KR101980802B1 - Composition comprising bee venom isolated from Vespa mandarinia worker for prevention or treating bovine mastitis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 정제 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물을 육계 또는 각종 가축류에게 급여할 경우, 소장은 물론 대장에서 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 확산을 억제할 수 있어 결과적으로 가금티푸스를 예방, 개선 및 치료할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물을 이용함으로써 가금티푸스의 발병을 감소시켜 가금류의 건강 증진을 통한 농가의 경제적 손실도 줄일 수 있다.The present invention relates to a composition for preventing or treating poultry typhus comprising bee venom as an active ingredient. When the composition containing the tablet bee venom as an active ingredient is fed to broiler chickens or various kinds of livestock, it is possible to inhibit the spread of Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa in the small intestine as well as the small intestine As a result, poultice typhus can be prevented, improved and treated. Therefore, by using the composition of the present invention, it is possible to reduce the incidence of poultry typhus and reduce the economic loss of the farmer through health promotion of poultry.
Description
본 발명은 장수말벌의 일벌로부터 분리된 봉독을 함유하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for preventing or treating cow mastitis containing bee venom isolated from a beetle of long life wasps.
국내에서 사용되는 대부분의 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera)의 일벌로부터 분리된 것으로, 한방에서 봉침요법으로 주로 사용되어 왔다. 봉독은 벌의 독낭에 들어있는 것으로, 약 40여 가지의 물질로 이루어져 있으며 기원전부터 인체의 질병치료에 이용되어 왔다. 봉독은 벌의 종류에 따라 그 성분에 차이를 보이며, 동일한 벌이라도 일령에 따라 성분의 차이가 발생한다. 현재 봉독 성분에 따른 작용과 기전, 봉독의 과민성과 독성, 면역요법 및 관절염, 단순포진, 다발성 경화증, 종양 등의 질병 치료 등에 대한 연구가 보고되고 있으며 특히 항균작용과 세포 손상개선효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 근래에는 벌의 종류벌로 봉독 성분이 각각 다른 것으로 확인되면서 이에 대한 생리활성 연구 또한 지속되고 있다. 그러나 이 중에서도 장수말벌의 일벌로부터 채취한 봉독에 대한 연구는 거의 진행되고 있지 않다. Most of the bee venom used in Korea is isolated from the bees of Apis mellifera , and has been mainly used as a needle therapy in oriental medicine. Bee venom is contained in the bee venom of the bee, which is composed of about 40 substances and has been used for the treatment of diseases of the human body since BC. The bee venom shows differences in its components depending on the bees, and even in the same bee, there is a difference in composition depending on the age. Currently, studies on the action and mechanism of bee venom component, sensitivity and toxicity of bee venom, immunotherapy and treatment of diseases such as arthritis, herpes simplex, multiple sclerosis and tumor have been reported. Especially, It is known. In recent years, bee venom components have been confirmed to be different from each other, and their physiological activity studies are also continuing. However, the research on bee venom collected from the worker bees of loneliness was not progressing.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 이러한 다양한 벌로부터 채취한 정제봉독이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 장수말벌(Vespa mandarinia) 일벌의 봉독이 젖소유방염을 일으키는 주요 원인균인 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. Under these circumstances, the inventors of the present invention have been studying various physiological activities of tablet bee venom collected from these various bees, and found that the bee venom of Vespa mandarinia bees is a major causative agent of cow mastitis, Streptococcus agalactiae ) And Pseudomonas aeruginosa , and thus completed the present invention.
본 발명의 목적은 장수말벌의 일벌로부터 분리된 봉독을 함유하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다. It is an object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of cow mastitis containing bee venom isolated from a beetle of longevity wasp.
본 발명은 장수말벌(Vespa mandarinia)의 일벌로부터 분리된 봉독을 함유하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for the prevention or treatment of cow mastitis containing bee venom isolated from a worker bee of Vespa mandarinia .
상기 봉독은 장수말벌의 일벌의 독낭에서 분리한 봉독에서 당류와 휘발성물질을 제거하여 얻은 정제봉독일 수 있다. The bee venom can be obtained from a bee venom which is separated from the bee venom of a worker bee of the longevity wasp and is obtained by removing saccharides and volatile substances.
