KR101968253B1 - Pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis and candidiasis comprising Toxoplasma gondii-GRA7 recombinant protein as an active ingredient - Google Patents

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Abstract

본 발명은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래 재조합 GRA7 단백질을 항원으로 이용할 경우, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 감염에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.The invention Toxoplasma gondii GRA7 (Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis or candidiasis comprising an antigen-derived recombinant protein as an active ingredient.
The Toxoplasma of the present invention gondii) When using as an antigen a protein derived from recombinant GRA7, jeneseu L. monocytogenes (Listeria monocytogenes ) and Candida albicans ( Candida albicans ) infection, and thus can be usefully used for preventing or treating listeriosis or candidiasis.

Description

톡소포자충 ＧＲＡ７ 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 리스테리아증 및 칸디다증의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis and candidiasis comprising Toxoplasma gondii-GRA7 recombinant protein as an active ingredient}[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis and candidiasis comprising as an active ingredient a recombinant protein derived from Toxoplasma gondii GRA7 antigen,

본 발명은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The invention Toxoplasma gondii GRA7 (Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis or candidiasis comprising an antigen-derived recombinant protein as an active ingredient.

자연계에서 흔하게 발견되고 인수공통 전염병을 유발하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 인체 감염시 초기 가벼운 두통 및 복통을 유발하는 식중독을 유발하나 인체 중추 신경계로 감염될 경우 구토, 발열, 불안 등을 포함한 전구증상과 전형적인 뇌수막염, 패혈증 또는 뇌염 등 리스테리아증을 유발하여 인간의 생명을 치명적으로 위협하는 고위험 병원성 미생물이다. 리스테리아증의 주증세인 뇌수막염은 주로 노년과 면역부전 환자에게서 나타나며, 1차 패혈증 또는 심내막염을 유발하기도 한다. 특히, 임산부는 정상인에 비해 약 20배 이상 높은 감염 위험성을 보이며, 리스테리아 모노사이토제네스 감염은 조기 분만, 자연유산, 사산, 태아 감염 등을 유발하며, 감염 산모 및 태아는 뇌수막염 혹은 심내막염 등의 심각한 합병증을 일으켜 사망에 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 리스테리아 모노사이토제네스는 저온과 고온(0~45℃)에서 성장이 가능하고, 잠복기가 70~90일에 달하며, 치사율이 20~30％에 달하여 매년 전 세계적으로 병원성 리스테리아 모노사이토제네스에 의한 리스테리아 감염 질환 환자 및 사망자가 증가하고 있는 가운데 일상생활에서 흔히 접하게 되는 가공식품, 샐러드, 조리기구, 다양한 농축산물 등 일반 환경 내 어디든 존재하고 있어 수시로 국민 건강을 위협하고 있다. Listeria monocytogenes , which is commonly found in nature and causes common communicable diseases, causes food poisoning that causes early mild headaches and abdominal pain at the time of human infection, but it causes vomiting, fever and anxiety when infected with the human central nervous system It is a high-risk pathogenic microorganism that causes listeriosis such as global symptoms, typical meningitis, sepsis or encephalitis, and lethal threat to human life. Meningitis, a major symptom of listeriosis, occurs primarily in older patients and immunocompromised patients, and may cause primary sepsis or endocarditis. Listeria monocytogenes infection causes premature labor, spontaneous abortion, stillbirth, and fetal infections. Infectious maternal and fetal infections are associated with serious complications such as meningitis or endocarditis To lead to death. Listeria monocytogenes can grow in low temperature and high temperature (0 ~ 45 ℃), incubation period is 70 ~ 90 days, mortality rate is 20 ~ 30%, and every year Listeria infection by pathogenic Listeria monocytogenes As the disease patients and deaths are increasing, they are present everywhere in the general environment such as processed foods, salads, cooking utensils, various agricultural and livestock products, etc., which are frequently encountered in everyday life.

상기한 바와 같이 인체에 치명적인 질환을 유발하는 리스테리아증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제가 필요한 실정이나 아직 리스테리아증의 치료에는 항생제를 사용하는 치료가 주가 되고 있다. 한편, 최근에는 항생제 남용에 대한 문제점이 대두되고 있어, 리스테리아증의 치료에 효과가 좋으면서도 인체에 안정성이 있는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다(한국등록특허 제10-1660638호). As described above, there is a need for a therapeutic agent capable of effectively treating listeriosis which causes a fatal disease in the human body. However, treatment of listeriosis is mainly performed using antibiotics. On the other hand, recently, problems with the abuse of antibiotics are emerging, and there is a desperate need to develop a therapeutic agent which is effective for the treatment of listeriosis and has stability to the human body (Korean Patent No. 10-1660638).

또한, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 정상 세균총의 일부로서 인간의 구강, 음부 및 위장관의 점막 표면에 군집하고 있는 효모균과 같은 이상성 진균인 모닐리아증이라고도 하는 칸디다증(candidiasis)의 원인균이다. 칸디다 알비칸스는 진균(곰팡이)의 일종으로서 인체 내의 상피세포에서 주로 번식한다. In addition, Candida albicans is a causative organism of candidiasis, also called monilia, which is part of normal flora and is an ideal fungus such as yeast that is clustered on the mucosal surfaces of human oral, vaginal and gastrointestinal tracts. Candida albicans is a type of fungus (mold) that mainly reproduces in epithelial cells in the body.

정상적인 피부, 점막, 분변, 객담, 요 등에 존재하며 인체에는 해가 없지만, 항생물질이나 부신피질 호르몬을 사용한 경우나, 인체의 면역력이 저하된 경우에는 이상증식을 하여 병을 일으킨다. 그것은 또한 구내염 및 질염과 같은 국소 점막염을 일으킬 수 있는 기회 감염균이거나, 또는 그것이 침투하여 전신성 감염이 될 수 있다. 종류로는 구각, 혀, 외음부, 질 등이 짓무르고 통증이 있는 점막 칸디다증, 피부의 주름 사이나 손가락 사이, 항문 부근이나 유방 등이 발갛게 짓무르는 피부 칸디다증, 설사, 복통, 황달 등을 일으키는 소화관 칸디다증, 패혈증과 같은 증세를 띠며, 수막염이나 심내막염을 수반하는 전신성 칸디다증이 있다. It is present in normal skin, mucous membrane, feces, sputum, urine, and there is no harm to human body. However, when antibiotic substance, corticosteroid, or the immunity of human body is decreased, abnormal proliferation is caused and disease is caused. It can also be an opportunistic infection that can cause stomatitis, such as stomatitis and vaginitis, or it can penetrate and become a systemic infection. Types include: mucocutaneous candidiasis with mucous membranes with painful and painful mouth, tongue, vulva, and vagina; glandulitis that causes skin candidiasis, diarrhea, abdominal pain, jaundice, Candidiasis, sepsis, and systemic candidiasis with meningitis or endocarditis.

최근에 항암화학요법이나 장기이식 후의 면역억제제 투여로 인한 면역저하 환자나 후천성면역부전증(AIDS) 환자의 증가와 함께 전신성 진균 감염증의 발병률은 크게 증가하고 있고 그 중요성도 나날이 커지고 있다. 실제로 암이나 에이즈에 걸린 경우, 환자가 죽는 원인이 병 그 자체보다는 장기나 혈액의 진균감염 때문이다. 또한 진균 감염의 원인균도 점차 다양해지고 있고 앞으로 더 많은 종류의 진균이 침습성 감염증을 유발할 것으로 예측하고 있다.Recently, the incidence of systemic fungal infections has increased with the increasing number of immunocompromised patients or acquired immunodeficiency (AIDS) patients due to the administration of immunosuppressive drugs after chemotherapy or organ transplantation, and its importance is increasing day by day. In fact, if you have cancer or AIDS, the cause of the patient's death is due to organs or blood fungal infections rather than the disease itself. In addition, the causative organisms of fungal infections are becoming more diverse, and more types of fungi are expected to cause invasive infections.

현재 임상적으로 사용되는 항진균제로는 암포테리신 B(amphotericin B)외에는 아졸계열(azole)의 합성물질이 대부분 사용되고 있다. 그러나 이런 항진균제들이 사용시 부작용이 심하게 나타나는 단점이 있다(한국등록특허 제10-1632042호). Currently, most of the antifungal agents used clinically are amphotericin B, but most of the azole compounds are used. However, these antifungal agents have disadvantages in that side effects are severe when used (Korean Patent No. 10-1632042).

한편, 톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 대식세포에 침투하여 중추신경계를 감염시키는 기회감염성 원충기생충이다. 톡소포자충은 고양이를 종숙주로 하여 고양이 분변에 나온 우씨스트(oocyst)를 통해 사람을 비롯한 각종 온혈 동물에 감염되며, 감염된 동물의 조직에 씨스트(cyst)로 존재하다가 사람이 섭식할 때 감염된다. 또한, 산모가 톡소포자충에 감염된 경우 이의 영양형(trophozoite)이 태반을 거쳐 태아에게 감염된다. 선천성 감염의 경우 초기 태아는 유사산이 일어나며, 중후기 태아의 경우에는 정상적 분만이 이루어지더라도 이후 시력손상, 수두증, 정신박약 등의 증상이 나타난다. 후천적 감염의 경우 대부분의 개체에서 무증상이지만, 면역성이 손상된 환자, 예컨대 HIV 감염에 따른 AIDS 환자 또는 의학적 처치에 의하여 면역부전이 일어난 환자에서는 망막맥락막, 뇌수막염 등의 심각한 증상이 나타난다. On the other hand, Toxoplasma gondii ) is an opportunistic protozoal parasite that infects macrophages and infects the central nervous system. Toxoplasma gonorrhea is caused by the oocyst from cat litter, which infects humans and other warm-blooded animals. It is present in the tissues of infected animals as a cyst and then infected when a person eats. In addition, when the mother is infected with toxoplasmosis, her trophozoite infects the fetus through the placenta. In the case of congenital infection, the fetus develops a similar acid, and in the case of the middle-after fetus, symptoms such as visual impairment, hydrocephalus, and mental retardation appear even after normal delivery. Acquired infections are asymptomatic in most individuals, but patients with impaired immunity, such as AIDS patients due to HIV infection, or patients with immunodeficiency due to medical treatment, have severe symptoms such as retinal choroid and meningitis.

본 발명자들은 이러한 심각한 증상을 유발하는 톡소포자충으로부터 유래된 항원 단백질인 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7)이 MyD88을 통해 TRAF6와 상호작용하고, 대식세포(macrophage)에서 선천 면역 반응(innate immune response)이 일어나게 하며, 체내(in vivo)에서 톡소포자충 감염에 대해 효과적인 방어를 할 수 있게 해주는 것으로 보고한 바 있다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016).The present inventors have found that the antigen protein GRA7 ( Toxoplasma gondii dense granule antigen 7 interacts with TRAF6 through MyD88, causing an innate immune response in the macrophage and an effective defense against toxoplasmosis infection in vivo (Yang CS et al ., Infect Immun . , 84: 339-350, 2016).

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 리스테리아증 또는 칸디다증을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 세포 내 감염된 리스테리아 모노사이토제네스 및 칸디다 알비칸스가 톡소포자충 유래 GRA7 항원 단백질에 의해 생존률이 현저하게 감소함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.Under these circumstances, the inventors of the present invention have made extensive efforts to develop a therapeutic agent capable of more effectively treating listeriosis or candidiasis. As a result, the survival rate of the intracellularly infected Listeria monocytogenes and Candida albicans derived from toxoplasmosis-derived GRA7 antigen protein , The present invention has been completed.

한국등록특허 제10-1660638호Korean Patent No. 10-1660638 한국등록특허 제10-1632042호Korean Patent No. 10-1632042

Yang CS et.al., Infect Immun., 84: 339-350, 2016Yang CS et al., Infect Immun., 84: 339-350, 2016

본 발명의 목적은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래의 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 유효성분으로 포함하는, 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for producing Toxoplasma The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis or candidiasis, which comprises as an active ingredient a recombinant dense granule antigen 7 protein (rGRA7 protein) derived from gondii .

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 이용하여 리스테리아증 또는 칸디다증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating listeriosis or candidiasis using the pharmaceutical composition.

본 발명의 또 다른 목적은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래의 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 이용한 항리스테리아증 또는 항칸디다증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.A further object of the present invention is Toxoplasma gondii (Toxoplasma (recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein) derived from a gondii- derived recombinant GRA7 protein.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물의 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료용도, 및 상기 약학적 조성물을 이용하여 리스테리아증 또는 칸디다증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a recombinant protein derived from Toxoplasma gondii dense granule antigen (GRA7) antigen, a pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis or candidiasis, And a method for preventing or treating listeriosis or candidiasis using the pharmaceutical composition.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 유효성분으로 포함하는, 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In one embodiment, the present invention relates to a recombinant GRA7 protein (recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein) comprising 15 to 236 amino acid residues comprising the amino acid sequence of [Formula 1] Or a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of candidiasis.

[식 1] PVDX1LRPTNAGVDSK[Equation 1] PVDX 1 LRPTNAGVDSK

상기 [식 1]에서 X1= S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)이다. 단, X1 이 S인 경우, S는 인산화되어 있다.X 1 = S (serin), D (aspartic acid) or E (glutamic acid) in the above formula 1. However, when X 1 is S, S is phosphorylated.

본 발명에서 용어 "GRA7(dense granule antigen 7; GenBank accession no. DQ459443.2)"이란, 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래 항원 단백질로, 236개의 아미노산 서열로 구성되어 있다. GRA7은 MyD88을 통해 TRAF6와 상호작용하고, 대식세포(macrophage)에서 선천 면역 반응(innate immune response)이 일어나게 하며, 체내(in vivo)에서 톡소포자충 감염에 대해 효과적인 방어를 할 수 있게 해주는 것으로 보고된 바 있다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016).The term " dense granule antigen 7 (GenBank accession no. DQ459443.2) " in the present invention refers to Toxoplasma gondii- derived antigenic protein, consisting of 236 amino acid sequences. GRA7 has been reported to interact with TRAF6 through MyD88, to cause an innate immune response in macrophages, and to provide an effective defense against toxoplasmosis infection in vivo (Yang CS et al ., Infect Immun . , 84: 339-350, 2016).

