KR101971092B1

KR101971092B1 - 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드

Info

Publication number: KR101971092B1
Application number: KR1020170082039A
Authority: KR
Inventors: 김성현; 최원일; 신용철; 윤영성; 김진화
Original assignee: 한국세라믹기술원; 아미코젠주식회사
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2019-04-23
Also published as: US11472840B2; EP3647320A1; KR20190001859A; CN111094319A; JP2020525033A; CN111094319B; JP7184371B2; WO2019004674A1; EP3647320A4; US20200123199A1

Abstract

본 발명은 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아세틸콜린이 작용하는 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 차단하여 주름 개선 효과를 나타내는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.

Description

아세틸콜린수용체 결합 펩타이드{PEPTIDE FOR BINDING TO ACETYLCHOLINE RECEPTORS}

본 발명은 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아세틸콜린이 작용하는 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 차단하여 주름개선 효과를 나타내는 펩타이드에 관한 것이다.

최근 건강한 삶에 대한 관심이 증가하고, 생활수준의 향상, 여성의 사회진출 증가, 고령화 가속화 등으로 인해, 소비자들의 화장품에 대한 욕구는 아름답게 꾸미기 위한 용도에서 점차 기능적 용도를 요구하는 것으로 변화하고 있다.

피부 노화 현상을 방지하고 보다 건강하고 탄력있는 피부를 유지하기 위하여 주름 개선 효과가 있는 생리활성물질을 개발하고자 하는 연구활동이 꾸준히 진행되어 왔다. 대표적으로 1995년 광노화된 피부의 개선을 위한 치료제로 트레티노인(trans-retinoic acid)이 미국 FDA 허가를 받았으며, 이보다 부작용이 적은 레티놀이 1990년대 중, 후반부터 화장품 원료에 사용되기 시작하면서 본격적으로 주름 개선 화장품이 출시되기 시작하였다. 그 이후로 여성 호르몬 유사 물질, 각종 식물에서 추출한 항산화제 등이 주름 개선 원료로서 화장품에 도입되었다.

그러나 이러한 화장품 원료들은 대부분 효능이 미진하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다. 또한 효능이 좋은 원료라고 하더라도 현재의 화장품 원료들은 피부에 작용하는 범위가 제한적이고, 대부분 콜라겐 합성 촉진, 콜라겐 분해 억제, 활성산소 제거와 같이 피부에 미치는 효능이 유사하여 보다 새롭고 보다 강력하며 보다 근본적인 주름 개선을 원하는 고객들의 요구를 충분히 만족시킬 수 없었다. 이에, 최신 피부 과학 이론에 기반하여 새로운 피부 노화 메커니즘을 규명하고 이를 차단하거나 늦출 수 있는 원료와 기술에 대한 연구가 화장품 산업에서 활발히 진행되고 있다.

최근 펩타이드 성분을 화장품에 사용하여 피부 주름을 개선하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 펩타이드(peptide)는 아미노산이 2개 이상이 결합하여 형성된 물질인데, 화학합성, 효소반응 또는 단백질로부터의 가수분해에 의해 제조된다.

한편, 아세틸콜린은 말초신경계에서 골격근과 내장근육의 운동에 관여하며, 뇌에서는 학습과 기억에 영향을 미친다. 운동 신경과 근육이 만나는 곳에서 신경전달물질인 아세틸콜린의 분비를 방해하면 근육의 수축을 억제하여 근육이 마비가 되면서 주름살이 펴지는 데, 이를 이용한 것의 일례로 보톡스가 이에 해당한다. 보톡스는 운동신경 말단에서 근육의 수축에 필수적인 물질인 아세틸콜린이 분비되는 과정을 막는다. 그 결과 근육이 움직일 수 없게 되고, 근육에 의해 유발되던 주름이 없어지게 된다.

따라서, 같은 원리로 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드를 개발한다면 피부 주름의 개선 및 예방을 기대할 수 있을 것으로 예상된다.

대한민국 등록특허공보 제10-0553174호

본 발명은, 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 1 내지 6 중 어느 하나의 일반식으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드를 제공하는 것을 본 발명의 일 측면으로 한다.

