KR101967881B1 - Marker for diagnosing Charcot-Marie-Tooth disease and use thereof - Google Patents
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Abstract
일 양상에 따른 NEFH 단백질 변이체 또는 NEFH 유전자 변이체는 샤르코-마리-투스병을 진단하기 위한 마커로서 이용할 수 있다. 상기 NEFH 유전자 변이체를 이용한 진단은 샤르코-마리-투스병에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기진단을 가능하게 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료효과를 극대화할 수 있다.According to one aspect, the NEFH protein variant or NEFH Gene variants can be used as markers to diagnose Charcot-Marie-Tooth disease. The NEFH Genetic variant diagnosis enables precise diagnosis of Charcot-Marie-Tooth disease through genetic testing, and thus it is possible to maximize the therapeutic effect by applying the recently developed treatment method early.
Description
NEFH 단백질 변이체 또는 NEFH 유전자 변이체, 이들을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 샤르코-마리-투스병을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법에 관한 것이다.NEFH protein variants or NEFH A kit for diagnosing Charcot-Marie-Tooth disease, and a diagnostic method of the disease using the composition or kit.
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT) 또는 유전 운동 감각 신경병(hereditary motor and sensory neuropathy)은 유전적 및 임상적으로 이질적인 말초신경 시스템의 장애로서, 감각 기능의 손실을 동반한 원위성 근육 약화 등의 증상을 나타낸다(Harding et al., Brain 103:259-280(1980)). CMT는 가장 보편적인 종류의 유전 말초 신경병증이다. 이는 80개 이상의 원인 유전자와 관련이 있다. 조직병리학적 및 전기생리학적 결과에 따르면, CMT는(1) 38 m/s 이하의 정중 운동 신경 전도 속도를 나타내는 탈수초성 CMT1;(2) 38 m/s 이상의 정중 운동 신경 전도 속도를 나타내는 축삭형 CMT2; 및(3) 25 내지 45 m/s 사이의 정중 운동 신경 전도 속도를 나타내고, 축삭 및/또는 탈수초성 특징을 보이는 신경 병리를 나타내는 중간형 IntCMT로 분류할 수 있다. Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) or hereditary motor and sensory neuropathy is a disorder of the hereditary and clinically heterogeneous peripheral nervous system, with loss of sensory function And weakness of the original satellite muscle (Harding et al., Brain 103: 259-280 (1980)). CMT is the most common type of genetic peripheral neuropathy. It is associated with more than 80 causative genes. According to histopathological and electrophysiologic results, CMT was (1) dehydrated CMT1 showing a median motor nerve conduction velocity of 38 m / s or less; (2) axon indicating a median nerve conduction velocity greater than 38 m / s CMT2; And (3) a median IntCMT that exhibits a median motor nerve conduction velocity between 25 and 45 m / s and exhibits neuropathology characterized by axonal and / or dehydration characteristics.
상기 CMT의 발생 빈도는 2500 명당 한 명으로 유전되는 희귀질환 가운데 높은 빈도를 보인다. CMT 환자들은 발과 손의 근육들이 점점 위축되어 힘이 약해지며, 발 모양과 손 모양이 변형되거나 안면 마비 및 청력장애 등이 발생한다. 발병은 주로 10 세 전후에 일어나나 드물게는 30 대 이후에도 일어난다. 환자들의 증상은 유전자 돌연변이의 종류에 따라 거의 정상에 가까운 가벼운 상태에서부터 아주 심하여 보행에 도움이 필요하거나 또는 휠체어에 의존해야 하는 정도까지 다양하다.The incidence of CMT is high among rare diseases inherited by one person per 2,500 people. In CMT patients, the muscles of the feet and hands gradually contract and weaken, deforming the shape of the foot and hands, and causing facial paralysis and hearing impairment. The onset usually occurs around the age of 10, but rarely after the age of 30. Patients' symptoms vary from mild to near normal, depending on the type of gene mutation, to the extent that they need help with walking or are dependent on a wheelchair.
CMT 치료를 위한 약물들 가운데 프로게스테론 수용체의 길항제인 오나프리스톤(onapristone)을 투여한 형질전환마우스에서 NEFH mRNA의 과발현을 감소시키고 부작용이 없이 유전 운동 감각 신경병의 표현형을 호전시킨 보고가 있었고, 말초신경에서 수초형성에 필수적인 물질인 아스코르빈산(ascorbic acid)은 CMT1A 형질전환 마우스에서 수초 재형성 및 유전 운동 감각 신경병의 표현형을 개선하였고, 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3)은 CMT1A 환자군에서 수초화된 신경섬유를 증가시켜 감각 증상 개선효과를 나타냈다고 보고되었다. 따라서, CMT의 정확한 유전적 진단에 따라 발병의 억제 및 유전적 원인에 적합한 맞춤 치료가 가능하게 되었으나, 아직까지 효율적인 유전성 신경 질환의 진단 방법 개발은 미흡한 실정이다. 유전적으로 매우 이질적인 특성을 가진 운동 감각 신경병의 맞춤 치료를 위하여 먼저 정확한 유전적 진단법의 확립이 요구되고 있다.There was a report in which transgenic mice treated with onapristone, an antagonist of progesterone receptor, decreased the overexpression of NEFH mRNA and improved phenotypic phenotype of hereditary motor neuropathy without side effects. Ascorbic acid, an essential substance in herbal formulations, improved the phenotype of herpes reparative and hereditary kinetic neuropathy in CMT1A transgenic mice and neurotrophin-3 (NT-3) in the CMT1A patient group It was reported that the effect of improving the sensory symptoms was increased by increasing the herniated nerve fibers. Thus, CMT can be used as an adjunct to the genetic diagnosis of genetic neuropathy. However, the development of effective diagnostic methods for hereditary neurological diseases is still insufficient. For the treatment of kinematic neuropathy with very heterogeneous genetic characteristics, it is required to establish accurate genetic diagnosis method first.
이에 본 발명자들은 CMT의 발병 원인을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, 기존에 보고되지 않은 신규한 돌연변이 유전자를 규명하였으며, 상기 돌연변이 유전자가 CMT의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention have made efforts to investigate the cause of CMT, and as a result, they have uncovered a novel mutant gene which has not been previously reported, and confirmed that the mutant gene can be usefully used for the diagnosis of CMT, Respectively.
일 양상은 신경미세섬유 중쇄 폴리펩티드 (neurofilament-heavy polypeptide: NEFH) 단백질 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.One aspect provides a neurofilament-heavy polypeptide (NEFH) protein variant or polynucleotide encoding the same.
다른 양상은 샤르코-마리-투스병의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.Another aspect provides a composition for diagnosing the onset or the risk of the onset of Charcot-Marie-Tooth disease.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 샤르코-마리-투스병의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.Another aspect provides a kit for diagnosing the onset or the risk of the onset of Charcot-Marie-Tooth disease comprising said composition.
다른 양상은 샤르코-마리-투스병을 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of diagnosing Charcot-Marie-Tooth disease or providing information for predicting the risk of onset.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 신경미세섬유 중쇄 폴리펩티드 (neurofilament-heavy polypeptide: NEFH) 단백질 변이체를 제공한다.One aspect is to provide a neurofilament-heavy polypeptide (NEFH) protein variant consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
상기 NEFH 단백질 변이체는 분리된 NEFH 단백질 변이체일 수 있다.The NEFH protein variant may be an isolated NEFH protein variant.
신경미세섬유(Neurofilament)는 3종(light, medium, 및 heavy)의 중간(intermediate) 미세섬유 폴리펩티드를 포함한다. 상기 NEFH 단백질은 신경 세포의 골격을 형성하는 신경미세섬유를 만들며, 2종의 작은 신경미세섬유 폴리펩티드가 제공하지 않는 성숙한 축삭의 형성에 관여한다. 상기 NEFH 단백질은 NCBI Accession number NP_066554.2로 등록된 단백질일 수 있고, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. Neurofilaments include three light (medium, medium, and heavy) microfine fiber polypeptides. The NEFH protein forms neuronal microfibers that form the skeleton of neurons and is involved in the formation of mature axons that are not provided by the two small nerve microfiber polypeptides. The NEFH protein may be a protein registered with the NCBI Accession number NP_066554.2, for example, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
용어, "NEFH 단백질 변이체"란 서열번호 1로 표시되는 NEFH 단백질의 아미노산 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 NEFH 유전자 변이체에 의해 코딩되는 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환(p.Lys1010Glnfs*57 또는 p.K1010Qfs*57)된 NEFH 단백질 변이체일 수 있다. 상기 격자 이동에 의하여, 1010번 이후의 아미노산이 서열번호 1로 표시되는 NEFH 단백질의 아미노산 서열과 다른 아미노산으로 변경될 수 있고, 1010번 이후 56개의 아미노산이 번역된 후, 종결코돈에 의하여 종결될 수 있다. 1010번 이후의 아미노산 서열은 KATEDKAAKGK에서 QASREGHRRQGRQGEVRQGERNIRNSQRNSEESRSSRIRVTQFSLFLSLCKKKLLR로 변경된 것일 수 있다. 상기 NEFH 단백질 변이체는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것일 수 있다. The term " NEFH protein variant " means that a mutation has occurred in a part of the amino acid sequence of the NEFH protein represented by SEQ ID NO: 1. Specifically, in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 to 3015 times, 3027 times, positions CAAGCCTCCAGAG a duplicate of NEFH (K) at
다른 양상은 NEFH 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.Another aspect provides polynucleotides that encode NEFH protein variants.