상기 봉독은 만다라톡신(mandaratoxin)을 유효성분으로 함유하는 것일 수 있다. The bee venom may contain mandaractoxin as an active ingredient.
상기 젖소 유방염은 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 중 선택되는 1종 이상의 세균을 원인균으로 하는 것을 특징으로 한다. The cow mastitis is characterized in that it causes one or more bacteria selected from Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa as causative microorganisms.
본 발명은 또한 상기 조성물을 함유하는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액상캡슐제, 수용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군에서 선택되는 제형의 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 제공될 수 있다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cow mastitis in a formulation selected from the group consisting of powders, granules, tablets, capsules, liquid capsules, aqueous solutions, suspensions, emulsions, syrups and aerosols containing the composition .
또 다른 형태에서 본 발명은 상기 조성물에 페니실린 및 메티실린에서 선택되는 1종 이상의 항생제가 첨가된 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다. In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cow mastitis in which at least one antibiotic selected from penicillin and methicillin is added to the composition.
이에 본 발명은 장수말벌의 일벌로부터 분리된 봉독을 함유하는 젖소 유방염의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공할 수 있다. Accordingly, the present invention can provide a feed composition for preventing or ameliorating cow mastitis containing bee venom isolated from a beetle of longevity wasp.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 봉독은 여름철 성충시기인 8월 이후 채집되는 장수말벌의 일벌로부터 채취한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명의 봉독은 정제봉독으로서, 말벌집 또는 꿀벌 통에 모여드는 말벌을 포획하여 독낭을 분리하거나 또는 말벌을 분쇄 원심분리하여 봉독을 획득할 수 있다. 특히, 봉독 외의 이물질인 당류와 휘발성물질을 제거하여 얻은 정제봉독인 것으로서, 자세하게는 상기 정제봉독은 장수말벌 일벌의 독낭에서 분리한 봉독에서 봉독 외의 이물질인 당류와 휘발성물질을 제거하여 얻은 것일 수 있다. The bee venom of the present invention is collected from the beeswax of the longevity wasp collected after August, which is the summer adult time. More specifically, the bee venom of the present invention is a taboo bee poisoning, and the bee venom can be captured by capturing a wasp collecting in a wasp house or a bee barrel and separating the viscose or centrifuging the wasp by crushing. In particular, the tablet bee venom obtained by removing saccharides and volatile substances, which are foreign substances other than bee venom, in detail, the purified bee venom may be obtained by removing saccharides and volatile substances other than bee venom from bee venom, .
상기 젖소 유방염은 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 중 선택되는 1종 이상의 세균을 원인균으로 하는 것을 특징으로 한다. The cow mastitis is characterized in that it causes one or more bacteria selected from Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa as causative microorganisms.
상기 조성물은 다른 항생제의 첨가로 인해 항생효과 또는 살세균 효과가 상승될 수 있다. 이에, 통상적으로 사용되는 항생제가 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다. 따라서 바람직하게는 본 발명은 상기 조성물에 페니실린 및 메티실린에서 선택되는 1종 이상의 항생제가 첨가된 복합제제를 제공할 수 있다. The antibiotic effect or the bactericidal effect of the composition can be increased by adding other antibiotics. Thus, commonly used antibiotics may be added to the composition of the present invention. Accordingly, preferably, the present invention can provide a combination preparation in which one or more antibiotics selected from penicillin and methicillin are added to the composition.
본 발명은 또한 상기 조성물을 함유하는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액상캡슐제, 수용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군에서 선택되는 제형의 약학 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a compound selected from the group consisting of powders, granules, tablets, capsules, liquid capsules, aqueous solutions, suspensions, emulsions, syrups and aerosols containing the composition.
본 발명은 장수말벌(Vespa mandarinia)의 일벌로부터 분리된 봉독을 함유하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cow mastitis containing bee venom isolated from a worker bee of Vespa mandarinia .
