2 SO 4 and the ELISA signal was measured at 450 nm on a Bio-Tek Synergy Neo2 instrument.

제조예 2-9. 웨스턴 블랏팅 분석Production Example 2-9. Western blot analysis

재조합 GST-SNAP25(웰당 20ng 내지 1μg), 또는 neuro-2a 세포 용균액(웰당 15μg)을 Precision protein standards(웰당 3㎕)와 함께 10% 또는 12% SDS-PAGE에 전기영동하였다. 젤을 전이 완충액(48 mM Tris, 38.9 mM 글리신, 20 % 메탄올, 및 0.05 % SDS)에 5분간 침지한 후에, 단백질을 Trans-Blot® Semi-Dry(Bio-Rad 170-3940)를 이용하여 25V 로 45분간 PVDF 멤브레인으로 전이하였다. PVDF 멤브레인을 1x TBST(1x TBS/0.05% Tween 20)로 1회 가볍게 세척한 후, 상온의 블로킹 완충액 (5% nonfat dried milk in 1x TBST) 내에서 15분간 반응시키고, 상온의 하이브리도마 배양 상층액(블로킹 완충액으로 1:100 희석)과 45분간 반응시켰다. 다클론 항체 항-SNAP25 IgG(Sigma S9684, 1:8,000 희석), 및 항- SNAP25197 IgG(R&D MC6050, 1:100 희석)를 양성 대조군으로 사용하였다. 1x TBST로 15분간 3회 세척한 후에, PVDF 멤브레인을 상온의 염소 항-토끼 IgG-HRP 접합체(1:10,000 희석), 또는 염소 항-마우스 IgG-HRP 접합체(1:10,000 희석)와 45분간 반응시켰다. 이를 다시 1x TBST로 15분간 3회 세척한 후에, 재조합 GST-SNAP25, 또는 내인성 SNAP25를 ECL 용액으로 검출하고, Bio-Rad ChemiDocTM MP 이미징 시스템(Bio-Rad Universal hood III)을 사용하여 정량화하였다.Recombinant GST-SNAP25 (20 ng to 1 μg per well) or neuro-2a cell lysate (15 μg per well) was electrophoresed on 10% or 12% SDS-PAGE with Precision protein standards (3 μl per well). After immersing the gel in transient buffer (48 mM Tris, 38.9 mM glycine, 20% methanol, and 0.05% SDS) for 5 minutes, the protein was eluted using Trans-Blot® Semi-Dry (Bio-Rad 170-3940) To the PVDF membrane for 45 minutes. The PVDF membrane was washed once with 1x TBST (1x TBS / 0.05% Tween 20), reacted for 15 minutes in blocking buffer (5% nonfat dried milk in 1x TBST) at room temperature, (1: 100 dilution with blocking buffer) for 45 minutes. Polyclonal antibody anti-SNAP25 IgG (Sigma S9684, 1: 8,000 dilution), and anti-SNAP25 197 IgG (R & D MC6050, 1: 100 dilution) were used as positive controls. After washing three times for 15 minutes with 1x TBST, the PVDF membrane was incubated with a cold goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate (1: 10,000 dilution) or a goat anti-mouse IgG-HRP conjugate (1: 10,000 dilution) . Recombinant GST-SNAP25 or endogenous SNAP25 was detected with ECL solution and quantitated using a Bio-Rad ChemiDoc TM MP imaging system (Bio-Rad Universal hood III) after washing with 1x TBST three times for 15 minutes three times.

상기의 Working ECL 용액은 사용 전에 A 용액과 B 용액을 1:1 비율로 혼합하여 준비하였다. A 용액은 0.1 M Tris-HCl(pH 8.8), 2.5 mM 루미놀 in DMSO, 4 mM 4-요오드페닐보론산, 0.2 mM 테트라부틸암모늄 붕화수소, 2% 에틸렌 글리콜, 및 0.02% Triton X-100으로 구성되고, B 용액은 0.1 M Tris-HCl(pH 8.8), 10.6 mM 과산화수소, 및 0.012% 주석산 나트륨으로 구성된다.The Working ECL solution was prepared by mixing A solution and B solution at a ratio of 1: 1 before use. Solution A consisted of 0.1 M Tris-HCl (pH 8.8), 2.5 mM luminol in DMSO, 4 mM 4-iodophenylboronic acid, 0.2 mM tetrabutylammonium borohydride, 2% ethylene glycol, and 0.02% Triton X-100 And the B solution consists of 0.1 M Tris-HCl (pH 8.8), 10.6 mM hydrogen peroxide, and 0.012% sodium tartrate.

실시예 1. SNAP25에 특이적인 단일 클론 항체의 생성Example 1 Production of Monoclonal Antibodies Specific to SNAP25

Botox® 제조업체인 Allergan사는 N-CDSNKTRIDEANQ-C로 표시되는 13개의 아미노산 잔기 펩타이드를 사용하여 항체를 생산하였다. 상기 펩타이는 보툴리눔 독소 A형에 의해 분해되어 생성되는 SNAP25197의 C-말단과 동일하게 설계된 것이다. SNAP25FL도 SNAP25197과 동일한 서열을 포함하고 있으므로, SNAP25197을 특이적으로 인식하는 항체는 아미노산 서열 그 자체보다는 SNAP25197의 미확인된 특성에 기인할 것으로 생각된다. SNAP25FL는 206개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 그 모식도를 도 1에 나타내었다. SNAP25FL는 SNARE 모티프를 통해서 신택신(syntaxin) 1A, 및 VAMP2(synaptobrevin 2)와 안정된 삼원복합체를 형성한다. 삼원복합체는 SNAP180 없이는 형성되지 않기 때문에, SNAP25197에서는 덜 안정되고 비기능적인 삼원복합체가 형성된다(PeerJ. 2015 Jun 30;3:e1065). SNAP25의 C-말단 마지막 9개의 아미노산의 생체 내에서 삼원복합체의 형성에 가장 필수적이라는 발견은 보툴리눔 독소 A형에 의한 아미노산 위치 197에서의 절단이 미확인된 구조의 변형, 특히 C-말단과 제 2 SNARE 도메인의 변형을 야기한다는 것을 시사한다. 따라서, SNAP25FL 와 SNAP25197 사이의 유추되는 구조적 차이는 SNAP25197에 특이적인 단일 클론 항체의 생산을 가능하게 한다.Allergan, a Botox® manufacturer, produced antibodies using 13 amino acid residue peptides, designated N-CDSNKTRIDEANQ-C. The pepti is designed to be identical to the C-terminal of SNAP25 197 produced by degradation by botulinum toxin type A. SNAP25 FL also because it contains the same sequence as SNAP25 197, antibodies that recognize SNAP25 197 specifically is thought to be due to the unknown nature of the SNAP25 than 197 amino acid sequence itself. SNAP25 FL consists of 206 amino acid sequences, and the schematic diagram thereof is shown in Fig. SNAP25 FL forms a stable tertiary complex with syntaxin 1A and VAMP2 (synaptobrevin 2) through the SNARE motif. Because the tertiary complex is not formed without SNAP 180 , a less stable, non-functional tertiary complex is formed in SNAP25 197 (Peer J. 2015 Jun 30; 3: e1065). The discovery that the last nine amino acids at the C-terminus of SNAP25 are most essential for the formation of a ternary complex in vivo is a modification of the structure in which the cleavage at the amino acid position 197 by the botulinum toxin type A is not known, Domain &lt; / RTI &gt; Thus, the inferred structural differences between SNAP25 FL and SNAP25 197 enable the production of monoclonal antibodies specific for SNAP25 197 .

본 발명자들은 하기 두가지 기준을 충족시키는 10개의 펩타이드를 설계하였다. 첫째, 상대적으로 낮은 항원성을 보이는 알파 나선형 영역을 배제할 것. 둘째, 항체의 교차 반응성을 감소시키기 위해 펩타이드 서열은 비중복적이고 독특할 것. 상기 기준에 따라 설계된 10개의 펩타이드 항원 서열을 하기 표 2에 나타내었다.The present inventors designed 10 peptides that meet the following two criteria. First, exclude the alpha helical region with relatively low antigenicity. Second, the peptide sequence should be non-redundant and unique to reduce cross-reactivity of the antibody. Ten peptide antigen sequences designed according to the above criteria are shown in Table 2 below.

Immunogens/AA Position in SNAP25Immunogens / AA Position in SNAP25 서열번호SEQ ID NO: AA SequenceAA Sequence N peptideN peptide 1-131-13 서열번호 1SEQ ID NO: 1 KLH-C-MAEDADMRNELEEKLH-C-MAEDADMRNELEE 1-131-13 서열번호 2SEQ ID NO: 2 MAEDADMRNELEE-C-KLHMAEDADMRNELEE-C-KLH 19-3819-38 서열번호 3SEQ ID NO: 3 KLH-C-DQLADESLESTRRMLQLVEEKLH-C-DQLADESLESTRRMLQLVEE 51-7051-70 서열번호 4SEQ ID NO: 4 KLH-C-DEQGEQLERIEEGMDQINKDKLH-C-DEQGEQLERIEEGMDQINKD M peptideM peptide 122-136122-136 서열번호 5SEQ ID NO: 5 KLH-C-DEREQMAISGGFIRRKLH-C-DEREQMAISGGFIRR C peptideC peptide 170-184170-184 서열번호 6SEQ ID NO: 6 KLH-C-EIDTQNRQIDRIMEKKLH-C-EIDTQNRQIDRIMEK 180-194180-194 서열번호 7SEQ ID NO: 7 KLH-C-RIMEKADSNKTRIDEKLH-C-RIMEKADSNKTRIDE 180-197180-197 서열번호 8SEQ ID NO: 8 KLH-C-RIMEKADSNKTRIDEANQKLH-C-RIMEKADSNKTRIDEANQ 186-197186-197 서열번호 9SEQ ID NO: 9 KLH-C-DSNKTRIDEANQKLH-C-DSNKTRIDEANQ 189-201189-201 서열번호 10SEQ ID NO: 10 KLH-C-KTRIDEANQPATKKLH-C-KTRIDEANQPATK

표 2에 기재된 총 10개의 펩타이드 중 M과 N 펩타이드를 사용하여 SNAP25FL, 및 SNAP25197을 모두 검출할 수 있는 항체를 생성하였다. C 펩타이드에서는 ①SNAP25FL, ②SNAP25197, 또는 ③SNAP25FL, 및 SNAP25197에 결합 특이성을 가지는 상이한 3종류의 항체가 생성될 것으로 예상되었다. 본 발명의 항체 제조를 위해 ELISA와 웨스턴 블랏팅에서 상업적으로 이용 가능항 토끼 다클론 항체 항-SNAP25 IgG(Sigma-Aldrich)와 MC6050(R & D)를 대조군으로 사용하였다. 항-SNAP25 IgG는 SNAP25FL와 SNAP25197를 모두 인식 가능하고, MC6050는 SNAP25197에 특이적인 단일 클론 항체이다.M and N peptides among the total of 10 peptides shown in Table 2 were used to generate antibodies capable of detecting both SNAP25 FL and SNAP25 197 . The C-peptide was expected to be three types of antibodies having different binding specificity to ①SNAP25 FL, ②SNAP25 197, or ③SNAP25 FL, SNAP25 and 197 generated. Commercially available anti-rabbit polyclonal antibodies anti-SNAP25 IgG (Sigma-Aldrich) and MC6050 (R & D) were used as controls in ELISA and Western blotting for the production of antibodies of the invention. Anti-SNAP25 IgG recognizes both SNAP25 FL and SNAP25 197 , and MC6050 is a monoclonal antibody specific for SNAP25 197 .

