KR101980819B1 - 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 - Google Patents

자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는, 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체는 소량의 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터 극미량으로 존재하는 세포 유리 DNA를 효율적 및 초고감도로 검출할 수 있는바, 암 조기 진단, 치료, 뿐만 아니라 유전자 변이 진단 서비스로의 활용이 기대된다.

Description

자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 {Magnetic nanostructure for detecting and isolating circulating cell-free DNA comprising conductive polymers containing magnetic nanoparticles and cationic polymers}
본 발명은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체에 관한 것이다.
최근 전 세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있으며, 따라서 암 조기 진단 방법에 대한 연구 비중이 증가하고 있는 추세이다. 그러나 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사 등의 침습적인 방법이 주를 이루고 있다. 특히, 현재 주로 활용되는 조직검사는 질병이 의심되는 부위의 일부를 적출해 현미경으로 관찰하는 방식으로 이뤄지기 때문에, 조직 샘플을 채취하기 위해 침이나 펀치, 내시경, 또는 복강경 등을 이용해 인체를 절개하여, 환자가 느끼는 불편함이 적지 않고, 흉터가 남으며, 회복에도 시간이 걸린다.
이러한 기존의 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체 검사를 이용한 분자진단법이 주목을 받고 있다. 액체 생체 검사는 비 침습적인(non-invasive) 방법을 사용하기 때문에, 검사 결과 도출 속도가 빠르며, 질병의 일부분만 분석할 수 있었던 조직 샘플과 달리, 체액 즉 액체 생체 샘플은 질병에 대해 다각적 분석을 수행할 수 있다. 특히, 액체 생체 검사는 암의 진단에 탁월한 효용성을 발휘할 것으로 전망되며, 혈액, 소변 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액 내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능할 것으로 예측된다.
또한, 분자진단법은 체외진단의 대표적인 기술로 혈액, 소변 등의 유전자 정보가 들어 있는 시료로부터, DNA, RNA에서 일어나는 분자 수준 변화를 수치 또는 영상을 통해 검출해 진단하는 기법이다. 이는 정확도가 높으며 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점이 있기 때문에, 유전체 분석기술의 급속한 발전과 함께 비용 절감의 장점을 바탕으로 암 진단 기술에 응용하려는 노력이 시도되고 있다.
또한, 세포-유리 DNA(cell-free DNA; cfDNA)는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암 세포 유래 DNA를 의미하며, 괴사, 세포 사멸 또는 비뇨기관의 정상세포 및/또는 암세포에서 활성화되어, 다양한 세포 생리학적 과정을 통해 소변, 혈액 등으로 방출된다. 따라서, 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서 유래된 cfDNA를 분리하고 검출하는 기술이 발전함에 따라, 액체 생체 검사가 암 위험군 환자를 모니터링 하는 데 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 도구가 될 것이다. 실제로 소변, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid; CSF), 혈장, 혈액, 또는 체액은 쉽게 얻을 수 있는 시료이므로, 반복적인 샘플링을 통해 대량의 단순하고 비-침습적인 검체의 수집이 가능하다. 이에 따라 암 진단에 있어서 가장 비침습적인 액체 생체 검체를 통하여 병원체의 DNA를 검출하고 분석하는 방법이 주목을 받고 있다.
그러나, 혈액, 소변 등 액체 시료 내 cfDNA를 분석하고 유전자에서 발생하는 변이를 발견하여 암을 조기 진단하는 방법에는 현재의 기술로는 많은 한계가 있다(한국 공개 특허 10-2016-0129523). 특히, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액의 시료 내에 cfDNA가 매우 적은 농도로 존재하며, cfDNA가 노화 과정에서 자연스러운 유전자 변이가 발생할 수 있는데, 이는 반드시 암으로 진행되는 것이 아니며 설령 암으로 진행되어도 큰 문제를 일으키지 않는 경우도 있다. 따라서 검출 민감도의 향상 및 정확한 암 조기 진단을 위한 방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
따라서 cfDNA가 액체 시료에서 극히 낮은 수준으로 발견되기 때문에, 높은 품질과 적은 시료 양으로 DNA 추출 프로토콜을 개발하는 것이 분자 분석 과정에서 가장 중요한 단계이며, 본 발명의 자성 나노 구조체를 이용하여, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 액체 시료로부터 cfDNA의 초고감도 검출, 농축, 분리 기술이 확립될 수 있을 것으로 기대한다.
본 발명자는 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 제조하여, 상기 구조체가 소량의 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터, 다양한 종류의 세포 유리 DNA를 효율적으로 검출할 수 있으며, 시료에 극미량으로 존재하는 세포 유리 DNA의 검출, 분리 및 회수에 있어 월등하게 향상된 효과를 가지는 것을 확인한바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는, 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여 세포-유리(cell-free) DNA의 검출 및/또는 회수방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 포함하는 암 진단키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여 암의 발병 및/또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여 암 진단 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 제공한다.
이때, 상기 자성 나노 구조체는 상기 양이온성 고분자로 표면처리 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 양이온성 고분자 및 상기 전도성 고분자는 비오틴(biotin) 및 스트렙타비딘(streptavidin)의 결합으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전도성 고분자는 폴리피롤(polypyrrole) 또는 이의 유도체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 자성 나노 구조체는 자성 나노 와이어일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세포-유리 DNA는 pH의 변화에 따라 상기 자성 나노 구조체로부터 분리될 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 개체 시료에 처리하는 단계; (2) 상기 시료에 포함된 세포-유리 DNA가 상기 자성 나노 구조체에 부착되는 단계; (3) 상기 개체 시료로부터 상기 세포-유리 DNA가 부착된 자성 나노 구조체를 분리하는 단계; 및 (4) 상기 세포-유리 DNA가 부착된 상기 (3) 단계의 자성 나노 구조체로부터 pH의 변화에 따라 상기 세포-유리 DNA를 분리시키는 단계를 포함하는 세포-유리 DNA 검출 및 회수방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 검출 및 회수방법에 있어, 상기 시료는 소변, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid; CSF), 혈장, 혈액, 또는 체액일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 암은 자궁경부암, 폐암 또는 유방암을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체로부터 DNA를 검출 또는 회수하여 분석하는 단계를 포함하는 암의 발병 및/또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용한 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체는 소량의 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터 다양한 종류의 세포 유리 DNA(cfDNA)를 효율적으로 검출할 수 있다. 보다 구체적으로, 다량의 자성 나노 입자를 전기중합 과정 중에 탑재함으로써 발생되는 강한 자기장으로 인해 시료에 극미량으로 존재하는 세포 유리 DNA를 효율적으로 포획할 수 있으며, 세포 유리 DNA의 검출, 분리 및 회수에 있어서, 자성 나노 와이어 구조체의 긴 구조로 인해, 다량의 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민을 부착할 수 있으며, 이로써 시료에 존재하는 DNA의 포획 효율을 월등히 높일 수 있는바, 검출 민감도가 향상되어 종래 기술에 비하여 현저하게 증가된 세포 유리 DNA의 검출 및 회수 효과를 나타낸다. 또한, 자성 나노 와이어의 실처럼 얇고 긴 구조는 혈액 또는 소변에 존재하는 다량의 세포 또는 단백질 등의 틈을 뚫고 들어가 암 관련 cfDNA를 효과적으로 찾고, 포획할 수 있으므로 월등히 향상된 검출 효율을 보여준다. 따라서 본 발명에 따른 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체는 암 조기 진단, 치료, 뿐만 아니라 DNA를 추출하여 유전자 변이 진단 서비스로의 활용이 기대된다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 이용하여 세포-유리 DNA(cfDNA)를 검출 및 회수하는 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b 및 도 2c는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2d는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 자성 나노 입자(MNP)의 자기 이력 곡선(magnetic hysteresis loop)을 나타낸 결과이다.