[일반식 1] WTWKG-X_n

[일반식 2] TWKG-X_n

[일반식 3] WKG-X_n

[일반식 4] KG-X_n

[일반식 5] G-X_n

[일반식 6] X_n

(상기 X_n는 1 내지 6개의 임의의 아미노산으로 이루어진 시퀀스를 나타냄)

본 발명에서 용어, “펩타이드 (peptide) 또는 이의 단편”이란 아미드 결합 (또는 펩타이드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 주름 개선 효과를 나타내는 펩타이드 또는 이의 단편을 의미한다.

본 발명의 펩타이드 또는 이의 단편은 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 이의 단편은 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 상세하게는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.

보다 구체적으로는 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의해 생산할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여 융합 파트너와 본 발명의 펩타이드로 된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 그것으로 숙주 미생물을 형질전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킨 후 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다. 이를 위하여 예를 들어 Factor Xa나 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합파트너와 본 발명의 펩타이드 유전자 사이에 삽입할 수 있다

본 발명에 의한 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드에 있어서, 상기 Xn 은 서열번호 1 내지 11 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.

[서열번호 1] KGTLNR,

[서열번호 2] RKSLLR,

[서열번호 3] EDKGKN,

[서열번호 4] RDKLQM,

[서열번호 5] QLGQLS,

[서열번호 6] GRLSAS,

[서열번호 7] RQLNNQ,

[서열번호 8] DNLQNN,

[서열번호 9] LYQRLG,

[서열번호 10]NKQVKF,

[서열번호 11]ETYDSK

본 발명에 의한 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 12 내지 22 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

서열번호 12: WTWKGKGTLNR

서열번호 13: WTWKGRKSLLR

서열번호 14: WTWKGEDKGKN

서열번호 15: WTWKGRDKLQM

서열번호 16: WTWKGQLGQLS

서열번호 17: WTWKGGRLSAS

서열번호 18: WTWKGRQLNNQ

서열번호 19: WTWKGDNLQNN

서열번호 20: WTWKGLYQRLG

서열번호 21: WTWKGNKQVKF

서열번호 22: WTWKGETYDSK

본 발명에 의한 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드에 있어서, 상기 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드는 하기 서열번호 23 내지 26로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

서열번호 23: WTWKGKGTLNR

서열번호 24: WTWKGRKSLLR

서열번호 25: WTWKGEDKGKN

서열번호 26: WTWKGRDKLQM

본 발명에 의한 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드에 있어서, 상기 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드는 하기 서열번호 27 내지 31로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 아래 서열번호 27 내지 31로 표시되는 아미노산 서열은 최적화를 위해 서열번호 23 내지 26로 표시되는 아미노산 서열 중 일부가 결실된 구조이다.

서열번호 27: TWKGKGTLNR

서열번호 28: WKGKGTLNR

서열번호 29: WTWKGKGTLN

서열번호 30: WTWKGKGTL

서열번호 31: KGTLNR

또한, 본 발명은

(1) 펩타이드 라이브러리를 제작 후, 벡터에 삽입하여 재조합 파아지를 제조하는 단계;

(2) 상기 재조합 파아지와 아세틸콜린수용체를 혼합한 후, 바이오패닝(biopaning)을 실시하여 아세틸콜린수용체와 결합하는 파아지를 선별하는 단계;

(3) 상기 단계 (2)에서 선별된 파아지에 대하여 아세틸콜린수용체와, 대조군과의 효소면역분석(ELISA)을 실시하는 단계; 및

(4) 상기 효소면역분석 실시 결과를 분석하여 대조군 대비 아세틸콜린수용체와 결합 시그널의 강도가 1.5 배 이상인 파아지를 선별하는 단계; 를 포함하는 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드 스크리닝 방법을 제공하는 것을 본 발명의 또 다른 측면으로 한다.