상기 NEFH 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열은 중복된 CAAGCCTCCAGAG를 나타내는 것일 수 있다. 상기 NEFH 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. The polynucleotide encoding the NEFH protein variant may be a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is duplicated. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 may be indicative of a redundant CAAGCCTCCAGAG. The polynucleotide encoding the NEFH protein variant may be a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
따라서, 상기 NEFH 단백질 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되어 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 NEFH 단백질 변이체일 수 있다. Thus, the NEFH protein variant is encoded by a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence consisting of a redundant nucleotide sequence of CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and lysine (K) at
NEFH(neurofilament-heavy polypeptide) 유전자는 상기 NEFH 단백질을 코딩하는 유전자로서, NCBI Accession number NM_021076.3 로 등록된 유전자일 수 있고, 예를 들면 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자일 수 있다. The neurofilament -heavy polypeptide (NEFH) gene may be a gene encoding the NEFH protein and may be a gene registered with NCBI Accession number NM_021076.3, for example, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 .
용어, "NEFH 유전자 변이체"란 서열번호 2로 표시되는 NEFH 유전자의 뉴클레오티드 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복(c.3015_3027dup)된 NEFH 유전자 변이체일 수 있다. The term " NEFH Quot; gene variant " refers to NEFH represented by SEQ ID NO: 2 Means that a mutation has occurred in a part of the nucleotide sequence of the gene. Specifically, CAUGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 may be a NEFH gene mutant that is overlapped (c.3015_3027dup).
상기 NEFH 유전자 변이체는, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 또는 CAAGCCTCCAGAG의 중복에 의해 생성된 것일 수 있다.The NEFH The gene mutant may be a nucleotide sequence at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or a duplication of CAAGCCTCCAGAG.
통상의 기술자라면 상기 등록 번호를 이용하여 변이의 위치, 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 진뱅크(GenBank)에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. Those skilled in the art will readily be able to identify the position, nucleotide sequence and amino acid sequence of the mutation using the registration number. The specific sequence corresponding to the number registered in the UCSC genome browser or GenBank may change over time. It will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention also affects the altered sequence.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 NEFH 단백질 변이체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 NEFH 유전자 변이체는 샤르코-마리-투스병의 진단 마커일 수 있다. 따라서, 상기 NEFH 단백질 변이체의 p.K1010Qfs*57 변이 부위 또는 상기 NEFH 유전자 변이체의 c.3015_3027dup 변이 부위는 샤르코-마리-투스병의 진단을 위한 돌연변이 마커일 수 있다.A NEFH protein variant consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT)은 손과 발의 말초신경 발달에 관여하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 질병으로서, 발병 유형에 따라 신경 수초 이상과 관련이 있는 제1형, 축삭돌기 이상과 관련이 있는 제2형, 그리고 제1형과 제2형이 복합적으로 나타나는 제3형과 제4형, X 염색체와 관련된 X형으로 분류될 수 있다.Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a disease caused by a mutation of a gene involved in peripheral nerve development of the hands and feet. It is a
샤르코-마리-투스병 제2형(Charcot-Marie-Tooth disease type 2: CMT2)은 상염색체 우성 축삭형 신경병증이며, CMT1 보다 장애 정도나 발병 연령층이 다양하고, 신경 전도 속도는 정상이거나 약간 저하되는 것이 특징이다. 샤르코-마리-투스병 제2형 CC(Charcot-Marie-Tooth disease type 2CC: CMT2CC)는 주로 하지에 영향을 미치는 상염색체 우성 말초 신경병증으로서, 근육 약화 및 위축, 및 보행 장애를 유발하며, 발병 연령과 중증도는 다양한 것이 특징이다. 구체적으로, 상기 NEFH 단백질 변이체 또는 NEFH 유전자 변이체는 CMT2의 진단 마커일 수 있다. 상기 NEFH 단백질 변이체 또는 NEFH 유전자 변이체는 CMT2CC의 진단 마커일 수 있다. Charcot-Marie-Tooth Disease type 2 (CMT2) is an autosomal dominant axon neuropathy. It has a greater degree of impairment or age at onset than CMT1, and the nerve conduction velocity is normal or slightly lower . Charcot-Marie-Tooth disease type 2CC (CMT2CC) is an autosomal dominant peripheral neuropathy that mainly affects the lower limb, causing muscle weakness and atrophy and gait disorder, Age and severity are various. Specifically, the NEFH protein mutant or NEFH gene mutant may be a diagnostic marker of CMT2. The NEFH protein variant or NEFH gene variant may be a diagnostic marker of CMT2CC.
용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "CMT의 진단"이란 CMT의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미할 수 있다.The term " diagnosis " means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. Therefore, the above-mentioned " diagnosis of CMT " may refer to whether or not the CMT is caused or to predict the onset of the onset of CMT.
용어, "진단 마커(diagnosis marker)"는 상기 CMT의 발병 여부 또는 발병 가능성을 진단할 수 있는 물질을 의미할 수 있다.The term " diagnosis marker " may refer to a substance capable of diagnosing the onset or susceptibility of the CMT.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정할 수 있다. 유의성 있는 진단 마커란 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고, 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미할 수 있다. 상기 진단 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 NEFH 단백질 변이체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 NEFH 유전자 변이체는 CMT 환자에서만 검출이 되고, 정상인 대조군에서는 검출될 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 따라서 상기 변이체의 존재 여부를 검출하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.Selection and application of significant diagnostic markers can determine the reliability of diagnostic results. Significant diagnostic markers may be markers with high reliability with high validity and consistency in repeated measurements. A NEFH protein variant consisting of an amino acid sequence in which the lysine (K) at
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
구체적으로, 상기 CMT은 CMT2일 수 있고, CMT2CC일 수 있다.Specifically, the CMT may be CMT2 or CMT2CC.
용어, "단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질을 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.The term " agent capable of specifically detecting a protein " means a substance that can be used to specifically identify or detect the protein in a sample of an individual.
상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p.K1010Qfs*57 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있다.The agent capable of specifically detecting the protein can be a substance capable of specifically detecting the mutation site of pK1010Qfs * 57.
용어, "단백질의 p.K1010Qfs*57 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질의 p.K1010Qfs*57 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.The term "agent capable of specifically detecting the pK1010Qfs * 57 mutation site of a protein" can be used to specifically identify or detect the pK1010Qfs * 57 mutation site of the protein in a sample of an individual Material.
상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 NEFH 단백질 변이체, 예를 들면 NEFH 변이체의 p.K1010Qfs*57 변이 부위를 타겟(target)으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있고, 보다 구체적으로 HSPB3 단백질 변이체에 특이적인 폴리펩티드일 수 있고, 보다 구체적으로 NEFH 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있고, 보다 더 구체적으로 서열번호 1의 단백질의 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 NEFH 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있으나, 그 종류가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.The agent capable of specifically detecting the protein may be a specific compound or a synthetic target substance having a NEFH protein variant, for example, a mutation site of pK1010Qfs * 57 of a NEFH variant, and more specifically, a HSPB3 protein (K) at
용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기 NEFH 단백질 변이체에 특이적인 항체는, NEFH 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 NEFH 단백질 변이체를 얻고, 얻어진 NEFH 단백질 변이체로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 NEFH 단백질 변이체에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함될 수 있고, 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 나아가, 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다.The term " antibody ", as it is known in the art, refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. The antibody specific for the NEFH protein variant can be obtained by cloning a gene encoding a NEFH protein variant into an expression vector according to a conventional method to obtain a NEFH protein variant encoded by the gene and then obtaining a NEFH protein variant from the obtained NEFH protein variant ≪ / RTI > Also included are partial peptides that may be made from the NEFH protein variants, and the partial peptides may include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody is not particularly limited, and any polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding property thereof may be included in the antibody and all the immunoglobulin antibodies may be included. Further, the antibody may also include a special antibody such as a humanized antibody.
다중클론 항체는 상기한 NEFH 단백질 변이체 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for obtaining sera containing antibodies by injection of the NEFH protein variant antigen described above into an animal and blood sampling from the animal. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, dogs, and the like.
단일클론 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6: 511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature 352: 624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol 222(58): 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (Kohler and Milstein, European Jounal of Immunology 6: 511-519, 1976) or the phage antibody library (Clackson et al, Nature 352: 624- 628, 1991; Marks et al., J Mol Biol 222 (58): 1-597, 1991). The antibody prepared by the above method can be separated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
상기 NEFH 단백질 변이체를 검출할 수 있는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.An antibody capable of detecting the NEFH protein variant may comprise a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains as well as functional fragments of the antibody molecule. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
용어, "폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.The term " agent capable of specifically detecting a polynucleotide " means a substance that can be used to specifically identify or detect the polynucleotide in a sample of an individual.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있다.The agent capable of specifically detecting the polynucleotide can be a substance capable of specifically detecting the c.3015-3027dup mutation site.