도 2e는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 부착 및 분리 과정에서 표면 전하의 변화를 모니터링하기 위해 제타전위 값을 조사한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)를 이용하여, 게놈 DNA의 높은 회수 효율을 확인한 결과이다.
도 3b 및 도 3c는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 포집 후, 회수된 DNA를 직접적으로 확인한 공초점 형광 이미지 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 검출 한계 (LOD)를 나타낸 결과이다.
도 5a는 자궁경부암 환자의 자궁경부에서 면봉으로 채취된 세포시료로부터, HPV DNA 유전자형(genotyping)을 확인하고자, 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Roche Cobas 4800 HPV Test를 사용하여 비교한 결과이다.
도 5b는 자궁경부암 환자의 자궁경부 표본시료로부터 회수된 DNA의 증폭을 대표적으로 도식한 결과이다.
도 6은 본 발명의 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 이용하여 소변시료에서의 세포-유리 DNA(cfDNA)를 검출 및 회수하는 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 HPV18-positive(HeLa) 세포 또는 HPV16-positive(SiHa) 세포를 HPV-negative 소변시료에 혼합하여, 각각 다른 분자량의 폴리에틸렌이민(PEI 800Da 또는 25kDa)이 접합된 본 발명의 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)의 cfDNA 포집 및 회수 효율을 나타낸 것이다.
도 7c 및 도 7d는 HPV18-positive(HeLa) 세포 또는 HPV16-positive(SiHa) 세포를 HPV-negative 소변시료에 혼합하여, 각각 다른 시간으로 반응시킨 결과, 본 발명의 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)의 cfDNA 포집 및 회수 효율을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 소변시료에서의 DNA 검출 한계(LOD)를 나타낸 결과이다.
도 9a는 자궁경부암 환자의 소변시료에서 회수된 cfDNA 농도를 측정한 결과이다.
도 9b는 자궁경부암 환자의 HPV 유전자형 프로파일을 분석한 결과이다.
도 10a는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 사용하여 건강한 대조군과 자궁경부암 환자의 소변시료에서 회수된 cfDNA의 농도를 측정한 결과이다.
도 10b 및 도 10c는 소변시료 또는 면봉으로 채취한 자궁경부 세포시료에서 유형 특이적 HPV 검출을 확인한 결과이다.
도 11a는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 사용하여 추출된 cfDNA의 크기별 검출 효율을 확인한 결과이다.
도 11b는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 사용하여, 자성 나노 구조체의 길이에 따른 DNA 검출 효율을 확인한 결과이다.
도 11c는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Qiagen kit를 이용하여 DNA 검출 효율을 비교한 결과이다.
도 11d는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Qiagen kit를 이용하여 DNA 회수 효율을 비교한 결과이다.
도 11e는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Qiagen kit를 이용하여 유방암 및 폐암 환자의 혈장 내에 존재하는 cfDNA 검출 효율을 비교한 결과이다.
도 11f 는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Qiagen kit를 이용하여 DNA를 회수한 후, PCR 증폭하여 DNA의 변이를 확인한 결과이다.
도 11g는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Qiagen kit를 이용하여 DNA를 회수한 후, EGFR exon 19 E746_A750del 유전자 변이를 평가한 결과이다.
도 11h는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 상업용 Qiagen kit를 이용하여 DNA를 회수한 후, EGFR exon 21 L858R 유전자 변이를 평가한 결과이다.
도 11i는 본 발명의 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 이용하여 폐암 환자의 혈장 또는 뇌척수액 (CSF)으로부터 검출한 cfDNA 및 암 조직의 유전자 변이를 비교한 결과이다.
본 발명은 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체에 대한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 자성 나노 구조체는 소량의 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터, 다양한 종류의 세포 유리 DNA를 효율적으로 검출할 수 있으며, 시료에 극미량으로 존재하는 세포 유리 DNA의 검출, 분리 및 회수에 있어서 월등하게 향상된 효과를 가지는 것을 확인한 바, 암의 예방, 진단 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체로서, 상기 자성 나노 구조체는 상기 양이온성 고분자로 표면처리 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "세포-유리(cell-free) DNA(cfDNA)"는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암 세포 유래 DNA를 의미하며, 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 역시 이에 포함된다. 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터 상기 세포 유리 DNA를 분석하여, 체액 검사 방법을 이용한 비 침습적, 비수술적인 방법으로써 암 세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능하며, 기존의 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안이 될 수 있다. 또한, 상기 세포-유리 DNA의 검출을 통해 암 진단 및 암 환자의 예후를 관찰할 수 있다.
본 발명의 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없으나, 바람직하게는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 양이온성 고분자 및 상기 자성 나노 구조체는 비오틴(biotin) 및 스트렙타비딘(streptavidin)의 결합으로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 전도성 고분자는 폴리피롤(polypyrrole) 또는 이의 유도체일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 자성 나노 구조체는 자성 나노 와이어일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 자성 나노 와이어는 전기화학적 증착 과정 동안, 다량의 자성 나노 입자, 전도성 고분자인 폴리피롤 및 비오틴이 함께 도핑(doping)되며, 이 결과, 궁극적으로 양이온성 분지형 고분자인 폴리에틸렌이민이 상기 자성 나노 구조체에 많은 용량으로 도입될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 자성 나노 구조체는 자성 나노 입자 및 비오틴 분자가 도핑된 프리-스탠딩 폴리피롤 나노 와이어(free-standing Ppy NWs) 형태로 제조되며, 생성된 나노 와이어에 N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS)를 첨가하여 카복실산(-COOH; carboxylic acid)기를 활성화시켜, 생성된 자성 나노 와이어에 스트렙타비딘(streptavidin)을 표지시킨다. 그 후, 스트렙타비딘이 표지된 나노 와이어를 비오틴이 도입된 PEI 용액에 첨가하여, 자성 나노 와이어에 비오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 접합시킨다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 안에 자성 나노 입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다. 