각각의 합성 펩타이드를 2마리의 토끼에게 주사하여 다클론 항체 혈청을 수득하고, 4마리의 마우스에게 주사하여 단일 클론 혈철을 수득하였다. 단일 클론 항체를 제조하기 위한 하이브리도마 세포 제조 과정을 도 2에 나타내었다. 구체적으로, 4마리의 마우스를 펩타이드로 면역화시켜 항체 생산을 유도하고, 마우스 혈청을 ELISA 스크리닝 후, ELISA 양성 마우스의 비장 세포를 분리하여 SP2 골수종 세포와 융합시켰다. 이어서 하이브리도마 세포를 펩타이드 항원당 96-웰 플레이트에 단일세포로 파종하였다. 양성 하이브리도마 세포의 선별은 먼저 7 x 96-웰 플레이트를 스크리닝하여 ELISA에서 가장 높은 반응성을 보이는 24개의 클론을 선별하였고, 이후 ELISA와 웨스턴 블랏팅에서 재조합 SNAP25와 반응시켜 가장 높은 반응성, 및 감수성을 보이는 5개의 클론을 재선별하였다. 상기 5개의 양성 클론으로부터 단일세포를 분리하기 위해 먼저 5개의 클론을 96-웰 플레이트에 단일세포로 파종하고, ELISA로 10개의 클론을 무작위로 선별하여 펩타이드 항원을 검출하기 위한 활성을 평가하였다. 이후, 모든 10개의 클론이 양성으로 확인되면 ELISA와 웨스턴 블랏팅에서 재조합 SNAP25에 대한 반응성, 및 감수성을 재평가하였다. 상기 초기 하이브리도마 세포 스크리닝의 결과를 도 3에 나타내었다. 7 x 96-웰 플레이트에서 배양한 하이브리도마 세포(클론 4, B4)의 배양액 상층액을 수득하고, 이의 반응성을 Direct ELISA로 평가한 결과, 약 25%의 클론이 ELISA 양성으로 나타났다(panels A-G). 이로부터 강한 양성반응을 보이는 24개의 클론을 선택하고, 세포 용해물에 대해 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA)로 내재성 SNAP25에 대한 반응을 평가하여(panel H), 10개의 클론을 단일세포 선별을 위한 최종 클론으로 선택하였다. Each synthetic peptide was injected into 2 rabbits to obtain polyclonal antibody serum, and 4 mice were injected to obtain monoclonal blood. The process for producing hybridoma cells for producing monoclonal antibodies is shown in Fig. Specifically, four mice were immunized with peptides to induce antibody production, mouse serum was screened by ELISA, and splenocytes from ELISA-positive mice were isolated and fused with SP2 myeloma cells. Hybridoma cells were then inoculated into single cells in 96-well plates per peptide antigen. Selection of positive hybridoma cells was performed by first screening 7 x 96-well plates to select 24 clones that showed the highest reactivity in ELISA and then reacted with recombinant SNAP25 in ELISA and Western blotting to obtain the highest reactivity and sensitivity Were selected. To separate single cells from the 5 positive clones, 5 clones were first seeded into single cells in 96-well plates, and 10 clones were randomly selected by ELISA to evaluate the activity for detecting peptide antigens. Thereafter, if all 10 clones were identified as positive, the reactivity and susceptibility to recombinant SNAP25 were re-evaluated in ELISA and Western blotting. The results of the initial hybridoma cell screening are shown in FIG. A culture supernatant of hybridoma cells (clone 4, B4) cultured in 7 x 96-well plates was obtained and its reactivity was evaluated by Direct ELISA, and about 25% of the clones were ELISA positive (panels AG ). Twenty-four clones with a strong positive response were selected and cell lysates were assessed for response to endogenous SNAP25 by sandwich ELISA (panel H) and 10 clones were selected for single cell selection Clones.

단일세포 클론의 선별을 위해 하이브리도마 클론을 96-웰 플레이트에 단일세포 밀도로 파종하고, 4일 후, 배양액 상층액으로 재조합 SNAP25에 대한 Direct ELISA를 수행하여 반응성을 평가하여, 가장 강한 ELISA 신호를 생성하는 5개의 클론을 선택하였다. 예를 들면 클론 4의 경우, 96-웰 플레이트에서 배양된 서브 클론의 80% 이상이 ELISA에서 양성으로 나타났고, A8 내지 A10, B11, C10, D2, D8, D9, E5, E11, F10, 및 G7을 포함하는 12개의 서브 클론은 음성 대조군보다 낮은 ELISA 신호를 생성하였다(도 4A). 가장 ELISA 신호가 강한 5개의 서브 클론의 세포 용해물을 샌드위치 ELISA(도 4B)와 웨스턴 블랏팅(도 4C)으로 분석한 결과, ELISA와 웨스턴 블랏팅 결과가 정확하게 일치하는 것을 알 수 있었다. 웨스턴 블랏팅 동안에 세포 용행물이 변성된다는 것을 감안할 때, 상기 결과는 하이브리도마 클론 4에 의해 생산된 단일 클론 항체가 비변성(즉, ELISA), 및 변성된 NAP25와 동등하게 반응한다는 것을 의미한다. 단일세포 클론의 선별은 2회 더 반복하였고, 이를 도 5와 도 6에 나타내었다.Hybridomas clones were seeded in 96-well plates at a single cell density for selection of single cell clones, and after 4 days, direct ELISA for recombinant SNAP25 was performed in the culture supernatant to assess reactivity and the strongest ELISA signal Were selected. &Lt; tb &gt; &lt; TABLE &gt; For example, in the case of clone 4, more than 80% of the subclones cultured in 96-well plate were positive in ELISA and A8 to A10, B11, C10, D2, D8, D9, E5, E11, Twelve subclones containing G7 produced an ELISA signal lower than the negative control (Figure 4A). Analysis of the cell lysates of the five subclones with the strongest ELISA signal by sandwich ELISA (FIG. 4B) and Western blotting (FIG. 4C) revealed that the ELISA and Western blotting results were exactly the same. Given that the cellular material is denatured during western blotting, this result means that the monoclonal antibody produced by hybridomaster clone 4 is unmodified (i. E., ELISA) and reacts equally with denatured NAP25 . Selection of single cell clones was repeated two more times, as shown in Figures 5 and 6.

상기 3회의 단일세포 클론의 선별을 위한 과정에서 음성 대조군보다 유의하게 높은 ELISA 신호를 생성하지 못한 클론 6과 8을 추가 분석에서 제외하고, SNAP25FL, SNAP25197, 또는 SNAP25FL, 및 SNAP25197에 결합 특이성을 가지는 단일 클론 항체를 생산하는 총 12종의 하이브리도마 클론을 수득하였다.Clones 6 and 8, which did not generate significantly higher ELISA signals than the negative control, were excluded from further analysis in the course of screening for the three single cell clones, and SNAP25 FL , SNAP25 197 , or SNAP25 FL , and SNAP25 197 A total of 12 hybridomas clones producing monoclonal antibodies with specificity were obtained.

실시예 2. 단일 클론 항체의 생산 및 정제Example 2 Production and Purification of Monoclonal Antibodies

상기 수득된 12종의 하이브리도마 클론으로부터 단일 클론을 생산, 및 정제하기 위해, 하이브리도마 세포를 T175 플라스크에서 배양하여 90% 밀도가 되었을 때, 1:4 내지 1:10으로 계대 배양하였다. 3-4일 후, 세포를 모아 원심분리 후 무혈청 배지로 재현탁하여 1.0x 106 cells/㎖로 준비하였다. 4일간 배양 후, 세포 배양액의 상층액을 수득하여 단백질 G 컬럼(HiTrap® Protein G HP 컬럼)으로 IgG를 정제하였다. 배양액 상층액으로부터 정제된 단일 클론 항체의 수율은 하이브리도마 배치와 클론에 따라 다양하였다. 따라서 이들을 12회 이상 정제하여 약 2.45 ~ 5.52 ㎎의 C16 IgG를 수득하였다(표 3).Hybridoma cells were cultured in T175 flasks and subcultured at 1: 4 to 1: 10 when they reached 90% density, in order to produce and purify monoclons from the 12 hybridomas clones obtained. After 3-4 days, the cells were collected, centrifuged, resuspended in serum-free medium, and prepared at 1.0 × 10 6 cells / ml. After 4 days of culture, the supernatant of the cell culture was obtained, and the IgG was purified with a protein G column (HiTrap® Protein G HP column). The yield of purified monoclonal antibodies from culture supernatants varied according to hybridoma batches and clones. Therefore, they were purified more than 12 times to obtain C16 IgG of about 2.45-5.52 mg (Table 3).

Monoclonal antibodyMonoclonal antibody Volume of cell culture supernatant (㎖)Volume of cell culture supernatant (ml) Yield (㎎)Yield (mg) C16 IgG1 C16 IgG 1 185 185 2.782.78 235 235 4.324.32 542 542 2.902.90 331 331 2.452.45 291 291 2.602.60 233 233 5.525.52 225 225 3.873.87 253 253 3.553.55 190 190 3.163.16 165 165 3.353.35 269 269 3.763.76 283283 3.923.92 277277 4.414.41 299299 4.134.13 237237 3.433.43

다클론 항체 항체의 정제 결과는 표 4에 나타내었다.The results of the purification of the polyclonal antibody are shown in Table 4.