본 발명에 의한 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제하는 펩타이드의 선별 방법에 있어서, 상기 (1) 펩타이드 라이브러리를 제작 후, 벡터에 삽입하여 재조합 파아지를 제조하는 단계에서의 상기 펩타이드 라이브러리는, 서열번호 1 내지 11 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 라이브러리를 이용하여 제작된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 상기 생체구조물에 대하여 결합활성을 나타낼 수 있는 펩타이드를 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장품 조성물을 제공하는 것을 다른 측면으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 주름개선용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 측면으로 한다.

본 발명에 따른 주름개선용 약학적 조성물은 본 발명의 펩타이드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 주름개선용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다.

본 발명에 의한 펩타이드는 아세틸콜린 수용체와 결합강도가 높아 아세틸 콜린과 강하게 결합하여 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써, 본 발명에 의한 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 화장품 조성물 및 약학적 조성물은 뛰어난 주름개선 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 랜덤 펩타이드 DNA 라이브러리의 제작 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 패닝 단계에서 아세틸콜린 수용체에 대한 특이성의 증가여부를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 패닝 단계에서 회수한 재조합 파아지의 음성대조군인 스트랩타비딘(strepavidin) 대비 아세틸콜린 수용체 대한 ELISA결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ELISA 결과에서, 아세틸콜린 수용체 / 스트랩타비딘(strepavidin) 의 시그널 비율이 1.5 배 이상인 재조합 파아지의 시퀀싱에 의한 선별된 펩타이드의 multiple alignment의 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 양성대조군인 Synake와 Vialox 와 선별된 펩타이드의 결합능을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 양성대조군인 Synake의 결합능을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 선별된 펩타이드의 결합능을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 optimization을 위한 deletion된 펩타이드의 결합능을 비교한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 deletion된 펩타이드의 결합능을 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 랜덤 펩타이드 파지라이브러리 제조

1-1. 4mer, 5mer, 6mer 랜덤 펩타이드 제작 및 벡터에의 삽입

랜덤 펩타이드 라이브러리(WTWKG(X)_n, X=random amino acids, n = 4 내지 6)을 제조하기 위하여, DNA 라이브러리 4mer (TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCTGGACATGGAAGGGANNKNNKNNKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT), 5mer (TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCTGGACATGGAAGGGANNKNNKNNKNKKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT), 6mer (TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCTGGACATGGAAGGGANNKNNKNNKNNKNKKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT)를 합성하였다(Bioneer, Daejeon, Korea).

두 개의 single strand 프라이머(TTCTATGCGGCCCAG, AACAGTTTCTGCGGC)로 PCR을 이용하여 Double strand insert를 증폭하였다. 랜덤 펩타이드 DNA 라이브러리 제작 결과를 도 1에 도시하였다.

이를 파아지미드 벡터(Phagemid Vector)(pIGT)에 삽입하기 위해서, 파아지미드 벡터와 PCR을 이용하여 증폭한 인서트 DNA를 제한효소로 처리하였다.

약 10 ㎍의 인서트 DNA를 SfiI(New England Biolabs(NEB), Ipswich) 및 NotI(NEB, Ipswich)으로 8시간 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 10 μg의 파아지미드 벡터를 SfiI 및 NotI으로 8시간 처리하고, CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB, Ipswich)를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제한 결과를 도 1에 도시하였으며, 4mer, 5mer, 6mer 펩타이드 라이브러리 DNA는 각각 1.8 × 10⁹, 3.2 × 10⁸, 5.9 × 10⁸ 개 제작하였다.

T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA(3 ㎍)를 파아지미드 벡터(10 ㎍)와 18 ℃에서 15 시간 동안 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 ㎕로 DNA를 용해시켜다.

1.2 전기천공

상기 실시예 1.1에서 제조된 각 4mer, 5mer, 6mer 랜덤 인서트 DNA를 포함하고 있는 파아지미드 벡터 100 ㎕를 4 ㎕씩 25개로 분주하여 전기천공을 수행하였다.

보다 상세하게는, 컴피턴트 세포(competent cell)를 얼음 위에서 녹이고, 200 ㎕의 컴피턴트 세포를 인서트 DNA를 포함하고 있는 각각의 파아지미드 벡터 용액 4 ㎕와 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm의 큐벳에 넣은 뒤, 1분 동안 얼음 위에 두었다.

