KR101967326B1

KR101967326B1 - 양이온성 사이클로덱스트린 유도체 및 이를 이용한 약물전달 시스템

Info

Publication number: KR101967326B1
Application number: KR1020170142020A
Authority: KR
Inventors: 임춘우; 강지혜; 권은서
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-08-13

Abstract

본원 발명은 약물로 사용되는 소수성 물질을 포획(encapsulation)하여 세포내로 전달이 용이한 약물전달 시스템으로 사용 가능한 사이클로덱스트린 유도체를 합성하고 약물을 포획하는 것에 관한 발명이다. 또한, 상기 사이클로덱스트린 유도체를 사용하여 리포좀을 생성하고 여기에 약물을 담지할 수 있는 약물전달 방법을 제공한다.
본원 발명은 사이클로덱스트린을 이용하여 리포좀을 형성함으로써, 종래의 리포좀 형성을 위한 별도의 단계가 필요 없고, 리포좀 내부의 친수성 부분에는 친수성 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라, 리포좀의 인지질 부분에 해당하는 소수성 부분에는 소수성 약물을 담지할 수 있는 다양한 경우에 적용할 수 있는 장점이 있다.

Description

양이온성 사이클로덱스트린 유도체 및 이를 이용한 약물전달 시스템{Cationic cyclodextrin derivatives and drug delivery system using thereof}

본원 발명은 사이클로덱스트린 유도체를 포함하는 약물전달 시스템에 관한 것으로서, 구체적으로 신규한 양이온성 사이클로덱스트린 유도체, 이의 제조방법, 이를 이용한 리포좀, 상기 리포좀을 이용한 약물전단 시스템에 관한 것이다.

대부분의 약물은 소수성을 띠기 때문에 수용액상에 잘 녹지 않는다. 약물이 인체에 전달되기 위해서는 혈액 등에 용해가 되어야 하나 혈액은 수용성이므로 약물이 잘 녹지 않는 문제점이 발생한다. 그 이유로 여러 가지 형태의 생물학적으로 안정한 친수성 물질과 공유 또는 비공유 결합을 통하여 약물을 전달하는 시스템이 개발되고 있다. 사이클로덱스트린은 인체에 해가 거의 없기 때문에 현재 이를 이용한 많은 약물전달 시스템이 개발되었다.

사이클로덱스트린(Cyclodextrin, 이하 'CD')은 알파-1,4 결합으로 연결된 환형 올리고당류의 한 종류로서 6개 내지 10개의 글루코오스의 수에 따라서 α-CD, β-CD, γ-CD, δ-CD, ε-CD로 나눌 수 있다. 대표적으로 많이 사용되는 α-CD, β-CD, γ-CD에 대한 구조식이 도 1(wikimedia 발췌)에 기재되어 있다.

도 2를 참고하면, CD의 입체적 형태는 뾰족한 부분이 절단된 내부가 비어있는 원뿔 모양으로서 입체 형태의 상단과 하단은 히드록시기로 인해서 친수성을 띄고 있다. 상단에 해당하는 부분은 일차 히드록시 그룹, 하단에 해당하는 부분은 이차 히드록시 그룹으로 지칭된다. 입체 모양 안쪽은 포도당 고리의 산소 원자와 탄소, 수소 원자로 인해서 전자밀도가 높은 소수성 공동(hydrophobic cavity)을 형성한다. 이러한 소수성 공동을 이용하여 소수성 약물을 담지할 수 있다. 특히 CD는 독성 및 면역원성(immunogenicity)이 낮기 때문에 약물전달과 관련된 분야에서 매우 활용도가 높다. CD를 이용한 약물전달에 대한 다양한 기술은 비특허문헌 1에 소개되어 있다.

CD를 이용한 새로운 기능성 재료를 만들기 위해서 다양한 방법이 시도되고 있다. CD에 결합되는 그룹에 따라, 양성, 중성, 음이온성 CD로 분류될 수 있다(비특허문헌 2 참조). 이중에서 양이온성 CD와 관련된 연구는 주로 유전자 전달(gene delivery)에 관련되어 있다(비특허문헌 3 참조).

특허문헌 1은 CD의 일차 히드록시 그룹에 PEG(poly ethylene glycol)을 결합시킨 후 여기에 음이온 또는 중성이온을 결합시킨 음이온 고분자 결합 CD 또는 중성이온 고분자 결합 CD 기반의 덴드리머에 관한 것이다. 특허문헌 1은 상기 덴드리머를 독소루비신(doxorubicin)과 같은 의약품을 전달하기 위한 매개체로서 활용하였다(도 3 참조).