Polyclonal antibodyPolyclonal antibody Volume of cell culture supernatant (㎖)Volume of cell culture supernatant (ml) Yield (㎎)Yield (mg) A15 IgG1 A15 IgG 1 403 403 6.376.37 210 210 2.222.22 202 202 4.204.20 217 217 3.903.90 171 171 3.453.45 226 226 3.163.16 233 233 5.525.52 205 205 4.044.04 200 200 3.633.63 177 177 5.115.11 B23 IgG1 B23 IgG 1 44.5 44.5 0.170.17 186 186 1.141.14 B20 IgG1 B20 IgG 1 45 45 0.580.58 B16 IgG1 B16 IgG 1 44.5 44.5 0.390.39 B4 IgG1 B4 IgG 1 42 42 1.341.34 292 292 4.324.32 282 282 6.426.42 285285 5.455.45 275275 3.403.40 C7 IgG2a C7 IgG 2a 152 152 5.185.18 161 161 3.303.30 F14 IgG1 F14 IgG 1 263 263 2.562.56

평균적으로, 배양 상등액 100㎖로부터 IgG 약 1 내지 2 ㎎을 수득하였다. IgG의 순도 및 이들의 항원 결합 특이성은 SDS-PAGE 및 ELISA로 확인하였다.On average, about 1 to 2 mg of IgG was obtained from 100 ml of the culture supernatant. The purity of IgG and their antigen binding specificities were confirmed by SDS-PAGE and ELISA.

실시예 3. 다클론 항체 항체의 생산 및 정제Example 3 Production and Purification of Polyclonal Antibody Antibodies

토끼 혈청으로부터의 다클론 항체 항체의 정제는 상기 준비예에 기재한 바와 같이 SNAP25-AffiGel을 이용하였다. rA15 혈청의 4가지 배치로부터 얻은 SNAP25-AffiGel 분획물의 혈청 단백질 분포를 하기 표 5에 나타내었다. Purification of polyclonal antibody antibodies from rabbit sera was performed using SNAP25-AffiGel as described in the preparation example above. The serum protein distributions of the SNAP25-AffiGel fractions from the four batches of rA15 serum are shown in Table 5 below.

Rabbit serum (㎖)Rabbit serum (ml) Yield (㎍)Yield (㎍) pH 5.5 pH 5.5 pH 4.0 pH 4.0 pH 2.5 pH 2.5 30 30 1010 8585 350350 3030 11021102 525525 11601160 3030 936936 504504 990990 100100 6464 337337 945945

상기 표 5에서와 같이 각각의 혈청 샘플이 SNAP25-AffiGel 분획에서 상이한 단백질 분포 패턴을 나타냈음에도 불구하고, IgG는 10% SDS-PAGE에 의해 조사 된 모든 분획의 주요 성분으로서 검출되었다. 이를 도 7에 나타내었다. 그러나 샌드위치 ELISA로 시험했을 때 내인성 SNAP25에 대한 반응성은 pH 4.0 분획에서만 검출되어, pH 4.0 분획에서의 IgG가 내인성 SNAP25에 대해 매우 특이적이라는 것을 나타내었다. 따라서 이후의 다클론 항체 혈청을 이용한 시험에서는 pH 4.0 분획을 독점적으로 이용하였다. Although each serum sample showed a different protein distribution pattern in the SNAP25-AffiGel fraction as in Table 5 above, IgG was detected as a major component of all fractions examined by 10% SDS-PAGE. This is shown in Fig. However, when tested in a sandwich ELISA, reactivity to endogenous SNAP25 was detected only in the pH 4.0 fraction, indicating that IgG in the pH 4.0 fraction was highly specific for endogenous SNAP25. Therefore, pH 4.0 fractions were used exclusively in subsequent tests using polyclonal antibody sera.

도 7A에서 레인 M은 사이즈마커, 레인 1은 flow-through, 레인 2는 pool of eluted IgG at pH 5.5, 레인 3은 pool of eluted IgG at pH 4.0, 레인 4는 pool of eluted IgG at pH 2.5, 레인 5는 pool of eluted IgG at pH 11.5를 나타낸다.In FIG. 7A, lane M is a size marker, lane 1 is flow-through, lane 2 is pooled eluted IgG at pH 5.5, lane 3 is pooled eluted IgG at pH 4.0, lane 4 is pooled eluted IgG at pH 2.5, 5 represents the pool of eluted IgG at pH 11.5.

실시예 4. 단일 클론 항체의 서열 분석Example 4. Sequence analysis of monoclonal antibodies

하이브리도마 세포로부터 추출한 총 RNA를 올리고-dT 안티센스 프라이머, 또는 유전자 특이적(murine IgG1 CH and kappa CL) 안티센스 프라이머를 사용하여 cDNA로 전사하였다. 항체의 이소 타입을 결정하기 위해 특정 설치류의 불변 도메인 프라이머를 사용하여 PCR로 cDNA를 증폭시키고, 변형된 V H 및 V L 프라이머를 사용하여 cDNA로부터 가변 도메인을 증폭시켰다. 5' RACE를 위해 cDNA의 3' 말단에 단일중합체[dC] 꼬리를 추가하고, 중쇄 및 경쇄를 올리고[dG] 센스 프라이머, 및 유전자 특이적(CH / KC) 안티센스 프라이머로 증폭시켰다. 이후, 시퀀싱을 위해 PCR 산물을 블런트(blunt), 또는 TA 벡터에 클로닝하였다. 서열 분석 결과는 V H 및 V L 사슬에 정렬시켜 컨센서스 서열을 결정하였다.Total RNA extracted from hybridoma cells was transcribed into cDNA using oligo-dT antisense primer, or gene specific (murine IgG1 CH and kappa CL) antisense primer. To determine the isotype of the antibody, cDNA was amplified by PCR using specific rodent constant domain primers and the variable domains were amplified from cDNA using modified V H and V L primers. A single polymer [dC] tail was added to the 3 'end of the cDNA for 5' RACE and the heavy and light chains were amplified with an oligo [dG] sense primer and a gene specific (CH / KC) antisense primer. The PCR product was then blunt, or cloned into a TA vector for sequencing. Sequencing results were aligned to the V H and V L chains to determine the consensus sequence.

CDR 서열은 ①SNAP25FL에 특이적인 IgGs(표 6), ②SNAP25197에 특이적인 IgGs(표 7), 또는 ③SNAP25FL, 및 SNAP25197에 특이적인 IgGs(표 8)로 요약된다.CDR sequences are summarized in specific IgGs (Table 6), specific IgGs (Table 7), or ③SNAP25 FL, and specific IgGs (Table 8) in 197 SNAP25 in ②SNAP25 197 ①SNAP25 the FL.

CDRCDR 서열번호SEQ ID NO: SequenceSequence Identified InIdentified In VH CDR1V H CDR1 서열번호 11SEQ ID NO: 11 GYSITSGYYGYSITSGYY D2D2 서열번호 12SEQ ID NO: 12 GYTFTDYNGYTFTDYN D6D6 서열번호 13SEQ ID NO: 13 GYTFTNYGGYTFTNYG E6E6 VH CDR2V H CDR2 서열번호 14SEQ ID NO: 14 IRYDGSNIRYDGSN D2D2 서열번호 15SEQ ID NO: 15 IYPYNGDTIYPYNGDT D6D6 서열번호 16SEQ ID NO: 16 INTYTGEPINTYTGEP E6E6 VH CDR3V H CDR3 서열번호 17SEQ ID NO: 17 ARDRDSSYYFDYARDRDSSYYFDY D2D2 서열번호 18SEQ ID NO: 18 VRSGDYVRSGDY D6D6 서열번호 19SEQ ID NO: 19 ARGYYDYARGYYDY E6E6 VL CDR1V L CDR1 서열번호 20SEQ ID NO: 20 DHINNWDHINNW D2D2 서열번호 21SEQ ID NO: 21 QSLLDSNGKTYQSLLDSNGKTY D6D6 서열번호 22SEQ ID NO: 22 QSLLDSDGKTYQSLLDSDGKTY E6E6 VL CDR2V L CDR2 서열번호 23SEQ ID NO: 23 DTTDTT D2D2 서열번호 24SEQ ID NO: 24 LVSLVS D6, E6D6, E6 VL CDR3V L CDR3 서열번호 25SEQ ID NO: 25 QQYWSAPPTQQYWSAPPT D2D2 서열번호 26SEQ ID NO: 26 WQGTLFPYTWQGTLFPYT D6D6 서열번호 27SEQ ID NO: 27 WQGTHFPRTWQGTHFPRT E6E6

CDRCDR 서열번호SEQ ID NO: SequenceSequence Identified InIdentified In VH CDR1V H CDR1 서열번호 28SEQ ID NO: 28 GYSITSDYAGYSITSDYA C4C4 서열번호 29SEQ ID NO: 29 GFTFNTNAGFTFNTNA C7, C14C7, C14 서열번호 30SEQ ID NO: 30 GYTFTNYTGYTFTNYT C16C16 서열번호 31SEQ ID NO: 31 GYTFNTYAGYTFNTYA C24C24 서열번호 32SEQ ID NO: 32 GFTFSNYGGFTFSNYG D3D3 서열번호 33SEQ ID NO: 33 GFTFNTYAGFTFNTYA C15C15 VH CDR2V H CDR2 서열번호 34SEQ ID NO: 34 ISYSVGTISYSVGT C4C4 서열번호 35SEQ ID NO: 35 IRSKSNNYATIRSKSNNYAT C7, C15C7, C15 서열번호 36SEQ ID NO: 36 IRSKSDNYATIRSKSDNYAT C14C14 서열번호 37SEQ ID NO: 37 INPSSDYTINPSSDYT C16C16 서열번호 38SEQ ID NO: 38 IRSKSNNYTTIRSKSNNYTT C24C24 서열번호 39SEQ ID NO: 39 INSNGGTTINSNGGTT D3D3 VH CDR3V H CDR3 서열번호 40SEQ ID NO: 40 ARKGEYGFAYARKGEYGFAY C4C4 서열번호 41SEQ ID NO: 41 VYGRSYGGLSYVYGRSYGGLSY C7C7 서열번호 42SEQ ID NO: 42 VYGRSYGGLGYVYGRSYGGLGY C14C14 서열번호 43SEQ ID NO: 43 VRQVTTAVGGFAYVRQVTTAVGGFAY C15C15 서열번호 44SEQ ID NO: 44 ARRIFYNGRTYAAMDYARRIFYNGRTYAAMDY C16C16 서열번호 45SEQ ID NO: 45 VGQILYYYVGSPAWFAYVGQILYYYVGSPAWFAY C24C24 서열번호 46SEQ ID NO: 46 ARDRDAMDYARDRDAMDY D3D3 VL CDR1V L CDR1 서열번호 47SEQ ID NO: 47 KSVSTSGYSYKSVSTSGYSY C4, C14, C24C4, C14, C24 서열번호 48SEQ ID NO: 48 KSVSSSGYSYKSVSSSGYSY C7, C15, C16C7, C15, C16 서열번호 49SEQ ID NO: 49 QSIVNSHGNTYQSIVNSHGNTY D3D3 VL CDR2V L CDR2 서열번호 50SEQ ID NO: 50 LASLAS C4, C7, C14, C15, C16, C24C4, C7, C14, C15, C16, C24 서열번호 51SEQ ID NO: 51 KVSKVS D3D3 VL CDR3V L CDR3 서열번호 52SEQ ID NO: 52 QHSRELPLTQHSRELPLT C4, C7, C14, C15, C16C4, C7, C14, C15, C16 서열번호 53SEQ ID NO: 53 QHSRELPWTQHSRELPWT C24C24 서열번호 54SEQ ID NO: 54 FQGSHVPWTFQGSHVPWT D3D3