전기천공기(BioRAD, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 ㎌ 및 2.5 kV의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기천공기에 위치시킨 후, 펄스를 가하였다(시간상수는 4.5 내지 5 msec). 이후, 즉시 37 ℃로 준비한 20 mM의 글루코오스가 포함된 1 ㎖의 LB(Luria Bertani) 액체배지에 넣은 후, 얻어진 총 25 ㎖의 세포를 100 ㎖의 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37 ℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해, 10 ㎕를 분주한 후 희석하여 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 분주한 후 잔류하는 세포를 1 L의 LB에 20 mM 글루코오스 및 50 ㎍/㎖의 암피실린을 넣고, 30 ℃에서 하루 동안 배양하였다. 4 ℃에서 4,000 xg로 20분 동안 원심분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40 ㎖의 LB로 재현탁시킨 후 글리세롤을 최종 농도 20 % 이상 넣고 80 ℃에 보관하였다.

1.3 랜덤 펩타이드 라이브러리에서 재조합 파아지 생산

상기 실시예 1.2에서 80 ℃에 저장된 4mer, 5mer, 6mer 랜덤 펩타이드 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다.

30 ㎖ SB 액체배지에 80 ℃에 보관된 라이브러리 1 ㎖을 추가하여 20 분 동안 37 ℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하여 배양하였다. 여기에 Helper phage(10¹⁰ pfu)와 암피실린(최종 농도 50 ㎍/㎖)을 넣고 다시 1 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 그리고 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(10 ㎍/㎖)이 포함된 SB 액체배지 30 ㎖에 옮겨 같은 조건으로 16 시간 이상 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 생산된 재조합 파아지를 4 ℃에서 5,000 rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여, 상층액을 얻고, 상층액에 PEG/NaCl을 5:1의 부피비(v/v)로 혼합하여 얼음에 1 시간 동안 방치시킨 후, 4 ℃에서 20분 동안 13,000 rpm의 속도로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 1 ㎖의 PBS(Phosphate bufferd saline)로 펠렛을 재현탁시켰다.

실시예 2. 아세틸콜린수용체에 결합하는 펩타이드 스크리닝 방법

2.1 아세틸콜린수용체의 바이오패닝

아세틸콜린수용체(AchR) alpha 1(10 ㎍/㎖)을 96 well high binding plate의 8개의 well에 50 ㎕씩 넣은 후, 4 ℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 PBS 200 ㎕로 1회 세척한 후, 2% BSA(Bovine Serum Albumin) 200 ㎕를 넣고 상온에서 2 시간 동안 블록킹한 후, 용액을 모두 버리고 PBS 200 ㎕로 3회 세척하였다.

여기에 상기 실시예 1.3에서 각각 제조된 4mer, 5mer, 6mer 랜덤 펩타이드 재조합 파아지 포함 용액 400 ㎕ 및 2% BSA 400 ㎕을 혼합하여 웰(well)당 100 ㎕씩 넣고 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 8개 웰(well)의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST(tween-20)로 3회 세척한 뒤 0.2 M 글리신(pH 2.2)을 웰(well)당 100 ㎕씩 넣어 10분간 파아지를 용리시키고 800 ㎕ E-tube에 모아, 여기에 1 M Tris(pH 9.0) 200 ㎕를 넣어 중화시켰다.

각 바이오패닝마다 input 파아지 및 output 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. coil에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 output 파아지 500 ㎕를 5 ㎖의 E. coil와 섞어 37 ℃에서 200 rpm의 속도로 30분 동안 혼합하며 배양한 후, 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 헬퍼 파아지(1 × 10¹⁰ pfu) 첨가하여 같은 방법으로 30분 동안 배양하였다. 그 다음 암피실린(50 ㎍/㎖)과 카나마이신(10 ㎍/㎖)dl 포함된 50 ㎖ SB 배지에 옮겨 같은 방법으로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 5,000 rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 상층액에 PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 5 : 1 비율로 첨가한 후, 얼음에 1 시간 동안 정치시켰다. 4 ℃에서 13,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리 후, 상층액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펠렛을 현탁한 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법으로 사용했으며, 세척과정의 횟수를 3회, 5회, 7회 및 10회로 하여, 6mer 라이브러리(S6)를 아세틸콜린수용체 단백질에 대하여 5차례에 걸쳐 바이오패닝을 실시한 조건과 Input phage, Output phage의 결과를 하기 표 1에 정리하였다.