상기 톡소포자충은 대식세포에 침투하여 중추신경계를 감염시키는 기회감염성 원충기생충이며, 고양이를 종숙주로 하여 고양이 분변에 나온 우씨스트(oocyst)를 통해 사람을 비롯한 각종 온혈 동물에 감염된다. 감염된 동물의 조직에 씨스트(cyst)로 존재하다가 사람이 섭식할 때 감염되며, 산모가 톡소포자충에 감염된 경우 이의 영양형(trophozoite)이 태반을 거쳐 태아에게 감염된다. 선천성 감염의 경우 초기 태아는 유사산이 일어나며, 중후기 태아의 경우에는 정상적 분만이 이루어지더라도 이후 시력손상, 수두증, 정신박약 등의 증상이 나타난다. 후천적 감염의 경우 대부분의 개체에서 무증상이지만, 면역성이 손상된 환자, 예컨대 HIV 감염에 따른 AIDS 환자 또는 의학적 처치에 의하여 면역부전이 일어난 환자에서는 망막맥락막, 뇌수막염 등의 심각한 증상이 나타난다.The toxoplasmosis is an opportunistic parasitic parasite that infects macrophages and infects the central nervous system. It infects various warm-blooded animals including humans through oocyst which is a cat litter. It is present in the tissue of an infected animal as a cyst, and is infected when a person eats. When the mother is infected with toxoplasmosis, the trophozoite infects the fetus through the placenta. In the case of congenital infection, the fetus develops a similar acid, and in the case of the middle-after fetus, symptoms such as visual impairment, hydrocephalus, and mental retardation appear even after normal delivery. Acquired infections are asymptomatic in most individuals, but patients with impaired immunity, such as AIDS patients due to HIV infection, or patients with immunodeficiency due to medical treatment, have severe symptoms such as retinal choroid and meningitis.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 [식 1]에서 X1은 S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)일 수 있으며, 또한 D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)일 수 있으며, 또한 D(aspartic acid)일 수 있다. 단, X1이 S(serin)인 경우, PKC-α 매개에 의해 인산화된 형태일 수 있다.In one embodiment of the present invention, X 1 in formula 1 may be S (serin), D (aspartic acid) or E (glutamic acid), D (aspartic acid) or E (glutamic acid) And may also be D (aspartic acid). Provided that when X < 1 > is S (serin), it may be in a form phosphorylated by PKC-alpha mediator.

상기 [식 1]에서 X1은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 단백질의 아미노산 서열 중 GRA7-Ⅰ 도메인 내의 52번째 S(serin) 위치로서, 특정 인산화 부위(site)일 수 있다. 상기 S52를 포스포미메틱 잔기(phosphomimetic residue)인 아스파르트산(aspartic acid. D) 또는 글루탐산(glutamic acid, E)으로 단일 치환한 S52D 또는 S52E 돌연변이체(mutant)는 인산화된 단백질을 모방하여 상기 단백질을 활성화 시킬 수 있다. 인산화되어 활성화된 상기 GRA7 항원 유래 단백질은 선천면역(innate immunity)과 관련되어 있는 분자(molecule)인 ASC와 LPD1과 상호작용하여 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여할 수 있다.In the above formula 1, X 1 represents toxoplasmosis GRA7 ( Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) the 52nd S (serin) position in the GRA7-I domain of the amino acid sequence of the antigen-derived protein, which may be a specific phosphorylation site. The S52D or S52E mutant in which the S52 is monosubstituted by a phosphomimetic residue aspartic acid (D) or glutamic acid (E) mimics a phosphorylated protein to convert the protein Can be activated. The phosphorylated and activated GRA7 antigen-derived protein may contribute to antimicrobial defense by interacting with ASC and LPD1, molecules associated with innate immunity.

본 발명의 일실시예에 있어서, PKC-α 매개에 의해 인산화(phosphorylation) 된 GRA7 단백질은 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여하는 ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) 또는 PLD1(Phospholipase D1)과의 상호작용이 필수적임을 확인하였다(도 1 내지 도 10).In one embodiment of the present invention, the phosphorylated GRA7 protein mediated by the PKC-alpha mediates an apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain (ASC) or PLD1 Phospholipase D1) was essential (FIGS. 1 to 10).

본 발명에 있어서, 상기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. In the present invention, the recombinant GRA7 protein having a length of 15 to 236 amino acids including the amino acid sequence of the above-mentioned [Formula 1] may be any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: Lt; RTI ID = 0.0 > of: < / RTI >

또한, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. Preferably, the recombinant GRA7 protein may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9, more preferably an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: Sequence, and most preferably a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.

또한, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 상기 재조합 GRA7 단백질은 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 15개 내지 55개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있다.The recombinant GRA7 protein may be 15 to 236 amino acids in length, more preferably 15 to 55 amino acids in length, and most preferably 15 Lt; / RTI > amino acids in length.

또한, 상기 단백질의 변형체(mutant)가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변형체란 GRA7 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).Also included within the scope of the present invention are mutants of such proteins. By a modified version of the protein is meant a protein having a sequence that differs by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, with the amino acid sequence of the GRA7 protein and one or more amino acid residues. Amino acid exchange in proteins and fragments that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

본 발명의 GRA7 단백질은 톡소포자충으로부터 유래한 것으로서, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.The GRA7 protein of the present invention is derived from toxoplasmosis, and can be produced by a recombinant method based on DNA sequence. When a gene recombination technique is used, a nucleic acid encoding a protein is inserted into an appropriate expression vector, a host cell is cultured so that a protein of interest is expressed in the transformant transformed with the recombinant expression vector, Can be obtained by recovering the protein.

본 발명에서 용어 "리스테리아증(listeriosis)"이란, 식중독 발병의 원인균인 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 의해 감염되는 병으로, 리스테리아균이 위를 통해 장과 혈류로 침투하면서 발병된다. 일단 혈류까지 리스테리아균이 침투하면 중추신경계(central nervous system)와 태반(placenta)까지 이 균이 확산될 수 있다. 특히 에이즈와 같은 질병으로 인해 면역계(immune system)가 약화된 사람에게는 뇌막염(meningitis)까지 유발시킬 수 있다. The term in the invention "listeriosis (listeriosis)" refers to a pathogen Listeria monocytogenes in food poisoning outbreak jeneseu (Listeria monocytogenes ), which develops when Listeria infiltrates into the intestine and bloodstream through the stomach. Once Listeria infiltrates into the bloodstream, it can spread to the central nervous system and the placenta. It can also cause meningitis in people with a weakened immune system due to diseases such as AIDS.

본 발명에서 용어 "칸디다증(candidasis)"이란, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 인한 진균증이며 최초로 아구창 환자에게서 분리되었고 여성의 경우 질염을 일으키고 유아의 기저귀 발진을 유발한다. In the present invention, the term " candidasis " is a mycosis caused by Candida albicans , which was first isolated from a throat patient, causing a vaginitis in a woman and causing diaper rash in infants.

본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 리스테리아증 또는 칸디다증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 리스테리아증 또는 칸디다증의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다. The term " prevention " in the present invention means all the actions of inhibiting or delaying the onset of listeriosis or candidiasis by administration of the pharmaceutical composition of the present invention. By " treatment " It means any act that has alleviated or benefited from symptoms of already induced listeriosis or candidiasis.

본 발명의 일실시예에 있어서, 톡소포자충(Toxoplasma gondii)으로부터 GRA7 유전자를 수득하고, 이를 벡터에 삽입하여 발현벡터를 수득한 다음, 이를 대장균에 도입하여 GRA7을 생산하는 형질전환체를 수득하였으며, 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 GRA7 단백질을 대량생산하고 정제하였다. 또한, 상기 정제된 재조합 GRA7 단백질을 대상으로 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석을 수행한 결과, 상기 재조합 GRA7 단백질이 PKC-α 매개에 의해 인산화되며, 인산화된 GRA7 단백질은 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여하는 ASC 또는 PLD1과의 상호작용함을 확인하였다(도 1 내지 도 10). 상기 재조합 GRA7 단백질이 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 감염으로 인한 리스테리아증(listeriosis) 또는 칸디다증(candidasis)을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 재조합 GRA7 단백질을 PKCα+/+ 마우스로부터 분리한 DMEM(Bone-marrow-derived macrophage)에 처리하고 리스테리아 모노사이토제네스 및 칸디다 알비칸스 감염에 대한 항균 활성(antimicrobial activity)을 확인하였다. 그 결과, 처리량 의존적으로 재조합 GRA7 단백질이 리스테리아 모노사이토제네스 또는 칸디다 알비칸스에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킴을 확인하였다(도 16).In one embodiment of the invention, Toxoplasma gondii , and inserted into the vector to obtain an expression vector, which was then introduced into Escherichia coli to obtain a transformant for producing GRA7. The transformant was cultured to produce recombinant GRA7 protein in a large amount And purified. Further, immunoblotting (IB) analysis of the purified recombinant GRA7 protein revealed that the recombinant GRA7 protein is phosphorylated by PKC-α mediated phosphorylation, and the phosphorylated GRA7 protein is inhibited by antimicrobial defense Interacting with the contributing ASC or PLD1 (Figs. 1 to 10). The recombinant GRA7 protein can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition capable of preventing or treating listeriosis or candidiasis caused by infection of Listeria monocytogenes or Candida albicans , The recombinant GRA7 protein was treated with bone marrow-derived macrophages (DMEM) isolated from PKCα + / + mice to confirm the antimicrobial activity against Listeria monocytogenes and Candida albicans infection Respectively. As a result, it was confirmed that the recombinant GRA7 protein significantly increased the antibacterial reaction against Listeria monocytogenes or Candida albicans in a throughput-dependent manner (Fig. 16).

따라서, 본 발명에서 제공하는 재조합 GRA7 단백질은 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료 효과를 갖는 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.Accordingly, it was found that the recombinant GRA7 protein provided by the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition having an effect of preventing or treating listeriosis or candidiasis.

본 발명의 재조합 GRA7 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 리스테리아증 또는 칸디다증에 대한 면역성을 유도할 수 있는데, 상기 재조합 GRA7 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적절하게 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 주사제는 생리식염액 및 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등) 및 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 분사제의 경우에는 적합한 분사제, 예컨대, 압축공기, 질소, 이산화탄소, 또는 탄화수소 기반 낮은 끓는점 용매 등을 사용하여 가압팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시체의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.A pharmaceutical composition containing the recombinant GRA7 protein of the present invention as an active ingredient may induce immunity against listeriosis or candidiasis, and the recombinant GRA7 protein may be suitably formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a pigment and a flavoring agent in the case of oral administration. In the case of an injection, A non-aqueous solvent such as an aqueous solvent such as water and a ring gel liquid, a vegetable oil, a higher fatty acid ester (e.g., oleic acid), and an alcohol (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.) A buffering agent, a preservative, an anhydrous agent, a solubilizing agent, an isotonic agent and a stabilizer may be mixed and used. In the case of a propellant, it can be conveniently delivered in the form of an aerosol sprayer body from a pressurized pack or sprayer using a suitable propellant, such as compressed air, nitrogen, carbon dioxide, or a hydrocarbon-based low boiling point solvent.

본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above. For example, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like in the case of oral administration, and in the case of injections, unit dosage ampoules or a plurality of dosage forms.

상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.The route of administration of the pharmaceutical composition may be administered through any conventional route so long as it can reach the target tissue.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 본 발명의 재조합 GRA7 단백질은 비경구 경로, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스(bolus)로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있으나, 바람직하게는 근육내 또는 피하 주사로 투여되는 것이 바람직하다.The term " administration " of the present invention means introduction of a predetermined substance into a patient by any suitable method, and is formulated into human or veterinary and administered by various routes. The recombinant GRA7 protein of the present invention may be administered via a parenteral route such as intravenous, intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous and may be administered by the inhalation route via oral, nasal, rectal, transdermal or aerosol It may be administered as a bolus or slowly, but preferably it is administered intramuscularly or subcutaneously.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 리스테리아 모노사이토제네스 또는 칸디다 알비칸스에 대한 항균 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 재조합 GRA7 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 재조합 GRA7 단백질과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. "치료상 유효량" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다. The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term " pharmaceutically effective amount " of the present invention means an amount sufficient to exhibit an antimicrobial effect against Listeria monocytogenes or Candida albicans, and an amount not causing side effects or severe or excessive immune responses, The effective dose level will depend on the disorder being treated, the severity of the disorder, the activity of the particular compound, the route of administration, the rate of removal of the recombinant GRA7 protein, the duration of treatment, the drug used in combination with or concurrently with the recombinant GRA7 protein, , Dietary habits, general health status, and factors known in the pharmaceutical and medical arts. Various general considerations to be considered in determining " therapeutically effective amount " are known to those skilled in the art and are described, for example, in Gilman et al. , eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990 and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.

상기 종래의 치료제는 항생제 또는 항진균제일 수 있으며, 상기 항생제는, 이에 제한되지는 않으나, 테트라사이클린(tetracycline), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 클린다마이신(clindamycin), 반코마이신(vancomycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 페니실린(penicillin) 및 바시트라신(bacitracin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다. 또한, 상기 항진균제는, 이에 제한되지는 않으나, 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 플루코나졸(fluconazole), 테르비나핀(terbinafine), 그리세오풀빈(griseofulvin), 아이오딘화칼륨(potassium iodide), 및 플루시토신(flucytosine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.The conventional therapeutic agent may be an antibiotic or an antifungal agent, and the antibiotic may include, but is not limited to, tetracycline, nitrofurantoin, clindamycin, vancomycin, ciprofloxacin, Penicillin, and bacitracin. ≪ Desc / Clms Page number 7 > The antifungal agent may be selected from the group consisting of, but not limited to, amphotericin B, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, terbinafine, griseofulvin, Potassium iodide, and flucytosine. In the case of the present invention,

본 발명의 약학적 조성물은 GRA7 단백질과 함께 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having the effect of preventing or treating listeriosis or candidiasis together with GRA7 protein.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.The pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of oral, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol or other oral formulations, external preparation, suppository and sterilized injection solution, . Suitable formulations known in the art are preferably those disclosed in Remington ' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton PA. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like. Such solid preparations are prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 리스테리아증 또는 칸디다증의 발병이 예상되거나 또는 상기 리스테리아증 또는 칸디다증이 발병된 인간을 제외한 개체에게 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 리스테리아증 또는 칸디다증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for preventing or ameliorating listeriosis or candidiasis, which comprises administering the pharmaceutical composition to a subject other than a human with anticipated onset of listeriosis or candidiasis or with the onset of the listeriosis or candidiasis. Or < / RTI >

본 발명의 용어 "개체"란, 리스테리아증 또는 칸디다증이 발병할 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 바람직하게는 리스테리아증 또는 칸디다증의 증상이 나타날 수 있는 고등 척추동물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 리스테리아증 또는 칸디다증이 발병될 수 있는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축 및 이로부터 감염될 수 있는 사람이 될 수 있다.The term " individual " of the present invention means a living organism capable of developing listeriosis or candidiasis, preferably a high vertebrate animal in which the symptoms of listeriosis or candidiasis may occur, It can be a cattle such as cattle, pigs, sheep, goats, dogs and the like, which can become infected or can become infected with.