CDRCDR 서열번호SEQ ID NO: SequenceSequence Identified InIdentified In VH CDR1V H CDR1 서열번호 55SEQ ID NO: 55 GFTFSNYGGFTFSNYG B4B4 서열번호 56SEQ ID NO: 56 GINIKDYYGINIKDYY B23B23 VH CDR2V H CDR2 서열번호 57SEQ ID NO: 57 ISSGGSYTISSGGSYT B4B4 서열번호 58SEQ ID NO: 58 IDPGNGDAIDPGNGDA B23B23 VH CDR3V H CDR3 서열번호 59SEQ ID NO: 59 ARHEGGGNPYFDYARHEGGGNPYFDY B4B4 서열번호 60SEQ ID NO: 60 NEIAYNEIAY B23B23 VL CDR1V L CDR1 서열번호 61 SEQ ID NO: 61 QSLVHSNGNTYQSLVHSNGNTY B4B4 서열번호 62SEQ ID NO: 62 QSLLDSDGKTYQSLLDSDGKTY B23B23 VL CDR2V L CDR2 서열번호 63SEQ ID NO: 63 KVSKVS B4B4 서열번호 64SEQ ID NO: 64 LVSLVS B23B23 VL CDR3V L CDR3 서열번호 65SEQ ID NO: 65 SQNTLVPWTSQNTLVPWT B4B4 서열번호 66SEQ ID NO: 66 WQGTHFPFTWQGTHFPFT B23B23

본 발명에서 제조된 항체의 VH, 및 VL 도메인 서열은 하기 표 9로 요약된다.The V H and V L domain sequences of the antibodies prepared in the present invention are summarized in Table 9 below.

항체Antibody 서열번호SEQ ID NO: 서열order B4B4 VH V H 서열번호 67SEQ ID NO: 67 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHEGGGNPYFDYWGQGTTLTVSSEVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHEGGGNPYFDYWGQGTTLTVSS VL V L 서열번호 68SEQ ID NO: 68 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTLVPWTFGGGTKLEIKDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTLVPWTFGGGTKLEIK B23B23 VH V H 서열번호 69SEQ ID NO: 69 EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGINIKDYYMHWMKQRPEQDLEWIGWIDPGNGDAEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEIAYWGQGTLVTVSAEVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGINIKDYYMHWMKQRPEQDLEWIGWIDPGNGDAEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEIAYWGQGTLVTVSA VL V L 서열번호 70SEQ ID NO: 70 DIVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIKDIVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK C4C4 VH V H 서열번호 71SEQ ID NO: 71 DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSVGTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLLLKSVTNEDTATYFCARKGEYGFAYWGQGTLVTVSADVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSVGTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLLLKSVTNEDTATYFCARKGEYGFAYWGQGTLVTVSA VL V L 서열번호 72SEQ ID NO: 72 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELKDIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK C7C7 VH V H 서열번호 73SEQ ID NO: 73 QVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSLLYLQMNNLKTEDTAMYYCVYGRSYGGLSYWGQGTLVTVSA&Lt; RTI ID = VL V L 서열번호 74SEQ ID NO: 74 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELKDIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK C14C14 VH V H 서열번호 75SEQ ID NO: 75 EVKLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSDNYATYYADSVKDRFTISRDDSPSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVYGRSYGGLGYWGQGTLVTVSA&Lt; RTI ID = VL V L 서열번호 76SEQ ID NO: 76 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELKDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYVHWYQQPPQQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK C15C15 VH V H 서열번호 77SEQ ID NO: 77 EVKLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRQVTTAVGGFAYWGQGTLVTVSE&Lt; RTI ID = VL V L 서열번호 78SEQ ID NO: 78 DIVMTQSPASLAVSLGQRTTISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELRDIVMTQSPASLAVSLGQRTTISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELR C16C16 VH V H 서열번호 79SEQ ID NO: 79 EVQLQQSGAELARPGASVQMSCKAFGYTFTNYTMHWVRQRPGQGLEWIGFINPSSDYTNYNQKFKDKATLSADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRIFYNGRTYAAMDYWGQGTSVTVSSEVQLQQSGAELARPGASVQMSCKAFGYTFTNYTMHWVRQRPGQGLEWIGFINPSSDYTNYNQKFKDKATLSADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRIFYNGRTYAAMDYWGQGTSVTVSS VL V L 서열번호 80SEQ ID NO: 80 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELKDIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK C24C24 VH V H 서열번호 81SEQ ID NO: 81 EVKLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGYTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYTTYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQINNLKTEDTAMYYCVGQILYYYVGSPAWFAYWGQGTLVTVSA&Lt; RTI ID = VL V L 서열번호 82SEQ ID NO: 82 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIFLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPWTFGGGTKLEIKDIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIFLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPWTFGGGTKLEIK D2D2 VH V H 서열번호 83SEQ ID NO: 83 DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYIRYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTASYYCARDRDSSYYFDYWGQGTALTVSSDVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYIRYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTASYYCARDRDSSYYFDYWGQGTALTVSS VL V L 서열번호 84SEQ ID NO: 84 DIVMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISDTTSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSAPPTFGGGTKLEIKDIVMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISDTTSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSAPPTFGGGTKLEIK D3D3 VH V H 서열번호 85SEQ ID NO: 85 EVQLEESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDKRLELVATINSNGGTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDSAMYYCARDRDAMDYWGQGTSVTVSS&Lt; VL V L 서열번호 86SEQ ID NO: 86 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVNSHGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK&Lt; RTI ID = 0.0 &gt; D6D6 VH V H 서열번호 87SEQ ID NO: 87 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYIYPYNGDTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVRSGDYWGQGTTLTVSSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYIYPYNGDTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVRSGDYWGQGTTLTVSS VL V L 서열번호 88SEQ ID NO: 88 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKTYLNWLLQRPGQSPSRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTLFPYTFGGGTKLEIKDVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKTYLNWLLQRPGQSPSRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTLFPYTFGGGTKLEIK E6E6 VH V H 서열번호 89SEQ ID NO: 89 QIQLAQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYAADFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCARGYYDYWGQGTTLTVSSQIQLAQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYAADFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCARGYYDYWGQGTTLTVSS VL V L 서열번호 90SEQ ID NO: 90 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIKDVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK

표 7에서 VL CDR3 서열은 C4, C7, C14, C15, 및 C16 IgG와 같은 SNP25197 특이적인 IgG에 의해 공유되는 반면, VH 서열은 IgG 특이적인 경향이 있다는 점이 흥미롭다. 상기 서열 정렬 분석의 결과는 표 6 내지 8에 기재된 본 발명의 CDR 서열이 종래 공개된 CDR VL 및 VH 서열(미국 특허 US8198034B2)과 중첩되지 않는 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 항체 서열이 하이브리도마 양성 세포에 대한 엄격한 다중 스크리닝으로부터 기인했기 때문인 것으로 판단되며, 이로써 본 발명의 항체는 현저히 낮은 K D 값을 가질 것으로 기대된다.It is interesting that the V L CDR3 sequences in Table 7 are shared by SNP25 197 specific IgGs such as C4, C7, C14, C15, and C16 IgG, whereas V H sequences are IgG specific. The results of the sequence alignment analysis showed that the CDR sequences of the present invention as shown in Tables 6 to 8 do not overlap with the CDR V L and V H sequences (US Patent No. US 8,198,034 B2). This is because the antibody sequences of the present invention are believed to result from a rigorous multiple screening of hybridoma positive cells, whereby the antibodies of the present invention are expected to have significantly lower K D values.

실시예 5. 단일 클론 항체의 동역학 분석Example 5. Kinetic analysis of monoclonal antibodies

단일 클론 항체의 동역학 분석은 상기 준비예에 기재한 바와 같이 ForteBio® Octet Red96 기기를 사용하여 BLI 분석을 통해 독점적으로 수행하였다. SNAP25197 특이적 IgG의 C4, C7, C16, 및 C24 동역학 분석 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8A는 GST-SNAP25197 로딩된 항 GST 바이오 센서를 단계적으로 희석한 IgG 샘플(분석물 결합), 및 1x 동역학 완충액(분석물 해리) 동역학 곡선의 원 데이터, 도 8B는 동역학 곡선에서 기준선 BLI 신호를 제거한 후, ForteBio® Octet 분석 소프트웨어로 KD를 추정하여 정렬한 데이터이다. 도 8에서 IgGs loaded on AMC biosensors include C16 IgG (I), C24 IgG (II), C4 IgG (III), 및 C7 IgG (IV)이고, a는 antibody loading, b는 washing, c는 association of antigen, d는 dissociation of antigen을 나타낸다.Kinetic assays of monoclonal antibodies were performed exclusively via BLI analysis using a ForteBio (R) Octet Red 96 instrument as described in the preparation examples above. SNAP25 197 shown C4, C7, C16, C24 and kinetic analysis of specific IgG in Fig. Figure 8A shows the original data of the IgG sample (analyte binding) and 1x kinetic buffer (analyte dissociation) kinetic curve which were stepwise diluted with the GST-SNAP25 197 loaded anti-GST biosensor, Figure 8B shows the baseline BLI signal And then estimating K D with ForteBio® Octet analysis software. In FIG. 8, IgGs loaded on AMC biosensors include C16 IgG (I), C24 IgG (II), C4 IgG (III), and C7 IgG d represents dissociation of antigen.