S6 Biopanning
조건	name	Input	Output	Output/input
AchR 10ug/ml Binding 30℃ Incubation 1h PBST 0.1% Washing 3회	1 ^st S6	2840010⁶= *1.1210** ¹⁰	21100010² = *2.110** ⁶	*18.7510 ^-5**
AchR 10ug/ml Binding 30℃ Incubation 1h PBST 0.1% Washing 5회	2 ^nd S6	940010⁶ = *3.610** ⁹	4100010² = *410** ⁵	*11.110 ^-5**
AchR 10ug/ml Binding 30℃ Incubation 1h PBST 0.1% Washing 7회	3 ^rd S6	12840010⁶= *5.1210** ¹⁰	20100010²= *2.010** ⁶	*3.910 ^-5**
AchR 10ug/ml Binding 30℃ Incubation 1h PBST 0.1% Washing 10회	4 ^th S6	7940010⁶= *3.1610** ¹⁰	75100010²= *7.510** ⁶	*23.710 ^-5**
AchR 10ug/ml Binding 30℃ Incubation 1h PBST 0.1% Washing 10회	5 ^th S6	10440010⁶= *4.1610** ¹⁰	82100010²= *8.210** ⁶	*19.710 ^-5**

2.2 아세틸콜린수용체(AchR)의 인풋 파아지(Input phage)의 ELISA

상기 라이브러리의 각 인풋 파아지(Input phage)의 ELISA를 스트랩타비딘(Streptavidin) 및 아세틸콜린수용체(AchR)에 대해 수행하였다.

96웰 ELISA 플레이트에 10 ㎍/㎖ 아세틸콜린수용체와 스트랩타비딘을 각 웰당 50 ㎕씩 10개씩 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 이후 모든 웰을 0.05% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.05% PBST로 3회 세척하였다.

상기 표 1에서의 재조합 파아지인 세 번째(3 ^rd S6), 네 번째(4 ^th S6) 및 다섯 번째(5 ^th S6) 인풋 파아지 800 ㎕ 및 10% BSA 200 ㎕를 혼합하여 100 ㎕씩 아세틸콜린수용체와 스트랩타비딘 웰에 각각 3웰 씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다. 0.05% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.05% PBST로 3회 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)(BD Science) 용액 100 ㎕를 분주하여 발색 반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1 M HCl을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과를 도 2에 도시하였다.

2.3 아세틸콜린수용체에 특이적인 파아지 검색(colony ELISA)

상기 표 1에서의, 4 번째(4 ^th S6), 5 번째(5 ^th S6) output 파아지를 E. coil에 접종시킨 후, 플라크가 플레이트 당 100 내지 200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 50개를 1 ㎖의 SB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37 ℃에서 5 시간 동안 진탕 배양하여 헬퍼 파이지를 30 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 200 rpm의 속도로 하루동안 배양하였다. 배양액을 12,000 rpm의 속도로 2분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수한 후, 2% BSA를 넣고 이를 파아지 검색에 사용하였다.

96 well ELISA 플레이트에 5 ㎍/㎖의 아세틸콜린수용체, Streptavidin을 각 웰(well)당 50 ㎕씩 50개의 웰(well)에 넣고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날, 모든 웰(well)의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 용액 100 ㎕씩을 모든 웰(well)에 분주하고 30 ℃에서 1 시간 동안 정치하였다. 0.05% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1 : 2,000 으로 희석하여 100 ㎕씩 분주하고 30 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.05% PBST로 3회 세척한 후, TMB 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, 결과를 도 3에 정리하였다.

도 3을 참조하여, Streptavidin 대비 아세틸콜린수용체 시그널이 1.5 배 이상 나온 파아지의 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Bioneer, Deajon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 GATTACGCCAAGCTTTGGAGC를 사용하였다.