본 발명의 약학적 조성물을 상기 개체에 투여하면, 리스테리아증 또는 칸디다증을 유발시키는 균주에 대하여 개체의 면역성을 증진시켜서, 리스테리아증 또는 칸디다증을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 약학적 조성물의 투여 대상은 일차적으로는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 가축에 의하여 리스테리아증 또는 칸디다증이 전염될 수 있는 인간의 예방 또는 치료에도 사용될 수 있다.When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to the subject, it may exhibit the effect of preventing or treating listeriosis or candidiasis by enhancing immune status of a subject against a strain causing listeriosis or candidiasis. The subject of administration of such a pharmaceutical composition may be primarily livestock such as cattle, pigs, sheep, goats, dogs, etc., but is not limited to, but is not limited to, human preventive or preventive measures against which listeriosis or candidiasis may be transmitted by the livestock It can also be used for treatment.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 후보물질과 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 GRA7 단백질을 접촉시키는 단계; 상기 재조합 GRA7 단백질의 S52 위치에서의 인산화 여부를 조사하는 단계; 및 상기 후보물질이 인산화를 촉진하는지를 판단하는 단계;를 포함하는 항리스테리아증 또는 항칸디다증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for producing a recombinant GRA7 protein comprising contacting a candidate substance with a recombinant GRA7 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Determining whether the recombinant GRA7 protein is phosphorylated at the S52 position; And judging whether the candidate substance promotes phosphorylation. The present invention also provides a method for screening a therapeutic agent for an anti-listerial or anti-candidiasis.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 GRA7 단백질의 S52 위치에서의 인산화 여부에 따라 상기 단백질을 활성화 시킬 수 있고, 상기 단백질은 선천면역(innate immunity)과 관련된 ASC와 PLD1과 상호작용하므로 감염성 질환인 리스테리아증 또는 칸디다증을 억제하는 치료제로 판단할 수 있다.The protein can be activated according to whether the recombinant GRA7 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is phosphorylated at the S52 position. Since the protein interacts with ASC and PLD1 related to innate immunity, Listeriosis, or candidiasis.

상기 재조합 GRA7 단백질의 S52에서의 인산화 여부는 GRA7의 S52의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 판단할 수 있으며, 상기 항체는 당업계에 통상적인 항체 제작 방법을 통해 제작하여 사용할 수 있다.The phosphorylation of the recombinant GRA7 protein in S52 can be judged by using a monoclonal antibody or polyclonal antibody that specifically recognizes the phosphate group of S52 of GRA7. The antibody can be produced by an antibody production method Can be manufactured and used.

상기 모노클로날 항체에 마커가 표지된 2차 항체를 처리하거나 상기 모노클로날 항체에 직접 마커를 컨쥬게이션시키면 마커에 의해 쉽게 GRA7의 S52의 인산기 존재 여부를 조사할 수 있게 된다. 이러한 마커로는 방사선 동위원소, 발광 물질, 발색 반응 효소 등을 이용할 수 있을 것이다. 예를 들어, GFP, YFP, RFP, BFP 등과 같은 형광 단백질을 마커로 사용하여 표지하는 경우 다양한 형광측정법을 통해 상기 모노클로날 항체의 양을 측정함으로써 GRA7의 S52에서의 인산화 여부를 판단할 수 있다. 다르게는, GRA7의 S52의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 GRA7에 처리하고 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay) 방법을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하여 수행할 수 있다. 이 경우 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 아니면 직접 GRA7의 S52의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다.When the secondary antibody labeled with the marker is labeled with the monoclonal antibody or the marker is directly conjugated to the monoclonal antibody, the presence of the phosphate group of S52 of GRA7 can be easily detected by the marker. As such a marker, a radioactive isotope, a luminescent substance, a chromogenic reaction enzyme and the like may be used. For example, when a fluorescent protein such as GFP, YFP, RFP, or BFP is used as a marker, the amount of the monoclonal antibody can be measured by various fluorescence measurement methods to determine the phosphorylation of GRA7 in S52 . Alternatively, the monoclonal antibody that specifically recognizes the phosphate group of S52 of GRA7 can be subjected to quantitative analysis by treating the GRA7 with an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method. In this case, an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) is quantitatively analyzed by performing a color reaction using a conjugated secondary antibody or a substrate thereof, A monoclonal antibody that specifically recognizes the phosphate group of S52 of GRA7 can be directly quantitatively analyzed using a conjugate of AP or HRP enzyme or the like.

마찬가지의 원리에 의해 본 발명은 후보물질을 세포 또는 인간을 제외한 동물에 처리하고, GRA7의 S52 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항리스테리아증 또는 항칸디다증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. According to the same principle, the present invention relates to a method of treating a candidate substance in an animal other than a cell or a human, and determining whether or not the candidate substance inhibits phosphorylation at the S52 position and determining whether the candidate substance inhibits or promotes phosphorylation. A method of screening for a therapeutic agent for listeriosis or anti-candidiasis.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 항리스테리아증 또는 항칸디다증 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.In the screening method of the present invention, the candidate substance may be an individual nucleic acid, protein, other extract or a natural substance, a compound, etc., presumed to have the potential as an antiretroviral agent or an anti-candidiasis therapeutic agent according to a conventional selection method or randomly selected .

본 발명의 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래 재조합 GRA7 단백질을 항원으로 이용할 경우, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 감염에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.When the recombinant GRA7 protein derived from Toxoplasma gondii of the present invention is used as an antigen, the antimicrobial reaction against Listeria monocytogenes and Candida albicans infection can be remarkably increased. Therefore, Listeria monocytogenes Or for the prevention or treatment of candidiasis.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 THP-1 세포의 용해물(lysate)과 His 표지된 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)의 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 통해 수득한 GRA7 복합체(GRA7 complex)의 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 5 ㎍/㎖의 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 THP-1 세포에 처리하여 일정 시간(0, 5, 15, 30, 60, 및 120분) 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 PLD1, TRAF6, ASC, PLD2, NLRP3, NLRC4에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 3은 본 발명의 신호 시퀀스(signal sequence), N-말단 도메인(Ⅰ-Ⅳ), 막관통(transmembrane) 및 C-말단 도메인(Ⅴ)을 가지고 있는 야생형(wild type, WT) GRA7과 상기 구성을 일부만 가지고 있는 GRA7 변형체의 맵핑, 그리고 이의 ASC, PLD1 및 TRAF6과의 상호작용을 개략적으로 요약하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 Ⅴ5가 표지된 ASC(Ⅴ5-ASC) 융합체(fusion)를 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, Ⅴ5에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 분석 결과를 기반으로 도출된 ASC의 구조를 간략하게 모식화하여 상단에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 AU1이 표지된(tagged) PLD1(AU1-PLD1) 융합체(fusion)를 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, AU1에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 분석 결과를 기반으로 도출된 PLD1의 구조를 간략하게 모식화하여 상단에 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 5 ㎍/㎖의 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 THP-1 세포에 처리하여 일정 시간(0, 5, 15, 30, 60, 및 120분) 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 PKCα, PKCβ1, PKCγ에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) HEK293T 세포에 플래그-표지된(Flag-tagged) PKCα와 공발현(co-expression) 시킨 GRA7WT, GRA7-IWT, GRA7-IS52A, GRA7-ⅢWT, GRA7-ⅢT121A 또는 GRA7-ⅢS135A의 Phos-tagⓡ 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다. (B) HEK293T 세포에 플래그-표지된(Flag-tagged) PKCα, PKCδ 또는 PKCξ와 공발현(co-expression) 시킨 GST-GRA7WT의 Phos-tagⓡ 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였으며, 탈인산가수분해효소로서, CIP(calf intestinal alkaline phosphatase)를 사용하였다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 PKCα(recombinant PKCα)를 사용하여, 체내(in vitro) 인산화 어세이(phosphorylation assay)와 전체 GRA7 시퀀스(sequence)를 포함하는 비편향 중복 펩티드 어레이(non-biased overlapping peptide array)를 수행하고 얻은, 인산화 신호를 나타내는 GRA7 유래 펩티드, 49PVDSLRPTNAGVDSK63 및 121TDRKVVPRKSEGKRS 135의 광 유도 발광 값(photo-stimulated luminescence value)을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7-Ⅰ(GST-GRA7-Ⅰ) 또는 점 돌연변이(point mutation) 형태의 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-S52A; S52D; S52E) 및 Ⅴ5가 표지된 ASC(Ⅴ5-ASC)를 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, Ⅴ5에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. (B) HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 점 돌연변이(point mutation) 형태의 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-S52A; S52D; S52E) 및 AU1이 표지된(tagged) PLD1(AU1-PLD1)을 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, AU1에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 3개의 잠재적인 인산화 위치를 포함하고 있는 GRA7의 구조를 간략하게 모식화하여 상단에 나타내었다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 PKCα+/+ 또는 PKCα-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에 처리하여 30분 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 ASC, PLD1, PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다. (B) 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 PKCα에 특이적인 shRNA를 사용하여 넉다운(knock down) 시킨 THP-1 세포에 처리하여 30분 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 ASC, PLD1, PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, PKCα 비특이적인 shRNA로 non-silencing(scrambled) shRNA(shNS)를 사용하였다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 His 표지된(His-tagged) GRA7-Ⅰ과 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant)의 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 결과(A)와, His에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과(B)를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 His 표지된 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)을 사용하였다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα+/+와 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 주고, 배양 상층액(supernatant)에 존재하는 사이토카인, IL-1β 및 IL-18의 분비량을 ELISA assay를 수행하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. (B) ASC에 특이적인 shRNA를 도입한 BMDM에 rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여 자극을 주고, 배양 상층액(supernatant)에 존재하는 사이토카인, IL-1β 및 IL-18의 분비량을 ELISA assay를 수행하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, ASC 비특이적인 shRNA로 non-silencing(scrambled) shRNA(shNS)를 사용하였다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 일정 시간(0, 6, 18, 및 48시간) 동안 처리하여 자극을 준, PKCα+/+와 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM의 배양 상층액(supernatant)에서 IL-1β p17, IL-18 p18 및 카스파제-1 p10(caspase-1 p10)에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα+/+와 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 rGRA7, rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 주고, 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행하여 BMDM 용해물(lysate)에서 ASC 올리고머화(oligomerization) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하으며, UN은 아무것도 처리하지 않은 BMDM을, SN은 배양한 BMDM으로부터 수거한 상층액(supernatant)을 의미한다. (B) rGRA7, rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 준, PKCα+/+와 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM을 면역염색(immunostaining)하고, ASC 염증조절복합체(pyroptosome)의 스펙(speck) 형성을 촬영한 공초점 레이저 주사현미경 사진이다. (C) 상기 (B)의 공초점 레이저 주사현미경 사진으로부터 ASC 염증조절복합체를 포함하는 세포를 계수하고 그 비율을 그래프화하여 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여 자극을 준, PKCα+/+와 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM을 이용하여 초원심세포분획법(subcellular fractionation)과 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 ASC 및 PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따라 PKCα+/+마우스로부터 분리한 BMDM에 (A) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 (B) 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 감염시키고, rGRA7-ⅠWT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여, 이에 따른 항균 활성 효과를 CFU assay를 수행하여 분석한 결과를 나타낸 도이다. Figure 1 is a graph showing the results obtained by co-immunoprecipitation (co-IP) of a lysate of THP-1 cells and a His-tagged recombinant GRA7 protein (rGRA7 protein) according to an embodiment of the present invention Figure 6 shows the result of Coomassie blue staining of the GRA7 complex (GRA7 complex).
FIG. 2 is a graph showing the results of treatment of THP-1 cells with 5 μg / ml of recombinant GRA7 protein (rGRA7) according to an embodiment of the present invention and stimulating them for a predetermined time (0, 5, 15, 30, 60, and 120 minutes) Immunoblotting (IB) analysis of the intrinsic proteins PLD1, TRAF6, ASC, PLD2, NLRP3, and NLRC4 by performing co-immunoprecipitation (co-IP). Here, whole cell lysate (WCL) was used as a control.
Figure 3 shows the wild type (WT) GRA7 having the signal sequence, N-terminal domain (I-IV), transmembrane and C-terminal domain (V) Mapping of a GRA7 variant having only a portion of its complement, and its interactions with ASC, PLD1 and TRAF6.
FIG. 4 is a graph showing the expression of GRA7 (GST-GRA7) or a truncated mutant thereof (GST-GRA7-I-IV; GST-GRA7-I; GST-GRA7-Ⅱ, GST-GRA7-Ⅲ, GST-GRA7-Ⅳ, GST-GRA7-Ⅴ and V5-labeled ASC (Ⅴ-ASC) Figure 5 shows the results of performing immunoblotting (IB) on V5. Here, the ASC structure derived from the analysis results is briefly modeled and shown at the top.
FIG. 5 is a graph showing the expression of GRA7 (GST-GRA7) or a truncated mutant thereof (GST-GRA7-I-IV; GST-GRA7-I; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; and AU1 tagged PLD1 (AU1-PLD1) , And performing immunoblotting (IB) on AU1. Here, the structure of PLD1 derived based on the analysis result is briefly modeled and shown at the top.
FIG. 6 is a graph showing the results of treatment of THP-1 cells with 5 μg / ml of recombinant GRA7 protein (rGRA7) according to an embodiment of the present invention and stimulating them for a certain period of time (0, 5, 15, 30, 60, and 120 minutes) Immunoblotting (IB) analysis of intrinsic proteins PKCα, PKCβ1, and PKCγ after co-immunoprecipitation (co-IP) was performed. Here, whole cell lysate (WCL) was used as a control.
FIG. 7 is a graph showing the results of (A) GRA7 WT , GRA7-I WT , GRA7-I S52A , and GRA7-I co-expressed with flag-tagged PKCa in (A) HEK293T cells -III WT , GRA7-III T121A Or GRA7-Ⅲ an illustrative Phos-tag ⓡ gel electrophoresis results of the S135A. (B) flag in HEK293T cells a diagram showing a labeled (Flag-tagged) PKCα, PKCδ or PKCξ and coexpression (co-expression) were Phos-tag ⓡ gel electrophoresis results of the GST-WT GRA7. Here, WCL (whole cell lysate) was used as a control group and CIP (calf intestinal alkaline phosphatase) was used as a phosphatase.
Figure 8 is a graph showing the results of an in vitro phosphorylation assay and a non-defective overlapping peptide array comprising the entire GRA7 sequence using purified recombinant PKCa according to one embodiment of the present invention. 49 PVD S LRPTNAGVDSK 63 and 121 TDRKVVPRKSEGKR S 135 , which are obtained by performing a non-biased overlapping peptide array and showing a phosphorylated signal.
9 is a graph showing the results of (A) truncated mutants of GRA7-I (GST-GRA7-I) or point mutation in which GST is labeled in HEK293T cells, (GST-GRA7-Ⅰ-S52A; S52D; S52E) and V5-labeled ASC (Ⅴ-ASC) were introduced to perform GST-pulldown assay and immunoblotting (IB) Fig. (B) truncated mutants (GST-GRA7-I-S52A; S52D; S52E) of GRA7 (GST-GRA7) or point mutation in which GST is labeled in HEK293T cells and AU1 (AU1-PLD1) was introduced to perform GST-pulldown assay, and immunoblotting (IB) was performed on AU1. Here, the structure of GRA7 containing three potential phosphorylation sites is briefly modeled and shown at the top.
10 is a graph showing the effect of (A) recombinant GRA7 protein (rGRA7) on BMDM obtained from PKC alpha + / + or PKC alpha - / - mice and stimulating them for 30 minutes according to one embodiment of the present invention, co-immunoprecipitation (co-IP) and immunoblotting (IB) analysis of the intrinsic proteins ASC, PLD1 and PKCa. Here, whole cell lysate (WCL) was used as a control. (B) Recombinant GRA7 protein (rGRA7) was treated with knock down THP-1 cells using shRNA specific for PKCα, stimulated for 30 minutes, co-immunoprecipitation (co-IP ) And performing immunoblotting (IB) analysis on the intrinsic proteins ASC, PLD1, and PKCa. Here, non-silencing (scrambled) shRNAs (shNS) were used as PKCa nonspecific shRNAs.
Figure 11 shows the result of coomassie blue staining of purified (His-tagged) GRA7-I and its point mutation form mutant according to one embodiment of the present invention (A ) And an immunoblotting (IB) analysis result (B) for His. Here, a recombinant GRA7 protein (rGRA7 protein) that was His-labeled was used as a control.
12 is a graph showing the results of (A) stimulation with a mutant protein of rGRA7-I WT or its point mutation type in BMDM isolated from PKCa + / + and PKCa - / - mice And the amount of cytokine, IL-1 beta and IL-18 secreted in the culture supernatant was measured by ELISA assay. (B) BMDM with ASC-specific shRNA was treated with rGRA7-I WT or its mutant protein in point mutation form to stimulate the cytokine in the culture supernatant , IL-1 [beta] and IL-18 secretion levels of the cells were measured by ELISA assay. Here, non-silencing (scrambled) shRNAs (shNS) were used as ASC nonspecific shRNAs.
FIG. 13 is a graph showing the effect of treatment of a mutant protein in the form of rGRA7-I WT or its point mutation according to an embodiment of the present invention for a certain period of time (0, 6, 18, and 48 hours) , Immunoblotting for IL-1β p17, IL-18 p18 and caspase-1 p10 (caspase-1 p10) in the culture supernatant of BMDM isolated from PKCα + / + and PKCα - / - , IB). Here, whole cell lysate (WCL) was used as a control.
14 is a graph showing the results of (A) a mutant protein in the form of rGRA7, rGRA7-I WT or its point mutation in a BMDM isolated from PKCα + / + and PKCα - / - , And immunoblotting (IB) was performed to observe the results of ASC oligomerization analysis in a BMDM lysate. Here, WCL (whole cell lysate) is used as a control, UN means BMDM that is not treated, and SN means supernatant collected from cultured BMDM. (B) Immunostaining of BMDM isolated from PKCα + / + and PKCα - / - mice stimulated with rGRA7, rGRA7-Ⅰ WT or its point mutation type mutant protein , And speck formation of the ASC inflammatory regulator complex (pyroptosome). (C) Cells containing the ASC inflammation-modulating complex are counted from the confocal laser scanning microscope photograph of (B), and the ratio is shown in a graph.
FIG. 15 is a graph showing the results of immunoprecipitation of PKCa + / + and PKCa - / - mice, which were treated with rguA7-I WT or its point mutation type mutant protein in accordance with an embodiment of the present invention A diagram showing the results of immunoblotting (IB) analysis of intrinsic proteins ASC and PKCα by performing subcellular fractionation and co-immunoprecipitation (co-IP) using BMDM to be. Here, whole cell lysate (WCL) was used as a control.
FIG. 16 is a graph showing the effect of the Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenes) on BMDM isolated from PKCa + / + mice according to an embodiment of the present invention. monocytogenes ) or (B) Candida albicans and treated with mutant proteins of the rGRA7-I WT or its point mutation type, and the effect of the antimicrobial activity was analyzed by the CFU assay And FIG.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 실험 재료 준비 및 실험 방법 1: Preparation of experimental materials and experimental methods