용어, "폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.The term " agent capable of specifically detecting the c.3015_3027dup mutation site of a polynucleotide " refers to a substance that can be used to specifically identify or detect the c.3015_3027dup mutation site of the polynucleotide in a sample of an individual it means.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 NEFH 유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 구체적으로 NEFH 유전자 변이체의 c.3015_3027dup 변이 부위에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 보다 구체적으로 NEFH 유전자 변이체의 c.3015_3027dup 변이 부위에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 구체적으로 NEFH 유전자 변이체의 c.3015_3027dup 변이 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 그 종류가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. The agent capable of specifically detecting the polynucleotide may be a substance that specifically binds to the NEFH gene mutant, specifically, a NEFH Or a substance specifically binding to the c.3015_3027dup mutation site of the genetic mutant, more specifically NEFH A polynucleotide that specifically binds to the c.3015_3027dup mutation site of the genetic mutant, more specifically, NEFH Probe, or antisense nucleic acid that specifically binds to the c.3015_3027dup mutation site of the genetic mutant, but the type thereof is not necessarily limited thereto.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이 부위를 포함하고 상기 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 변이 부위는 서열번호 2의 5' 말단으로부터 3015번째 이후의 뉴클레오티드, 3028번째 이후의 뉴클레오티드, 또는 3028번째 내지 3040번째 뉴클레오티드일 수 있다.The agent capable of specifically detecting the polynucleotide is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary polynucleotide thereof, wherein the polynucleotide comprises a mutation site of the polynucleotide and comprises 10 or more consecutive Lt; / RTI > polynucleotide. The mutation site may be a nucleotide at position 3015 or more from the 5 'end of SEQ ID NO: 2, a nucleotide at position 3028 or later, or a nucleotide at positions 3028 to 3040.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 변이 부위에서 뉴클레오티드 변이를 나타내는 것이다. 따라서, 하나의 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 샤르코-마리-투스병의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 샤르코-마리-투스병의 발병 위험과 연관되어 있는 것을 판단될 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은, 하나의 특정한 서열을 가진 샤르코-마리-투스병의 발병 위험과 연관되어 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 및 그에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 즉 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에서 변이 부위인 상기 서열번호 1의 5' 말단으로부터 3015번째 이후의 뉴클레오티드, 3028번째 이후의 뉴클레오티드, 또는 3028번째 내지 3040번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에서 c.3015_3027dup 변이를 검출할 수 있다. The agent capable of specifically detecting the polynucleotide indicates a nucleotide variation at a mutation site. Thus, when one single-stranded polynucleotide is associated with the risk of developing Sharko-Maritus disease, the polynucleotide complementary to the single-stranded polynucleotide is naturally associated with the risk of developing Charko-Mariotys disease Can be judged. Thus, compositions according to one aspect may comprise single-stranded polynucleotides and polynucleotides having a sequence complementary thereto, which are associated with the risk of developing a Charcot-Marie-Tooth disease with one particular sequence. That is, the agent capable of specifically detecting the polynucleotide is a polynucleotide of SEQ ID NO: 2, wherein the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 is a nucleotide at position 3015 or later from the 5'end of SEQ ID NO: 1, a nucleotide at position 3028 or later, Gt; nucleotides < / RTI > Or the agent capable of specifically detecting the polynucleotide can detect the c.3015-3027dup mutation in the polynucleotide of SEQ ID NO: 2.
상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것일 수 있다.The primer, probe, or antisense nucleic acid specifically binds to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which the CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 overlap, and does not specifically bind to the nucleotide sequence of other nucleic acid material It may not be.
상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 통상의 기술자가 NEFH 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인할 수 있다.The primer, probe, or antisense nucleic acid may be prepared by a conventional technique using NEFH Can be designed based on the nucleotide sequence of the gene variant.
용어, "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, NEFH 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 CMT를 진단할 수 있다.The term " primer " refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying. Lt; RTI ID = 0.0 > 50 < / RTI > Primers are usually synthesized but can also be used in naturally occurring nucleic acids. The sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but is sufficiently complementary that it can hybridize with the template. Primers are designed to initiate DNA synthesis in the presence of a polymerization reaction (i. E., A reagent for DNA polymerase or reverse transcriptase and four different nucleoside triphosphates) at the appropriate buffer solution and temperature The length of the PCR conditions, sense and antisense primers can be modified based on those known in the art . Thus, NEFH The CMT can be diagnosed by performing PCR amplification using the sense and antisense primer of the nucleotide sequence of the gene mutant.
용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, NEFH 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 CMT를 진단할 수 있다.The term " probe " means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short period of a few nucleotides or a few hundred nucleotides that can specifically bind to mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific nucleic acid . The probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art. Therefore, NEFH Hybridization is performed using a probe complementary to the nucleotide sequence of the gene mutant, and CMT can be diagnosed through hybridization.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phospharamidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한하지 않는다.The primers or probes can be chemically synthesized using the phospharamidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may incorporate additional features that do not alter the basic properties. Examples of additional features that may be incorporated include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more nucleic acids with homologues, and modifications between nucleic acids.
용어, "안티센스 핵산"은 타겟으로 하는 NEFH 유전자 변이체에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 NEFH 유전자 변이체와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, NEFH 유전자 변이체를 검출하는 데 사용될 수 있다.The term "antisense nucleic acid" is a target to NEFH NEFH < / RTI >< RTI ID = 0.0 > Means a nucleic acid-based molecule capable of forming a dimer with a gene variant and can be used to detect a NEFH gene variant.
상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것일 수 있다. 상기 단편은 5개 이상, 구체적으로 10개 이상, 보다 구체적으로 10개 내지 1000개, 보다 더 구체적으로 10개 내지 500개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 500개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 300개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 200개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 150개의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.The antisense nucleic acid may be the polynucleotide or a fragment thereof, or complementary thereto. More preferably 10 to 1000, more particularly 10 to 500, even more specifically 15 to 500, even more specifically 15 to 300, more specifically 10 or more, more specifically 10 to 1000, More specifically from 15 to 200 nucleotides, more particularly from 15 to 150 nucleotides, but it is possible to choose an appropriate length to increase the detection specificity.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 CMT의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.Another aspect provides a kit for diagnosing the onset or the risk of the onset of CMT comprising said composition.
상기 키트는 검사 대상에게서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출함으로써 CMT의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단할 수 있다.The kit comprises a protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
구체적으로, 상기 키트는 검사 대상에게서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 p.K1010Qfs*57 변이 부위, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 검출함으로써 CMT의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단할 수 있다.Specifically, the kit includes a mutation site of pK1010Qfs * 57 of a protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
상기 키트에는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 특이적으로 인지하는 항체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산이 포함될 수 있고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.The kit includes an antibody specifically recognizing a protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
구체적으로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.Specifically, the kit may be an RT-PCR kit, a microarray chip kit, or a protein chip kit.
상기 RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.The RT-PCR kit requires RT-PCR to specifically detect the c.3015_3027dup mutation site of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 May be included. The RT-PCR kit comprises a primer pair, which is specific for the c.3015_3027dup mutation site of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of the overlapping nucleotide sequence of CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, Enzymes such as deoxyribonucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterilized water and the like.
상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위의 존재 여부를 검출하여 CMT의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.The microarray chip may comprise a DNA or RNA polynucleotide probe. The microarray comprises a microarray comprising a probe specific for a c.3015_3027dup mutation site of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which the CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a duplicated nucleotide sequence Configuration. The microarray detects the presence of the c.3015_3027dup mutation site of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence with the overlapping CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and provides information useful for diagnosing the possibility of CMT .
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위에 대한 프로브를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, DNA 마이크로어레이는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법에 의해 상기 c.3015_3027dup 변이 부위에 대한 프로브를 기판 상에 고정화시킬 수 있다. 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.A method for preparing a microarray by immobilizing a probe on a substrate for a c.3015_3027dup mutation site of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is duplicated is well known in the art It is known. For example, the DNA microarray can be prepared by a method using micropipetting using a piezo electric method or a spotter using a pin type, A probe for a mutation site can be immobilized on a substrate. The substrate of the microarray may be coated with an activating group selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine and aldehyde, but is not limited thereto . The substrate may be selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon film, and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto.
또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.In addition, hybridization of nucleic acids on a microarray and detection of hybridization results are well known in the art. The detection can be accomplished by labeling the nucleic acid sample with a labeling substance capable of generating a detectable signal comprising a fluorescent material, such as Cy3 and Cy5, and then hybridizing on the microarray and detecting a signal The hybridization result can be detected.
상기 단백질 칩 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현수준을 측정할 수 있다. 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.The protein chip kit can measure the expression level of a protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at
다른 양상은 CMT를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.In another aspect, lysine (K) at
용어, "개체"는 CMT의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 포유동물일 수 있으며, 예를 들면 인간(Homo sapiens)일 수 있다. 상기 인간은 중국인일 수 있다.The term " individual " refers to an individual who seeks to determine whether or not CMT has developed or is likely to develop or predict the risk of developing CMT. The subject may be a vertebrate animal, specifically a mammal, an amphibian, a reptile, a bird, or the like, more specifically a mammal, for example a human ( Homo sapiens ). The human being may be Chinese.