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, Lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included . Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 동물의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will depend on the age, sex, weight of the animal to be treated, the particular disease or condition to be treated, the severity of the disease or condition, the route of administration and the judgment of the prescriber. Dosage determinations based on these factors are within the level of ordinary skill in the art and generally the dosage ranges from 0.01 mg / kg / day to approximately 2000 mg / kg / day. A more preferable dosage is 1 mg / kg / day to 500 mg / kg / day. The administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered by various routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine dural or intracerebral injection.
본 발명의 조성물은 통상적으로 이용되는 젖소의 사료에 첨가되어 젖소 유방염의 예방 또는 개선용 사료 조성물로 이용될 수 있다. The composition of the present invention can be used as a feed composition for preventing or ameliorating cow's mastitis by being added to a commonly used feed of cows.
본 발명은 장수말벌의 일벌로부터 분리된 봉독을 함유하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물을 젖소에게 급여할 경우 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 유발되는 증상인 우유 내의 체세포 수를 감소 및 억제할 수 있어 결과적으로 젖소 유방염을 예방, 개선 및 치료할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물을 이용함으로써 젖소의 건강 증진을 통해 깨끗한 원유의 공급이 가능함으로써 농가의 수익증대에도 도움이 될 수 있다. The present invention relates to a composition for preventing or treating cow mastitis containing bee venom isolated from a beetle of long life wasps. When the composition is fed to a cow, the number of somatic cells in the milk, which is a symptom caused by Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa , can be reduced and inhibited, resulting in prevention and prevention of cow mastitis, Can be improved and treated. Therefore, by using the composition of the present invention, it is possible to supply clean crude oil through health promotion of cow, which can also help to increase profit of the farm household.
장수말벌 일벌의 봉독에 대해서는 대한민국 공개특허 제10-1999-0039050호에 여드름 치료 효과가 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1061257호 등에 서양종 꿀벌의 봉독이 젖소 유방염과 같은 질병을 개선시킬 수 있음이 나타나 있으나 현재까지 장수말벌 유래의 봉독을 이용하여 젖소 유방염을 개선시킬 수 있다는 것에 관해서는 공지된 바 없다. For the bee venom of longevity wasp beetle, Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-1999-0039050 discloses the effect of acne treatment, and Korean bee's bee bee bee treatment improves diseases such as dairy cow mastitis in Korean Patent No. 10-1061257 However, it is not known that the bean curd derived from longevity wasp can be used to improve cow mastitis.
도 1은 장수말벌의 일벌로부터 정제봉독을 채취하는 과정을 나타내는 사진이다.
도 2는 서양종꿀벌의 일벌로부터 정제봉독을 채취하는 과정을 나타내는 사진이다.
도 3은 장수말벌의 일벌로부터 채취한 정제봉독에 대한 UPLC 결과를 나타낸다(붉은색 표기 피크 - 만다라톡신). 1 is a photograph showing a process of collecting a tablet bee venom from a worker bees of a longevity wasp.
Fig. 2 is a photograph showing the process of collecting the tablets of bee venom from the bees of the western species of bees.
Figure 3 shows the UPLC results for tablet bee venom collected from the worker bees of the longevity wasp (red marked peak-mandarotoxin).
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein but may be embodied in other forms. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the concept of the invention to those skilled in the art.