시퀀싱을 통해 아세틸콜린수용체에 특이적 결합능을 갖는 펩타이드 시퀀스를 도 4 및 하기 표 2에 정리하였다.

펩타이드 시퀀스
이름	시퀀스	중복횟수
S6_1	WTWKGKGTLNR	6/16
S6_2	WTWKGRKSLLR	1/16
S6_3	WTWKGEDKGKN	1/16
S6_4	WTWKGRDKLQM	1/16
S6_5	WTWKGQLGQLS	1/16
S6_6	WTWKGGRLSAS	1/16
S6_7	WTWKGRQLNNQ	1/16
S6_8	WTWKGDNLQNN	1/16
S6_9	WTWKGLYQRLG	1/16
S6_10	WTWKGNKQVKF	1/16
S6_11	WTWKGETYDSK	1/16

실시예 3. 발굴한 펩타이드의 아세틸콜린 결합력 비교실험

상기 표 2에서 펩타이드들 중 multiple alignment를 통해 시퀀스 유사성을 보이는 S6_1 (WTWKGKGTLNR), S6_2 (WTWKGRKSLLR), S6_3 (WTWKGEDKGKN), S6_4 (WTWKGRDKLQM)을 합성하였다.

이의 아세틸콜린수용체에 대한 결합력을 비교하고자, 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance(SPR) 실험을 진행하였다(Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden). 선택된 아세틸콜린수용체 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 500초까지 association과 dissociation을 관찰하였다. 관찰조건은 러닝 버퍼 20 mM Tris(pH 7.4), 속도 30 ㎕/분, 펩타이드 농도 10 μM (S6_1, S6_2, S6_3, S6_4)의 조건에서 수행하였다.

결합력 비교실험 결과 도 5에 정리하였다.

실시예 4. 발굴한 펩타이드 S6_1과 양성대조군과의 결합력 비교실험

발굴한 펩타이드인 S6_1(WTWKGKGTLNR)과 deletion된 form인 Sc_1_C6(KGTLNR)와 양성대조군인 Synake와 Vialox의 아세틸콜린수용체에 대한 결합력을 비교하고자 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance(SPR) 실험을 진행하였다(Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden).

선택된 아세틸콜린수용체 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 500초까지 association과 dissociation을 관찰하였다. 관찰조건은 러닝 버퍼 20 mM Tris(pH 7.4), 속도 30 ㎕/분, 펩타이드 농도 10 μM (Synake, Vialox, S6_1, S6_1_C6)의 조건에서 수행하였다. 결합력 비교실험 결과 도 6에 정리하였다.

실시예 5. S6_1 펩타이드 및 Synake 펩타이드 친화력 측정

발굴한 펩타이드인 S6_1(WTWKGKGTLNR)과 양성대조군인 Synake의 아세틸콜린수용체에 대한 친화력을 확인하고자, 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance(SPR) 실험을 진행하였다(Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden). 아세틸콜린수용체를 EDC/NHS를 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 500초까지 association과 dissociation을 관찰하였다. 관찰조건은 러닝 버퍼 20 mM Tris(pH 7.4), 속도 30 ㎕/분에서 수행하였다. 농도 10 내지 50 μM(Synake), 농도 0.1 내지 10 μM(펩타이드 S6_1)의 조건에서 수행하였다. 각각의 결과를 도 7(Synake) 및 도 8(펩타이드 S6_1)에 도시하였다.

실시예 6. S6_1의 펩타이드 최적화 및 결합력 비교실험

S6_1의 최적화를 위해 N-말단과 C-말단에서 하나와 두 개씩 아미노산을 제거한 펩타이드들인 S6_1_C10 (TWKGKGTLNR), S6_1_C9 (WKGKGTLNR) 와 S6_1_C10_end (WTWKGKGTLN), S6_1_C9_end (WTWKGKGTL)을 합성하였다.

이들 펩타이드의 아세틸콜린수용체에 대한 결합력을 비교하고자, 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance(SPR) 실험을 진행하였다(Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden).