상기 분석값은 하기 표 10에 기재하였다.The analytical values are shown in Table 10 below.

Monoclonal AbsMonoclonal Abs SPR Kinetic Parameters (SNAP25SPR Kinetic Parameters (SNAP25 197197 )) KK onon (M (M -1-One ss -1-One )) KK dis dis (s(s -1-One )) KK D D (nM)(nM) SNAP25197 specfic
(dipped in 125 nM)SNAP25 197 specfic
(dipped in 125 nM) C4C4 2.30 x 105 2.30 x 10 5 4.10 x 10-3 4.10 x 10 -3 17.8 ± 4.4517.8 ± 4.45 C7C7 2.57 x 105 2.57 x 10 5 4.94 x 10-3 4.94 x 10 -3 19.3 ± 3.1519.3 ± 3.15 C16C16 2.35 x 105 2.35 x 10 5 2.15 x 10-3 2.15 x 10 -3 9.17 ± 2.719.17 ± 2.71 C24C24 5.29 x 105 5.29 x 10 5 5.09 x 10-3 5.09 x 10 -3 9.62 ± 1.309.62 ± 1.30 SNAP25197 specific
(dipped in 250 nM)SNAP25 197 specific
(dipped in 250 nM) C4C4 2.27 x 105 2.27 x 10 5 1.48 x 10-3 1.48 x 10 -3 6.53 ± 1.096.53 ± 1.09 C7C7 2.77 x 105 2.77 x 10 5 1.22 x 10-3 1.22 x 10 -3 4.41 ± 0.684.41 ± 0.68 C16C16 2.36 x 105 2.36 x 10 5 1.52 x 10-3 1.52 x 10 -3 6.44 ± 1.256.44 ± 1.25 C24C24 4.58 x 105 4.58 x 10 5 2.41 x 10-3 2.41 x 10 -3 5.25 ± 1.095.25 ± 1.09

KD 값의 nM 범위를 고려할 때 동역학 분석은 정상적으로 진행되는 것으로 보였으나, 낮은 농도의 GST-SNAP25197(125 nM)가 로딩된 바이오센서로 동역학 분석을 수행하는 경우에는 KD 값은 해리 속도 상수 Kdis의 변화에 비례적으로 감소하여(표 9), 유사한 항원 특이성을 가진 단일 클론 항체의 경우 Kdis 값(1.22~5.09 x 10-3)은 종래 보고된 것(3.11 x 10-4 ~ 6.74 x 10-5, 미국 특허 US8198034B2)보다 1 내지 2 배 더 낮은 것으로 나타났다.Considering the nM range of K D values, the kinetic analysis seems to proceed normally, but when performing a kinetic analysis with a low-concentration GST-SNAP25 197 (125 nM) loaded biosensor, the K D value is the dissociation rate constant to reduce the change of Kdis proportionally (Table 9), in the case of monoclonal antibodies with a similar antigen specificity Kdis value (1.22 ~ 5.09 x 10 -3) is the prior report (3.11 x 10 -4 ~ 6.74 x 10 -5 , U.S. Patent No. 8,198,034 B2).

상대적으로 높은 K D 및 Kdis 값의 원인으로 두 가지가 고려된다. 첫째는 부적절한 분석 완충액의 사용이고, 두번째는 항-GST 바이오센서로 수행되는 동역학 분석 자체의 한계이다(ForteBio Application Note 14: Biomolecular Binding Kinetics Assays on the Octet Platform). 첫번째의 경우, 본 발명자들의 추가 분석에서 다양한 분석용 완충액을 이용하여 비교한 결과, 1x 동역학 완충액이 모든 완충액 중에서 가장 적절한 것으로 평가되었다. 따라서 대체 동역학 분석으로 항 마우스 IgG Fc 포획(AMC) 바이오센서를 직접 항체에 로딩하고, 단계적으로 희석된 재조합 GST-SNAP25와 결합/해리시켰다. 보다 구체적으로, 정제된 IgG는 100 또는 200 nM로 희석한 데 비하여, GST-SNAP25FL, 또는 SNAP25197는 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 또는 100 nM로 단계적으로 희석하였다. 이를 1x 동역학 완충액에서 1분간 평형시킨 후, AMC 바이오센서에 10분간 IgG를 로딩하고, 1x 동역학 완충액에서 10분간 침지시켰다. 분석물의 결합/해리는 10분간 수행하였고, K D 는 상기 기재된 바와 같이 추정하였다. 상기 대체 동역학 곡선의 원 데이터를 도 9A에, KD를 추정하여 정렬한 데이터는 도9B에 나타내었다. 도 9에서 IgGs loaded on AMC biosensors include C14 (I), C24(II), D2 (III), D6 (IV), E6 (V), 및 A15 (VI)이고, a는 antibody loading, b는 association of antigen, c는 dissociation of antigen을 나타낸다.Two factors are considered to account for the relatively high K D and K dis values. The first is the use of an inadequate analytical buffer, and the second is the limit of the kinetic analysis itself performed with the anti-GST biosensor (ForteBio Application Note 14: Biomolecular Binding Kinetics Assays on the Octet Platform). In the first case, in a further analysis of the present inventors, a comparison using various buffers for analysis showed that a 1x kinetic buffer solution was the most suitable among all buffers. Thus, an anti-mouse IgG Fc capture (AMC) biosensor was loaded directly into the antibody by an alternative kinetic analysis and bound / dissociated with the stepwise diluted recombinant GST-SNAP25. More specifically, the purified IgG will, GST-SNAP25 FL, or SNAP25 197 is at 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, or 100 nM was stepwise diluted as compared to the dilution with 100 or 200 nM. This was equilibrated in 1x dynamic buffer for 1 minute, then loaded on an AMC biosensor for 10 minutes and immersed in 1x kinetic buffer for 10 minutes. Binding / dissociation of the analyte was performed for 10 minutes and K D was estimated as described above. The original data of the alternative dynamic curve is shown in Fig. 9A, and the data obtained by estimating K D is shown in Fig. 9B. In Fig. 9, IgGs loaded on AMC biosensors include C14 (I), C24 (II), D2 (III), D6 (IV), E6 Antigen, c represents dissociation of antigen.

ForteBio® Octet 분석 소프트웨어를 사용하여 추정된 KD 값은 표 11에 기재하였다.The estimated K D values using ForteBio® Octet analysis software are listed in Table 11.

IgGsIgGs Kinetics Parameters with SNAP25Kinetics Parameters with SNAP25 197197 Kinetics Parameters with SNAP25Kinetics Parameters with SNAP25 FLFL KK onon (M (M -1-One ss -1-One )) KK dis dis (s(s -1-One )) KK D D (pM)(pM) KK onon (M (M -1-One ss -1-One )) KK dis dis (s(s -1-One )) KK D D (pM)(pM) Bi-specificBi-specific aA15 a A15 7.78 x 104 7.78 x 10 4 1.22 x 10-7 1.22 x 10 -7 1.56 ± 0.011.56 ± 0.01 8.39 x 104 8.39 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 1.19 ± 0.621.19 + - 0.62 aB4 a B4 1.0 x 105 1.0 x 10 5 5.56 x 10-7 5.56 x 10 -7 0.48 ± 0.020.48 + 0.02 9.51 x 104 9.51 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 0.10 ± 0.380.10 + - 0.38 aB23 a B23 2.54 x 104 2.54 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 3.27 ± 0.033.27 ± 0.03 9.58 x 104 9.58 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 0.10 ± 0.420.10 + - 0.42 SNAP25197-specificSNAP25 197 -specific bC4 b C4 9.28 x 104 9.28 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 1.07 ± 0.601.07 ± 0.60 (not determined)(not determined) bC7 b C7 7.78 x 104 7.78 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 1.28 ± 0.751.28 + - 0.75 aC14 a C14 7.67 x 104 7.67 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 1.30 ± 0.751.30 0.75 bC16 b C16 1.60 x 106 1.60 x 10 6 2.57 x 10-6 2.57 x 10 -6 1.62 ± 0.461.62 + - 0.46 aC24 a C24 8.68 x 104 8.68 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 1.15 ± 0.871.15 ± 0.87 bD3 b D3 1.11 x 105 1.11 x 10 5 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 0.90 ± 0.590.90 ± 0.59 SNAP25FL
-specificSNAP25 FL
-specific bD2 b D2 (not determined)(not determined) 1.64 x 105 1.64 x 10 5 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 0.61 ± 0.280.61 0.28 bD6 b D6 3.52 x 104 3.52 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 2.84 ± 0.022.84 ± 0.02 bE6 b E6 5.38 x 104 5.38 x 10 4 1.0 x 10-7 1.0 x 10 -7 1.86 ± 0.591.86 ± 0.59

표 11에서 가장 주목되는 것은 Kdis 값(즉, 2.57 x 10-6 내지 1.0 x 10-7)으로, 항-GST 바이오센서를 사용하여 측정된 것보다 수치가 작았다. 사실상 ForteBio® Octet을 사용하여 정확하게 측정하기에는 해리 속도가 너무 낮았으므로, 1.0 x 10-7을 6 개의 IgG에 대해 시험적으로 제공하였다. 이러한 일시적인 해리 속도 상수로 K D 값을 구한 결과, 0.48 내지 3.27 pM이었다. SNAP25197 특이적 IgG를 로딩한 AMC 바이오센서는 1㎛까지는 GST- SNAP25FL와 통계적으로 유의하게 연관되지는 않는다. 마찬가지로, GST-SNAP25197는 SNAP25FL 특이적 IgG를 로딩한 AMC 바이오센서와 연동되지 않는다. 이러한 IgG의 결합 특이성은 ELISA에서의 반응성과 일치하는 것으로 나타났다.Of note in Table 11, the Kdis value (i.e., 2.57 x 10 -6 to 1.0 x 10 -7 ) was less than that measured using the anti-GST biosensor. In fact, the dissociation rate was too low for accurate measurements using ForteBio® Octet, so 1.0 x 10 -7 was provided for 6 IgGs as a test. The K D value was obtained from this temporary dissociation rate constant as 0.48 to 3.27 pM. The AMC biosensor loaded with SNAP25 197 specific IgG is not statistically significantly associated with GST-SNAP25 FL up to 1 μm. Likewise, GST-SNAP25 197 does not work with AMC biosensors loaded with SNAP25 FL -specific IgG. The binding specificity of these IgGs was found to be consistent with the reactivity in the ELISA.