실시예Example 1-1:  1-1: 리스테리아Listeria 모노사이토제네스Monosaitogenes (( ListeriaListeria monocytogenesmonocytogenes ) 및 칸디다 알비칸스() And candida albicans ( Candida albicansCandida albicans ) 배양) Culture

리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 Dr. Portnoy 교수 (University of California-Berkely), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 Dr. Richard Bennett 교수 (Brown University)로 공여받았다. Jeneseu L. monocytogenes (Listeria monocytogenes ) Professor Portnoy (University of California-Berkely), Candida albicans (Candida albicans) are Dr. Professor Richard Bennett (Brown University).

리스테리아 모노사이토제네스는 BHI(brain-heart-infusion) 액체 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였으며, 칸디다 알비칸스는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 액체 배지를 사용하여 30℃에서 1일 동안 배양하였다. Listeria monocytogenes was cultured at 37 ° C in a BHI (brain-heart-infusion) liquid medium. Candida albicans was cultured in YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) Lt; / RTI > for 1 day.

상기 리스테리아 모노사이토제네스 및 칸디다 알비칸스는 흡광도(absorbance)가 0.9인 미드 로그 페이즈(mid-log-phase)의 균주를 사용하였으며, PBS로 3회 세척하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 리스테리아 모노사이토제네스는 BHI 아가 플레이트(BHI agar plate), 칸디다 알비칸스는 YPD 아가 플레이트(YPD agar plate)에서 1일간 정치 배양하여 CFU(colony-forming unit)를 측정하였다.The Listeria monocytogenes and Candida albicans used a mid-log-phase strain having an absorbance of 0.9, washed three times with PBS and stored in a -80 ° C freezer. Listeria monocytogenes was cultured in BHI agar plate and Candida albicans in YPD agar plate for 1 day to measure CFU (colony-forming unit).

실시예Example 1-2: 마우스(mouse) 및 세포 준비 1-2: Mouse and cell preparation

야생형(wild-type)의 C57BL/6 마우스는 오리엔트 바이오(Orient Bio; 대한민국 경기도)에서 구입하여 사용하였다. PKCα 넉아웃(PKCα-/-) 마우스(B6;129-Prkcatm1Jmk/J, 009068)와 PLD1 넉아웃(PLD1-/-) 마우스(B6.Cg-Pld1tm1 . 1Gbp/J, 028665)는 Jackson Laboratory에서 구입하여 사용하였다. 모든 실험동물은 SPF(specific pathogen free; 특정 병원체 부재시설) 환경하에서 유지하였다. 또한, 모든 실험동물의 실험 절차는 한양대학교 실험동물센터(protocol 2014-0207)와 바이오리더 코퍼레이션(bioleader Corporation; 대한민국, 대전, protocol BLS-ABSL3-13-11)의 관리와 허가를 받아 진행되었으며, 모든 동물 실험은 한국 식품의약품안전관리본부 (KFDA; Korean Food and Drug Administration)의 가이드라인(guideline)을 따라 수행하였다.Wild-type C57BL / 6 mice were purchased from Orient Bio (Gyeonggi-do, Korea) and used. PLD1 knockout (PLD1 - / - ) mice (B6.Cg-Pld1 tm1 . 1 Gbp / J, 028665) and PKCα knockout (PKCα - / - ) mice (B6; 129- Prkca tm1Jmk / . All experimental animals were maintained in SPF (specific pathogen free) environment. In addition, the experimental procedures of all experimental animals were conducted under the management and approval of Hanyang University Laboratory Animals Center (protocol 2014-0207) and bioleader Corporation (Korea, Daejeon, protocol BLS-ABSL3-13-11) All animal studies were conducted in accordance with the Guidelines of the Korean Food and Drug Administration (KFDA).

한편, HEK293T(human embryonic kidney cell line) 세포(ATCC-11268; American Type Culture Collection)는 10% FBS(fetal bovine serum; Invitrogen), 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 페니실린 G(penicillin G; 100 IU/㎖), 스트렙토마이신(streptomycin; 100 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM 배지(Invitrogen)를 이용하여 배양하였다.On the other hand, human embryonic kidney cell line (HEK293T) cells (ATCC-11268; American Type Culture Collection) were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (Invitrogen), sodium pyruvate, ), Penicillin G (100 IU / ml) and streptomycin (100 쨉 g / ml) in DMEM medium (Invitrogen).

인간 단핵세포주(human monocytic cell line)인 THP-1 세포(ATCC TIB-202)는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640-GlutaMAXTM 배지를 사용하여 배양하였으며, 20nM의 PMA(Sigma Aldrich)를 24시간 동안 처리하여 대식세포 유사 세포(macrophage-like cells)로 분화를 유도하고 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)으로 3회 세척하였다.Human monocytic cell line (human monocytic cell line) in THP-1 cells (ATCC TIB-202) is containing a 10% FBS RPMI 1640-GlutaMAX TM (Sigma Aldrich) for 24 h to induce differentiation into macrophage-like cells and washed three times with PBS (phosphate buffered saline).

일차 골수 유래 대식세포(primary bone marrow-derived macrophages; BMDMs)는 C57BL/6 마우스로부터 분리하였으며, M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor; R&D Systems, 416-ML)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 3~5일 동안 배양하였다.Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were isolated from C57BL / 6 mice and cultured in DMEM medium containing M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor; R & D Systems, 416-ML) For 5 days.

실시예Example 1-3: 체외( 1-3: In vitro ( in vitroin vitro )에서의 ) In 리스테리아Listeria 모노사이토제네스Monosaitogenes (( ListeriaListeria monocytogenes monocytogenes ) 또는 칸디다 알비칸스() Or candida albicans ( Candida albicansCandida albicans ) 감염(infection)) Infection

체외(in vitro) 실험을 위해서는, 세포에 각각 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)을 2~4 시간 동안 감염시켰으며, 이후, 세포 내로 들어가지 못한 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)을 제거하기 위해 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)으로 세포를 세척하였다. 상기 세척된 세포에 새로운 배지(fresh medium)를 넣어 주었으며, 사용하는 시점까지 37℃에서 배양하였다.For in vitro experiments, cells were infected with Listeria monocytogenes or Candida albicans for 2 to 4 hours, respectively, and then Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenes or Candida albicans ) Cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) to remove Listeria monocytogenes or Candida albicans . Fresh medium was added to the washed cells and cultured at 37 ° C until use.

실시예Example 1-4: 시약, 플라스미드 및 항체 준비 1-4: Reagent, plasmid and antibody preparation

송아지 장 알카리성 포스파타제(calf intestinal alkaline phosphatase, CIP)(P4978)와 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. Calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) (P4978) and DMSO (Dimethyl sulfoxide) were purchased from Sigma-Aldrich.

Flag-PKCα(Flag-Protein Kinase C α), Flag-PKCβ(Flag-Protein Kinase C β), Flag-PKCδ(Flag-Protein Kinase C δ) 및 Flag-PKCξ(Flag-Protein Kinase C δ) 플라스미드(plasmid)는 Dr. D. Zhou(Xiamen University, China)로부터 제공받아 사용하였다. 글루타티온 S-전달효소(GST; Glutathione S-transferase)가 표지된(tagged) GRA7(dense granule antigen 7)과 절단된(truncated) 변이 유전자(mutant gene)는 N-말단(N-terminal)의 GST 에피토프(GST epitope) 표지(tag)가 암호화(encoding)되는 pEBG 유도체(derivative)의 BamHⅠ과 NotⅠ 위치(site) 사이에 삽입, 복제(clone)하여 사용하였다. V5가 표지된(tagged) ASC(V5-ASC) 또는 AU1이 표지된(tagged)-PLD1(Phospholipase D1)(AU1-PLD1)과 절단된(truncated) 변이 유전자(mutant gene)는 pcDNA3.0의 XbaⅠ과 BamHⅠ 위치에 삽입, 복제(clone)하여 사용하였다. 상기 모든 구성물(construct)들은 ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer를 이용하여 시퀀싱(sequencing)하였으며, 오리지널(original) 시퀀스(sequence)와 100% 일치함을 확인하였다. (Flag-Protein Kinase C?), Flag-PKC? (Flag-Protein Kinase C?), Flag-PKC? (Flag-Protein Kinase C?), Flag-PKC? ) D. Zhou (Xiamen University, China). The GRA7 (dense granule antigen 7) and the truncated mutant gene tagged with glutathione S-transferase (GST) are mutated in the N-terminal GST epitope Was inserted between the BamHI and Not I site of the pEBG derivative, in which the GST epitope tag was encoded and cloned. The V5-tagged ASC (V5-ASC) or AU1-tagged-PLD1 (AU1-PLD1) and truncated mutant genes were obtained from XbaI of pcDNA3.0 And cloned into BamHI site. All of the constructs were sequenced using an ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer and confirmed to be 100% identical to the original sequence.

Phospho-(Thr147)-PLD1(3831), phospho-(Ser561)-PLD2(3834), PLD1(3832), PLD2(13904), PKCα(2056), PKCγ(43806) 및 NLRP4(NLR family pyrin domain containing 4; 12421)에 대한 특이 항체(specific antibody)는 Cell Signaling Technology사로부터 구입하였다. 액틴(Actin; I-19), ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain; N-15-R), IL-18(H-173-Y), TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6; H-274), 카스파제-1 p10(caspasee-1 p10; M-20), Rab5(D-11), Rab7(H-50), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1; E-5), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2; H4B4), 튜불린(Tubulin; B-5-1-2), 칼넥신(Calnexin; H-70), FACL4(Fatty acid-CoA ligase 4; N-18), VDAC(B-6), His(His17), V5(C-9), Flag(D-8) 및 GST(B-14)에 대한 특이 항체는 Santa Cruz Biotechnology사로부터 구입하여 사용하였다. AU1(GTX23402)과 PKCβI(A10-F)는 각각 GenenTex사와 Antibodies-online Inc.사에서 구입하였다. IL-1β(AF-401-NA)와 NLRP3(AG-20B-0014)는 각각 R&D Systems과 Adipogen에서 구입하여 사용하였다.(NLR family pyrin domain containing 4 < RTI ID = 0.0 > (NLR4)) < / RTI &; 12421) was purchased from Cell Signaling Technology. Actin (I-19), ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain (N-15-R), IL-18 (H-173-Y), TRAF6 (tumor necrosis factor receptor- Rab5 (H-50), LAMP1 (Lysosomal-associated membrane protein 1, E-5), caspase-1 p10 B-5-1-2), Calnexin (H-70), FACL4 (Fatty acid-CoA ligase 4, N-18 ), VDAC (B-6), His (His17), V5 (C-9), Flag (D-8) and GST (B-14) were purchased from Santa Cruz Biotechnology. AU1 (GTX23402) and PKCβI (A10-F) were purchased from GenenTex and Antibodies-online Inc., respectively. IL-1β (AF-401-NA) and NLRP3 (AG-20B-0014) were purchased from R & D Systems and Adipogen, respectively.