이러한 자성 나노 와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA를 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성, 및 적용된 자기장에 대한 높은 반응성으로부터 발생하는 자성 나노 와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적이며, 정전기적 상호 작용을 통해 표적 DNA에 대한 탁월한 접촉 및 결합을 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포-유리 DNA는 인유두종 바이러스 DNA(human papillomavirus DNA; HPV DNA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 인유두종 바이러스(Human papilloma virus, HPV)는 인체 감염 시 사마귀, 자궁경부암의 발생 원인이 되는 파필로마바이러스과에 속하는 이중 나선상 DNA 바이러스로서, 피부 및 점막의 상피 이상을 초래하는 가장 일반적인 바이러스이다. 이 중 고위험군(high-risk group)인 발암성 인유두종 바이러스가 자궁경부암과 연관성이 높다고 알려져 있으며, 고위험군인 HPV 유전자가 숙주 유전자에 삽입되어 증식되며 자궁경부 상피 내 종양이라는 암 전단계를 거쳐 종양을 형성하는 것으로 보고되어 있다. 특히, HPV16 및 HPV18은 자궁경부 상피 내 종양 (cervical intraephithelial neoplasia, CIN), 편평상피세포종양 (squamous cell carcinoma, SCC) 조직의 90% 이상에서 검출되며, 따라서, 발암성 인유두종 바이러스 중 HPV16, HPV18이 가장 중요하고 전 세계적으로 70% 이상의 자궁경부암에서 발견된다. 일반적으로 인유두종 바이러스의 분자진단법은 임상 샘플에서 추출한 게놈 DNA를 증폭시켜 HPV 감염 여부를 확인하는 데 주로 사용된다. 이러한 분자진단법은 분자 수준에서 특정 유전자 서열의 존재를 확인함으로써, 질병 진행의 예측과 모니터링에 대한 중요한 통찰력을 제공한다. 실제로, 표적화된 유전 물질의 효율적인 검출은 질병의 근본적인 메커니즘을 밝히는 것뿐만 아니라 수집된 정보에 입각하여, 치료 결정을 용이하게 한다. 그러나 종래의 분자진단법에서 사용되고 있는 실시간 PCR(real-time PCR) 기반의 방법은 낮은 임상 민감성과 특이성으로 인해 HPV 감염의 조기 진단을 제공하지 못한다는 한계가 있다. 현재 HPV 감염의 선별검사 방법으로는 전통적인 방식의 자궁경부세포검사 (cervical cytology)가 사용되고 있으며, 이러한 종래의 검사법은 자궁경부에서 세포를 채취해야 하므로 거부감 및 불편감으로 인해 정기적인 검진의 어려움이 발생한다. 그러나 정기적인 자궁경부암 검진은 자궁경부암 발생을 60% 예방할 수 있으며, 따라서, 비침습적이며 거부감이 적은 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 시료를 이용한 올바른 자궁경부암 선별검사의 시행은 저비용, 고효율의 자궁경부암 발생을 예방하고 및 사망률을 줄이는데 핵심적인 요소가 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 시료로부터 cfDNA를 초고감도로 검출한 후, 추출된 cfDNA를 사용하여 HPV의 분자적 진단을 시행할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포-유리 DNA는 pH의 변화에 따라 상기 자성 나노 구조체로부터 분리될 수 있다. 보다 바람직하게는, 산성 또는 중성(pH 3 내지 7)의 환경에서 DNA의 포획이 현저하게 증가하고, 마찬가지로 염기성(pH 10)의 환경에서 DNA의 분리 효율이 현저하게 증가한다. 이는 낮은 pH에서 폴리에틸렌이민(PEI)의 아민기 (NH2; pKa = 7.11)의 양성자화(protonation)에 기인하며, 그 결과, DNA에서 음으로 하전된 인산기와의 정전기적 상호작용을 강화시켜 결국 자성 나노 와이어의 DNA 부착 능력을 극대화시킨다. 자성 나노 와이어에 결합된 DNA의 pH 의존성 방출 패턴을 정량적으로 확인한 결과, 자성 나노 와이어로부터 용출된 DNA는 pH 값이 증가함에 따라 유의하게 증가하였다. 이러한 양상은 폴리에틸렌이민(PEI)의 아민기의 탈양성자화(deprotonation)와 직접적인 관련이 있으며, 궁극적으로 폴리에틸렌이민/DNA 복합체의 형성을 변경시키는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 세포-유리 DNA의 검출 및/또는 회수방법을 제공한다. 보다 구체적으로 (1) 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 개체 시료에 처리하는 단계; (2) 상기 시료에 포함된 세포-유리 DNA가 상기 자성 나노 구조체에 부착되는 단계; (3) 상기 개체 시료로부터 상기 세포-유리 DNA가 부착된 자성 나노 구조체를 분리하는 단계; 및 (4) 상기 세포-유리 DNA가 부착된 상기 (3) 단계의 자성 나노 구조체로부터 pH의 변화에 따라 상기 세포-유리 DNA를 분리시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 생물학적 시료일 수 있으며, 바람직하게는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 액체 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 상기 암은 그 종류에 있어서 제한이 없으며, 다양한 암종에 적용 가능하다. 따라서 간암, 대장암, 직장암, 폐암, 자궁내막암, 난소암, 신우암, 췌장암, 소장암, 간췌담도암, 위암, 뇌종양 및 유방암 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 진단키트는 바이오센서일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 암의 발병 및/또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 방법은 본 발명의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체로부터 DNA를 추출 또는 분리하여 분석하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 분석은 시료 중 DNA의 농도, 카피 수 또는 염기서열을 분석하여 유전자 변이 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 나노 구조체를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체로서, 폴리에틸렌이민의 양이온성 고분자으로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 제조하고, 상기 자성 나노 구조체의 형태학적 특성을 평가한 결과, 자성 나노 입자가 높은 밀도로 본 발명의 자성 나노 구조체에 매립된 것을 확인하였다(실시예 1 참조).
또한, 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 자궁경부 표본시료(ervical swab specimens)에서의 DNA 검출 및 회수 효율을 평가하기 위해, pH 변화에 따른 DNA 포집 및 분리 효율을 평가(실시예 2-1 참조)하고, 자궁경부 표본시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체의 DNA 검출 한계(LOD)를 평가(실시예 2-2 참조)하였으며, 자궁경부 표본시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체 및 상업용 Cobas 4800 HPV 시스템을 이용한 HPV 유전자형 분석 및 DNA 포집 효율을 비교(실시예 2-3 참조)하였다.
또한, 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 소변시료로부터 DNA 검출 및 회수 효율을 평가(실시예 3-1 참조)하고, 소변시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체의 DNA 검출 한계(LOD)를 평가(실시예 3-2 참조)하였으며, 소변시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체를 이용한 HPV DNA를 회수(실시예 3-3 참조)하였으며, 소변시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체를 이용한 암환자 또는 건강한 대조군의 HPV 유전자형 분포 패턴을 평가(실시예 3-4 참조)하였다.
또한, 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 혈장시료로부터 DNA 검출 효율을 평가(실시예 4-1 참조)하고, 혈장시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체의 길이에 따른 DNA 포집 및 회수 효율을 평가(실시예 4-2 참조)하였으며, 혈장시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체 및 상업용 Qiagen kit와의 DNA 검출 효율을 비교(실시예 4-3 참조)하였으며, 유방암 또는 폐암 환자의 혈장시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체 및 상업용 Qiagen kit와의 DNA 검출 효율을 비교(실시예 4-4 참조)하여, 폐암 환자의 혈장시료로부터 본 발명에 따른 자성 나노 구조체 및 상업용 Qiagen kit로 회수된 DNA의 변이를 확인(실시예 4-5 참조)하였다. 또한, 본 발명의 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 이용하여, 혈장 또는 뇌척수액 시료로부터 DNA 검출 효율을 평가(실시예 4-6 참조)하였다.