<실시예 1. 정제봉독의 제조>≪ Example 1: Preparation of tablet bee venom &
장수말벌, 서양종꿀벌, 동양종꿀벌, 서양뒤영벌의 일벌에서 봉독채집장치를 이용하여 봉독을 채집하였고, 봉독의 간이정제방법을 통해 당류와 휘발성물질을 제거하고 동결건조함으로써 순수한 수용성을 갖는 정제 봉독 건조물을 제조하였다. 장수말벌은 여름철 성충시기인 8월 이후 채집되는 장수말벌의 일벌로부터 채취하였고, 다른 벌은 15일령 이상된 일벌로부터 봉독을 채집하였는데, 15일령 이상된 일벌에서 봉독을 채집한 것은 기존의 연구를 통해 서양종꿀벌의 경우 15일령 이상된 일벌에서 봉독의 함량이 가장 많았던 것으로 확인되었고, 이와 같은 현상 또한 다른 벌 종류에서도 나타났기 때문이다. 도 1은 장수말벌 일벌의 봉독 채집과정, 도 2에는 서양종꿀벌 일벌의 봉독 채집과정이 개시되어 있다. Bee venom was collected from beeswax collected from beeswax collected from beeswax in the beeswax of longevity wasp, wyoming bee, oriental bee and western bees. Purification of bee venom by simple purification of sugar beet and volatile substances and freeze - . Longevity wasps were collected from the worker bees of the longevity wasps collected in August, the summer adult period, and the other beeons were collected from the worker bees 15 days old and older. In the case of western species, bee venom was found to be the most abundant in bees older than 15 days, and this phenomenon also occurred in other bees. FIG. 1 shows a process of collecting bee venom of a longevity wasp, and FIG. 2 shows a bee venom collecting process of a beeswax of a wyoming bee.
이렇게 채취한 벌 한 마리당 정제봉독의 함량을 하기 표 1에 나타내었는데, 벌의 종류에 따라 정제봉독의 함량이 각각 다른 것으로 확인된다. Table 1 shows the content of tablet bee venom per one bee collected in this manner, and it is confirmed that the content of tablet bee venom is different according to the bees.
<< 실시예Example 2. 2. 정제봉독의Tablets of beijing 유효성분 및 품질확인> Checking the active ingredients and quality>
실시예 2-1. 만다라톡신의 함량 확인Example 2-1. Determine the content of mandarotoxin
UPLC(Ultra performance Liquid chromatography)를 수행하여 봉독 내의 만다라톡신(mandaratoxin, MDTX)의 함량을 확인하여 채취된 정제봉독의 품질을 확인하였다. 장수말벌 일벌로부터 채취된 정제봉독(시험봉독) 40 mg을 3차 증류수 10 ㎖에 녹여 PTFE 0.2 μm필터로 여과하였고, 표준품 만다라톡신(Reference.MD., 82545-77-5 Mandaratoxin)은 2 mg/㎖로 만들어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하였다. 효소 피크의 우수한 분리도를 갖는 Sepadex C-50 컬럼을 사용하여, ICH (International Conference on Harmonisation) guideline에 따라 검출한계를 산출하였다. UPLC 조건은 하기 표 2를 기준으로 수행하였고 결과값은 도 3에 나타내었다. The quality of the collected bee venom was confirmed by confirming the content of mandarotoxin (MDTX) in bee venom by performing UPLC (Ultra Performance Liquid chromatography). 40 mg of purified bee venom (test bee venom) collected from longevity wasp was collected in 10 ml of distilled water and filtered through a PTFE 0.2 μm filter. The reference mandarotoxin (Reference.MD., 82545-77-5 Mandaratoxin) Ml and filtered using the same filter as the test bee venom. Detection limits were calculated according to ICH (International Conference on Harmonization) guidelines using Sepadex C-50 columns with good separation of enzyme peaks. The UPLC conditions were performed based on the following Table 2, and the results are shown in FIG.
이렇게 산출된 장수말벌 일벌의 봉독 내 만다라톡신의 함량은 11.3 ± 1.9% 로서 고품질의 정제봉독이 채취되었음을 알 수 있다. The content of mandarin toxin in bee venom of longevity wasp was 11.3 ± 1.9%, which indicates that high quality bee venom was collected.