실시예Example 1-5: 면역  1-5: Immunity 블롯Blot 분석 및  Analysis and 면역침강법Immune sedimentation

상기 실시예 1-2에서 준비한 THP-1, HEK293T, BMDM을 이용하여 웨스턴 면역 블롯팅(western immunoblotting, IB), 면역침강법(immunoprecipitation), 및 GST(Glutathione S-transferase) pulldown assay를 수행하여 분석을 진행하였다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Yang CS et.al., Cell Host Microbe, 11: 264-276, 2012). Western immunoblotting (IB), immunoprecipitation, and GST (Glutathione S-transferase) pulldown assay were performed using THP-1, HEK293T and BMDM prepared in Example 1-2. (Yang CS et al ., Infect Immun . , 84: 339-350, 2016; Yang CS et al ., Cell Host Microbe , 11: 264-276, 2012).

구체적으로, 웨스턴 블롯 분석을 위해 1차 항체(primary Ab)를 1/1,000로 희석하여 사용하였다. 면역침강법을 위해 세포를 수확하고 컴플리트 프로테아제 저해제 칵테일(complete protease inhibitor cocktail; Roche)이 추가된 NP-40 버퍼(buffer)를 이용하여 용해시켰다. 용해물(lysate)을 혼합하고, 로테이터(rotator)에서 18시간 동안 4℃에서 인큐베이션(incubation)하여 항체와 단백질 A-세파로오스(protein A-sepharose)로 침전시켰다. GST(Glutathione S-transferase) pulldown assay를 위해, 사전-세척된 용해물(pre-cleared lysate)은 글루타티온이 결합된 세파로오스 비드(glutathione-conjugated Sepharose bead; Amersham Biosciences) 슬러리 50%와 혼합하였으며, 결합 반응(binding reaction)은 4시간 동안 4℃에서 인큐베이션(incubation)하여 수행하였다. 이후, 웨스턴 블롯 분석을 위해, 샘플을 SDS 샘플 버퍼에 용해시키고, SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 항체 결합은 화학 발광계(chemiluminescence; ECL:Millipore)를 사용하여 가시화하고, Vilber사의 화학 발광 분석기(Vilber chemiluminescence analyzer, Fusion SL 3;Vilber Lourmat)로 검출하였다.Specifically, primary antibody (primary Ab) was diluted to 1/1000 for Western blot analysis. Cells were harvested for immunoprecipitation and lysed using NP-40 buffer supplemented with complete protease inhibitor cocktail (Roche). The lysates were mixed and incubated in a rotator at 4 ° C for 18 hours to precipitate with antibody and protein A-sepharose. For the Glutathione S-transferase (GST) pulldown assay, the pre-cleared lysate was mixed with 50% glutathione-conjugated Sepharose bead (Amersham Biosciences) slurry, The binding reaction was carried out by incubation at 4 [deg.] C for 4 hours. Then, for Western blot analysis, samples were dissolved in SDS sample buffer and separated by SDS-PAGE. Antibody binding was visualized using chemiluminescence (ECL: Millipore) and detected with Vilber chemiluminescence analyzer (Fusion SL 3; Vilber Lourmat).

실시예Example 1-6: 펩티드  1-6: Peptides 스팟Spot 어레이(peptide spot array) Array (peptide spot array)

펩티드 어레이는 SPOT 합성 방법을 사용하여, [γ-32P]ATP와 칼슘(calcium) 존재 하에서 Intavis사의 유도체화된 셀룰로오스 막(derivatized cellulose membrane)에 펩티드 배열을 합성하였다(Ashpole NM et al., J Biol Chem ., 287: 8495-8506, 2012; Gaji RY et al., PLoS Pathog., 11: e1005268, 2015). 펩티드 스팟 인산화(phosphorylation)는 포스포르이미징(phosphorimaging)을 이용하여 정량화하였다.Peptide arrays were synthesized on the derivatized cellulose membrane of Intavis using peptide synthesis using the [? - 32 P] ATP and calcium (Ashpole NM et al ., J Biol Chem . , 287: 8495-8506, 2012; Gaji RY et al ., PLoS Pathog ., 11: e1005268, 2015). Peptide spot phosphorylation was quantified using phosphorimaging.

구체적으로, 펩티드 멤브레인(peptide membrane)은 5% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 결합 버퍼(binding buffer)를 이용하여 실온(room temperature, RT)에서 30분 동안 블로킹(blocking) 시켰다. 5 nM의 재조합 PKCα를 50mM HEPES(pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 mM ATP, 1 mM CaCl2, 6 μCi/㎖ [γ-32P]ATP에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 상기 멤브레인(membrane)은 100mM 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.0), 1M NaCl, 10 mM EDTA로 3회 세척하고, 포스포르이미징(phosphorimaging; Fuji phosphor imager)을 사용하여 가시화하였다. 각 펩티드의 인산화(phosphorylation)는 Multi Gauge version 3.0(Fujifilm)을 사용하여 검출하고 정량화하였다. Specifically, the peptide membrane was blocked with a binding buffer containing 5% bovine serum albumin (BSA) at room temperature (RT) for 30 minutes. 5 nM of recombinant PKCα was added to 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 100 mM ATP, 1 mM CaCl 2 , 6 μCi / ml [γ- 32 P] ATP and incubated at room temperature for 15 min And then incubated. The membrane was washed three times with 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 1M NaCl, 10 mM EDTA, and visualized using a phosphorimaging (Fuji phosphor imager). Phosphorylation of each peptide was detected and quantified using Multi Gauge version 3.0 (Fujifilm).

실시예Example 1-7: 재조합  1-7: Recombination GRA7GRA7 단백질 제조 Protein manufacture

재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)은 Yang CS et.al., Infect Immun., 84, 339-350 (2016)에 기재되어 있는 방법에 따라 수행하여 수득하였다. GRA7의 아미노산 잔기(amino acid residue) 26-80, 26-80S52A, 26-80S52D, 120-150S135A 및 120-150S135D은 Novagen사의 N-말단(N-terminal)이 6×His 표지(tag)된 pRSFDuet-1 벡터(vector)에 삽입, 복제(clone)하여 사용하였다. 이때, 상기 벡터 제조사인 Novagen사가 추천한 표준 프로토콜(standard protocol)에 따라 단백질 발현 숙주로서 E. coli BL-21(DE-3)pLysS를 사용하였으며, 상기 E. coli 균주에서 단백질 발현을 유도하고, 수집(harvest)하여 정제하여 사용하였다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Alaganan A et.al., Proc Natl Acad Sci USA., 111: 1126-1131, 2014).Recombinant GRA7 protein (rGRA7 protein) was obtained by performing the method described in Yang CS et al ., Infect Immun ., 84, 339-350 (2016). Amino acid residue 26-80 of GRA7, 26-80 S52A , 26-80 S52D , 120-150 S135A And 120-150 S135D were inserted into a pRSFDuet-1 vector (Novation's N-terminal 6xHis-tagged) and cloned. At this time, according to a standard protocol recommended by Novagen, the vector manufacturer, E. coli BL-21 (DE-3) pLysS was used, and E. coli (Yang CS et al ., Infect Immun . , 84: 339-350, 2016; Alaganan A et al ., Proc . Natl Acad Sci . USA , 111: 1126-1131, 2014).

rGRA7 돌연변이 단백질은 투과성 셀룰로오스 멤브레인(permeable cellulose membrance)을 사용하여 투석하고, LAL 분석(Limulus amebocyte lysate assay; BioWhittaker)에 의해 LPS(lipopolysaccharide) 오염(contamination) 정도를 확인하였으며, 실험에 사용된 rGRA7 단백질에 LPS가 20 pg/㎖ 미만의 농도 수준으로 포함되어 있었다.The rGRA7 mutant protein was dialyzed using a permeable cellulose membrane and the degree of LPS (lipopolysaccharide) contamination was confirmed by LAL analysis ( Limulus amebocyte lysate assay; BioWhittaker). The rGRA7 protein LPS was contained at a concentration level of less than 20 pg / ml.

제조한 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 정리하면 하기 표 1과 같다.The prepared recombinant GRA7 protein (recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein) is summarized in Table 1 below.

위치location 특성characteristic 재조합 Recombination GRA7GRA7 단백질(rGRA7) The protein (rGRA7) 아미노산 서열Amino acid sequence 서열번호SEQ ID NO: 1-2361-236 wild type
(X1: S52)wild type
(X 1: S52) GRA7
(GenBank accession no. DQ459443.2)GRA7
(GenBank accession no. DQ459443.2) MARHAIFSALCVLGLVAAALPQFATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDX 1 LRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNVGTVLGFAALAAAAAFLGMGLTRTYRHFSPRKNRSRQPALEQEVPESGEDGEDARQMARHAIFSALCVLGLVAAALPQFATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQA PVDX 1 LRPTNAGVDSK GTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNVGTVLGFAALAAAAAFLGMGLTRTYRHFSPRKNRSRQPALEQEVPESGEDGEDARQ 1One 26-18126-181 wild typewild type GRA7-Ⅰ-ⅣGRA7-I-IV AATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNVAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNV 22 26-8026-80 wild type
(X1: S52)wild type
(X 1: S52) GRA7-Ⅰ
(GRA7-ⅠWT)GRA7-I
(GRA7-I WT ) AATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDX 1 LRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESAATASDDELMSRIRNSDFFDGQA PVDX 1 LRPTNAGVDSK GTDDHLTTSMDKASVES 33 80-12080-120 wild typewild type GRA7-ⅡGRA7-II SQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHSQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEH 44 120-150120-150 wild typewild type GRA7-Ⅲ
(GRA7-ⅢWT)GRA7-Ⅲ
(GRA7-III WT ) HTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMHTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM 55 150-181150-181 wild typewild type GRA7-ⅣGRA7-IV MGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNVMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNV 66 201-236201-236 wild typewild type GRA7-ⅤGRA7-V LTRTYRHFSPRKNRSRQPALEQEVPESGEDGEDARQLTRTYRHFSPRKNRSRQPALEQEVPESGEDGEDARQ 77 49-6349-63 point mutation
(S52A)point mutation
(S52A) GRA7-ⅠS52A GRA7-I S52A PVD A LRPTNAGVDSKPVD A LRPTNAGVDSK 88 49-6349-63 point mutation
(X1: S52D)
: 포스포미메틱
(phosphomimetic) 변형체point mutation
(X 1: S52D)
: Forcematic
phosphomimetic variant GRA7-ⅠS52D GRA7-I S52D PVD X 1 LRPTNAGVDSKPVD X 1 LRPTNAGVDSK 99 49-6349-63 point mutation
(S52E)point mutation
(S52E) GRA7-ⅠS52E GRA7-I S52E PVD E LRPTNAGVDSKPVD E LRPTNAGVDSK 1010 120-150120-150 point mutation
(T121A)point mutation
(T121A) GRA7-ⅢT121A GRA7-Ⅲ T121A H A DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMH A DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM 1111 120-150120-150 point mutation
(T121D)point mutation
(T121D) GRA7-ⅢT121D GRA7-Ⅲ T121D H D DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMH D DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM 1212 120-150120-150 point mutation
(T121E)point mutation
(T121E) GRA7-ⅢT121E GRA7-Ⅲ T121E HEDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMH E DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM 1313 121-135121-135 point mutation
(S135A)point mutation
(S135A) GRA7-ⅢS135A GRA7-Ⅲ S135A TDRKVVPRKSEGKR A TDRKVVPRKSEGKR A 1414 121-135121-135 point mutation
(S135D)
: 포스포미메틱
(phosphomimetic) 변형체point mutation
(S135D)
: Forcematic
phosphomimetic variant GRA7-ⅢS135D GRA7-Ⅲ S135D TDRKVVPRKSEGKR D TDRKVVPRKSEGKR D 1515 121-135121-135 point mutation
(S135E)point mutation
(S135E) GRA7-ⅢS135E GRA7-Ⅲ S135E TDRKVVPRKSEGKR E TDRKVVPRKSEGKR E 1616

실시예Example 1-8: 단백질 정제 및 질량 분광 분석법(mass spectrometry) 1-8: Protein purification and mass spectrometry

침전물(precipitates)은 용해 버퍼(lysis buffer)로 광범위하게 세척하였다. 비드(bead)에 결합된 단백질을 용출(elution)시키고, NuPAGE 4~12% 비스-트리스 구배 겔(Bis-Tris gradient gel; Life Technologies)상에서 분리시켰다. 상기 겔은 은 염색(silver staining; Life Technologies) 후, 한국생명공학연구원 질량 분석 시설의 이온-트랩 질량 분석기(ion-trap mass spectrometry)를 이용하여 특정 단백질 밴드(band)를 잘라내어 분석하였으며, 아미노산 서열은 이중질량분석법(tandem mass spectrometry)과 데이터베이스 검색을 통해 밝혀냈다.The precipitates were extensively washed with lysis buffer. The protein bound to the beads was eluted and separated on a NuPAGE 4-12% Bis-Tris gradient gel (Life Technologies). After the silver staining (Life Technologies), the gel was cut and analyzed with a specific protein band using ion-trap mass spectrometry of a mass spectrometry facility of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and the amino acid sequence Was found through tandem mass spectrometry and database search.

실시예Example 1-9:  1-9: 렌티바이러스의Lentivirus shRNAshRNA (( lentivirallentiviral short-hairpin RNA) 제작 및 형질도입 short-hairpin RNA) and transfection

렌티바이러스의 shRNA 제작(production), 농축(concentration), 적정(titration), 및 형질도입(transduction)은 Open Biosystems사로부터 구입한 표적(traget) shRNA(short-hairpin RNA) 플라스미드(plasmid) DNA(인간 PKCα 및 마우스 ASC)를 사용하여 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Cell Host Microbe., 11: 264-276, 2012; Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016)에 따라 수행하였다. GFP-암호화(encoding) 렌티바이러스(pGIPZ 렌티바이러스 벡터; Open Biosystems)를 사용한 병행(parallel) 실험은 80%의 세포가 바이러스에 의해 성공적으로 형질도입된 것으로 나타났다.ShRNA production, concentration, titration, and transduction of lentivirus were performed using traget shRNA (short-hairpin RNA) plasmid DNA (Human (Yang CS et al ., Cell Host Microbe. , 11: 264-276, 2012; Yang CS et al ., Infect Immun . , 84: 339-350 , 2016). Parallel experiments using GFP-encoding lentivirus (pGIPZ lentiviral vector; Open Biosystems) showed that 80% of the cells were successfully transduced by the virus.