용어, "생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 단백질 시료의 경우, 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨를 직접 이용하거나, 또는 용해 버퍼에서 용해된 단백질을 이용할 수 있다. 상기 단백질 시료에는 순수하게 분리된 단백질 뿐만 아니라 조 분리된 단백질, 예를 들면, 단백질을 포함하는 세포 파쇄물도 포함한다. 핵산 시료의 경우, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 핵산을 직접적으로 분리하거나, 또는 PCR과 같은 핵산 증폭 방법에 의하여 특정한 영역이 증폭된 핵산을 이용할 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 DNA는 게놈 DNA, cDNA 또는 재조합 DNA일 수 있다. 상기 RNA는 mRNA일 수 있다. 상기 핵산 시료에는 순수하게 분리된 핵산뿐만 아니라 조 분리된 핵산, 예를 들면, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물도 포함한다. The term " biological sample " may include, but is not limited to, tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine samples separated from the subject. Methods for obtaining biological samples from an individual are known in the art. In the case of a protein sample, the separated tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine can be used directly or proteins dissolved in the lysis buffer can be used. The protein sample includes not only purely separated proteins, but also cell lysates containing crude proteins, for example, proteins. In the case of a nucleic acid sample, a nucleic acid amplified with a specific region can be used by directly separating the nucleic acid from tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine or by a nucleic acid amplification method such as PCR. The nucleic acid may be DNA or RNA. The DNA may be genomic DNA, cDNA, or recombinant DNA. The RNA may be mRNA. The nucleic acid sample includes not only a nucleic acid that is purely isolated, but also a cell lysate containing a crude nucleic acid, for example, a nucleic acid.
상기 단백질은 상기 아미노산 변이 부위의 아미노산 잔기를 직접적으로 결정하여 검출하는 것일 수 있다. 아미노산을 결정하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 단백질 서열분석기를 이용하여 아미노산 변이 부위의 아미노산 잔기를 직접적으로 결정할 수 있다. The protein may be one that directly detects and detects the amino acid residue at the amino acid mutation site. Methods for determining amino acids are known in the art. For example, a protein sequence analyzer can be used to directly determine the amino acid residue at the amino acid mutation site.
상기 단백질은 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p.K1010Qfs*57 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것일 수 있다. 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항원과 항체의 결합을 측정하면서 아미노산 변이 부위의 아미노산을 결정할 수 있다. The protein may be detected using an agent capable of specifically detecting the protein. Specifically, the agent capable of specifically detecting the protein may be one capable of specifically detecting the mutation site of
상기 단백질을 검출하는 분석법은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 효소면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation Assay), 보체고정분석(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter: FACS), 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Methods for detecting the protein include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), Protein Chip, and the like are available. However, But is not limited thereto.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 변이 부위의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정하여 검출하는 것일 수 있다. 뉴클레오티드를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 염기 서열분석기를 이용하여 뉴클레오티드 변이 부위의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 알려진 핵산의 뉴클레오티드 시퀀싱 방법(sequencing method)에 의하여 변이 부위의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법에는 생거(또는 디데옥시) 시퀀싱 방법, 차세대 시퀀싱, 차차세대 시퀀싱, 또는 막삼-길버트(화학 절단) 방법이 포함될 수 있다. The polynucleotide may be one that directly detects and detects the nucleotide at the nucleotide mutation site. Methods for determining nucleotides are known in the art. For example, the nucleotide at the nucleotide mutation site can be directly determined using a nucleotide sequence analyzer. The nucleotide of the mutation site can be directly determined by a nucleotide sequencing method of a known nucleic acid. Methods for nucleotide sequencing can include ginger (or dideoxy) sequencing methods, next generation sequencing, next generation sequencing, or germ-gilbert (chemical cleavage) methods.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 변이 부위의 서열을 포함하는 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, 변이 부위의 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출 가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일염기 연장(single base primer extension: SBE) 방법이 이용될 수 있다.The polynucleotide may be detected using an agent capable of specifically detecting the polynucleotide. Specifically, the agent capable of specifically detecting the polynucleotide may be a preparation capable of specifically detecting the c.3015_3027dup mutation site. The agent capable of specifically detecting the c.3015_3027dup mutation site of the polynucleotide may be, but is not limited to, a primer, a probe, or an antisense nucleic acid. For example, a nucleotide at a mutation site can be determined by hybridizing a probe containing a sequence at a mutation site with a polynucleotide of interest, and analyzing the result of hybridization. The degree of hybridization can be confirmed, for example, by marking a detectable label on the target nucleic acid, detecting the hybridized target nucleic acid, or confirming it by an electrical method or the like. In addition, a single base primer extension (SBE) method can be used.
상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 분석법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Methods for detecting the polynucleotide include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection (RNase protection) assay: RPA), Northern blotting, DNA chip, and the like.
상기 방법에서, 개체로부터 분리한 생물학적 시료에 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 p.K1010Qfs*57 변이 부위, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.3015_3027dup 변이 부위가 존재할 경우, CMT가 발병되었거나 또는 발병 위험이 있는 것으로 진단할 수 있다.In the above method, a biological sample separated from an individual has a
"샤르코-마리-투스병의 발병 위험"은 샤르코-마리-투스 발병 위험의 상대적인 위험일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 발병의 확률이 건강한 정상인 군 또는 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군에 비하여 증가되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 위험은 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체가 다른 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체에 비하여 샤르코-마리-투스병의 발병의 확률이 증가되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다.The "risk of onset of Charcot-Marie-Tooth disease" may be a relative risk of the risk of Charcot-Marie-Tooth. For example, the risk may be indicative of whether the probability of onset is increased relative to a healthy normal population or a group having a reference genomic sequence. In addition, the risk may be that an individual with a particular allele or genotype has an increased likelihood of developing a Charcot-Marie-Tooth disease as compared to an individual having another specific allele or genotype.
일 양상에 따른 NEFH 단백질 변이체 또는 NEFH 유전자 변이체는 샤르코-마리-투스병 제2형을 진단하기 위한 마커로서 이용할 수 있다. 상기 NEFH 유전자 변이체를 이용한 진단은 샤르코-마리-투스병에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기진단을 가능하게 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료효과를 극대화할 수 있다.According to one aspect, the NEFH protein variant or NEFH Gene variants can be used as markers for diagnosing Sharko-Marie-
도 1은 NEFH 유전자 변이를 갖는 CMT2 환자가 포함되어 있는 가족(c.3015_3027dup 변이를 갖는 가족)의 가계도이다. NEFH 유전자 변이 부위의 유전자형은 각각의 구성원의 하단에 나타내었다. 흰색 도형은 정상인, 검정색 도형은 CMT2 환자를 의미한다.
도 2는 대조군(정상인)과 CMT2 환자에서 NEFH 유전자 변이 부위를 포함하는 염기서열 크로마토그램이다.
도 3은 NEFH 변이 (p.Lys1010Glnfs*57)에 의해 헤어핀 구조를 형성하는 것을 나타낸 이미지이다.
도 4는 p.Lys1010Glnfs*57 단백질 변이체와 참조 서열과의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 5는 p.Lys1010Glnfs*57 변이를 갖는 환자에서 촬영한 MRI이다.Fig. 1 is a family tree diagram of a family (c.3015_3027dup mutation) family including a CMT2 patient having a NEFH gene mutation. NEFH The genotype of the gene mutation site is shown at the bottom of each member. White figure is normal, black figure is CMT2 patient.
FIG. 2 is a nucleotide sequence chromatogram containing the NEFH gene mutation site in the control (normal human) and CMT2 patients.
3 is an image showing formation of a hairpin structure by the NEFH mutation (p.Lys1010Glnfs * 57).
4 is a graph showing the difference between the p.Lys1010Glnfs * 57 protein variant and the reference sequence.
Figure 5 is an MRI taken from a patient with the p.Lys1010Glnfs * 57 mutation.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. One. CMT와CMT and 연관된 유전자 및 단백질 변이 확인 Identification of associated gene and protein mutations
1. 환자의 선별1. Selection of patients
본 연구는 상염색체 우성 CMT2 신경병증 환자를 포함하는 중국인 가족 (패밀리 ID: FC503, 도 1) 을 대상으로 하였다. 가족은 총 5명이며, 2명이 발병되었다. 대조군은 가족력이 없는 건강한 정상인 500명을 대상으로 하였다. 모든 참가자는 성균관대학교 삼성병원의 심의위원회로부터 승인된 프로토콜에 따라 서면으로 동의하였다. This study was conducted on a Chinese family (family ID: FC503, Fig. 1) including patients with autosomal dominant CMT2 neuropathy. A total of five family members were born and two were diagnosed. The control group consisted of 500 normal healthy individuals without family history. All participants agreed in writing in accordance with the protocol approved by the deliberation committee of Sungkyunkwan University Samsung Hospital.
2. 전체 엑솜 시퀀싱 및 CMT2 원인 유전자의 동정2. Identification of total exome sequencing and CMT2 gene
CMT2 환자의 혈액 샘플에서 CMT2 원인 유전자를 확인하였다.The CMT2 gene was identified in blood samples from CMT2 patients.