또한 SDS-PAGE 분석을 통해서도 장수말벌 일벌의 봉독 및 만다라톡신을 확인하였는데, SDS-polyacrylamide gel은 Laemmli(1970)의 방법을 따라 15%의 separation gel과 5%의 staking gel을 준비하였다. 봉독과 만다라톡신 시료는 PBS로 1㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비 한 후 4 × loading buffer와 혼합하였다. size marker 7 ㎕와 함께 10 ㎕의 시료를 loading 하였다. 다음으로는 Mini protein electrophoresis assay unit(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 100V 400mA에서 1시간 30분 동안 분리시킨 후 silver staining하여 단백질 band를 확인하였다. 이에 대한 결과는 도 10에 나타내었는데, 도 10의 CBV는 말벌 봉독을 나타내며, MDTX는 만다라톡신을 나타낸다. In addition, SDS-PAGE analysis confirmed bee venom and mandarotoxin in the lobster wasp, SDS-polyacrylamide gels were prepared according to the method of Laemmli (1970) with 15% separation gel and 5% staking gel. Bee venom and mandarotoxin samples were diluted to 1 μg / ml with PBS and mixed with 4 × loading buffer. 10 ㎕ of sample was loaded with 7 ㎕ of size marker. Next, protein bands were identified by silver staining after separation at 100 V 400 mA for 1 hour and 30 minutes using Mini protein electrophoresis assay unit (Bio-Rad Laboratories, USA). The results are shown in FIG. 10, wherein CBV in FIG. 10 represents wasp honeybee and MDTX represents mandarotoxin.
실시예 2-2. 서양종꿀벌 봉독과 장수말벌 봉독의 성분 비교Example 2-2. Comparing the components of bee venom and bees
문헌 상에 기재된 내용을 참고하여 서양종꿀벌 봉독과 장수말벌 봉독의 성분을 비교하여 표 3에 나타내었다(Venoms of the hymenoptera, by Tom Piek, Academic press, 1986; Hymenoptera venom review focusing on Apis mellifera. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, P.R. de Lima et al., 2003; Bee, wasp and ant venomics pave the way for a component-resolved diagnosis of sting allergy, Journal of Proteomics, D. C. de Graal et al., 2009).Table 3 compares the components of the bee venom of the Western and Oriental bees by reference to the description in the literature (Table 3) (Venom of the hymenoptera, by Tom Piek, Academic press, 1986; Journal of the Hymenoptera venom review focusing on Apis mellifera. (1997), and the degenerative changes of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in vivo and in vivo.
표 3을 참고하면, 서양종꿀벌 일벌과 장수말벌 일벌으로부터 각각 채취된 정제봉독에 포함된 유효성분의 분포가 전혀 다른 것으로 확인되어 이들이 갖는 약리학적/생리학적 효과 또한 차이가 있을 것으로 예상되었다. As shown in Table 3, the distribution of the active ingredients contained in the tablet bee venom collected from the western bees and the longevity wasps were found to be completely different from each other, and the pharmacological / physiological effects of the beeswax were expected to be different.
<실시예 3. 정제봉독의 항세균 효과 확인> ≪ Example 3: Confirmation of antibacterial effect of tablet bee venom &
시험에 사용한 균주는 건국대학교로부터 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae, ATCC 13813)와 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 15442)를 분양받아 사용하였다. 스트렙토코커스 아갈락티애는 5% sheep blood (MD cell, USA)를 포함한 TSA(Trypticase soy agar, BD Difco, USA) 배지, 슈도모나스 아에루지노사는 TSA 배지를 사용하여 37℃에서 배양하여 실험 전까지 2회 계대배양 후 실험에 사용하였다. Streptococcus agalactiae (ATCC 13813) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) were purchased from Konkuk University. Streptococcus agalactiae were cultured in TSA medium (Trypticase agar, BD Difco, USA) containing 5% sheep blood (MD cell, USA) and Pseudomonas aeruginosa at 37 ℃ using TSA medium. After the incubation, the cells were used for the experiment.
서양종꿀벌와 장수말벌의 정제봉독의 항세균 효과를 확인하기 위해 스트렙토코커스 아갈락티애 또는 슈도모나스 아에루지노사에 대한 최소생육억제농도(MIC) 및 최소살균억제농도(MBC)를 측정하였고 이를 표 3 및 표 4에 나타내었다. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum inhibitory concentration (MBC) of Streptococcus agalactiae or Pseudomonas aeruginosa were measured in order to confirm the antibacterial effect of bee venom purified from beeswax and longevity wasp. Table 4 shows the results.