실시예Example 1-10: 사이토카인( 1-10: cytokine ( cytokinecytokine ) 측정) Measure

배양 상층액(supernatant)에 존재하는 마우스 사이토카인은, 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Cell Host Microbe., 11: 264-276, 2012)에 따라 BD OptEIA ELISA set(BD Pharmingen)를 사용하여 측정하였다. 모든 분석(assay)은 제조사의 제품 메뉴얼에 따라 수행하였다.Mouse cytokines present in the culture supernatant were cultured in BD OptEIA ELISA set (BD Pharmingen) according to the previously known technique (Yang CS et al ., Cell Host Microbe. , 11: 264-276, 2012) . All assays were performed according to manufacturer's product manuals.

실시예Example 1-11:  1-11: ASCASC 올리고머화Oligomerization 분석( analysis( ASCASC oligomerizationoligomerization assay) assay)

0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100), EDTA가 포함되지 않은 프로테아제 저해제 칵테일(EDTA-free protease inhibitor cocktail), 및 포스파타아제 저해제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)(Roche)을 포함한 TBS 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 7.4) 및 150 mM NaCl)를 이용하여 대식세포를 용해시켰다. 용해물(lysate)을 4℃에서 15분 동안 6,000g로 원심분리하고, 침전물(pellet)과 상층액(supernatant)을 각각 트리톤-불용성 분획(Triton-insoluble fraction) 및 트리톤-가용성 분획(Triton-soluble fraction)으로 사용하였다. ASC 올리고머화(oligomerization) 검출을 위해, 트리톤-불용성 침전물(Triton-insoluble pellet)은 TBS 버퍼(buffer)로 2회 세척하고, 세척 후 300 ㎕의 TBS 버퍼로 재현탁(resuspension) 시켰다. 재현탁 시킨 침전물(pellet)에 2mM DSS(disuccinimidyl suberate; Pierce)를 처리하여 37℃에서 30분 동안 가교 결합(cross-linkage) 시킨 다음, 15분 동안 6,000g로 원심분리하였다. 침전물(pellet)은 SDS 샘플 버퍼로 용해시켰다. TBS buffer (50 mM) containing 0.5% Triton X-100, EDTA-free protease inhibitor cocktail, and phosphatase inhibitor cocktail (Roche) Tris-HCl (pH 7.4) and 150 mM NaCl) to dissolve macrophages. The lysate was centrifuged at 6,000 g for 15 min at 4 ° C and the pellet and supernatant were separated into Triton-insoluble fraction and Triton-soluble fraction, fraction). For ASC oligomerization detection, the Triton-insoluble pellet was washed twice with TBS buffer, and resuspended with 300 μl of TBS buffer after washing. The resuspended pellet was treated with 2 mM disuccinimidyl suberate (Pierce), cross-linked at 37 ° C for 30 minutes and then centrifuged at 6,000 g for 15 minutes. The pellet was dissolved in SDS sample buffer.

실시예Example 1-12:  1-12: ASCASC 염증조절복합체( Inflammatory modulating complex inflammasomeinflammasome // pyroptosomepyroptosome )의 면역염색(immunostaining)) Immunostaining.

세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 및 0.1% NP40으로 고정시키고, 세척한 뒤, Sigma사의 항-ASC(anti-ASC) 항체와, 2차 항체로서 FITC가 결합된 항-랫트 항체(FITC-conjugated anti-rat antibody)를 이용하여 염색하였다. 이미징 분석은 공초점 레이저 주사현미경(laser-scanning confocal microscopy; model LSM 800, Zeiss)을 이용하여 관찰하였으며, ASC 염증조절복합체(inflammasome은 pyroptosome으로도 알려져 있음)를 포함하는 세포의 비율(percentage)은 각 5개 구간에서 최소 100개의 세포를 계수함으로써 측정하였다.Cells were fixed with 4% paraformaldehyde and 0.1% NP40, washed and then incubated with Sigma anti-ASC (anti-ASC) antibody and FITC conjugated anti-rat antibody (FITC- conjugated anti-rat antibody). Imaging analysis was performed using a laser-scanning confocal microscope (Model LSM 800, Zeiss), and the percentage of cells containing the ASC inflammation-modulating complex (also known as pyrometosome) A minimum of 100 cells were counted in each of the 5 sections.

실시예Example 1-13: 세포 분획법(cellular fractionation) 1-13: Cell fractionation

세포질(cytosol)과 미토콘드리아(mitochondria)는 미토콘드리아 분획 키트(Mitochondria Fractination kit; Active Motif, 40015)를 사용하거나, 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015)에 따라 세포로부터 분리하였다. 세포질(cytosol), 마이크로솜(소포체; endoplasmic reticulum, ER), 미토콘드리아와 결합된 막(mitochondria-associated membrane, MAM) 분획물과 순수(pure) 미토콘드리아는 소포체 분리 키트(Endoplasmic Reticulum Isolation Kit; Sigma, ER0100)를 사용하거나, 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015; Bozidis P et.al., Curr Protoc Cell Biol ., Chapter 3: Unit 3 27, 2007; Wieckowski MR et.al., Nat Protoc ., 4: 1582-1590, 2009)에 따라 세포로부터 분리하였다. SDS-PAGE를 하기 위해, 초원심세포분획된(subcellular fractionated) 단백질을 2% SDS를 함유하는 버퍼(buffer)로 용해시키고, 2× 환원 샘플 버퍼(2× reducing sample buffer)로 비등(boiling)시켰다. Cytosol and mitochondria can be obtained by using mitochondrial fractionation kit (Active Motif, 40015) or using a previously known technique (Yang CS et al ., Nat Commun . , 6: 6115, 2015) . ≪ / RTI > The endoplasmic reticulum (ER), mitochondria-associated membrane (MAM) fractions and pure mitochondria were obtained from the endoplasmic reticulum isolation kit (Sigma, ER0100) (Yang CS et al ., Nat Commun . , 6: 6115, 2015; Bozidis P et al. , Curr Protoc Cell Biol . , Chapter 3: Unit 3 27, 2007; Wieckowski MR et al. , Nat Protoc . , 4: 1582-1590, 2009). For SDS-PAGE, the subcellular fractionated protein was dissolved in a buffer containing 2% SDS and boiled with 2 x reducing sample buffer .

실시예Example 1-14:  1-14: CFUCFU 분석(Colony-Forming Units Assay) Analysis (Colony-Forming Units Assay)

대식세포 내 박테리아 생존력(viability)를 분석하기 위해, 세포를 4시간 동안 각각 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 감염시킨 다음, 세포 외(extracellular) 박테리아를 제거하기 위해 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)으로 세척하였다. 세척 후, 감염된 세포를 지정된 시간 동안 배양하였다. 지정된 시간 동안 배양한 후 세포를 수확하고, 세포 내(intracellular) 박테리아를 방출시키기 위해 0.3% 사포닌(saponin; Sigma-Aldrich)으로 용해시켰다. 세포 용해물(cell lysate)은 격렬하게 재현탁(resuspension) 시킨 뒤 스크류 캡(screw cap) 튜브(tube)로 옮기고, 37℃로 예열된(preheated) 항온 수조 초음파기(water bath sonicator; Elma)에서 5분 동안 초음파 처리(sonication) 하였다. 초음파 처리된 세포 용해물은 PBS를 이용하여 10배 희석하였다. 각 시료의 4개의 희석액을 리스테리아 모노사이토제네스는 BHI(brain-heart-infusion) 아가 플레이트(agar plate), 칸디다 알비칸스는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 아가 플레이트(agar plate)에 각각 도포한 뒤, 37℃에서 1일 동안 배양하였다.Macrophages to analyze bacterial survival (viability), the cells for 4 hours, respectively jeneseu L. monocytogenes (Listeria monocytogenes or Candida albicans and then washed with phosphate buffered saline (PBS) to remove extracellular bacteria. After washing, infected cells were incubated for a specified time. After incubation for the indicated time, cells were harvested and lysed with 0.3% saponin (Sigma-Aldrich) to release intracellular bacteria. The cell lysate was resuspensioned vigorously and then transferred to a screw cap tube and incubated in a preheated water bath sonicator (Elma) at 37 ° C for 5 Min for sonication. Ultrasonically treated cell lysates were diluted 10-fold with PBS. The four dilutions of each sample were applied to a brain-heart-infusion (BHI) agar plate, a Candida albicans YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) agar plate, and then cultured at 37 ° C for 1 day.

실시예Example 2:  2: GRA7GRA7 단백질(dense granule antigen 7 protein)의 역할 규명 Identifying the role of protein (dense granule antigen 7 protein)

실시예Example 2-1:  2-1: GRA7GRA7 단백질과  Protein and ASCASC 및  And PLD1과의PLD1 연관성 correlation

대식세포(macrophage) 내에서 감염성 질환(infectious disease)에 대한 치료 전략으로서의 세포내 신호 기전(intracellular signaling pathway)에서 GRA7의 역할을 규명하기 위하여, GRA7이 선천면역(innate immunity)과 관련되어 있는 분자(molecule)와 상호작용하는지 조사하였다. GRA7 복합체(GRA7 complex)는 THP-1 세포의 용해물(lysate)과 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)의 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 통해 수득하였다. 정제된 GRA7 복합체는, 질량 분광 분석법(mass spectrometry analysis)을 통해 확인된 PLD1(124 K), PKCα(76 K), ASC(21 K), TRAF6(60 K)을 포함한 여러 내재적 단백질(endogenous protein)을 선택적으로 회수하였다(도 1). THP-1 세포를 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)로 자극(stimulation)한 후, 내재적(endogeneous) 단백질에 대한 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행해 본 결과, 비록 15분에서 60분 정도 수준으로 일시적일지라도 GRA7이 PLD1, TRAF6, ASC를 포함한 여러 내재적 단백질과 강하게 상호작용하는 것을 확인하였다(도 2의 A 및 B). 반면, PLD2, NLRP3, NLRC4와는 상호 작용하지 않음을 확인하였다(도 2의 C). 분자량(molecular weight)과 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 토대로, GRA7은 이전에 보고(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016)된 바와 같이, TRAF6와 연관되어 있음을 알 수 있었다(도 1 내지 도 3). To characterize the role of GRA7 in the intracellular signaling pathway as a therapeutic strategy for infectious disease in macrophages, GRA7 is associated with innate immunity molecule) in the cell. The GRA7 complex (GRA7 complex) was obtained via co-immunoprecipitation (co-IP) of the lysate of THP-1 cells and the recombinant GRA7 protein (rGRA7 protein). The purified GRA7 complexes contain several endogenous proteins, including PLD1 (124K), PKCa (76K), ASC (21K) and TRAF6 (60K), identified through mass spectrometry analysis. (Fig. 1). After stimulating THP-1 cells with recombinant GRA7 protein (rGRA7 protein) and performing co-immunoprecipitation (co-IP) on endogenous proteins, Minute, GRA7 strongly interacted with several endogenous proteins including PLD1, TRAF6, and ASC (FIGS. 2A and 2B). Whereas it did not interact with PLD2, NLRP3, and NLRC4 (FIG. 2C). On the basis of molecular weight and co-immunoprecipitation (co-IP), GRA7 has been reported previously (Yang CS et al ., Infect Immun . , 84: 339-350, 2016) , And TRAF6 (Figs. 1 to 3).

구조적으로, GRA7은 신호 시퀀스(signal sequence), N-말단 도메인(Ⅰ-Ⅳ), 막관통(transmembrane, TM), C-말단 도메인(Ⅴ)을 가지고 있다(도 3). HEK293T 세포에 다양한 포유류(mammalian)의 글루타티온 S-전달효소(GST; Glutathione S-transferase)가 표지된(tagged) GRA7(dense granule antigen 7)(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 V5가 표지된(tagged) ASC(V5-ASC) 융합체(fusion)를 사용하여 나타낸 상세 맵핑(mapping)은, GRA7의 N-말단 Ⅰ-도메인(domain)(aa26-80)이 오직 ASC와 최소한의 결합 친화도(binding affinity)를 보이고, N-말단 PYD 도메인(aa1-91)을 가진 ASC는 ASC WT(wild type)만큼 GRA7과 강하게 결합함을 나타내었다(도 3 및 도 4). GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 AU1이 표지된(tagged) PLD1(AU1-PLD1) 융합체(fusion)를 사용하여 수행한 GST pulldown assay 결과는, GRA7의 N-말단 Ⅲ-도메인(aa120-150)이 PLD1의 PX(aa81-212)와 상호작용하는데 필요하다는 것을 보여주었으며(도 3 및 도 5), ASC, PLD1 및 TRAF6와 GRA7과의 상호작용은 유전적으로 분리될 수 있음을 나타내었다(도 1 내지 도 5). Structurally, GRA7 has a signal sequence, an N-terminal domain (I-IV), a transmembrane (TM), and a C-terminal domain (V) (Figure 3). HEK293T cells were transfected with various mammalian glutathione S-transferase (GST) tagged GRA7 (dense granule antigen 7) (GST-GRA7) or truncated mutants thereof GST-GRA7-Ⅳ, GST-GRA7-Ⅴ) and V5-tagged ASCs (GST-GRA7-Ⅳ, GST- GRA7- The detailed mapping shown using the V5-ASC fusion shows that the N-terminal I-domain (aa26-80) of GRA7 shows only minimal binding affinity with ASC , And the N-terminal PYD domain (aa1-91) bind strongly to GRA7 by ASC WT (wild type) (FIGS. 3 and 4). GST-GRA7-Ⅲ GST-GRA7-Ⅲ GST-GRA7-Ⅲ GST-GRA7-Ⅲ GST-GRA7-Ⅲ GST- The GST pulldown assay results using PLD1 (AU1-PLD1) fused with AU1 tagged GRA7-Ⅳ showed that the N-terminal III-domain (aa120- 150) was shown to be required to interact with PX (aa81-212) of PLD1 (FIGS. 3 and 5), indicating that the interaction of ASC, PLD1 and TRAF6 with GRA7 could be genetically cleaved 1 to 5).

이러한 결과는, 대식세포 내에서 N-말단 Ⅰ-도메인과 N-말단 Ⅲ 도메인을 통해 GRA7이 각각 ASC 및 PLD1과 독립적으로 그리고 직접적으로 상호작용한다는 것을 보여주었다.These results showed that GRA7 interacts independently and directly with ASC and PLD1 through the N-terminal I-domain and the N-terminal III domain in macrophages, respectively.