따라서, 본 발명에 따른 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 시료에 존재하는 DNA의 검출 및 회수에 있어서 그 효율을 월등히 높일 수 있으며, 민감도가 향상된바, 암 조기 진단, 치료뿐만 아니라 DNA를 추출하여, 유전자 변이 진단 서비스로의 활용이 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 제조 및 형태학적 특성 평가
1-1. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 제조
도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)이 표면에 접합된 자성 나노 구조체를 제조하였다. AAO 주형(template)의 한 면을 Q150T 모듈러 코팅 시스템(Quorum Technologies, UK)을 사용하여 5 × 10-3 mbar 및 50 mA에서 600 초 동안 금(Au) 층(약 150 ㎚ 두께)으로 코팅하였다. 모든 전기화학적 실험은 금(Au) 코팅된 AAO 주형에서 백금 와이어 상대 전극과 Ag/AgCl(3.0 M NaCl type) 비교 전극을 구비한 potentiostat/galvanostat(BioLogic SP-150)를 사용하여 측정하였다. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 제조를 위해 자성 나노 입자(MNP, 5 ㎍/㎖, diameter 10 ㎚)를 금(Au) 코팅된 AAO 디스크 위에 부착시키고자, 자성 나노 입자를 배양하여 상온(RT)에서 적당한 흡인으로 AAO 기공에 침투시켰다. AAO 주형의 기공에 0.01M 폴리(4-스티렌설폰산)(poly(4-styrene sulfonic acid)) 및 1 ㎎/㎖ 의 비오틴(biotin)을 함유하는 0.01 M 피롤용액과 함께 1.0 V (vs. Ag/AgCl)에서 7분 동안 크로노암페로메트리(chronoamperometry)를 적용하여 전기화학적 증착을 수행하였다. 생성된 AAO 주형을 증류수로 여러 번 세척하고, 2 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액에 3 시간 동안 담갔다가 초음파 처리를 위해(Bioruptor® UCD-200, Diagenode)에 넣어 자성 나노 입자 및 비오틴 분자가 도핑된 프리-스탠딩 폴리피롤 나노 와이어(free-standing Ppy NWs)를 얻었다. 그 후, 생성된 나노 와이어에 30 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) 및 6 mM N-hydroxysuccinimide (NHS)를 첨가하여 카복실산(-COOH; carboxylic acid)기를 활성화하였다. 이어서, 생성된 나노 와이어를 스트렙타비딘(streptavidin; 10 ㎍/㎖)과 함께 45분 동안 배양하고 증류수로 세척하였다. 이후, 스트렙타비딘이 표지된 나노 와이어를 비오틴이 도입된 PEI 용액에 첨가한 후, 추가로 상온에서 1 시간 동안 배양하고, 물로 세척한 후, 자기장을 이용하여 분리(magnetic separation)하였다. 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 탈이온수에 분산시키고 사용할 때까지 실온에서 보관하였다. 이러한 제조방법으로 인해, AAO 주형이 선택적으로 용해된 후, 각각의 폴리피롤(Ppy) 자성 나노 와이어가 AAO 주형으로부터 방출되고, 자성 나노 와이어에 비오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI, 25 kDa)이 추가로 접합되었다.
1-2. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 형태학적 특성 평가
폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 형태(morphology)는 주사전자현미경(field emission scanning electron microscope; SEM, JSM 7800F, JEOL) 및 투과전자현미경(field emission transmission electron microscope; TEM, G2F30, Tecnai)을 이용하여 관찰하였다. 자기력 측정은 SQUID-VSM magnetometer(MPMS-VSM, Quantum design)를 이용하여 수행하였다. 또한, PEI/mPpy NW의 표면 전하(surface charge)는 제타전위 측정기(Zetasizer Nano ZS, Malvern)로 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 주사전자현미경(SEM) 이미지(스케일바 10 ㎛, 확대도의 스케일바 1 ㎛) 및 도 2b에 나타낸 투과전자현미경(TEM) 이미지(스케일바 500 ㎚)를 통해 약 200 ㎚의 직경 및 약 16 ㎛의 평균 길이를 갖는 비교적 긴 길이의 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW) 합성을 확인하였다. 또한, 상대적으로 다양한 길이 분포를 갖는 PEI/mPpy NW의 형태를 확인하였다. 이러한 나노 와이어의 긴 형태는 더 큰 유연성 및 다목적성을 보장한다.
또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 투과전자현미경(TEM) 이미지(스케일바 50 ㎚)는 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 안에 자성 나노 입자(MNP; <10 ㎚ 직경)가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립된 것을 확인하였다.
또한, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 자성 나노 입자(MNP) 및 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW; MNW)에 대한 포화 자화 값을 측정하여, 자화 곡선을 도식한 결과, 같은 수의 자성 나노 입자가 나노 와이어에 결합되었을 때, 자성 나노 와이어의 자화 거동(magnetization behavior) (포화 자화 = 82 emu/g)이 MNP (포화 자화 = 45 emu/g)의 자화 거동보다 큰 것을 확인하였다. 특히, 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)의 자기력은 나노 와이어 내에 존재하는 고밀도의 산화철 나노 입자의 기하학적 감금(geometric confinement)과, 그 결과로 인한 각각의 나노 입자 자기 모멘트의 정렬 결과에 의해 강화되었다.
또한, 도 2e에 나타낸 바와 같이, DNA 포획 및 회수 과정에서 표면 전하의 변화를 모니터링하기 위해 제타전위 값을 조사한 결과, positive(+) (Ⅱ)에서 negative(-) (Ⅲ)로의 제타전위의 변화는 DNA가 자성 나노 와이어에 부착된 결과로 발생하였다. 그 후, 자성 나노 와이어로부터 포획된 DNA의 pH에 의한 분리 결과, 순수 DNA (I)의 값과 유사하게 제타전위(IV) 값이 명백하게 감소됨을 확인하였다. (Ⅱ): 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW), (Ⅲ): 자성 나노 와이어에 포집된 DNA (DNA-PEI/mPpy NW 복합체), (Ⅳ) pH 10에서 PEI/mPpy NW로부터 방출된 DNA (순수한 DNA가 용출됨)
실시예 2. 자궁경부 표본시료(cervical swab specimens)에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 효율 평가
2-1. pH 변화에 따른 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 포집 및 회수 효율 평가
양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 분리 기술로서의 활용 가능성을 확인하기 위해, DNA 포집 및 회수 효율을 평가하였다. HPV positive 세포주인 HeLa 세포 (HPV18-positive) 또는 SiHa 세포 (HPV16-positive)로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하여, 알려진 농도의 게놈 DNA를 체외 (ex vivo)에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 혼합(spike)하여 평가하였다. 보다 구체적으로, HeLa 세포 또는 SiHa 세포로부터 회수된 게놈 DNA를 Tris-EDTA buffer (완충액) (10 mM)에 다양한 양(0.01 내지 1000 ng/㎖)으로 넣은 후, 다양한 농도가 되도록 제조하였다. 즉각적인 DNA 포집을 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 (5 ㎕, 0.05 ㎎/100 ㎕)를 게놈 DNA를 함유하는 용액에 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 그 후, 30 분 동안 자성선반(magnetic rack)에 놓은 뒤, 결합되지 않거나, 또는 비특이적으로 결합한 성분을 분리하고 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)에 부착된 DNA를 포집하였다. 포집된 DNA를 상온의 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 10.0)에서 1 시간 동안 와류시켜 (vortexing) DNA를 용출시켰다. 포집된 후 방출된 DNA를 제조사의 지시에 따라 PicoGreen 분석법으로 정량화하고, 공초점 현미경으로 DNA의 포집을 확인하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 혼합한 게놈 DNA의 양에 관계없이, 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)를 이용한 DNA 회수에서 높은 성능을 확인하였으며, 자성 나노 와이어는 95 % 이상의 효율로 10 pg/㎖의 낮은 농도에서도 게놈 DNA를 성공적으로 포집하였다. 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성, 및 적용된 자기장에 대한 높은 반응성으로부터 발생하는 자성 나노 와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적이며, 정전기적 상호 작용을 통해 표적 DNA에 대한 탁월한 접촉 및 결합을 유도할 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 3b 및 도 3c에 나타낸 바와 같이, PicoGreen으로 염색한 후 공초점 형광 이미지를 통해, 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)에서 포집 후, 회수된 DNA를 직접적으로 확인하였다. pH 10에서 DNA-PEI/mPpy NW 복합체의 배양 후, 포집된 DNA는 자성 나노 와이어로부터 완전히 분리되었음을 확인하였고, DNA 포집 효율이 산성 또는 중성 환경 (pH 3 내지 7)에서 현저하게 증가함을 관찰하였다. 이러한 경향은 낮은 pH에서 폴리에틸렌이민(PEI)의 아민기 (NH2; pKa = 7.11)의 양성자화(protonation)에 기인하며, 이는 DNA에서 음으로 하전된 인산기와의 정전기적 상호작용을 강화시켜 결국 자성 나노 와이어의 DNA 부착 능력을 극대화시킨다. 자성 나노 와이어에 결합된 DNA의 pH 의존성 방출 패턴을 정량적으로 확인한 결과, 자성 나노 와이어로부터 용출된 DNA는 pH 값이 증가함에 따라 유의하게 증가하였다. 이러한 양상은 폴리에틸렌이민(PEI)의 아민기의 탈양성자화(deprotonation)와 직접적인 관련이 있으며, 궁극적으로 폴리에틸렌이민/DNA 복합체의 형성을 변경시키는 것으로 확인되었다. PicoGreen 시약은 이중가닥 DNA에 대한 특이적 결합으로 인해, 선명한 녹색 시그널을 나타내며, 이는 자성 나노 와이어에 의한 DNA 포집 및 회수의 뚜렷한 지표이다. pH 7에서 자성 나노 와이어의 공초점 이미지는 강한 녹색 형광을 나타내어 PEI-MNW 표면에 DNA가 직접 흡착되었음을 나타내며, 반대로, pH 10에서 자성 나노 와이어의 전하 반전이 일어나, DNA가 pH에 의해 해리되어 형광 신호가 관찰되지 않았다. 표시된 데이터는 다섯 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.