최소생육억제농도 분석은 액체 배지 희석법(broth-dilution method)을 사용하여 수행하였다. 봉독 수용액을 0~20 ㎍/㎖ 농도로 희석하였고, 상기 각 균주(세균)는 O.D.600 = 0.2로 농도를 조절하여 사용하였다. 96-웰 플레이트(96-well plate, Falcon, USA)에 각 균주 배양용 뉴트리언트 브로스(Nutrient Broth) 100 ㎖, 봉독 수용액 50 ㎖, 균주 희석액 50 ㎖를 순차적으로 첨가한 뒤 4 시간마다 UV-스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이때, 세균의 생육 곡선상에서 균주의 생장 (turbidity)이 검출되지 않는 최소농도를 최소생육억제농도로 설정하였다.The minimal inhibitory concentration assay was performed using a broth-dilution method. The aqueous solution of bee venom was diluted to a concentration of 0 to 20 μg / ml, and each strain (bacterium) was used at a concentration adjusted to O.D.600 = 0.2. 100 ml of Nutrient broth for each strain, 50 ml of bee venom solution and 50 ml of the dilution solution were sequentially added to a 96-well plate (Falcon, USA) in a 96-well plate. And incubated at 37 [deg.] C for 24 hours while measuring the absorbance value using a spectrophotometer. At this time, the minimum concentration at which no bacterial growth was detected on the growth curve of the bacteria was set as the minimum growth inhibitory concentration.
최소살균억제농도는 상술한 최소 저해 농도의 분석 과정에서 각 시간대 별 배양 세균 시료 50 ㎖를 취해 뉴트리언트 아가(Nutrient agar) 플레이트(plate)에 도말하여, 48 시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 생성되는 콜로니(colony) 수를 관찰하였을 때 상기 세균이 완전히 사멸(99.9%)되는 최소농도를 최소살균억제농도로 설정하였다. For the minimum inhibition concentration, 50 ml of the cultured bacterial sample at each time zone was plated on a Nutrient agar plate in the above-described analysis of the minimum inhibitory concentration, and cultured at 37 캜 for 48 hours. When the number of colonies was observed, the minimum concentration at which the bacteria were completely killed (99.9%) was set as the minimum inhibitory concentration.
또한, 장수말벌과 서양종꿀벌의 정제봉독을 1 x 108 CFU/mL의 스트렙토코커스 아갈락티애 또는 슈도모나스 아에루지노사 균주에 처리하여 항균력 지속시간(PAE)도 확인하였는데, 하기의 표 5에 개시된 것처럼 장수말벌의 정제봉독의 항균력이 더 오래 유지되는 것을 확인할 수 있다. In addition, the antibacterial duration (PAE) was also confirmed by treating the bee venom of longevity wasps and western bees with 1 x 10 8 CFU / mL of Streptococcus Agalactiae or Pseudomonas aeruginosa strain. As can be seen, the antimicrobial activity of tablet bee venom of longevity wasp is maintained longer.
이때 PAE 수치가 클수록 항균 지속 효과가 우수하다고 할 수 있으며, PAE를 구하는 식은 아래와 같다.At this time, the larger the PAE value, the better the antimicrobial persistence effect. The formula for obtaining PAE is as follows.
PAE = T - CPAE = T - C
T : 봉독을 처리한 시험구에서 1 log10까지의 생육에 걸리는 시간T: Time to grow up to 1 log10 in the bee venom-treated test area
C : 무처리구에서 1 log10까지의 생육에 걸리는 시간C: Growth time from untreated to 1 log10
<실시예 4. 유방염 감염 젖소의 우유 내 체세포 감소 효과 확인> Example 4. Confirmation of somatic cell reduction effect in milk of a mastitis infected cow.