실시예Example 2-2:  2-2: PKCα를PKCα 통한  through GRA7GRA7 단백질과  Protein and ASCASC 및  And PLD1과의PLD1 상호작용 Interaction

GRA7은 ASC와 PLD1과의 결합(binding) 뿐만 아니라, PKCα와도 상호작용(interaction) 한다. THP-1 세포를 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)로 자극(stimulation)한 후, 내재적(endogeneous) 단백질에 대한 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행해 본 결과, GRA7과 PKCα 간에는 강한 상호작용을 나타낸 반면, PKCβⅠ과 PKCγ와는 상호작용하지 않음을 확인하였다(도 6).GRA7 interacts with PKCα as well as with ASC and PLD1. After stimulation of THP-1 cells with recombinant GRA7 protein (rGRA7 protein) and co-immunoprecipitation (co-IP) of endogenous protein, the strong interaction between GRA7 and PKCα (Fig. 6), while PKC? I and PKC? Did not interact.

인간 키놈(human kinome)의 광범한 프로테오믹스(proteomics) 분석(Oppermann FS et.al., Mol Cell Proteomics ., 8: 1751-1764, 2009)과 컴퓨터를 사용한 시퀀스(sequence) 분석(Finn RD et.al., Nucleic Acids Res., 44: D279-D285, 2016)은 GRA7의 N-말단 Ⅰ, Ⅲ 도메인 및 C-말단 Ⅴ 도메인에 존재하는 다섯 개의 PKC 인산화 잔기(S52LR, T121DR, S135FK, T204TR, S209PR)을 예측하였다. GRA7이 PKCα에 의해 인산화(phosphorylation) 되는지 확인하기 위하여, 여러 전략을 세웠다. 먼저, 인산화된 단백질과 특이적으로 결합하고 겔(gel)에서 이동(migration)을 지연시키는 Phos-tagⓡ 생체분자(biomolecule)를 사용한 Phos-tagⓡ 겔 전기영동을 수행하였다(Kinoshita E et.al., Nat Protoc ., 4: 1513-1521, 2009). 이때, 인산화(phosphorylation) 분석을 위해 SDS-PAGE를 수행하고, Phos-tagⓡ 라벨링 시스템(Phos-tagⓡ labeling system)으로 가시화 하였다. 분석 결과, PKCα와 공발현(co-expression) 되었을 때, 야생형(wild-type)의 GRA7(GRA7WT), 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ 도메인(GRA7-IWT), 및 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅲ 도메인(GRA7-ⅢWT)은 더 천천히 이동하고, 업-시프트된 밴드(up-shifted band)가 나타나는 것을 확인하였다. 반면, PKCβ, PKCδ 또는 PKCξ과 공발현(co-expression) 되었을 때는 업-시프트된 밴드(up-shifted band)가 나타나지 않았다(도 7).Sequence analysis using a wide range of proteomics analysis of human kinomes (Oppermann FS et al ., Mol Cell Proteomics . , 8: 1751-1764, 2009) and computer (Finn RD et al ., Nucleic Acids Res, 44: . D279-D285, 2016) is five PKC phosphorylation residues present in the N- terminal ⅰ, ⅲ domain and C- terminal domains of ⅴ GRA7 (S 52 LR, T DR 121, S 135 FK, T 204 TR, and S 209 PR). To determine if GRA7 is phosphorylated by PKCα, several strategies have been established. First, a phosphorylated protein and the specific binding and Phos-tag ⓡ with the biomolecule (biomolecule) for delaying the movement (migration) in a gel (gel) Was performed Phos-tag ⓡ gel electrophoresis (Kinoshita E et.al., Nat Protoc, 4:. 1513-1521, 2009). At this time, perform an SDS-PAGE for analysis of the phosphorylation (phosphorylation), which was visualized with Phos-tag ⓡ labeling system (Phos-tag ⓡ labeling system) . As a result of the analysis, wild-type GRA7 (GRA7 WT ), wild-type GRA7-I domain (GRA7-I WT ) and wild type wild- -type GRA7-Ⅲ domain (GRA7-Ⅲ WT ) migrated more slowly and showed an up-shifted band. On the other hand, no up-shifted band appeared when co-expression with PKC ?, PKC? Or PKC? (FIG. 7).

한편, 정제된 재조합 PKCα(recombinant PKCα)를 사용하여, 체외(in vitro) 인산화 어세이(phosphorylation assay)와 전체 GRA7 시퀀스(sequence)를 포함하는 비편향 중복 펩티드 어레이(non-biased overlapping peptide array)를 수행하였다(Ashpole NM et al., J Biol Chem ., 287: 8495-8506, 2012; Gaji RY et al., PLoS Pathog ., 11: e1005268, 2015). GRA7로부터 얻은 두 개의 펩티드, 49PVDSLRPTNAGVDSK63 및 121TDRKVVPRKSEGKRS 135는 광 유도 발광 값(photo-stimulated luminescence value) 200(PSL/mm2) 이상의 인산화 신호를 나타내었다(도 8). 대조적으로, GRA7의 C-말단의 어떠한 펩티드도 두드러진 인산화 신호를 나타내지 않았다. GRA7은 세린(serine)/트레오닌(threonine) 잔기(residue)를 가지며, 인산화된 상기 두 개의 GRA7의 펩티드는 3개의 잠재적인 인산화 위치를 포함하고 있다(도 8 및 도 9). GRA7의 특이적인 점 돌연변이(point mutation) 형태, 즉 IS52A 및 ⅢS135A는 Phos-tagⓡ 겔 전기영동을 수행한 결과, 인산화가 현저하게 감소되는 것으로 확인된 반면, GRA7의 특이적인 점 돌연변이(point mutation) 형태, 즉 ⅢT121A는 인산화 감소 현상을 나타내지 않았다(도 7의 A). 이러한 결과를 통해, PKCα가 GRA7의 S52와 S135 잔기를 특이적으로 인산화시킬 수 있으며, 이에 GRA7이 PKCα의 기질(substrate)임을 알 수 있었다. On the other hand, using a purified recombinant PKCa (recombinant PKCa), a non-biased overlapping peptide array containing an in vitro phosphorylation assay and a whole GRA7 sequence was prepared (Ashpole NM et al. , J Biol Chem . , 287: 8495-8506, 2012; Gaji RY et al. , PLoS Pathog . , 11: e1005268, 2015). Two peptides from GRA7, 49 PVD S LRPTNAGVDSK 63 and 121 TDRKVVPRKSEGKR S 135 , showed a phosphorylation signal above a photo-stimulated luminescence value of 200 (PSL / mm 2 ) (FIG. 8). In contrast, no peptide at the C-terminus of GRA7 displayed a pronounced phosphorylation signal. GRA7 has a serine / threonine residue and the two phosphorylated peptides of GRA7 contain three potential phosphorylation sites (FIGS. 8 and 9). The specific point mutation form of GRA7 , I S52A And Ⅲ S135A is Phos-tag ⓡ gel result of the electrophoresis, while identified as being phosphorylated is significantly reduced, specific point mutations of GRA7 (point mutation) form, that is Ⅲ T121A did not show the phosphorylation reduced symptoms (Fig. 7, A). These results indicate that PKCα can specifically phosphorylate the S 52 and S 135 residues of GRA7, and GRA7 is a substrate for PKCα.

다음, GRA7의 S52와 S135의 인산화가 각각 ASC와 PLD1과의 결합(binding)에 필수적인지 알아보기 위하여, 연구를 수행하였다. GRA7의 점 돌연변이(point mutation) 형태, 즉 IS52A 및 ⅢS135A는 ASC와 PLD1과의 상호작용을 완벽하게 차단한 것으로 나타났는데, 이는 ASC와 PLD1과의 상호작용이 GRA7의 S52와 S135의 인산화에 의존적임을 유추할 수 있다(도 9). 더 나아가, ASC와 PLD1이 상호작용 하도록 포스포-세린(Phospho-serine), S52와 S135 대신에 포스포미메틱(phosphomimetic) 잔기인 아스파르트 산(aspartic acid, D) 또는 글루탐산(glutamic acid, E)으로 단일 치환하여 S52D와 S135E로 아미노산(amino acid)을 변형(mutation)시켰다. GST(Glutathione S-transferase) pulldown assay를 수행하여 분석을 진행한 결과, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)는 야생형(wild-type)의 GRA7과 비교하여 ASC 및 PLD1과 강하게 결합(binding)하는 것으로 나타났으며, 이는 본질적으로 GRA7을 인산화된 것처럼 모방(mimicking)하는 것이 선천성 면역 경로(innate immune pathway)에서 PKCα의 기능을 필요로 하는 것보다 더 중요함을 의미한다. 도 6 내지 도 9에서 나타낸 바와 일치하게, rGRA7의 자극(stimulation) 하에, PKCα-/- 마우스의 BMDM에서 GRA7이 ASC와 PLD1과의 상호작용이 현저하게 감소하는 것으로 나타났으며, 마찬가지로 PKCα에 특이적인 shRNA를 사용하여 넉다운(knock down) 시킨 THP-1 세포에서도 GRA7이 ASC와 PLD1과의 상호작용이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 또한, rGRA7의 자극(stimulation) 하에, PKCα의 약학적인 저해제를 BMDM에 처리한 경우에도 GRA7이 ASC와 PLD1과의 상호작용이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Next, studies were conducted to determine whether phosphorylation of S 52 and S 135 of GRA7 is essential for binding of ASC and PLD1, respectively. The point mutation form of GRA7 , I S52A And III S135A completely blocked the interaction between ASC and PLD1, suggesting that the interaction between ASC and PLD1 is dependent on phosphorylation of S 52 and S 135 of GRA7 (FIG. 9). Further, phospho-serine, aspartic acid (D) or glutamic acid (E), which is a phosphomimetic moiety in place of S 52 and S 135 to allow ASC and PLD 1 to interact, ) To mutate the amino acid into S52D and S135E. The phosphomimetic mutant of GRA7 was found to bind strongly to ASC and PLD1 as compared to wild-type GRA7 as a result of GST (Glutathione S-transferase) pulldown assay. ), Indicating that essentially mimicking GRA7 as phosphorylated is more important than requiring the function of PKCα in the innate immune pathway. Consistent with those shown in Figures 6 to 9, GRA7 in the BMDM of PKCa - / - mice under the stimulation of rGRA7 showed a marked decrease in the interaction of ASC with PLD1, It was confirmed that the interaction of GRA7 with ASC and PLD1 was significantly reduced even in THP-1 cells knocked down using shRNA (FIG. 10). In addition, it was confirmed that the interaction of ASC and PLD1 with GRA7 was reduced even when the pharmaceutical inhibitor of PKCa was treated with BMDM under the stimulation of rGRA7.

종합하면, 상기 결과를 통해 GRA7의 S52와 S135의 PKCα-매개 인산화(PKCα-mediated phosphorylation)가 GRA7과 ASC 또는 PLD1과의 각각의 상호작용에 필수적인 것을 알 수 있었다. Taken together, these results demonstrate that PKCα-mediated phosphorylation of S 52 and S 135 of GRA7 is essential for each interaction of GRA7 with ASC or PLD1.

실시예Example 2-3:  2-3: GRA7GRA7 -Ⅰ도메인의 -I domain ASCASC 의존적 염증조절복합체( Dependent inflammatory modulating complex ( ASCASC -dependent inflammasome)의 활성 유도-dependent inflammasome

대식세포(macrophage)의 선천면역반응(innate immune response)에 있어서, 톡소포자충(toxoplasma gondii, T. gondii) GRA7-Ⅰ 도메인의 역할을 규명하기 위하여, 이전에 공지된 실험 방법대로 박테리아를 이용하여 정제된 His 표지(His-tagged) GRA7-Ⅰ과 이의 변형체(mutant) 단백질을 만들었다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Alaganan A et.al., Proc Natl Acad Sci USA, 111: 1126-1131, 2014). 정제된 rGRA7-Ⅰ(10 kDa)은 SDS-PAGE와 면역 블롯 분석을 통해 확인하였다(도 11). 벡터 대조군과 비교하여, 대식세포(macrophage)에 rGRA7에 의해 유도된 세포독성(cytotoxicity)에 있어 유의한 차이를 나타내지 않았다.To identify the role of the toxoplasma gondii , T. gondii GRA7-I domain in the innate immune response of macrophages, the cells were purified using bacteria according to previously known experimental methods His-tagged GRA7-I and mutant proteins thereof (Yang CS et al . , Infect Immun . , 84: 339-350, 2016; Alaganan A et al ., Proc Natl Acad Sci USA , 111: 1126-1131, 2014). Purified rGRA7-I (10 kDa) was confirmed by SDS-PAGE and immunoblot analysis (Fig. 11). Did not show any significant difference in cytotoxicity induced by rGRA7 in macrophages as compared to vector control.

이전 연구 결과에서, rGRA7에 의해 대식세포에서 IL-1β을 포함한 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 유전자와 단백질의 발현이 유도됨을 확인하였으며(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016), NLRP3(nucleotide-binding domain, leucine-rich repeats containing family, pyrin domain-containing-3) 염증조절복합체(inflammasome)가 IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation)을 유도하는 어댑터(adaptor) ASC와 카스파제-1(caspase-1)과 상호작용하는 NLRP3을 함유하는 다량체 단백질 복합체(multimeric protein complex)와 관련됨을 확인하였다(Jayaraman P et.al., J Immunol ., 190: 4196-4204, 2013; Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015). Previous studies have shown that rGRA7 induces pro-inflammatory cytokine gene and protein expression including macrophage IL-1β (Yang CS et al . , Infect Immun . 84: 339-350, 2016), NLRP3 (nucleoside-binding domain, leucine-rich repeats containing family, pyrin domain-containing-3) inflammatory complexes induce the maturation of IL-1β and IL-18 It was found to be associated with a multimeric protein complex containing NLRP3 that interacts with the adapter ASC and caspase-1 (Jayaraman et al . , J Immunol . , 190 : 4196-4204, 2013; Yang CS et al . , Nat . Commun . , 6: 6115, 2015).