실시예 6. 단일 클론 항체의 항원 결합 특이성 확인Example 6 Identification of Antibody Binding Specificity of Monoclonal Antibodies

본 발명에서 제조된 단일 클론 항체를 Direct ELISA, 및 웨스턴 블랏팅 분석으로 SNAP25FL 및 SNAP25197 에 대한 반응성을 시험하였다. 먼저, Direct ELISA는 GST-SNAP25FL, 또는 GST-SNAP25197 코팅된 마이크로플레이트에서 정제된 IgG (50 ng per well)로 수행하였다. HRP 반응은 5분간 수행하였고, HRP 활성은 Bio-Tek SynergyNeo2를 사용하여 A450에서 측정하였다. 상기 측정값에서 IgG 없이 측정된 A450값을 제하여 A450 측정값을 산출하였고, SNAP25FL측정값에 대한 SNAP25197측정값의 비율(Ratio197/206)을 하기 표 12에 기재하였다. Ratio197/206 측정 결과는 BLI 분석에 의해 얻어진 결과와 일치하여, A15, B4, 및 B23과 같은 이중 특이적 IgG의 경우 1.0에 근접하였고, C7, C14, C16, 및 C24와 같은 SNAP25197 특이적 IgG의 경우 950 이상이었으며, SNAP25FL 특이적 IgG의 경우에는 0.02 내지 0.03으로 나타났다.The monoclonal antibodies prepared in the present invention were tested for their reactivity to SNAP25 FL and SNAP25 197 by Direct ELISA and Western blotting analysis. First, Direct ELISA was performed with purified IgG (50 ng per well) in GST-SNAP25 FL or GST-SNAP25 197 coated microplates. HRP reaction was performed for 5 minutes and HRP activity was measured at A450 using Bio-Tek Synergy Neo2. The A450 value was calculated by subtracting the A450 value measured without the IgG from the above measured value, and the ratio of the SNAP25 197 measured value to the SNAP25 FL measured value (Ratio 197/206 ) is shown in Table 12 below. The results of Ratio197 / 206 measurements were close to 1.0 for bispecific IgG such as A15, B4, and B23, consistent with the results obtained by BLI analysis, and SNAP25 197 specific IgG, such as C7, C14, C16, and C24 In the case of SNAP25 FL- specific IgG, and 0.02 to 0.03 in the case of SNAP25 FL- specific IgG.

　IgGsIgGs AA 450450 with SNAP25 with SNAP25 FLFL AA 450450 with SNAP25 with SNAP25 197197 　RatioRatio 197/206197/206 A15A15 1.3831.383 1.4451.445 1.041.04 B4B4 2.1632.163 1.7971.797 0.830.83 B23B23 1.9011.901 1.7541.754 0.920.92 C4C4 0.0010.001 0.9190.919 919919 C7C7 0.0010.001 1.1991.199 1,0371,037 C14C14 0.0010.001 0.9530.953 953953 C16C16 0.0010.001 0.9960.996 996996 C24C24 0.0010.001 0.9730.973 973973 D3D3 0.1250.125 1.6161.616 12.9312.93 D2D2 1.4481.448 0.0480.048 0.030.03 D6D6 1.8781.878 0.0310.031 0.020.02 E6E6 1.8081.808 0.0390.039 0.020.02

웨스턴 블랏팅 분석은 일차 항체의 공급원인 하이브리도마 배양액 상층액(1: 100 희석)으로 수행하였다. GST-SNAP25FL, 또는 GST-SNAP25197 0.5㎍을 변성 겔상에서 용해시키고 PVDF 멤브레인으로 전이시켜 항원으로 사용하였다. 단일 클론 항체는 ELISA 시험에서와 동일한 감도로 변성된 SNAP25 항원에 반응하였다. 상기 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 레인 1은 SNAP25FL, 레인 2는 GST-SNAP25197 이다. Western blotting analysis was performed with a hybridoma culture supernatant (1: 100 dilution) as the source of the primary antibody. GST-SNAP25 FL , or GST-SNAP25 197 were dissolved on a denaturing gel and transferred to a PVDF membrane and used as an antigen. Monoclonal antibodies reacted with the SNAP25 antigen, which was denatured with the same sensitivity as in the ELISA test. The results are shown in FIG. 10, lane 1 is SNAP25 FL , and lane 2 is GST-SNAP25 197 .

실시예 7. HRP(horseradish peroxidase)와 항체의 접합Example 7. Binding of HRP (horseradish peroxidase) and antibody

C16 IgG는 본 발명에서 시험된 단일 클론 항체 중에서 HRP와 접합된 후 가장 재현성 있는 항원 결합 특이성을 나타내었다. HRP 접합을 위해, C16 IgG(5 ㎎)를 실온 암소에서 2시간 동안 활성화된 HRP(5㎎)와 반응시키고, 0.1㎖의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride, 4㎎/㎖)을 첨가한 후, HRP-항체 접합체를 4℃의 1x PBS, 및 1x PBS/50% 글리세롤에서 여막하였다. 상기 결과를 도 11에 나타내었다.C16 IgG showed the most reproducible antigen binding specificity after conjugation with HRP among the monoclonal antibodies tested in the present invention. For HRP conjugation, C16 IgG (5 mg) was reacted with activated HRP (5 mg) in a room temperature cow for 2 hours, 0.1 ml of sodium borohydride (4 mg / ml) -Antibody conjugate was desalted in 1x PBS at 4 占 폚, and 1x PBS / 50% glycerol. The results are shown in Fig.

도 11A에 나타낸 바와 같이, C16 IgG-HRP 접합체의 형성은 인큐베이션 없이도 항원 검출이 가능하다는 점에서 매우 효율적이다(레인 1-3 참조). 유리 IgG, 및 HRP로 반영된 C16 IgG의 불완전한 접합은 효율적인 접합을 위한 반응 혼합물에서 비교적 높은 농도의 유리 HRP 및 IgG의 요구를 시사한다(레인 4-6 참조). 도 11A에서 레인 M은 사이즈마커, 레인 1은 unconjugated C16 IgG(9 mg), 레인 2는 activated HRP(4 mg), 레인 3은 C16 IgG/HRP mixture(C16 IgG-HRP) before incubation(4.5 mg), 레인 4는 C16 IgG-HRP after incubation(4.5 mg), 레인 5는 C16 IgG-HRP after blocking(4.3 mg), 레인 6은 C16 IgG-HRP after removal of free HRP by dialysis(4.3 mg)이고, a는 C16 IgG-HRP conjugates를 나타낸다.As shown in FIG. 11A, the formation of a C16 IgG-HRP conjugate is very efficient in that it allows antigen detection without incubation (see lanes 1-3). Incomplete conjugation of free IgG, and C16 IgG, reflected with HRP suggests the need for relatively high concentrations of free HRP and IgG in the reaction mixture for efficient conjugation (see lanes 4-6). (Lane 1) was unconjugated C16 IgG (9 mg), lane 2 was activated HRP (4 mg) and lane 3 was a C16 IgG / HRP mixture (C16 IgG-HRP) before incubation , Lane 4 is C16 IgG-HRP after incubation (4.5 mg), lane 5 is C16 IgG-HRP after blocking (4.3 mg), lane 6 is C16 IgG-HRP after removal of free HRP by dialysis Represents C16 IgG-HRP conjugates.

SNAP25197에 대한 2개의 상이한 C16 IgG-HRP 접합체의 반응성을 Direct ELISA로 조사하였다. 이를 위해 96-웰 마이크로플레이트를 0 내지 200pg의 GST-SNAP25197로 코팅하고, 마이크로플레이트 웰에서 성장한 세포에서 약 0.8%까지 내인성 SNAP25의 절단을 모방하였다. 실험 결과, 50㎕의 1-StepTM Ultra TMB-ELISA로 30분간 측정 시, C16 IgG-HRP 접합체(200 ng)는 50pg의 미량 GST-SNAP25197를 검출할 수 있었다(도 11B). 또한, GST-SNAP25197의 증가량에 비례하여 더 높은 A450 값이 측정되었다. 상기 결과로부터 C16-HRP 접합체는 최적화된 샌드위치 ELISA 검출 항체로 사용 가능하다.The second reactive IgG-HRP conjugate in two different C16 for SNAP25 197 was examined by Direct ELISA. To this end the coating 96-well microplates in the range of 0 to 200pg GST-SNAP25 197, and in cells grown in a microplate well to about 0.8% was mimic the cleavage of endogenous SNAP25. The experimental results, as measured for 30 minutes at a 1-StepTM Ultra TMB-ELISA of 50㎕, C16 IgG-HRP conjugate (200 ng) was able to detect a very small amount of the GST-SNAP25 197 50pg (Fig. 11B). In addition, a higher A450 value was measured in proportion to the increase in GST-SNAP25 197 . From the above results, the C16-HRP conjugate can be used as an optimized sandwich ELISA detection antibody.

실시예 8. 바이오틴과 항체의 접합Example 8. Binding of biotin to antibody

Allergan사에서 개발한 샌드위치 두 가지 항체, 즉 포획 항체로서 SNAP25197-특이적 IgG와 검출 항체로서 다클론 항체 SNAP25-특이적 IgG를 사용한다. 대조적으로, 본 발명의 샌드위치 ELISA는 단일 클론 포획 항체, 또는 검출 항체를 이용하므로, 품질 관리가 용이하고, 높은 수준의 재현성, 및 정확석을 나타내는 효과가 있다. 더하여, IgG와 같은 제 2 검출 항체에 알칼라인 포스파타아제, 또는 바이오틴을 첨가하면 각 웰에 포획 된 SNAP25를 표준화하므로 샌드위치 ELISA의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.Two sandwich antibodies developed by Allergan, SNAP25 197 -specific IgG as the capture antibody and SNAP25-specific IgG, polyclonal antibody, are used as the detection antibody. In contrast, the sandwich ELISA of the present invention utilizes a single clone capture antibody, or detection antibody, so that it is easy to manage quality, has a high level of reproducibility, and exhibits accuracy. In addition, the addition of alkaline phosphatase, or biotin to a second detection antibody, such as IgG, is expected to further improve the accuracy of the sandwich ELISA by standardizing captured SNAP25 in each well.