정제봉독과 상용봉독의 유방염 치료효과를 비교하기 위하여 유방염에 감염된 젖소 6개 농장, 30분방에 각 시료별 10분방씩 구분하여, 무처리구, 상용봉독 처리구, 정제봉독 처리구로 사양실험을 진행하였다. 무처리구의 경우 정제수만 30 mL을, 봉독처리구의 경우 서양종 꿀벌의 정제봉독과 장수말벌의 정제봉독 10 mg을 멸균 증류수 30 mL에 용해하여 유두침을 이용하여 유방 내로 투여하였다. 유두침은 1회용 플라스틱제품으로 길이가 2 cm인 유두침을 사용하였다. 일별 착유 후 한차례 봉독을 투여하였으며, 5일간 투여 후 Somacount 300 기기(Bnetley사, USA)를 이용하여 체세포수를 측정하였다. 상기 방법은 우유에 형광물질인 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)를 첨가하여 체세포를 염색 후 측정기기에 주입하여 레이져 빔으로 측정하는 것이다. 5일간 투여 후 20일 후에 체세포 수를 비교한 결과, 하기 표 7의 결과와 같이 서양종꿀벌의 봉독에 비하여 장수말벌의 정제봉독에서의 체세포 감소 비율이 현저하게 높음을 알 수 있다. 따라서 장수말벌의 정제봉독이 젖소 유방염의 치료제로서 이용가능함을 확인할 수 있다. In order to compare the effects of tablets bee venom and commercial bee venom on mastitis treatment, 6 milk cows infected with mastitis were divided into 10 minutes for each sample in 30 minutes, and the specimens were tested in the untreated, commercial bee venom and bee venom treatment specimens. In the case of non-treatment, only 30 mL of purified water was used. In the case of bee venom treatment, purified bee venom of bees of Western species and 10 mg of purified bee venom of longevity wasp were dissolved in 30 mL of sterilized distilled water. The nipple needle was a disposable plastic product and a nipple needle with a length of 2 cm was used. One day after milking, bee venom was administered. After 5 days, somatic cell number was measured using Somacount 300 instrument (Bnetley, USA). In this method, ethidium bromide, which is a fluorescent substance, is added to milk, and somatic cells are stained and injected into a measuring instrument and measured with a laser beam. As a result of comparing somatic cell numbers 20 days after 5 days of administration, the results of Table 7 show that the rate of somatic cell loss in tablets bee venom of longevity wasps is remarkably higher than that of beeswax of western type bees. Therefore, it can be confirmed that the purified bee venom of longevity wasps can be used as a therapeutic agent for cow mastitis.
<제제예 1. 약학적 제제>≪ Formulation Example 1 >
제제예 1-1. 정제의 제조Formulation Example 1-1. Manufacture of tablets
실시예 1의 정제봉독 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 타정하여 동물용 약학적 정제로 만들었다. 200 g of purified beacon of Example 1 was mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch and 32 g of colloidal silicic acid. To this mixture was added a 10% gelatin solution, which was pulverized and passed through a 14-mesh sieve. This was dried, and a mixture obtained by adding 160 g of potato starch, 50 g of talc and 5 g of magnesium stearate was triturated and made into pharmaceutical tablets for animals.
제제예 1-2. 주사액제의 제조Formulation Example 1-2. Injection preparation
실시예 1의 정제봉독 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열멸균하고 소분하여 동물용 주사액제를 제조하였다.100 mg of purified beacon of Example 1, 0.6 g of sodium chloride and 0.1 g of ascorbic acid were dissolved in distilled water to make 100 ml. This solution was placed in a bottle, sterilized by heating at 20 ° C for 30 minutes, and subdivided to prepare an injection solution for animals.
<제제예 2. 사료 조성물>Formulation Example 2. Feed composition >
실시예 1의 정제봉독 200g을 육계용 사료 제조시 1t을 첨가하여 젖소 유방염 예방용 사료를 제조하였다. 200g of tablets bee venom of Example 1 was added to 1t of broiler diets to prepare milk for cow mastitis prevention.
Claims (6)
상기 봉독은 장수말벌의 일벌의 독낭에서 분리한 봉독에서 당류와 휘발성물질을 제거하여 얻은 정제봉독인 것을 특징으로 하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the bee venom is purified bee venom obtained by removing saccharides and volatile substances from bee venom isolated from a bee venom of a worker bee of a longevity wasp.
상기 봉독은 만다라톡신(mandaratoxin)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 젖소 유방염의 예방 또는 치료용 조성물.The method according to claim 1,
The bee venom is a composition for preventing or treating cow mastitis, which comprises mandaroxin as an active ingredient.
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