구체적으로, 상기 가족 구성원으로부터 말초 혈액을 수득하고, QIAamp 혈액 DNA 정제 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 헥사플렉스 미소부수체(hexaplex microsatellite) 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 및 실시간(real-time) PCR을 이용하여, 환자 샘플에서 17p12(PMP22) 중복이 존재하는지 확인하였다. 자동 염기서열 분석기 ABI3130XL 및 Genemapper 소프트웨어(Life Technologies, Foster City, CA, USA)를 사용하여, 유전형을 분석하였다. Specifically, peripheral blood was obtained from the family members and genomic DNA was extracted using a QIAamp blood DNA purification kit (Qiagen, Hilden, Germany). Hexaplex microsatellite polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR were used to confirm the presence of 17p12 ( PMP22 ) redundancy in patient samples. The genotypes were analyzed using an automated sequencer ABI3130XL and Genemapper software (Life Technologies, Foster City, Calif., USA).
또한, SureSelect 표적 농축 시스템 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 엑솜을 캡쳐하고, 전체 엑솜을 HiSeq2500 게놈 분석기(Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 서열분석하였다. 분석된 서열을 인간 참조 게놈 UCSC 어셈블리 hg19 (http://genome.ucsc.edu)에 맵핑하고, 변이를 SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/) 및 GATK (http://www.broadinstitute.org/gatk/) 프로그램을 이용하여 추출하였다. 기능적으로 중요한 잠재적인 변이(미스센스(missense), 넌센스(nonsense), 엑손의 삽입-결실(exonic indel), 스탑 게인(stop gain) 및 스플라이싱 부위(splicing site))들을 상기 데이터로부터 일차적으로 선별하였다. 이어서, 신규한 또는 드문 변이(소수 대립유전자 빈도(minor allele frequency: MAF)가 0.01 이하)를 dbSNP147 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 1000 게놈 프로젝트 (1000 Genomes Project: 1000G) (http://www.1000genomes.org/), 엑솜 변이 프로젝트(Exome Variant Project: ESP) (http://evs.gs.washington.edu/EVS/), 및 엑솜 집합 컨소시움(Exome Aggregation Consortium: ExAC)(http://exac.broadinstitute.org/)과 같은 전세계적으로 이용가능한 인간 게놈 변이 데이터베이스와 비교하였다. 이어서, 단백질에서 상기 유전자 변이가 미치는 영향을 결정하기 위하여, MUpro(http://www.ics.uci.edu/~baldig/mutation), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2), 및 SIFT(http://sift.jcvi.org)의 예측 알고리즘을 이용하여 인 실리코(in silico) 분석을 수행하였다. 단백질의 2차 구조는 RNA 구조 프로그램 (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb)을 이용하여 예측하였다. Exomes were also captured using a SureSelect target enrichment system (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA) and the entire exomes were sequenced using a HiSeq2500 genome analyzer (Illumina, San Diego, CA, USA). The analyzed sequences are mapped to the human reference genomic UCSC assembly hg19 (http://genome.ucsc.edu), and the mutations are analyzed using SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/) and GATK (http://www.broadinstitute .org / gatk /) program. (Such as missense, nonsense, exonic indel, stop gain, and splicing site) that are functionally important can be removed from the data first Respectively. Subsequently, novel or rare mutations (minor allele frequency (MAF) of less than 0.01) were obtained from the dbSNP147 database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), the 1000 Genomes Project 1000G) (http://www.1000genomes.org/), the Exome Variant Project (ESP) (http://evs.gs.washington.edu/EVS/), and the Exome Aggregation Consortium : ExAC) (http://exac.broadinstitute.org/). Then, in order to determine the influence of the gene mutation on the protein, MUpro (http://www.ics.uci.edu/~baldig/mutation), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu / pph2), and in silico by using the prediction algorithm of the SIFT (http://sift.jcvi.org) (i n silico ) it was carried out for analysis. The secondary structure of the protein was predicted using the RNA structure program (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb).
WES 분석 결과, 발단자의 NEFH 유전자에서 c.3015_3027dup 변이를 확인하였다. 상기 변이는 NEFH 유전자의 CAAGCCTCCAGAG의 13bp가 순차 중복 (tandem duplication)되는 변이이다. 상기 c.3015_3027dup 변이는 p.Lys1010Glnfs*57 변이를 유발할 것으로 예측되었다. 모든 가족 구성원에서 상기 c.3015_3027dup 변이를 생어 서열분석 방법으로 조사하였다. 상기 발단자 및 발단자의 딸은 상기 c.3015_3027dup 변이를 가지고 있었다. 그러나, 발병되지 않은 가족들은 상기 변이를 가지고 있지 않았다. 즉, 발병된 개인에서 변이의 공분리 현상을 보였다. 발단자의 부모는 모두 c.3015_3027dup 변이를 갖고 있지 않았으므로, 상기 변이는 부모로부터 물려받은 것이 아니라 새롭게 발생된 돌연변이인 드 노보(de novo) 변이임을 알 수 있었다. 동정된 변이는 500명의 정상인 대조군 및 1000 게놈 프로젝트, dbSNP147, ESP, 및 ExAC를 포함하는 몇몇 글로벌 인간 변이 데이터베이스에서 확인되지 않은 것이었다. As a result of WES analysis, NEFH The c.3015_3027dup mutation in the gene was confirmed. The mutation may be NEFH 13bp of the gene CAAGCCTCCAGAG is a tandem duplication. The c.3015_3027dup mutation was predicted to induce the p.Lys1010Glnfs * 57 mutation. The c.3015_3027dup mutation occurred in all family members and examined by sequence analysis method. The daughter of the foot terminal and the starter had the c.3015_3027dup variation. However, unaffected families did not have these mutations. In other words, it showed the separation phenomenon of mutation in the affected individuals. Because the originator's parents did not all have c.3015_3027dup mutations, the mutations were not inherited from their parents, but were de novo mutations that were newly generated mutations. The identified mutations were not identified in some global human variation databases, including 500 normal controls and 1000 genome projects, dbSNP147, ESP, and ExAC.
도 2는 대조군(정상인)과 CMT2 환자에서 NEFH 유전자 변이 부위를 포함하는 염기서열 크로마토그램이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 c.3015_3027dup 변이는 종래 보고된 c.3010-3011delGA 또는 c.3017-3020dup 변이 근처에서 일어나, 이 부근 영역은 변이 핫스팟 (hot spot)인 것으로 예상된다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상대적으로 빈번한 결실/중복은 일부 회문식(palindromic) DNA 서열의 잠재적인 헤어핀 (hairpin) 구조에 의해 야기될 수 있다. 이러한 회문식 서열은 특이한 2차 구조를 형성하여, 게놈이 재배치되는데 영향을 미칠 수 있다. 상기 변이는, 종래 보고된 변이인, 3'UTR에 의해 코딩되는 크립틴 아밀로이드 생성 요소 (cryptic amyloidogenic element: CAE)의 중지 손실 (stop loss) 및 번역과 유사한 격자 이동 변이를 초래하였다. Figure 2 shows that in the control (normal) and CMT2 patients, NEFH This is a base sequence chromatogram containing a gene mutation site. As shown in Fig. 2, the c.3015_3027dup variation occurs near the conventionally reported c.3010-3011delGA or c.3017-3020dup variation, and this neighboring area is expected to be a variation hotspot. As shown in Figure 3, relatively frequent deletion / duplication can be caused by the potential hairpin structure of some palindromic DNA sequences. These regulatory sequences can form a unique secondary structure, which can affect the rearrangement of the genome. This mutation resulted in a lattice mobility shift similar to translation and stop loss of the cryptic amyloidogenic element (CAE) encoded by the 3'UTR, a previously reported variation.
표 1에 나타낸 바와 같이, FC503 가족에서 발단자의 표적 서열분석 데이터로부터 CMT 관련 유전자에서의 비동의(nonsynonymous) 변이를 확인하였다. 모든 변이는 다형성 또는 드문 개별적인 변이로 예상되어, 발병된 가족 구성원과 공분리되지 않았다. As shown in Table 1, nonsynonymous mutations in the CMT-related genes were identified from the target sequence analysis data of the initiator in the FC503 family. All mutations were expected to be polymorphic or rare individual mutations and were not co-segregated with the affected family members.
(No segregation)No separation
(No segregation)
CMT, 샤르코-마리-투스병; Nt, 뉴클레오티드; AA, 아미노산; N, 기록 없음.CMT, Charcoal-Marie-Tooth disease; Nt, nucleotides; AA, amino acid; N, no record.
a. 뉴클레오티드 및 아미노산 접근 번호는 NM_021076.3 및 NP_066554.2임.a. The nucleotide and amino acid accession numbers are NM_021076.3 and NP_066554.2.
b. 변이 대립인자 빈도는 1000 게놈(1000G) 데이터베이스(http://www.1000genomes.org/), 엑솜 서열분석 프로젝트(ESP) 데이터베이스의 변이 대립인자 빈도(http://evs.gs.washington.edu), 엑솜 집합 컨소시움(ExAC) 데이터베이스의 변이 대립인자 빈도(http://exac.broadinstitute.org)로부터 수득함.b. The frequency of mutation alleles depends on the frequency of mutation alleles in the 1000 genome (1000G) database (http://www.1000genomes.org/), the exon sequence analysis project (ESP) database (http://evs.gs.washington.edu) , The frequency of mutation alleles in the Exsome Set Consortium (ExAC) database (http://exac.broadinstitute.org).
c. SIFT: <0.05는 단백질의 기능에 영향을 미치는 것을 의미함, Polyphen-2 (PP2): ~1는 병원성을 예측함, MUpro: <0는 단백질 안정성이 감소된 것을 의미함, *은 병원성을 예측하는 것을 의미함.c. SIFT: <0.05 means affecting protein function, Polyphen-2 (PP2): ~ 1 predicts pathogenicity, MUpro: <0 means decreased protein stability, * predicts pathogenicity .