이에 대한 첫 번째 시도로서, 상기 준비예에 기재한 바와 같이 이중 특이성(bi-specific) 단일 클론 항체 A15를 바이오틴과 접합시키고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 실험 결과, 바이오틴의 농도가 높을수록 IgG당 더 많은 바이오틴 분자가 접합되었고, HABA/Avidin Premix(Thermo Scientific)를 이용한 바이오틴 접합의 정량에서 0.25 mM 바이오틴을 제공 시 IgG 1몰당 8몰의 바이오틴이 접합되는 것으로 나타났다. 0.5 mM 바이오틴과 접합된 IgG 중쇄는 SDS-PAGE 상에서 현저하게 느리게 이동하였다(도 12a, 및 도 12b). 도 12A와 12B에서 레인 M은 사이즈마커, 레인 1은 A15 IgG alone, 레인 2는 A15 IgG conjugated with 0.1 mM biotin, 레인 3은 A15 IgG conjugated with 0.25 mM biotin, 레인 4는 A15 IgG conjugated with 0.5 mM biotin을 나타낸다.As a first trial, bi-specific monoclonal antibody A15 was conjugated with biotin as described in the above preparation example, and the result is shown in Fig. Experimental results showed that the higher the concentration of biotin, the more biotin molecules were conjugated per IgG, and when 0.25 mM biotin was provided in the quantification of biotin conjugation using HABA / Avidin Premix (Thermo Scientific), 8 moles of biotin per 1 mole of IgG was conjugated Respectively. The IgG heavy chain conjugated with 0.5 mM biotin migrated significantly slower on SDS-PAGE (FIGS. 12A and 12B). 12A and 12B, lane M is a size marker, lane 1 is A15 IgG alone, lane 2 is A15 IgG conjugated with 0.1 mM biotin, lane 3 is A15 IgG conjugated with 0.25 mM biotin, lane 4 is A15 IgG conjugated with 0.5 mM biotin .

0.1mM 바이오틴과 접합된 A15 IgG의 반응성을 샌드위치 ELISA로 시험하였다. 간단하게, 보툴리눔 독소 처리한 N2-42F 세포의 세포 용해액(TCLs) 50㎕를 B4 IgG로 코팅된 마이크로플레이트에서 배양하고, B4 IgG에 의해 포획된 내재성 SNAP25197를 A15-바이오틴 접합체, 및 스트렙트아비딘-AP 접합체(1:500 dilution in 1x TBS)로 검출하였다. A15 IgG는 SNAP25FL, 및 SNAP25197에 모두 동등한 친화성 및 특이성으로 결합 가능한 이중 특이성 항체이므로(도 10 참조), SNAP25에 대한 A15 결합은 SNAP25 절단에 크게 영향을 받지 않을 것으로 기대된다. 그러나 바이오틴 접합된 A15 IgG와 SNAP25의 결합을 반영하는 AP 활성은 보툴리눔 독소 처리 농도에 비례하여 증가하였다(도 12c). 이러한 결과는 IgG의 경쇄 및 중쇄 모두의 바이오틴화에 대한 항원 특이성의 변화 때문일 것으로 판단된다(도 12b).The reactivity of A15 IgG conjugated with 0.1 mM biotin was tested by sandwich ELISA. Briefly, 50 쨉 l of cytolytic solution (TCLs) of N2-42F cells treated with botulinum toxin was cultured in a microplate coated with B4 IgG, and intrinsic SNAP25 197 captured by B4 IgG was treated with A15-biotin conjugate and streptavidin (1: 500 dilution in 1x TBS). It is expected that A15 binding to SNAP25 will not be significantly affected by SNAP25 cleavage, since A15 IgG is a bispecific antibody that can bind with both affinity and specificity equivalent to both SNAP25 FL and SNAP25 197 (see FIG. 10). However, the AP activity reflecting the binding of biotin-conjugated A15 IgG to SNAP25 increased in proportion to the botulinum toxin treatment concentration (Fig. 12C). These results are believed to be due to changes in antigen specificity for biotinylation of both light and heavy chains of IgG (Figure 12b).

실시예 9. 알칼라인 포스파타아제(AP)와 항체의 직접 가교 결합Example 9. Direct cross-linking of alkaline phosphatase (AP) with antibody

제 2 검출 항체에 대한 대안적인 접근법으로서, 정제된 IgG는 글루타르알데하이드 농도에 의해 가교 결합 정도를 조절 가능하므로, 2종의 다클론 항체 항체와 3종의 단일 클론 항체를 글루타르알데하이드를 이용해서 알칼라인 포스파타아제(AP)와 직접 가교시켰다. C16을 제외하고, 항체들은 모두 SNAP25FL, 및 SNAP25197을 모두 검출 가능한 이중 특이성 항체이다. C16 IgG는 HPR 접합은 효율적이되, C16의 항원 특이성에는 영향을 주지 않으므로, 대조군으로 사용하였다(도 11 참조). As an alternative approach to the second detection antibody, purified IgG can modulate the degree of cross-linking by the concentration of glutaraldehyde, so two polyclonal antibody antibodies and three monoclonal antibodies can be used with glutaraldehyde And directly cross-linked with alkaline phosphatase (AP). Except for C16, the antibodies are all bispecific antibodies capable of detecting both SNAP25 FL and SNAP25 197 . C16 IgG was used as a control group because the HPR junction was efficient and did not affect the antigen specificity of C16 (see FIG. 11).

항원 특이성 및 반응성을 유지하는 AP-IgG 접합체를 얻기 위한 최적의 조건을 찾기 위해, 표 13에 기재한 조건으로 상이한 인큐베이션 조건 하에서 IgG에 대한 AP의 다양한 비율로 IgG에 대한 AP의 가교 결합을 수행하고, 글루타르알데하이드 가교 결합 완료시 생성된 AP-IgG 접합체를 SDS-PAGE로 분석하였다.Cross-linking of AP to IgG was performed at various ratios of AP to IgG under different incubation conditions under the conditions set forth in Table 13 to find the optimal conditions for obtaining AP-IgG conjugates maintaining antigen specificity and reactivity , The AP-IgG conjugate produced upon completion of glutaraldehyde crosslinking was analyzed by SDS-PAGE.

AntibodyAntibody Ratio of IgG to APRatio of IgG to AP Incubation time/temperature Incubation time / temperature Analysis Analysis C1C1 1:31: 3 2 hr/4℃+2 hr/RT2 hr / 4 ° C + 2 hr / RT SDS-PAGESDS-PAGE C16C16 1:1~2:11: 1 to 2: 1 3-24 hr/RT or 37℃3-24 hr / RT or 37 ° C A15A15 1:1~2:11: 1 to 2: 1 5 hr/37℃5 hr / 37 ° C SDS-PAGE
& direct ELISASDS-PAGE
& direct ELISA rA15rA15 2:12: 1 2 hr/4℃+2 hr/RT2 hr / 4 ° C + 2 hr / RT Sigma IgGSigma IgG 2:12: 1 1-4hr/4℃ or RT1-4hr / 4 ° C or RT

상기 AP-IgG 접합체의 전기영동 사진 및 쿠마시블루 염색을 이용한 정량화 그래프 결과를 도 13에 나타내었다. 실험 결과, 다클론 항체 항-SNAP25 IgG(Sigma)는 0.2% 글루타르알데하이드가 제공되는 환경에서 AP와 가교 결합되었다. AP와의 가교 결합은 IgG가 AP와 고분자량 복합체를 형성하기 위한 매우 효율적인 방법이다. 생성된 AP-IgG 접합체는 SDS 겔에서 매우 느리게 이동하였고, 일부는 스태킹 겔을 통과하지 못하였다(도 13A). 시험된 모든 IgG들이 일관된 패턴을 나타내었다. 도 13A에서 레인 M은 사이즈마커, 레인 1은 unconjugated IgG, 레인 2는 AP, 레인 3은 AP-IgG conjugates이고, a는 the stacking gel portion of polyacryamide gel, b는 AP-IgG conjugates를 나타낸다.The electrophoresis of the AP-IgG conjugate and the quantification graph using Coomassie blue staining are shown in FIG. As a result of the experiment, polyclonal antibody anti-SNAP25 IgG (Sigma) was crosslinked with AP in the environment of 0.2% glutaraldehyde. Cross-linking with AP is a highly efficient method for IgG to form high molecular weight complexes with AP. The resulting AP-IgG conjugate migrated very slowly in the SDS gel and some did not pass through the stacking gel (Fig. 13A). All IgG tested showed a consistent pattern. In FIG. 13A, lane M represents a size marker, lane 1 represents unconjugated IgG, lane 2 represents AP, lane 3 represents AP-IgG conjugates, a represents the stacking gel portion of polyacryamide gel, and b represents AP-IgG conjugates.

추가로 다양한 농도의 GST-SNAP25197를 함유하는 2ng의 GST-SNAP25 혼합물로 코팅된 마이크로플레이트를 이용하여 Direct ELISA로 AP-rA15 IgG, 및 AP-Sigma IgG 접합체(100 ng per well)의 항원 반응성 및 특이성을 비교 시험하였다. 실험 결과, AP-Sigma IgG 접합체는 ELISA 신호를 생성하지 못했지만, AP-rA15 IgG 접합체는 바이오틴화된 A15 IgG와 유사한 결과를 나타내었다(도 12, 및 도 13B 참조). GST-SNAP25197의 농도가 증가함에 따라 비례해서 AP-rA15 IgG 접합체의 더 강한 ELISA 신호가 생성되었다. 도 12, 및 도 13의 결과는 SNAP25FL 반응성 항체가 단일 클론 또는 다클론 항체일 경우, IgG의 중쇄 및 경쇄 모두가 글루타르알데히드에 의해 활성화된 바이오틴에 효율적으로 접합되거나, AP에 가교 결합된다는 것을 의미한다. The antigenicity and reactivity of AP-rA15 IgG and AP-Sigma IgG conjugate (100 ng per well) was assessed by Direct ELISA using a microplate coated with 2 ng of GST-SNAP25 mixture containing various concentrations of GST-SNAP25 197 Specificity. As a result, the AP-Sigma IgG conjugate did not generate an ELISA signal, but the AP-rA15 IgG conjugate showed similar results as the biotinylated A15 IgG (see FIGS. 12 and 13B). As the concentration of GST-SNAP25 197 increased, a stronger ELISA signal of the AP-rA15 IgG conjugate was generated proportionally. The results in Figures 12 and 13 show that when the SNAP25 FL reactive antibody is a monoclonal or polyclonal antibody, both the heavy and light chains of IgG are efficiently conjugated to biotin activated by glutaraldehyde or cross-linked to AP it means.