2-2. 자궁경부 표본시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 검출 한계(LOD) 평가
상기 실시예 2-1에 나타낸 바와 같이, HPV positive 세포주인 HeLa 세포 (HPV18-positive) 또는 SiHa 세포 (HPV16-positive)로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 회수하여, 알려진 농도의 게놈 DNA를 체외 (ex vivo)에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 혼합(spike)하여, 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 검출 한계(LOD)를 평가하고자 하였다. 보다 구체적으로, DNA 서열의 검출 및 증폭에 있어, 자성 나노 와이어의 광범위한 적용 가능성을 평가하기 위해 HeLa (HPV18, 10 내지 50 copies/cell) 및 SiHa (HPV16, 1 내지 2 copies/cell)의 검출 한계 (limit of detection; LOD)를 분석하였다. 일반적으로 검출 한계 (LOD)는 임계 사이클 (threshold cycle; Ct)값을 기준으로 95 % 이상의 양성 결과가 검출된 HPV DNA의 최저 농도로 정의한다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 검출 한계 (LOD)는 HPV16 및 HPV18에 대해 3 cells/㎖ 이었다. 이와 유사하게, 도 4b에 나타낸 바와 같이, SiHa (좌) 및 HeLa (우) 세포주로부터 회수된 게놈 DNA를 완충 생리 식염수 (PBS)에 추가하여, 그 양에 따라 임계 사이클(Ct) 값을 도식하였다. 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)로부터 회수된 DNA의 임계 사이클(Ct) 값의 감소는 SiHa (좌) 및 HeLa (우) 세포주로부터의 회수하여 추가한 게놈 DNA의 양의 함수로서 관찰되었다. 이러한 결과로부터 자성 나노 와이어는 분석 민감도, 정량 정확도 및 재현성을 크게 향상시켜, DNA 포획 및 회수에 있어 적합한 것을 확인하였다. 특히, 극히 낮은 수준의 HPV DNA를 탐지할 때, DNA의 검출에 있어서 효율이 월등하게 개선되었다.
2-3. 자궁경부 표본시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 Cobas 4800 HPV 시스템을 이용한 HPV 유전자형 분석 및 DNA 포집 효율 비교
HPV 관련 암의 발병률이 빠르게 증가하고 있으므로 HPV 유전자형, 특히 고위험 HPV16 및 HPV18의 보다 민감하고 구체적인 검출 전략은 질병 진단 및 치료를 위한 임상에 적용 가능하다고 판단하여, 자궁경부암 환자의 자궁경부에서 채취된 면봉 세포시료(cervical swab specimens)에서 HPV DNA의 추출 효율을 평가하고 HPV16, HPV18, 및 12 가지 추가 유형 등 여러 HPV 유전자형을 확인함으로써 상기 실시예 1에서 제조한 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 임상적 유용성을 확인하고자 하였으며, 그 결과는 Roche Cobas 4800 HPV Test를 사용하여 얻은 결과와 비교되었다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW) 및 FDA 승인된 Cobas 4800 HPV 시스템의 DNA 포집 효율을 비교하고자, 자궁경부 표본시료(cervical swab specimens)를 무균 PBS로 처리하여, 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 증폭한 뒤, 다중 HPV 유전자형(multiple HPV genotypes)을 분석하였다. 국립암센터(고양, 한국)의 자궁경부암 환자로부터, 자궁경부 면봉 표본시료를 채취하였다. 모든 검체를 수집하여 Cobas PCR Cell Collection Media (Roche Molecular Systems, Inc.)에 넣고 4 ℃에서 검사를 수행할 때까지 보관하였다. 시료의 다중 HPV 유전자형 분석을 위해, Cobas x 480 기기(instrument) 및 Cobas z 480 분석기(analyzer)를 사용하여, Real-time PCR의 분석을 통해, Cobas 4800 HPV Test를 수행하였다. Cobas x 480을 이용하여 HPV DNA를 추출하고자, 각 시료 (400 ㎕)를 chaotropic 시약으로 점점 온도를 높여가며 용해시켰다. HPV DNA는 자성 유리 입자(magnetic glass particles)와 함께 세포 용해물(cell lysate)에서 추출 및 정제 되었으며, 용리 완충액(elution buffer; 150 ㎕)으로 용출하였다. 그 후, 용리액(eluate; 25 ㎕)을 같은 부피의 PCR master mix에 첨가하고 Cobas z 480 장비로 증폭시켰다. 마찬가지로, 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 사용하여, 각 시료(300 ㎕)에서 HPV DNA를 추출하였다. 세포 용해를 위해 각 시료(300 ㎕)에 유리 비드(80 ㎎)를 넣은 후, 즉시 PEI/mPpy NW (5 ㎕, 0.05 ㎎/100 ㎕)를 용액에 첨가하고 1 시간 동안 와류(vortexing)시켰다. HPV DNA를 nuclease-free water (58 ㎕)로 용출시킨 후, 용출된 DNA (13 ㎕)를 같은 부피의 Cobas HPV master mix와 혼합하고 Roche LC480 장비로 증폭시켰다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 자궁경부암 환자의 자궁경부에서 면봉으로 채취된 세포시료로부터, HPV DNA 유전자형 (genotyping)을 확인하고자, 자성 나노 와이어 및 Roche Cobas 4800 HPV Test를 사용하여 비교하였다. Roche Cobas 4800 HPV Test는 FDA가 승인한 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한, DNA 증폭 키트로서 다중 HPV 유전자형의 검출을 위해 임상 민감도, 특이성 및 강력한 재현성을 제공한다. 자성 나노 와이어를 사용하여 자궁경부암 환자의 자궁경부 표본시료(cervical swab specimens)의 게놈 DNA를 회수하고, 액체기반 세포 배지에서 DNA를 수집한 후 quantitative real-time PCR amplification을 사용하여 HPV16, HPV18 및 추가 12 개 유전자형의 존재를 직접 확인하였다. 분석 민감도는 3가지 종류의 HPV에서 Roche Cobas HPV Test의 분석 민감도 결과와 비교하여 결정되었다. 특히, HPV DNA는 자성 나노 와이어 및 Roche Cobas 4800 HPV Test 모두에서 우수한 상관 관계를 보였다. 또한, Roche Cobas 4800 HPV Test에서 얻은 결과와 비교했을 때, 자성 나노 와이어로 추출한 DNA는 표적 유전자의 임계 사이클(Ct) 값이 유의하게 낮았다. 경우에 따라 자성 나노 와이어와 Roche Cobas 4800 HPV Test 사이의 평균 임계 사이클(Ct) 값은 시료의 표적 DNA 양에 약 256 배의 차이가 있음을 나타내는 8주기의 차이를 나타냈다.