한편, 염증조절복합체(inflammasome)의 활성을 조절하는 데 있어, GRA7-Ⅰ 도메인의 역할을 규명하기 위하여, PKCα+/+와 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 rGRA7-Ⅰ 및 이의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 주었다. rGRA7과 rGRA7-ⅠWT으로 자극을 주었을 때, PKCα가 결핍된, 즉 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM은 야생형(wilde type), 즉 PKCα+/+ 마우스로부터 분리한 BMDM보다 IL-1β 및 IL-18의 생산이 현저하게 약화된 것으로 확인되었으나, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) ⅠS52D에 의해서는 PKCα가 결핍된 BMDM에서 IL-1β 및 IL-18 분비가 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다(도 12). 상기 결과와 일치하게, rGRA7-ⅠWT으로 자극에 의해, PKCα가 결핍된, 즉 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에서 카스파제-1(caspase-1) 활성과 IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation)이 현저하게 감소되는 것으로 확인되었으며, PKCα가 결핍되어 있더라도 본질적으로 GRA7의 활성화된 형태인 IS52D에 의해 '구조된(rescued)' 것으로, 즉, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) ⅠS52D에 의해 PKCα가 결핍된 BMDM에서 카스파제-1(caspase-1) 활성과 IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation)이 감소되지 않는 것으로 확인되었다(도 13). 특히 ASC-결합(binding) 의존적 상태에서, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-IS52A과 shRNA에 매개된 내재적(endogenous) ASC 발현 감소는 IL-1β 및 IL-18 생산의 현저한 감소를 유도하였다. On the other hand, it is used to modulate the activity of the inflammatory control complex (inflammasome), GRA7-Ⅰ to investigate the role of the domain, PKCα + / + and PKCα - / - rGRA7-Ⅰ and its variant (mutant in BMDM isolated from mouse ) Protein. When stimulated with rGRA7 and rGRA7-I WT , BMDM deficient in PKCα, ie, isolated from PKCα - / - mice, inhibited the production of IL-1β and IL, respectively, from wild type, ie, BMDM isolated from PKCα + -18 production was markedly weakened, but the phosphomimetic mutant I S52D of GRA7 markedly increased IL-1β and IL-18 secretion in PKCα-deficient BMDM (Fig. 12). By stimulating the match the result, the rGRA7 Ⅰ-WT, a PKCα-deficient, i.e., PKCα - / - caspase in BMDM was separated from the mouse of claim -1 (caspase-1) activity and IL-1β and IL-18 Maturation has been found to be significantly reduced, and even if PKCa is deficient, it is essentially 'rescued' by I S52D , an activated form of GRA7 , that is, a phosphomimetic variant of GRA7 (caspase-1) activity and maturation of IL-1 [beta] and IL-18 were not reduced in BMDM deficient in PKC [ alpha] by mutant I S52D (Fig. 13). In particular, in the ASC-binding-dependent state, the reduction of endogenous ASC expression mediated by rGRA7-I S52A and shRNA, a non-phosphorylatable mutant, PKCa, resulted in a significant increase in IL-1β and IL-18 production Respectively.

다음, ASC 스펙(speck)의 세포내(intracellular) 형성이 GRA7-I 상호작용에 의존적이라면, 실질적으로 ASC가 올리고머화(oligomerization) 되는지 확인하였다. 활성화된 카스파제-1(caspase-1)과 IL-1β의 분비와 일치하게, 야생형(wilde type), 즉 PKCα+/+ 마우스로부터 분리한 BMDM과 비교하여, PKCα가 결핍된, 즉 PKCα-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에서 ASC의 올리고머화와 스펙 형성이 두드러지게 감소하는 것을 확인되었으나, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) ⅠS52D에 의해 PKCα가 결핍된 BMDM에서 ASC의 올리고머화와 스펙 형성이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(도 14). 더 나아가, GRA7과 ASC의 세포내(intracellular) 상호작용(interaction)은 GRA7으로 자극을 준 후, 그들의 공배치(co-localization)에 의해 확인되었다. PKCα+/+ 마우스로부터 분리한 BMDM의 미토콘드리아 분획(mitochondrial fraction)을 이용하여 초원심세포분획법(subcellular fractionation)과 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP) 분석을 수행한 결과, GRA7-Ⅰ 도메인이 ASC 및 PKCα와 관련되어 있음을 알 수 있었다. 특히, 이러한 결합(binding) 양상(pattern)은 PKCα+/+ 마우스와 PKCα-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) ⅠS52D에 의해 증가됨을 확인하였다(도 15). 이러한 결과를 통해, GRA7-Ⅰ이 미토콘드리아에서 PKCα를 통해 ASC-의존적 염증조절복합체(inflammasome) 활성의 양성 조절자(positive regulator)로서 역할을 함을 알 수 있었다.Next, if the intracellular formation of the ASC speck is dependent on the GRA7-I interaction, we have verified that virtually ASC is oligomerized. Consistent with the active caspase -1 (caspase-1) and the secretion of IL-1β, as compared to the wild type (wilde type), that is isolated from BMDM PKCα + / + mice, a PKCα-deficient, i.e., PKCα - / - oligomerization and speciation of ASC in BMDMs isolated from mice was significantly reduced. However, oligomerization and ASC formation of ASC in BMDM deficient in PKCα by the phosphomimetic mutant I S52D of GRA7 And the formation of the spec was remarkably increased (Fig. 14). Furthermore, the intracellular interactions of GRA7 and ASC were confirmed by their co-localization after stimulation with GRA7. The mitochondrial fraction of BMDM isolated from PKCα + / + mice was analyzed by subcellular fractionation and co-immunoprecipitation (co-IP) analysis. As a result, GRA7- I domain was associated with ASC and PKCα. Particularly, this binding pattern was confirmed to be increased by the phosphomimetic mutant I S52D of GRA7 in BMDM obtained from PKCa + / + mice and PKCa - / - mice (Fig. 15). These results demonstrate that GRA7-Ⅰ plays a role as a positive regulator of ASC-dependent inflammatory activity through PKCα in mitochondria.

실시예Example 2-4:  2-4: 리스테리아Listeria 모노사이토제네스Monosaitogenes (( ListeriaListeria monocytogenesmonocytogenes ) 및 ) And 칸디Candy 다 All 알비칸스Albikans (( CandidaCandida albicansalbicans ) ) 감염에 대한 저항에 있어In resistance to infection GRA7GRA7 -Ⅰ 도메인의 항균 활성 효과Effect of antimicrobial activity of -I domain

상기 실시예 2-3에서 GRA7-Ⅰ도메인이 PKCα를 통해 ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain)-의존적 염증조절복합체(ASC-dependent inflammasome)의 활성을 유도함을 확인하였다.In Example 2-3, it was confirmed that the GRA7-I domain induces the activity of ASC-dependent inflammatory regulatory complex (ASC-dependent inflammatory domain) through the PKCα.

이에, PKCα를 통해 대식세포에서 rGRA7에 의해 유도되는 항균 활성(antimicrobial activity)를 확인하기 위해, PKCα+/+ 마우스로부터 수득한 BMDM을 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 감염시키고 CFU assay를 수행하였다. 그 결과, 야생형(wild-type)의 rGRA7과 야생형(wild-type)의 GRA7-ⅠWT를 처리한 것과 비교하여, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-IS52A는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 세포내(intracellular) 생존이 상당히 증가하였다. 이에 반해, 처리량 의존적으로 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) ⅠS52D는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킴을 확인하였다(도 16).Thus, to determine the antimicrobial activity (antimicrobial activity) induced by rGRA7 in macrophages through the PKCα, PKCα + / + mice L. monocytogenes jeneseu a BMDM obtained from (Listeria monocytogenes infection) or Candida albicans (Candida albicans) and the CFU assay was performed. As a result, compared to the treatment of wild-type rGRA7 and wild-type GRA7-I WT , the non-phosphorylatable mutant rGRA7-I S52A, which is a non-phosphorylatable mutant, The intracellular survival of Listeria monocytogenes or Candida albicans was significantly increased. On the other hand, the phosphomimetic mutant I S52D of GRA7 in a throughput-dependent manner is a Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenes, monocytogenes ) or Candida albicans (Fig. 16).

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis and candidiasis comprising Toxoplasma gondii-GRA7 recombinant protein as an active ingredient <130> P16U22D1771 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-1-236_wild type(X1: S52) <400> 1 Met Ala Arg His Ala Ile Phe Ser Ala Leu Cys Val Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Pro Gln Phe Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp 20 25 30 Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly 50 55 60 Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gln Glu 85 90 95 Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val Arg Ser Asp Ala Glu Val Thr 100 105 110 Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg 115 120 125 Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala 130 135 140 Leu Pro Ala Val Gly Met Gly Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu 145 150 155 160 Val Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Gln Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr 165 170 175 Thr Gly Gln Asn Val Gly Thr Val Leu Gly Phe Ala Ala Leu Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Phe Leu Gly Met Gly Leu Thr Arg Thr Tyr Arg His Phe 195 200 205 Ser Pro Arg Lys Asn Arg Ser Arg Gln Pro Ala Leu Glu Gln Glu Val 210 215 220 Pro Glu Ser Gly Glu Asp Gly Glu Asp Ala Arg Gln 225 230 235 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-26-181_wild type <400> 2 Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser 1 5 10 15 Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn 20 25 30 Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met 35 40 45 Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu 50 55 60 Thr Glu Pro Asp Glu Gln Glu Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val 65 70 75 80 Arg Ser Asp Ala Glu Val Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His Thr 85 90 95 Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser Phe Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met Gly Ala Ser 115 120 125 Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu Val Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Gln 130 135 140 Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr Thr Gly Gln Asn Val 145 150 155 <210> 3 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-26-80_wild type(X1: S52) <400> 3 Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser 1 5 10 15 Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn 20 25 30 Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met 35 40 45 Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser 50 55 <210> 4 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-80-120_wild type <400> 4 Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gln 1 5 10 15 Glu Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val Arg Ser Asp Ala Glu Val 20 25 30 Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His 35 40 <210> 5 <211> 31 <212> 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<400> 9 Pro Val Asp Asp Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-49-63_point mutation(S52E) <400> 10 Pro Val Asp Glu Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation(T121A) <400> 11 His Ala Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation(T121D) <400> 12 His Asp Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation(T121E) <400> 13 His Glu Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-121-135_point mutation(S135A) <400> 14 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-121-135_point mutation(S135D) <400> 15 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Asp 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-121-135_point mutation(S135E) <400> 16 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Glu 1 5 10 15 <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating listeriosis          and candidiasis comprising Toxoplasma gondii-GRA7 recombinant          protein as an active ingredient <130> P16U22D1771 <160> 16 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > GRA7-1-236_wild type (X1: S52) <400> 1 Met Ala Arg His Ala Ile 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Leu Thr Arg Thr Tyr Arg His Phe         195 200 205 Ser Pro Arg Lys Asn Arg Ser Ser Gln Pro Ala Leu Glu Gln Glu Val     210 215 220 Pro Glu Ser Gly Glu Asp Gly Glu Asp Ala Arg Gln 225 230 235 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-26-181_wild type <400> 2 Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser   1 5 10 15 Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn              20 25 30 Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met          35 40 45 Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu      50 55 60 Thr Glu Pro Asp Glu Gln Glu Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val  65 70 75 80 Arg Ser Asp Ala Glu Val Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His Thr                  85 90 95 Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser Phe Lys             100 105 110 Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met Gly Ala Ser         115 120 125 Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu Val Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Gln     130 135 140 Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr Thr Gly Gln Asn Val 145 150 155 <210> 3 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > GRA7-26-80_wild type (X1: S52) <400> 3 Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser   1 5 10 15 Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn              20 25 30 Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met          35 40 45 Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser      50 55 <210> 4 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-80-120_wild type <400> 4 Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gln   1 5 10 15 Glu Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val Arg Ser Serp Ala Glu Val              20 25 30 Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His          35 40 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_wild type <400> 5 His Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser   1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met              20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-150-181_wild type <400> 6 Met Gly Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu Val Pro Glu Leu Thr   1 5 10 15 Glu Glu Gln Gln Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr Thr Gly Gln Asn Val              20 25 30 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-201-236_wild type <400> 7 Leu Thr Arg Thr Tyr Arg His Phe Ser Pro Arg Lys Asn Arg Ser Ser Arg   1 5 10 15 Gln Pro Ala Leu Glu Gln Glu Val Pro Glu Ser Gly Glu Asp Gly Glu              20 25 30 Asp Ala Arg Gln          35 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> GRA7-49-63_point mutation (S52A) <400> 8 Pro Val Asp Ala Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys   1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-49-63_point mutation (X1: S52D) <400> 9 Pro Val Asp Asp Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys   1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-49-63_point mutation (S52E) <400> 10 Pro Val Asp Glu Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys   1 5 10 15 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation (T121A) <400> 11 His Ala Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser   1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met              20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation (T121D) <400> 12 His Asp Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser   1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met              20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation (T121E) <400> 13 His Glu Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser   1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met              20 25 30 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > GRA7-121-135_point mutation (S135A) <400> 14 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ala   1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > GRA7-121-135_point mutation (S135D) <400> 15 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Asp   1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > GRA7-121-135_point mutation (S135E) <400> 16 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Glu   1 5 10 15

Claims (10)

하기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 유효성분으로 포함하는, 리스테리아증 또는 칸디다증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
[식 1] PVDX1LRPTNAGVDSK
상기 [식 1]에서 X1= S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)이다. 단, X1 이 S인 경우, S는 인산화되어 있다.
A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of listeriosis or candidiasis comprising as an active ingredient a recombinant dense granule antigen 7 protein (rGRA7 protein) comprising 15 to 236 amino acid residues comprising the amino acid sequence of [Formula 1] Composition;
[Equation 1] PVDX 1 LRPTNAGVDSK
X 1 = S (serin), D (aspartic acid) or E (glutamic acid) in the above formula 1. However, when X 1 is S, S is phosphorylated.
제1항에 있어서, 상기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 약학적 조성물.
The recombinant GRA7 protein according to claim 1, wherein the recombinant GRA7 protein comprises 15 to 236 amino acid residues comprising the amino acid sequence of [Formula 1], wherein the recombinant GRA7 protein comprises any one selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: Wherein the protein is a protein comprising one amino acid sequence.
제2항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
3. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the recombinant GRA7 protein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제2항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
3. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the recombinant GRA7 protein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
제2항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
3. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the recombinant GRA7 protein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:
제1항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래인 것인 약학적 조성물.
The recombinant GRA7 protein of claim 1, wherein the recombinant GRA7 protein is Toxoplasma gondii ). &lt; / RTI &gt;
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제 또는 항진균제와 동시 또는 순차적으로 투여되는 것인 약학적 조성물.
7. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 6, which is administered simultaneously or sequentially with an antibiotic or an antifungal agent.
제7항에서 있어서, 상기 항생제는 테트라사이클린(tetracycline), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 클린다마이신(clindamycin), 반코마이신(vancomycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 페니실린(penicillin) 및 바시트라신(bacitracin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그 이상인 것인 약학적 조성물.
8. The method of claim 7, wherein the antibiotic is selected from the group consisting of tetracycline, nitrofurantoin, clindamycin, vancomycin, ciprofloxacin, penicillin, and bacitracin. Lt; RTI ID = 0.0 &gt; and / or &lt; / RTI &gt;
제7항에서 있어서, 상기 항진균제는 암포테리신 B(amphotericin B), 케토코나졸(ketoconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 플루코나졸(fluconazole), 테르비나핀(terbinafine), 그리세오풀빈(griseofulvin), 아이오딘화칼륨(potassium iodide), 및 플루시토신(flucytosine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그 이상인 것인 약학적 조성물.
8. The method of claim 7, wherein the antifungal agent is selected from the group consisting of amphotericin B, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, terbinafine, griseofulvin, Wherein the composition is one or more selected from the group consisting of potassium iodide, and flucytosine.
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