상기 실시예 1 내지 9의 결과로부터, 본 발명의 ①SNAP25FL, ②SNAP25197, 또는 ③SNAP25FL, 및 SNAP25197에 결합 특이성을 가지는 상이한 3종류의 항체들이 모두 SNAP25에 대해 높은 친화력과 특이성을 가지고 있으며, 변성 또는 천연의 표적 항원과 효율적으로 반응한다는 것을 알 수 있었다.From the above results of Examples 1 to 9, and all that three types of antibody different from having a binding specificity to the ①SNAP25 FL of the invention, ②SNAP25 197, or ③SNAP25 FL, and SNAP25 197 has a high affinity and specificity for SNAP25, modified Or reacted with the natural target antigen efficiently.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> AbBio CO., LTD. <120> Antibodies for determining an activity of botulinum toxin and a method for using the same <130> PDPB187217 <160> 90 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> clostridium botulinum <400> 1 Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> clostridium botulinum <400> 2 Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> clostridium botulinum <400> 3 Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Gln 1 5 10 15 Leu Val Glu Glu 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> clostridium botulinum <400> 4 Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln 1 5 10 15 Ile Asn Lys Asp 20 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> clostridium botulinum <400> 5 Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> clostridium botulinum <400> 6 Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 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43 Val Arg Gln Val Thr Thr Ala Val Gly Gly Phe Ala Tyr   1 5 10 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody CDR of clostridium botulinum <400> 44 Ala Arg Arg Ile Phe Tyr Asn Gly Arg Thr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr   1 5 10 15 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody CDR of clostridium botulinum <400> 45 Val Gly Gln Ile Leu Tyr Tyr Tyr Val Gly Ser Pro Ala Trp Phe Ala   1 5 10 15 Tyr     <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody CDR of clostridium botulinum <400> 46 Ala Arg Asp Arg Asp Ala Met Asp Tyr   1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody CDR of clostridium botulinum <400> 47 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr   1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody CDR of clostridium botulinum <400> 48 Lys Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr   1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala   1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr              20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile          35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe      50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr  65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 Val Arg Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser             100 105 110 Ser     <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody of clostridium botulinum <400> 88 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly   1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser              20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser          35 40 45 Pro Ser Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro      50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile  65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly                  85 90 95 Thr Leu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             100 105 110 <210> 89 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody of clostridium botulinum <400> 89 Gln Ile Gln Leu Ala Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu   1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr              20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met          35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe      50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe  65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys                  85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val             100 105 110 Ser Ser         <210> 90 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody of clostridium botulinum <400> 90 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly   1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser              20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser          35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro      50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile  65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly                  85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             100 105 110

Claims (22)

SNAP25(Synaptosomal nerve-associated protein 25)에 특이적으로 결합하는 항체로서,
상기 SNAP25는 SNAP25FL 또는 SNAP25197인 것이고,
상기 항체는 하기 (a) 내지 (l) 중에서 선택되는 어느 하나인 것인, 항체;
(a) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 11, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 14, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 17, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 20, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 23, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 25로 표시되는 항체;
(b) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 12, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 15, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 18, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 21, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 24, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 26으로 표시되는 항체;
(c) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 13, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 16, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 19, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 22, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 24, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 27로 표시되는 항체;
(d) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 28, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 34, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 40, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 47, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체;
(e) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 29, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 35, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 41, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 48, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체;
(f) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 29, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 36, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 42, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 47, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체;
(g) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 33, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 35, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 43, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 48, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체;
(h) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 30, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 37, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 44, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 48, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 52로 표시되는 항체;
(i) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 31, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 38, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 45, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 47, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 50, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 53으로 표시되는 항체;
(j) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 32, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 39, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 46, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 49, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 51, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 54로 표시되는 항체;
(k) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 55, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 57, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 59, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 61, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 63, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 65로 표시되는 항체;
(l) 중쇄 CDR1 영역이 서열번호 56, 중쇄 CDR2 영역이 서열번호 58, 중쇄 CDR3 영역이 서열번호 60, 경쇄 CDR1 영역이 서열번호 62, 경쇄 CDR2 영역이 서열번호 64, 및 경쇄 CDR3 영역이 서열번호 66으로 표시되는 항체.
As an antibody that specifically binds to SNAP25 (Synaptosomal nerve-associated protein 25)
The SNAP25 is SNAP25 FL or SNAP25 197 ,
Wherein the antibody is any one selected from the following (a) to (1);
(a) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 11, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 14, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 17, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 20, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 25;
(b) the heavy chain CDR1 region of SEQ ID NO: 12, the heavy chain CDR2 region of SEQ ID NO: 15, the heavy chain CDR3 region of SEQ ID NO: 18, the light chain CDR1 region of SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 region of SEQ ID NO: 26;
(c) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 16, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 19, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 22, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 27;
(d) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 28, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 34, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 40, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 47, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 52;
(e) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 29, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 35, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 41, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 48, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 52;
(f) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 29, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 36, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 42, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 47, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 52;
(g) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 35, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 43, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 48, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 52;
(h) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 30, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 37, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 44, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 48, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 52;
(i) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 31, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 38, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 45, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 47, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 53;
(j) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 32, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 39, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 46, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 49, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 54;
(k) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 55, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 57, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 59, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 61, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: 65;
(1) the heavy chain CDR1 region is SEQ ID NO: 56, the heavy chain CDR2 region is SEQ ID NO: 58, the heavy chain CDR3 region is SEQ ID NO: 60, the light chain CDR1 region is SEQ ID NO: 62, the light chain CDR2 region is SEQ ID NO: &Lt; / RTI &gt;
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항의 항체로 코팅된 배양접시.
A culture dish coated with the antibody of claim 1.
제 1항의 항체, 또는 제 15항의 배양접시를 포함하는, 키트.
A kit comprising the antibody of claim 1, or the culture dish of claim 15.
제 1항의 항체 생산용 하이브리도마 세포.
A hybridoma cell for the production of the antibody of claim 1.
제 17항에 있어서,
상기 하이브리도마 세포는 서열번호 1 내지 10으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 주사된 마우스의 비장세포와 골수종 세포가 융합된 것인, 하이브리도마 세포.
18. The method of claim 17,
Wherein the hybridoma cell is a fusion of spleen cells and myeloma cells of a mouse injected with at least one peptide selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 10.
(a) 개체로부터 분리된 신경세포에 보툴리눔 독소를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 신경세포에 제 1항의 항체로 SNAP25FL 또는 SNAP25197을 측정하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소의 활성을 결정하는 방법.
(a) treating a neuron isolated from an individual with a botulinum toxin; And
(b) measuring SNAP25 FL or SNAP25 197 as an antibody of claim 1 to said neuron.
제 19항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 활성을 결정하는 방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the botulinum toxin is a botulinum toxin type A. 22. A method for determining the activity of a botulinum toxin,
(a) 개체로부터 분리된 신경세포에 목적하는 시료를 처리하는 단계;
(b) 상기 신경세포에 제 1항의 (d) 내지 (l) 항체로 SNAP25197을 측정하는 단계; 및,
(c) SNAP25197이 측정되는 경우에 상기 시료에 보툴리눔 독소가 존재한다고 판단하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소의 검출 방법.
(a) treating a target sample with a neuron isolated from the subject;
(b) measuring the SNAP25 197 in claim 1 (d) to (l) an antibody to the neuronal cell; And
(c) determining that a botulinum toxin is present in the sample when SNAP25 197 is measured.
제 21항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 검출 방법.

22. The method of claim 21,
Wherein the botulinum toxin is a botulinum toxin type A,

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BR112021010306A BR112021010306A2 (en) 2018-11-29 2019-08-19 Cell-Based Method for Determining Botulinum Toxin Activity
US15/930,066 US10908148B2 (en) 2018-11-29 2020-05-12 Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
US15/930,100 US11169144B2 (en) 2018-11-29 2020-05-12 Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
US15/930,049 US10866232B2 (en) 2018-11-29 2020-05-12 Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111449A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 주식회사 에이비바이오 Cell-based method for determining botulinum toxin activity
WO2021075834A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 주식회사 하울바이오 Anti-snap 25 antibody for inhibiting snare complex, and use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8618261B2 (en) * 2008-03-14 2013-12-31 Allergan, Inc. Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays
KR101609894B1 (en) * 2008-03-14 2016-04-08 알러간, 인코포레이티드 Immuno-Based Botulinum Toxin Serotype A Activity Assays
WO2016097243A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Means and methods for the determination of the biological activity of bont/e in cells
KR20170026624A (en) * 2014-07-07 2017-03-08 알러간, 인코포레이티드 Method of detecting cleaved snap25 in tissue samples

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8618261B2 (en) * 2008-03-14 2013-12-31 Allergan, Inc. Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays
KR101609894B1 (en) * 2008-03-14 2016-04-08 알러간, 인코포레이티드 Immuno-Based Botulinum Toxin Serotype A Activity Assays
KR20170026624A (en) * 2014-07-07 2017-03-08 알러간, 인코포레이티드 Method of detecting cleaved snap25 in tissue samples
WO2016097243A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Means and methods for the determination of the biological activity of bont/e in cells

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020111449A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 주식회사 에이비바이오 Cell-based method for determining botulinum toxin activity
US11360081B2 (en) 2018-11-29 2022-06-14 Hugel Inc. Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
WO2021075834A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 주식회사 하울바이오 Anti-snap 25 antibody for inhibiting snare complex, and use thereof
KR20210045569A (en) * 2019-10-16 2021-04-27 주식회사 하울바이오 Anti-SNAP 25 antibodies inhibiting SNARE complex and use thereof
KR102274841B1 (en) 2019-10-16 2021-07-12 주식회사 하울바이오 Anti-SNAP 25 antibodies inhibiting SNARE complex and use thereof

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