3. 3. CMT2CMT2 환자의 임상 징후 및 전기생리학적 평가 Clinical Signs and Electrophysiological Evaluation of Patients
CMT 환자가 가지는 임상 징후를 확인하기 위한 실험을 하였다.Experiments were conducted to confirm clinical signs of CMT patients.
구체적으로, CMT2 환자에 대해 운동 및 감각 장애, 심건 반사(deep tendon reflexes) 및 근위축을 확인하였다. 발병 연령은 CMT 증상이 처음으로 나타난 환자의 연령을 환자에게 질문하여 확인하였다. 의학연구심의회(medical research council: MRC)의 등급으로 굴근(flexor)과 신근(extensor)의 강도를 수동으로 측정하였다. 질병의 중증도는 9 등급의 기능 장애 등급(functional disability scale: FDS)을 사용하여 평가하였다. 정중 신경, 척골 신경, 비골 신경, 및 장딴지 신경의 운동 및 감각 전도 속도를 측정하였다. 정중 신경 및 척골 신경의 운동 신경 전도 속도(motor nerve conduction velocity: MNCV)는 팔꿈치 또는 손목에서의 자극에 의해 측정하면서, 단무지외전근(abductor pollicis brevis) 및 소지내전근(adductor digiti quinti) 각각에 대한 복합근 활동 전위(compound muscle action potential: CMAP)를 기록하였다. 같은 방법으로, 비골 신경의 MNCV를 무릎과 발목에서의 자극에 의해 측정하면서, 단지신근(extensor digitorum brevis)에 대한 CMAP을 기록하였다. CAMP 진폭은 기준선에서 음의 피크 값까지 측정되었다. 감각 신경 전달 속도(Sensory nerve conduction velocity: SNCV)는 정중 신경 및 척골 신경으로부터 손가락-손목 부위에 대하여 순방향성(orthodromic) 점수로 얻었으며, 장딴지 신경에 대하여도 기록하였다. 또한, 감각 신경 활동 전위(Sensory nerve action potential: SNAP) 진폭을 측정하였다. Specifically, we identified motor and sensory disturbances, deep tendon reflexes, and atrophy in CMT2 patients. The age at onset was determined by asking the patient the age of the patient who first presented with CMT symptoms. The strength of the flexor and extensor was manually measured on a medical research council (MRC) scale. The severity of the disease was assessed using a functional disability scale of 9 (FDS). The motor and sensory conduction velocities of the median nerve, ulnar nerve, peroneal nerve, and calf nerve were measured. The motor nerve conduction velocity (MNCV) of the median nerve and the ulnar nerve was measured by stimulation at the elbow or wrist, while the composite of the abductor pollicis brevis and the adductor digiti quintion The compound muscle action potential (CMAP) was recorded. In the same way, the CMAP of the extensor digitorum brevis was recorded, while measuring the MNCV of the peroneal nerve by stimulation at the knee and ankle. CAMP amplitude was measured from baseline to negative peak value. Sensory nerve conduction velocity (SNCV) was obtained from the median nerve and ulnar nerve by orthodromic scores for the finger-wrist region, and also for the calf nerves. Sensory nerve action potential (SNAP) amplitude was also measured.
CMT2 환자의 임상적인 특징 및 전기생리학적 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 도 1은 NEFH 유전자 변이를 갖는 CMT2 환자가 포함되어 있는 가족(c.3015_3027dup 변이를 갖는 가족)의 가계도이다. NEFH 유전자 변이 부위의 유전자형은 각각의 구성원의 하단에 나타내었다. 흰색 도형은 정상인, 검정색 도형은 CMT2 환자를 의미한다. 발단자는 32세의 여성(도 1, Ⅱ-2)으로, 상지와 하지의 근육이 소실되었으며, 허벅지와 고관절 근육에서 현저한 근위부 약화를 보였다. 상기 환자는 12세에, 발가락으로 서는데 이상을 보였고, 가끔씩 경련을 일으키기 시작하였다. 상기 환자는 안정적으로 걷지 못하였으며, 20대 초반는 지팡이를 사용하여 보행하였다. 경미한 약화와 소실은 원위 및 근위 근육에서 분명하기 나타났다. 신경학적 검사 결과, 28세에, 첫번째 배측 골간근 (dorsal interosseous) 및 발목 배굴곡근 (ankle dorsiflexion)에서 경미한 약화를 보였으나 (의학연구심의회(medical research council: MRC) 등급 4 이상), 고관절 신장근 (hip extension) 및 무릎 굴근 (knee flexion) 및 신장근 (knee extension)에서, G3, G4- 및 G4-를 나타내어, 중증도의 약화를 보였다. 상기 환자는 동요성 보행을 하였으며, Gower’s maneuver를 보였다. 또한, 상기 환자는 쪼그리고 앉거나 뛰지 못하였다. 진동과 위치의 인지는 통증과 온도 감각보다 더욱 손상되었다. 상기 환자는 사지에서 심건 반사(deep tendon reflexes)를 보이지 않았으며, 자세 불안정 (postural instability)이 관찰되었다. 발바닥 반응(Plantar responses)은 없었다. 신경 전도 검사 (Nerve conduction study: NCS)를 28세, 30세, 및 32세에 수행하였다. 근전도검사 (electromyography: EMG) 결과, 근위 및 원위 만성 신경병증의 변화가 길이 의존적이지 않은 패턴으로 나타났다. 크레아틴 키나제 (creatine kinase: CK) 수준은 434 IU/L까지 증가하였다 (참조 범위: <205).Clinical characteristics and electrophysiological analysis results of CMT2 patients are shown in Table 2 below. Fig. 1 is a family tree diagram of a family (c.3015_3027dup mutation) family including a CMT2 patient having a NEFH gene mutation. NEFH The genotype of the gene mutation site is shown at the bottom of each member. White figure is normal, black figure is CMT2 patient. The originator was a 32-year-old woman (Fig. 1, Ⅱ-2), with upper limb and lower limb muscles disappeared and marked proximal weakening in the thigh and hip muscles. The patient, at 12 years of age, showed an abnormality with standing on the toes and occasionally started to develop seizures. The patient was unable to walk stably, and in the early 20s, he walked using a walking stick. Mild attenuation and loss were evident in the distal and proximal muscles. Neurological examination revealed a mild weakening at the age of 28 years, first dorsal interosseous and ankle dorsiflexion (medical research council (MRC) grade 4 and above) G3, G4- and G4- in the hip extension and knee flexion and knee extension, indicating weakness of severity. The patient had a gait and showed a Gower's maneuver. In addition, the patient did not squat or jump. The perception of vibration and position was more impaired than pain and temperature sensation. The patient did not show deep tendon reflexes in the limbs and postural instability was observed. There were no plantar responses. Nerve conduction study (NCS) was performed at 28, 30, and 32 years of age. Electromyography (EMG) showed that the changes in proximal and distal chronic neuropathy were not length dependent. Creatine kinase (CK) levels were increased to 434 IU / L (reference range: <205).
상기 환자의 가족력을 확인하였다. 환자의 아버지(I-1, M/66) 및 어머니(I-2, F/57)는 정상 소견을 보였다. 환자의 딸이 6세에 검사를 받았을 때, 진동 감각이 감소하였으며, 양쪽 하지에서 가끔씩 근육 경련을 일으켰다. 상지의 반사 신경은 유지되었으나, 하지의 반사 신경은 감소하였다. 발바닥 반응은 없었다. 그러나, 운동 기능은 정상이었으며, 일상 생활에 지장을 주는 수준은 아니었다. The family history of the patient was confirmed. The patient's father (I-1, M / 66) and mother (I-2, F / 57) showed normal findings. When the patient 's daughter was examined at 6 years of age, the sense of vibration decreased and occasional muscle spasms occured in both lower limbs. Upper limb reflexes were maintained, but lower reflexes were decreased. There was no plantar response. However, the exercise function was normal and did not interfere with daily life.
A: 없음(Absent), CMAP: 복합근 활동전위(compound muscle action potential), MNCV: 운동 신경 전도 속도(motor nerve conduction velocity), SNAP: 감각 신경 활동 전위(sensory nerve action potential), SNCV: 감각 신경 전달 속도(sensory nerve conduction velocity), ND: 수행되지 않음, TL: 말단 잠복기(terminal latency)A: Absent, CMAP: compound muscle action potential, MNCV: motor nerve conduction velocity, SNAP: sensory nerve action potential, SNCV: sensory nerve Sensory nerve conduction velocity, ND: not performed, TL: terminal latency,
3. 3. CMT2CMT2 환자 다리 근육의 지방 대체(fatty replacement)의 확인 Identification of fatty replacement in patient's leg muscles
CMT2 환자의 근육이 지방으로 대체되는 소견을 확인하기 위하여, CMT2 환자(도 1: II-2 및 III-1)의 허벅지(thigh) 및 종아리(calf)의 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging: MRI) 촬영을 수행하였다.Magnetic resonance imaging (MRI) of the thigh and calf of CMT2 patients (Fig. 1: II-2 and III-1) was performed to confirm the finding that the muscle of the CMT2 patient was replaced with fat. Photographing was performed.