선택된 아세틸콜린수용체 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 500초까지 association과 dissociation을 관찰하였다. 관찰조건은 러닝 버퍼 20 mM Tris(pH 7.4), 속도 30 ㎕/분, 펩타이드 농도 10 μM (Synake, Vialox, S6_1, S6_1_C10, S6_1_C9, S6_1_C10_end, S6_1_C9_end, S6_1_C6)의 조건에서 수행하였다. 결과를 도 9에 정리하였다.

실시예 7. S6_1_C9 펩타이드 친화력 측정

상기 실시예 6에서 제조된 최적화된 S6_1_C9 펩타이드(WKGKGTLNR)의 아세틸콜린수용체에 대한 친화력을 확인하고자, 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance(SPR) 실험을 진행하였다(Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden).

선택된 아세틸콜린수용체 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 500초까지 association과 dissociation을 관찰하였다. 관찰조건은 러닝 버퍼 20 mM Tris(pH 7.4), 속도 30 ㎕/분, 농도 0.1 내지 0.5 μM(펩타이드 S6_1_C9) 의 조건에서 수행하였다.

결과를 도 10에 정리하였다. 도 10를 참조하면, S6_1_C9 펩타이드(WKGKGTLNR)는 아세틸콜린에 대해 Synake 대비 약 100 배 높은 결합능을 보이는 것을 확인할 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF CERAMIC ENGINEERING & TECHNOLOGY <120> PEPTIDE FOR BINDING TO ACETYLCHOLINE RECEPTORS <130> DP-2017-0081-KR <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 1 Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 2 Arg Lys Ser Leu Leu Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 3 Glu Asp Lys Gly Lys Asn 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 4 Arg Asp Lys Leu Gln Met 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 5 Gln Leu Gly Gln Leu Ser 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 6 Gly Arg Leu Ser Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 7 Arg Gln Leu Asn Asn Gln 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 8 Asp Asn Leu Gln Asn Asn 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 9 Leu Tyr Gln Arg Leu Gly 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 10 Asn Lys Gln Val Lys Phe 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 11 Glu Thr Tyr Asp Ser Lys 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 12 Trp Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 13 Trp Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 14 Trp Thr Trp Lys Gly Glu Asp Lys Gly Lys Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 15 Trp Thr Trp Lys Gly Arg Asp Lys Leu Gln Met 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 16 Trp Thr Trp Lys Gly Gln Leu Gly Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 17 Trp Thr Trp Lys Gly Gly Arg Leu Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 18 Trp Thr Trp Lys Gly Arg Gln Leu Asn Asn Gln 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 19 Trp Thr Trp Lys Gly Asp Asn Leu Gln Asn Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 20 Trp Thr Trp Lys Gly Leu Tyr Gln Arg Leu Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 21 Trp Thr Trp Lys Gly Asn Lys Gln Val Lys Phe 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 22 Trp Thr Trp Lys Gly Glu Thr Tyr Asp Ser Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 23 Trp Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 24 Trp Thr Trp Lys Gly Arg Lys Ser Leu Leu Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 25 Trp Thr Trp Lys Gly Glu Asp Lys Gly Lys Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 26 Trp Thr Trp Lys Gly Arg Asp Lys Leu Gln Met 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 27 Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 28 Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 29 Trp Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 30 Trp Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ach-R <400> 31 Lys Gly Thr Leu Asn Arg 1 5

Claims

하기 서열번호 1, 2, 12 내지 15, 17 내지 19, 21 및 27 내지 30으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드:
[서열번호 1] KGTLNR,
[서열번호 2] RKSLLR,
[서열번호 12] WTWKGKGTLNR,
[서열번호 13] WTWKGRKSLLR,
[서열번호 14] WTWKGEDKGKN,
[서열번호 15] WTWKGRDKLQM,
[서열번호 17] WTWKGGRLSAS,
[서열번호 18] WTWKGRQLNNQ,
[서열번호 19] WTWKGDNLQNN,
[서열번호 21] WTWKGNKQVKF,
[서열번호 27] TWKGKGTLNR,
[서열번호 28] WKGKGTLNR,
[서열번호 29] WTWKGKGTLN, 및
[서열번호 30] WTWKGKGTL.
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제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제1항의 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물.
제1항의 펩타이드 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 주름개선용 약학적 조성물.
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