또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 상기 도 5a의 P4 환자에 대한 자궁경부 표본시료로부터 회수된 DNA의 증폭을 대표적으로 도식하였다. 보다 구체적으로, 이는 본 발명의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)를 이용하여, HPV DNA의 우수한 회수 및 표적 유전자 특이적 신호의 증폭이 생성된 것을 확인하였다. 그러나, 폴리에틸렌이민(PEI)이 없는 자성 나노 와이어에서는 유전자의 증폭이 나타나지 않았고, HPV DNA의 검출이 얻어지지 않았다(녹색). 이러한 결과는 자궁경부에서 면봉으로 채취된 세포시료에서 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)가 HPV DNA의 고효율 포집 및 분석이 가능하며, Roche Cobas 4800 HPV Test보다 더 높은 민감도와 특이성을 가진 HPV DNA의 다중 유전자형을 효율적으로 포집, 회수 및 분석할 수 있음을 보여준다. 따라서 본 발명의 자성 나노 와이어는 HPV 관련 암의 조기 발견 및 치료에 의미있는 결과를 제공하여, HPV 관련 암 환자의 진단 및 치료 효능을 향상시킬 수 있다.
실시예 3. 소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 효율 평가
3-1. 소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 포집 및 회수 효율 평가
도 6에 도식한 소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 포집 및 회수 효율을 평가하고자, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW)를 제조하였으며, 이때, 비오틴(biotin)이 도입된 폴리에틸렌이민 (PEI)의 분자량을 800 또는 25000 Da로 각각 다르게 하여, 상온에서 1 시간 동안 스트렙타비딘이 표지된 나노 와이어에 첨가하였다. 소변시료는 국립암센터(NCC) 임상시험심사위원회의 승인 절차에 따라 HPV 양성 환자 (HPV-positive patient) 30 명과 건강한 지원자 5 명을 대상으로 소변시료를 채취하였다. 수집된 소변시료는 사용하기 전까지 -20 ℃에서 보관하였다. 생체 외에서 (ex vivo) HPV18-positive (HeLa) 세포 또는 HPV16-positive (SiHa) 세포로부터 알려진 일정량의 게놈 DNA를 HPV-negative 소변시료에 0.01 내지 1,000 ng/㎖ 범위의 농도로 혼합(spike)하였다. 이어서, 게놈 DNA를 포함하는 소변시료 300 ㎕에 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어 (PEI/mPpy NW) 0.5 ㎎/㎖를 첨가하여, 다양한 시간 (10 분, 30 분, 60 분 또는 90 분) 동안 1,000 rpm으로 교반하였다. 그 후, 상기 교반된 용액을 30 분 동안 자성선반(magnetic rack)에 놓은 뒤, 결합되지 않거나, 또는 비특이적으로 결합한 성분을 분리하고 자성 나노 와이어에 부착된 DNA를 포획하였다. 이후, 포획된 DNA를 상온에서 다양한 시간 (10 분, 30 분, 60 분 또는 90 분)동안 최대 속도 2,500 rpm으로 교반(shaking)한 뒤, 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 10.0)에서 용출시켰다. 포집 및 회수된 DNA를 제조사의 지시에 따라 PicoGreen 분석법으로 정량화하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 도식한 바와 같이, HPV18-positive (HeLa) 세포 또는 HPV16-positive (SiHa) 세포를 HPV-negative 소변시료에 혼합하여, 각각 다른 분자량의 폴리에틸렌이민(PEI 800Da 또는 25kDa)이 접합된 자성 나노 와이어의 능력을 검증하였다. 첨가한 gDNA의 농도 범위에 따라 25 kDa의 PEI로 표지된 자성 나노 와이어를 사용하여 90 % 이상의 높은 포집 및 회수 효율로, DNA의 회수가 가능함을 확인하였다. 한편, 저분자량의 PEI (800Da)와 접합된 자성 나노 와이어의 효율은 gDNA의 농도가 증가함에 따라 현저하게 감소하였다. 따라서, 더 높은 분자량 (25 kDa)이 도입된 PEI가 저분자량이 도입된 PEI (800 Da)보다 DNA 분자와 더 좋은 결합(binding) 및 응축(condensation) 능력을 나타냄을 확인하였다. 이는 정전기 상호 작용(electrostatic interaction)에 의한 DNA-PEI/mPpy NW 복합체 형성이 PEI의 분자량에 의존함을 보여준다.
또한, 도 7c 및 도 7d에 도식한 바와 같이, HPV18-positive (HeLa) 세포 또는 HPV16-positive (SiHa)를 HPV-negative 소변시료에 혼합하여, 각각 다른 시간으로 반응시킨 결과, 반응시간이 길수록 포집 및 회수 효율이 더 높은 것을 확인하였다. 보다 구체적으로 DNA 포집 및 회수 효율은 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)가 25 kDa PEI를 사용하여 60 분 이상 반응하였을 때, 향상되었다. 상기 결과로부터, DNA 회수 효율 및 안정성을 향상시키는 조건을 확인할 수 있었다.
3-2. 소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 DNA 검출 한계(LOD) 평가
소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)의 DNA 검출 한계(LOD)를 평가하기 위해. 체외(ex vivo)에서 HeLa (HPV18, 10 내지 50 copies/cell) 또는 SiHa (HPV16, 1 내지 2 copies/cell) 세포주로부터 일정량 게놈 DNA를 각각의 HPV-negative 소변시료에 혼합(spike)하였다. 그 후, 각 시료에 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 자성 나노 와이어 0.5 ㎎/㎖를 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 1,000 rpm으로 교반(shaking)하였으며, HPV DNA는 핵산 분해 효소(nuclease-free)가 없는 물로 용리시켰다. 마지막으로, 회수된 DNA를 동량의 Cobas HPV master mix와 혼합하고, Roche LC480 장비로 증폭시켰다.
그 결과, 도 8에 도시한 바와 같이, 체외(ex vivo)에서 HeLa (HPV18, 10 내지 50 copies/cell) 또는 SiHa (HPV16, 1 내지 2 copies/cell) 세포주로부터 일정량 게놈 DNA를 각각의 HPV-negative 소변시료에 혼합한 결과, 다양한 농도에서 검출 한계 (LOD)를 확인하였다. 소변시료 내 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)의 검출 한계는 HPV16의 경우 10 cells/㎖, HPV18의 경우 30 cells/㎖로 나타났다.
3-3. 소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 이용한 HPV DNA 회수
양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW) 0.5 ㎎/㎖ 및 QIAamp 순환 핵산 키트 (QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 HPV-positive 및 HPV-negative 소변시료 300 ㎕에서 cfDNA를 회수하였다. 소변에서 용출된 cfDNA의 수율은 PicoGreen 형광분석법 및 직접적인 정량화, 시각화를 위한 겔 전기영동 분석으로 수행되었다. 이어서 용출된 DNA 13 ㎕의 검출 및 유전자형 분석을 위해, Roche Cobas 4800 HPV Test를 사용하여 동일한 부피의 Cobas HPV master mix reagent와 표적(target) HPV DNA를 증폭시켰다. 본 발명의 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NW)의 분석적 및 임상적 효율은 소변 기반 HPV DNA의 검출로부터 확인되었다. 총 27 개의 HPV positive 환자의 소변시료 또는 면봉으로 채취된 자궁경부 세포시료를 대상으로 분석하였다.