구체적으로, 위상-배열 멀티-코일(phase-array multi-coil)이 구비된 1.5-T 시스템(Siemens Vision, Siemens, Germany)을 사용하여 MRI를 수득하였다. 환자의 허벅지 및 종아리를 MRI 활영하였다. 다리 MRI는 축면 [시야(field of view: FOV), 24 내지 32 cm; 단면 두께, 10 mm; 단면 간격, 0.5 내지 1.0 mm] 및 관상면(coronal plane) (FOV, 38 내지 40 cm; 단면 두께, 4 내지 5 mm; 단면 간격, 0.5 내지 1.0 mm]에서 수행하였다. T1-강조 스핀-에코(spin-echo: SE)(TR/TE 570-650/14-20, 14-20ms), T2-강조 SE(TR/TE 2800-4000/96-99ms) 및 지방-억제(fat-suppressed) T2-강조 SE(TR/TE 3090-4900/85-99ms)의 프로토콜을 사용하였다.Specifically, MRI was obtained using a 1.5-T system (Siemens Vision, Siemens, Germany) equipped with a phase-array multi-coil. The patient 's thighs and calves were subjected to MRI. The leg MRI is an axial view (field of view: FOV, 24 to 32 cm; Section thickness, 10 mm; 0.5 to 1.0 mm] and coronal plane (FOV, 38 to 40 cm; section thickness, 4 to 5 mm; section interval, 0.5 to 1.0 mm) spin-echo: SE) (TR / TE 570-650 / 14-20, 14-20 ms), T2-weighted SE (TR / TE 2800-4000 / 96-99 ms) and fat- Emphasis SE (TR / TE 3090-4900 / 85-99 ms) protocol was used.
도 5는 p.Lys1010Glnfs*57 변이를 갖는 환자의 하지를 촬영한 MRI이다. 도 5A, 도 5C, 및 도 5E는 환자 II-2가 32세일 때, 하지를 촬영한 MRI이며, 도 5B, 5D, 및 5F는 환자 III-1가 6세일 때, 하지를 촬영한 MRI이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 강한 신호 변화는 종아리 근육에서와 유사한 수준으로 고관절 및 허벅지 근육에서 관찰되었다. 이러한 신호는 길이 의존성 축삭 변형을 보이는 다른 CMT 환자 구별되는 것이었다. 초기에 나타나는 심각한 변화는 외측광근 (vastus lateralis muscle)에서 관찰되었으며 (화살표), 상대적으로 폐각근 (adductor muscle)에서는 유지되었다. 또한, 하지 MRI로부터, 경골 앞쪽 근육 (화살표)의 양은 질병 말기까지 비교적 손상되지 않음을 알 수 있다. 이는 탈수초성 CMT1A 신경병증의 MRI 특징과 구별되는 것이었다. Figure 5 is an MRI image of a patient's leg with p.Lys1010Glnfs * 57 mutation. 5A, 5C, and 5E are MRI images of the lower limb when the patient II-2 is 32 years old, and FIGS. 5B, 5D, and 5F are MRI images of the lower limb when the patient III-1 is 6 years old. As shown in Figure 5, strong signal changes were observed in the hip and thigh muscles at levels similar to those in the calf muscles. These signals were distinct from other CMT patients with length-dependent axonal deformation. Significant early changes were observed in the vastus lateralis muscle (arrow) and relatively retained in the adductor muscle. In addition, from the lower limb MRI, the amount of the anterior muscle of the tibia (arrow) is not relatively damaged until the end of the disease. This was distinct from the MRI features of dehydrated CMT1A neuropathy.
<110> Samsung Life Public Welfare Foundation KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Marker for diagnosing Charcot-Marie-Tooth disease and use thereof <130> PN118905 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1020 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Ser Phe Gly Gly Ala Asp Ala Leu Leu Gly Ala Pro Phe Ala 1 5 10 15 Pro Leu His Gly Gly Gly Ser Leu His Tyr Ala Leu Ala Arg Lys Gly 20 25 30 Gly Ala Gly Gly Thr Arg Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ser Gly Phe His 35 40 45 Ser Trp Thr Arg Thr Ser Val Ser Ser Val Ser Ala Ser Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Arg Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ser Thr Asp Ser Leu Asp Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asn Gly Pro Glu Gly Cys Met Val Ala Val Ala Thr Ser Arg Ser 85 90 95 Glu Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Asn Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Ile 100 105 110 Asp Lys Val Arg Gln Leu Glu Ala His Asn Arg Ser Leu Glu Gly Glu 115 120 125 Ala Ala Ala Leu Arg Gln Gln Gln Ala Gly Arg Ser Ala Met Gly Glu 130 135 140 Leu Tyr Glu Arg Glu Val Arg Glu Met Arg Gly Ala Val Leu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ala Arg Gly Gln Leu Arg Leu Glu Gln Glu His Leu Leu Glu 165 170 175 Asp Ile Ala His Val Arg Gln Arg Leu Asp Asp Glu Ala Arg Gln Arg 180 185 190 Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Leu Ala Arg Phe Ala Gln Glu 195 200 205 Ala Glu Ala Ala Arg Val Asp Leu Gln Lys Lys Ala Gln Ala Leu Gln 210 215 220 Glu Glu Cys Gly Tyr Leu Arg Arg His His Gln Glu Glu Val Gly Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gln Ile Gln Gly Ser Gly Ala Ala Gln Ala Gln Met Gln 245 250 255 Ala Glu Thr Arg Asp Ala Leu Lys Cys Asp Val Thr Ser Ala Leu Arg 260 265 270 Glu Ile Arg Ala Gln Leu Glu Gly His Ala Val Gln Ser Thr Leu Gln 275 280 285 Ser Glu Glu Trp Phe Arg Val Arg Leu Asp Arg Leu Ser Glu Ala Ala 290 295 300 Lys Val Asn Thr Asp Ala Met Arg Ser Ala Gln Glu Glu Ile Thr Glu 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Gln Leu Gln Ala Arg Thr Thr Glu Leu Glu Ala Leu Lys 325 330 335 Ser Thr Lys Asp Ser Leu Glu Arg Gln Arg Ser Glu Leu Glu Asp Arg 340 345 350 His Gln Ala Asp Ile Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Ile Gln Gln Leu Asp 355 360 365 Ala Glu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Glu Met Ala Ala Gln Leu Arg Glu 370 375 380 Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala 385 390 395 400 Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Cys Arg Ile Gly Phe Gly 405 410 415 Pro Ile Pro Phe Ser Leu Pro Glu Gly Leu Pro Lys Ile Pro Ser Val 420 425 430 Ser Thr His Ile Lys Val Lys Ser Glu Glu Lys Ile Lys Val Val Glu 435 440 445 Lys Ser Glu Lys Glu Thr Val Ile Val Glu Glu Gln Thr Glu Glu Thr 450 455 460 Gln Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Glu Glu Glu Lys Glu Ala Lys Glu 465 470 475 480 Glu Glu Gly Lys Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Ala Glu Gly 485 490 495 Gly Glu Glu Glu Thr Lys Ser Pro Pro Ala Glu Glu Ala Ala Ser Pro 500 505 510 Glu Lys Glu Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala 515 520 525 Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val 530 535 540 Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala Lys Ser 545 550 555 560 Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu 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Glu Glu Gln Thr Glu Glu Thr 450 455 460 Gln Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Ala Lys Glu 465 470 475 480 Glu Glu Lys Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Gly 485 490 495 Gly Glu Glu Glu Glu Thr Lys Ser Pro Ala Glu Glu Ala Ala Ser Pro 500 505 510 Glu Lys Glu Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala 515 520 525 Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val 530 535 540 Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala Lys Ser 545 550 555 560 Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala 565 570 575 Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala 580 585 590 Lys Ser Pro Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val 595 600 605 Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Ala Lys Ser Pro Lys Glu 610 615 620 Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser 625 630 635 640 Pro Thr Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Glu 645 650 655 Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Lys Ala 660 665 670 Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Lys Ala Glu Ala 675 680 685 Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser 690 695 700 Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu 705 710 715 720 Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Thr Pro Glu Lys Ala 725 730 735 Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser 740 745 750 Pro Glu Lys Ala Lys Thr Leu Asp Val Lys Ser Pro Glu Ala Lys Thr 755 760 765 Pro Ala Lys Glu Glu Ala Arg Ser Pro Ala Asp Lys Phe Pro Glu Lys 770 775 780 Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys 785 790 795 800 Ser Pro Leu Lys Glu Asp Ala Lys Ala Pro Glu Lys Glu Ile Pro Lys 805 810 815 Lys Glu Glu Val Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Glu Lys Pro Gln Glu 820 825 830 Val Lys Val Lys Glu Pro Pro Lys Lys Ala Glu Glu Glu Lys Ala Pro 835 840 845 Ala Thr Pro Lys Thr Glu Glu Lys Lys Asp Ser Lys Lys Glu Glu Ala 850 855 860 Pro Lys Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Val Glu Glu Lys Lys Glu Pro 865 870 875 880 Ala Val Glu Lys Pro Lys Glu Ser Lys Val Glu Ala Lys Lys Glu Glu 885 890 895 Ala Glu Asp Lys Lys Lys Val Pro Thr Pro Glu Lys Glu Ala Pro Ala 900 905 910 Lys Val Glu Val Lys Glu Asp Ala Lys Pro Lys Glu Lys Thr Glu Val 915 920 925 Ala Lys Lys Glu Pro Asp Asp Ala Lys Ala Lys Glu Pro Ser Lys Pro 930 935 940 Ala Glu Lys Lys Glu Ala Ala Pro Glu Lys Lys Asp Thr Lys Glu Glu 945 950 955 960 Lys Ala Lys Lys Pro Glu Glu Lys Pro Lys Thr Glu Ala Lys Ala Lys 965 970 975 Glu Asp Asp Lys Thr Leu Ser Lys Glu Pro Ser Lys Pro Lys Ala Glu 980 985 990 Lys Ala Glu Lys Ser Ser Thr Asp Gln Lys Asp Ser Lys Pro Pro 995 1000 1005 Glu Gln Ala Ser Arg Glu Gly His Arg Arg Gln Gly Arg Gln Gly Glu 1010 1015 1020 Val Arg Gln Gly Glu Arg Asn Ile Arg Asn Ser Gln Arg Asn Ser Glu 1025 1030 1035 1040 Glu Ser Arg Ser Ser Arg Ile Arg Val Thr Gln Phe Ser Leu Phe Leu 1045 1050 1055 Ser Leu Cys Lys Lys Lys Leu Leu Arg 1060 1065 <210> 5 <211> 3198 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgatgagct tcggcggcgc ggacgcgctg ctgggcgccc cgttcgcgcc gctgcatggc 60 ggcggcagcc tccactacgc gctagcccga aagggtggcg caggcgggac gcgctccgcc 120 gctggctcct ccagcggctt ccactcgtgg acacggacgt ccgtgagctc cgtgtccgcc 180 tcgcccagcc gcttccgtgg cgcaggcgcc gcctcaagca ccgactcgct ggacacgctg 240 agcaacgggc cggagggctg catggtggcg gtggccacct cacgcagtga gaaggagcag 300 ctgcaggcgc tgaacgaccg cttcgccggg tacatcgaca aggtgcggca gctggaggcg 360 cacaaccgca gcctggaggg cgaggctgcg gcgctgcggc agcagcaggc gggccgctcc 420 gctatgggcg agctgtacga gcgcgaggtc cgcgagatgc gcggcgcggt gctgcgcctg 480 ggcgcggcgc gcggtcagct acgcctggag caggagcacc tgctcgagga catcgcgcac 540 gtgcgccagc gcctagacga cgaggcccgg cagcgagagg aggccgaggc ggcggcccgc 600 gcgctggcgc gcttcgcgca ggaggccgag gcggcgcgcg tggacctgca gaagaaggcg 660 caggcgctgc aggaggagtg cggctacctg cggcgccacc accaggaaga ggtgggcgag 720 ctgctcggcc agatccaggg ctccggcgcc gcgcaggcgc agatgcaggc cgagacgcgc 780 gacgccctga agtgcgacgt gacgtcggcg ctgcgcgaga ttcgcgcgca gcttgaaggc 840 cacgcggtgc agagcacgct gcagtccgag gagtggttcc gagtgaggct ggaccgactg 900 tcggaggcag ccaaggtgaa cacagacgct atgcgctcag cgcaggagga gataactgag 960 taccggcgtc agctgcaggc caggaccaca gagctggagg cactgaaaag caccaaggac 1020 tcactggaga ggcagcgctc tgagctggag gaccgtcatc aggccgacat tgcctcctac 1080 caggaagcca ttcagcagct ggacgctgag ctgaggaaca ccaagtggga gatggccgcc 1140 cagctgcgag aataccagga cctgctcaat gtcaagatgg ctctggatat agagatagcc 1200 gcttacagaa aactcctgga aggtgaagag tgtcggattg gctttggccc aattcctttc 1260 tcgcttccag aaggactccc caaaattccc tctgtgtcca ctcacataaa ggtgaaaagc 1320 gaagagaaga tcaaagtggt ggagaagtct gagaaagaaa ctgtgattgt ggaggaacag 1380 acagaggaga cccaagtgac tgaagaagtg actgaagaag aggagaaaga ggccaaagag 1440 gaggagggca aggaggaaga agggggtgaa gaagaggagg cagaaggggg agaagaagaa 1500 acaaagtctc ccccagcaga agaggctgca tccccagaga aggaagccaa gtcaccagta 1560 aaggaagagg caaagtcacc ggctgaggcc aagtccccag agaaggagga agcaaaatcc 1620 ccagccgaag tcaagtcccc tgagaaggcc aagtctccag caaaggaaga ggcaaagtca 1680 ccgcctgagg ccaagtcccc agagaaggag gaagcaaaat ctccagctga ggtcaagtcc 1740 cccgagaagg ccaagtcccc agcaaaggaa gaggcaaagt caccggctga ggccaagtct 1800 ccagagaagg ccaagtcccc agtgaaggaa gaagcaaagt caccggctga ggccaagtcc 1860 ccagtgaagg aagaagcaaa atctccagct gaggtcaagt ccccggaaaa ggccaagtct 1920 ccaacgaagg aggaagcaaa gtcccctgag aaggccaagt ccccagagaa ggaagaggcc 1980 aagtcccctg agaaggccaa gtccccagtg aaggcagaag caaagtcccc tgagaaggcc 2040 aagtccccag tgaaggcaga agcaaagtcc cctgagaagg ccaagtcccc agtgaaggaa 2100 gaagcaaagt cccctgagaa ggccaagtcc ccagtgaagg aagaagcaaa gtcccctgag 2160 aaggccaagt ccccagtgaa ggaagaagca aagacccccg agaaggccaa gtccccagtg 2220 aaggaagaag ctaagtcccc agagaaggcc aagtccccag agaaggccaa gactcttgat 2280 gtgaagtctc cagaagccaa gactccagcg aaggaggaag caaggtcccc tgcagacaaa 2340 ttccctgaaa aggccaaaag ccctgtcaag gaggaggtca agtccccaga gaaggcgaaa 2400 tctcccctga aggaggatgc caaggcccct gagaaggaga tcccaaaaaa ggaagaggtg 2460 aagtccccag tgaaggagga ggagaagccc caggaggtga aagtcaaaga gcccccaaag 2520 aaggcagagg aagagaaagc ccctgccaca ccaaaaacag aggagaagaa ggacagcaag 2580 aaagaggagg cacccaagaa ggaggctcca aagcccaagg tggaggagaa gaaggaacct 2640 gctgtcgaaa agcccaaaga atccaaagtt gaagccaaga aggaagaggc tgaagataag 2700 aaaaaagtcc ccaccccaga gaaggaggct cctgccaagg tggaggtgaa ggaagacgct 2760 aaacccaaag aaaagacaga ggtagccaag aaggaaccag atgatgccaa ggccaaggaa 2820 cccagcaaac cagcagagaa gaaggaggca gcaccggaga aaaaagacac caaggaggag 2880 aaggccaaga agcctgagga gaaacccaag acagaggcca aagccaagga agatgacaag 2940 cctcca gaccaaaaag acagcaagcc tccagagcaa gcctccagag aaggccacag aagacaaggc 3060 cgccaagggg aagtaaggca gggagaaagg aacatccgga acagccaaag aaactcagaa 3120 gagtcccgga gctcaaggat cagagtaaca caattttcac tttttctgtc tttatgtaag 3180 aagaaactgc ttagatga 3198
Claims (22)
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT)의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 조성물.A protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at position 1010 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine (Q) by lattice mobility, or
Wherein the CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is capable of specifically detecting a polynucleotide consisting of a redundant nucleotide sequence.
A composition for diagnosing the risk of, or risk of developing, Charcot-Marie-Tooth disease (CMT).
서열번호 1의 아미노산 서열에서 1010번 위치의 리신(K)이 격자 이동으로 글루타민(Q)로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 3015번 내지 3027번 위치의 CAAGCCTCCAGAG가 중복된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법.In order to provide information for diagnosing CMT or for predicting the risk of onset, in a biological sample separated from an individual,
A protein consisting of an amino acid sequence in which lysine (K) at position 1010 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine (Q) by lattice mobility, or
A method for detecting a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which a CAAGCCTCCAGAG at positions 3015 to 3027 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a duplicated nucleotide sequence.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20230138820A (en) | 2022-03-24 | 2023-10-05 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Novel Biomarker for Diagnosing Charcot-Marie-Tooth Disease Comprising Mutation of MPZ Gene and Uses Thereof |
-
2017
- 2017-08-09 KR KR1020170101356A patent/KR101967881B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Acta Neuropathologica Communications (2017), Vol. 5:55, p.1-15 [DOI 10.1186/s40478-017-0457-1] |
| GenBank: CAA33366.1 |
| Gene, Vol. 132 (1993) p. 297-300 |
| The American Journal of Human Genetics ,2016, vol. 98, p.597-614 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230138820A (en) | 2022-03-24 | 2023-10-05 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Novel Biomarker for Diagnosing Charcot-Marie-Tooth Disease Comprising Mutation of MPZ Gene and Uses Thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20190016873A (en) | 2019-02-19 |
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