그 결과, 도 9a에 도식한 바와 같이, PEI/mPpy NW (검정색 막대) 또는 Qiagen 키트 (빨간색 막대)를 사용하여 자궁경부암 환자 10 명의 소변시료에서 회수된 cfDNA 농도를 측정하였더니, PEI/mPpy NW를 사용하여 소변시료에서 얻은 cfDNA 총량은 Qiagen 키트를 사용하여 얻은 것보다 약 4 배 더 높았다. 보다 구체적으로, PEI/mPpy NW 또는 Qiagen 키트에 소변시료를 적용하여 HPV DNA를 효율적으로 분리하고 유전자형 프로파일을 밝혀내, 27 개의 HPV positive 검체 중에서, 26 개 검체 (96 %)에서 PEI/mPpy NW를 사용하여 HPV DNA를 확인한 반면, Qiagen 키트로 추출한 HPV DNA는 16 개 검체(59 %)에서 검출되었다. 또한, PEI/mPpy NWs에 의해 회수된 HPV DNA는 Qiagen 키트에 의해 회수된 HPV DNA보다 훨씬 더 낮은 임계 사이클(cycle threshold; Ct) 값을 나타냈다. 이는 DNA 회수 및 무결성에 있어서 본 발명의 자성 나노 와이어의 높은 성능을 강력하게 시사한다.
또한, 도 9b에 도식한 바와 같이, 용출된 cfDNA가 HPV DNA 유전자형(genotyping)과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 자궁경부암 환자의 HPV 유전자형 분석 프로파일은 면봉으로 채취된 자궁경부 세포시료를 이용하여 수행되었으며, 고위험 HPV 유형 (HPV16, HPV18 및 기타 12 종류의 타입)의 Roche Cobas 4800 HPV 테스트를 수행하여 확인되었다. 보다 구체적으로, PEI/mPpy NWs를 사용하여, 소변시료로부터 회수된 DNA가 면봉으로 채취된 자궁경부 세포시료에서 얻은 것과 마찬가지로, HPV 유전자형에서 유사한 분포를 나타냄을 확인했다.
상기 결과, 본 발명의 자성 나노 와이어의 긴 형태가 생체 활성을 유지하면서 HPV DNA와 많은 상호 작용을 할 수 있게 하여, 노출 기간 및 빈도가 증가하기 때문에 소변시료로부터 표적 HPV 서열의 전체 수율이 현저하게 향상되었다. 연필 모양의 나노 와이어는 표면 대 부피비가 크고, 소변에 존재하는 복합적인 구성 성분을 통해 자유롭게 이동할 수 있기 때문에 HPV DNA에 우선적으로 결합할 수 있다.
3-4. 소변시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)를 이용한 암환자 또는 건강한 대조군의 HPV 유전자형 분포 패턴 평가
암환자 또는 건강한 대조군의 소변시료에서 HPV 유전자형 분포 패턴을 확인하고, 그 결과를 면봉으로 채취한 자궁경부 세포시료의 결과와 비교함으로써, 소변 기반 HPV 검출의 임상적 성능을 조사하고자 하였다. PEI/mPpy NW를 사용하여 건강한 대조군과 자궁경부암 환자의 총 35 개의 소변 시료 (30 HPV positive 및 5 HPV negative 시료)에서 추출한 cfDNA의 양을 비교하였다.
그 결과 도 10a에 나타낸 바와 같이, PEI/mPpy NW를 사용하여 건강한 대조군과 자궁경부암 환자의 소변시료에서 회수된 cfDNA의 농도를 측정한 결과, 건강한 대조군 또는 암환자로부터 용출된 cfDNA의 농도에 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.
또한, 도 10b 및 도 10c에 나타낸 바와 같이, 면봉으로 채취한 자궁경부 세포시료 또는 300 ㎕의 소변시료 한 쌍에서 유형 특이적 HPV 검출을 더 조사한 결과, 소량의 소변시료 300 ㎕를 사용하여도, 소변시료 및 자궁경부 세포시료 사이에 HPV 유형 검출이 83 %로 매우 높은 일치성을 보였다. 이러한 결과는 소변 기반의 HPV 선별 검사(스크리닝)에서 PEI/mPpy NW의 사용이 HPV DNA의 여러 고위험 유전자형의 회수, 동정 및 분석에 상당히 유리함을 시사한다.
상기 결과로부터, 자궁경부암 환자의 소변시료에서 순환(circulating) cfDNA를 회수하여, 본 발명의 자성 나노 와이어(PEI/mPpy NWs)의 기능을 성공적으로 평가한 후 유형별 HPV DNA를 확인하고 검출함으로써 임상적 유용성을 입증했다. PEI/mPpy NWs 기반의 HPV DNA 분리 및 검출 전략은 대규모 임상 시험에서 자궁경부암의 임상적 선별 검사 및 진단을 위한 개발 및 평가에 있어, 다른 소변 기반 방법보다 높은 감도 및 정확성을 바탕으로, 비용 효율적이고 널리 활용될 수 있는 기술로 판단된다.
실시예 4. 혈장 또는 뇌척수액 시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 효율 평가
4-1. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 ( PEI / mPpy NW)의 DNA 검출 효율 평가
상기 실시예 1에 기재된 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 와이어 (PEI/mPpy NW)를 제조하여, 혈장 내 cfDNA를 효과적으로 검출하고자 하였다. low-range (10 내지 100 bp), middle-range (100 내지 2000 bp), 또는 high-range (3.5 내지 21 kb) DNA ladders를 건강한 인간 혈장 (healthy human plasma)에 농도 별로 혼합(spike)시켰다.
그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 자성 나노 와이어를 이용하여 추출된 cfDNA의 크기별 검출 효율을 확인한 결과, DNA 농도에 상관없이 높은 효율로 혈장 내 순환하는 작은 단편(fragment)의 종양 유래 cfDNA 추출이 가능한 것을 확인하였다.
4-2. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체의 길이에 따른 DNA 포집 및 회수 효율 평가
양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW)의 길이에 따른 DNA 검출 효율을 평가하고자, 자성 나노 입자, 7 ㎛ 및 16 ㎛의 길이로 자성 나노 와이어를 제작하였다.
그 결과, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 자성 나노 와이어의 길이가 길수록 혈장 내 순환하는 작은 단편(fragment)의 종양 유래 cfDNA 추출이 유리한 것을 확인하였다.
4-3. 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW) 및 Qiagen kit와의 DNA 검출 효율 비교
양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW) 및 가장 일반적으로 사용되고 있는 Qiagen kit와의 DNA 검출 효율을 비교하고자, 혈장으로부터 cfDNA의 부착/회수 효율을 비교하였다. 건강한 사람의 혈장에 low-range (10 내지 100 bp), middle-range (100 내지 2000 bp), high-range (3.5 내지 21 kb) DNA ladders를 혼합(spike)하였다. 또한, cfDNA의 크기별 검출 효율을 겔 전기영동을 수행하여(gel electrophoresis) 분석하였다.
그 결과, 도 11c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 자성 나노 와이어의 cfDNA 검출 효율이 상업적인 제품보다도 월등하게 높음을 확인하였으며, 또한, 도 11d에 도시한 바와 같이, 본 발명의 자성 나노 와이어가 Qiagen kit 보다 월등히 높은 회수 효율을 나타내었으며, 이를 통해, 혈장 내 순환하는 작은 단편(fragment)의 종양 유래 cfDNA 추출에 있어 매우 유리할 것으로 기대된다.
4-4. 유방암 또는 폐암 환자의 혈장시료로부터 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW) 및 Qiagen kit와의 DNA 검출 효율 비교
본 발명의 자성 나노 와이어 기반 cfDNA의 검출 능력을 평가하기 위해, 유방암 또는 폐암 환자의 혈장시료로부터 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW) 및 Qiagen kit와의 DNA 검출 효율 비교하였다.
그 결과, 도 11e에 나타낸 바와 같이, 대부분의 환자군에서 본 발명의 자성 나노 와이어의 cfDNA 검출 효율이 상업적인 제품보다도 월등하게 높음을 확인하였다.
4-5. 폐암 환자의 혈장시료로부터 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW) 및 Qiagen kit로 회수된 DNA 변이 확인
폐암 환자의 혈장시료로부터 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW) 및 Qiagen kit로 회수된 DNA의 변이(mutation)를 확인하고자, 검출된 cfDNA의 변이를 droplet digital PCR (ddPCR)을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 11f에 나타낸 바와 같이, 혈장 내 순환하는 대부분의 암 관련 cfDNA의 단편(fragment)은 200 bp 이하라고 알려져 있으므로 자성 나노 와이어를 통한 종양 관련 cfDNA의 추출 효능은 상업적인 키트보다 월등한 능력을 보여주는 바, 암조직과 일치하는 변이 결과를 확인하였다.
특히, 10명의 폐암 환자의 혈장을 통하여 본 발명의 자성 나노 와이어 및 Qiagen kit을 이용하는 방법으로 cfDNA를 추출한 후 ddPCR로 증명한 결과, 5명의 EGFR exon 21 L858R 변이를 가진 환자의 혈장에서는 자성 나노 와이어 (PEI/mPpy NW) 및 Qiagen kit에서 모두 암 조직과 일치하는 변이를 발견하였다.
또한, 자성 나노 와이어 (PEI/mPpy NW)를 이용하여, 300 ㎕의 환자 혈장(plasma)만을 사용하였을 때도, 1 ㎖을 사용한 Qiagen kit과 같이 변이가 확인되었다. 특히, 본 발명의 자성 나노 와이어를 이용한 경우, Mutant DNA에 비하여 Wildtype DNA가 상대적으로 월등히 낮은 것을 확인하여, 본 발명의 자성 나노 와이어는 혈장 내 순환하는 작은 단편(fragment)의 종양 유래 cfDNA 추출에 굉장히 유리할 것으로 기대된다.
이 외에도, 나머지 5명의 폐암 환자군, 즉 EGFR exon 19 E746_A750del mutation을 가진 환자의 혈장에서도 본 발명의 자성 나노 와이어 및 Qiagen kit을 이용하여, 동일하게 cfDNA를 추출하였다. 자성 나노 와이어를 통하여 검출된 cfDNA를 ddPCR로 확인한 결과 5명의 환자 중 4명에게서 암조직과 일치하는 변이를 발견하였으나, Qiagen kit으로 확인한 결과 5명 모두에게서 변이가 발견되지 않았다. 자성 나노 와이어는 적은 양의 혈장, 즉 300 ㎕의 혈장에서도 암 조직과 일치도가 높은 cfDNA의 검출 효율을 보였다.
또한, 도 11g에 나타낸 바와 같이, 폐암 환자의 혈장에서 자성 나노 와이어 및 Qiagen kit을 이용하여 cfDNA를 추출한 후 ddPCR을 통하여 검출한 뒤, EGFR exon 19 E746_A750del mutation을 가진 폐암 환자의 혈장에서 검출한 cfDNA를 증폭한 결과, Qiagen kit을 통해 검출된 cfDNA에는 많은 양의 wildtype DNA가 존재하는 반면, mutant DNA는 확인되지 않았다. 한편, 자성 나노 와이어를 통해 환자의 혈장에서 cfDNA를 검출한 결과, 많은 양의 wild type DNA가 존재하지는 않았으나 mutant DNA가 뚜렷히 보임을 확인하였다.
또한, 도 11h에 나타낸 바와 같이, 폐암 환자의 혈장에서 자성 나노 와이어 및 Qiagen kit을 이용하여 cfDNA를 추출한 후 ddPCR을 통하여 검출한 뒤, EGFR exon 21 L858R mutation을 가진 폐암 환자의 혈장에서 검출한 cfDNA를 증폭한 결과, Qiagen kit을 통해 검출된 cfDNA에는 많은 양의 wildtype DNA가 존재하였다. 한편, 자성 나노 와이어를 통하여 검출된 cfDNA에는 많은 양의 wild type DNA가 존재하지는 않았으나, Qiagen kit과 비슷한 level의 mutant DNA가 존재하는 것을 확인하였다. 이때, 자성 나노 와이어는 300 ㎕의 혈장에서 cfDNA를 추출한 데 반해, Qiagen kit는 1 ㎖의 혈장을 사용하였다.
4-6. 뇌척수액 시료에서의 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체(PEI/mPpy NW)의 효율 평가
상기 실시예 4-5에 기재된 방법을 이용하여 폐암 환자의 혈장 또는 뇌척수액(CSF) 시료로부터 양이온성 고분자로 표면처리된 자성 나노 구조체 (PEI/mPpy NW)로 회수된 DNA의 변이(mutation)를 확인하고자, 검출된 cfDNA의 변이를 droplet digital PCR (ddPCR)을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 11i에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 자성 나노 와이어를 통해 폐암 환자의 혈장 또는 뇌척수액 (CSF)으로부터 검출한 cfDNA와 암 조직의 유전자 변이를 비교한 결과, 9명의 환자의 체액에서 검출된 cfDNA를 통한 유전자 변이 검사는 암 조직과 일치하는 것으로 확인되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 자성 나노 입자 및 비오틴이 탑재된 폴리피롤(polypyrrole); 및 비오틴이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)을 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 와이어로서,
    상기 자성 나노 와이어는 상기 폴리에틸렌이민으로 표면처리 되고,
    상기 폴리에틸렌이민은 비오틴-스트렙타비딘-비오틴 결합으로 상기 자성 나노 와이어의 표면에 접합되며,
    상기 세포-유리 DNA는 pH의 변화에 따라 상기 자성 나노 와이어로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 와이어.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (1) 제 1항의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 와이어를 개체 시료에 처리하는 단계;
    (2) 상기 시료에 포함된 세포-유리 DNA가 상기 자성 나노 와이어에 부착되는 단계;
    (3) 상기 개체 시료로부터 상기 세포-유리 DNA가 부착된 자성 나노 와이어를 분리하는 단계; 및
    (4) 상기 세포-유리 DNA가 부착된 상기 (3) 단계의 자성 나노 와이어로부터 pH의 변화에 따라 상기 세포-유리 DNA를 분리시키는 단계를 포함하는, 세포-유리 DNA 검출 및 회수방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 시료는 소변, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid; CSF), 혈장, 혈액, 또는 체액인 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 회수방법.
  8. 제 1항의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 와이어를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
  9. 제 1항의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 와이어를 포함하는 암 진단키트.
  10. 제 1항의 세포-유리 DNA 검출 및 회수용 자성 나노 와이어로부터 DNA를 검출 또는 분리하여 분석하는 단계를 포함하는, 암의 발병 또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 분석은 시료 중 DNA의 농도, 카피 수 또는 염기서열을 분석하여 유전자 변이 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는, 암의 발병 또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법.
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