그러나 특허문헌 1에서 의약품을 담지하는 기작은 종래의 CD가 소수성 물질을 담지하는 기작과 유사한 소수성 캐비티가 PEG 체인에 의해서 확장된 부분에 약물이 담지되는 것이다. 이러한 경우 많은 양을 담지하지 못할 뿐만 아니라 실질적으로 생물체 내로 공급하여 세포에 직접적으로 영향을 주기 위해서는 세포벽의 통과 등의 다른 문제점을 해결해야 한다.

리포좀은 인지질 2중층 구조를 가진 소형의 구체이다. 형태에 따라서 완전한 구체가 아닌 타원체도 가능하다. 인지질의 소수성을 띄는 꼬리 부분과 친수성을 띄는 머리로 인해서, 물과 같은 용매에 넣었을 경우, 친수성 부분은 친수성 부분끼리 소수성 부분은 소수성 부분끼리 모이기 때문에 2중층 구조를 형성하고, 이러한 형태가 구에 가깝게 나타난다. 도 4는 CD로 구성된 리포좀의 개략적인 형태를 나타낸다. 도 4의 좌측은 CD로 이루어진 구형의 리포좀의 단면을 나타낸 것이다. 도 4의 우측은 CD로 이루어진 이중층의 예시로서 이중층의 바깥으로는 친수성 부분이 이중층의 내부로는 소수성 꼬리가 배치된다. 도 4의 우측에 볼 수 있듯이 이중층이 모두 트랜스 팩킹으로 정렬되어 있을 수 있으며(도 4 우측 상단), 알킬 체인이 서로 교차되어 패킹되어 있을 수 있다(도 4 우측 하단).

리포좀은 기본적으로 생물체 내로 물질을 이동하는 운반체로서 작용하며, 이러한 작용에 근거하며 다양한 약물전달에 활용되고 있다. 또한 리포좀을 이용한 약물을 특정 부분에 전달하는 등 다양하게 활용되고 있다.

비특허문헌 4, 5에서 알 수 있듯이 CD와 리포좀을 이용한 종래의 약물전달 시스템은 약물을 리포좀 내부 바로 주입하여 약물을 전달하거나 약물을 CD와 결합하여 이들 결합물의 물에 대한 용해도를 높인 후 이를 리포좀 내부로 주입하여 약물을 전달하는 방법이었다(도 5 참조, 비특허문헌 5에서 발췌). 비특허문헌 4, 5에서 언급한 바와 같이 약물을 CD와 결합하여 리포좀 내부로 주입하여 전달하는 경우 훨씬 효율이 좋다는 것을 알 수 있다. 비특허문헌 6에서는 양친성 CD를 사용하여 이중층 리포좀을 나타내고 있다.

국제공개 WO 제2016-161501호

이면경, "약물전달을 위한 Cyclodextrin 기반 거대분자 시스템 : 최근 발전과 미래 전망", KOSEN 분석리포트 2013 J. Zhang, P. X. Ma, Cyclodextrin-based supramolecular systems for drug delivery: Recent progress and future perspective, Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (2013) 1215-1233. C. O. Mellet, J. M. Benito, J. M. G. Fernandez, Preorganized, macromolecular, gene-delivery systems, Chem. Eur. J. 16 (2010) 6728-6742. Amber Vyas et al., Cyclodextrin based novel drug delivery systems, J. Incl Phenom Macrocycl Chem (2008) 62:23??42 Wen-Xi Wang et al., A comparison between conventional liposome and drug-cyclodextrin complex in liposome system, http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.ijpharm.2016.09.043 Chem. Eur. J. 2005, 11, 1171 ?? 1180

본원 발명은 약물로 사용되는 소수성 물질을 포획(encapsulation)하여 세포내로 전달이 용이한 약물전달 시스템으로 사용 가능한 CD 유도체를 합성하고 약물을 포획하는 것을 목적으로 한다. 또한, 상기 CD 유도체를 사용하여 리포좀을 생성하고 여기에 약물을 담지할 수 있는 약물전달 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 본원 발명은 양이온성 CD 유도체를 합성 및 약물을 담지할 수 있는 리포좀을 만드는 것을 특징으로 한다. CD는 생체 내에서 안정하다고 알려져 있고 제약이나 화장품 등에 많이 이용되고 있다. 이러한 CD에 소수성 알킬기를 도입하여 리포좀 형성이 용이하도록 합성하였다.

세포내 전달이 용이하도록 CD 유도체에 트리아졸리움(triazolium) 양이온성을 도입하였다. 리포좀을 형성하여 소수성 막내에 소수성 약물을 담지하거나 리포좀 내부의 친수성 부분에 친수성 약물을 또한 담지할 수 있다. 세포막을 형성하는 인지질의 경우 음이온을 띠고 있기 때문에, 양이온성 CD 유도체를 이용한 리포좀과 정전기적 인력을 이용하여 특정 부위에 약물을 전달할 수도 있다.

또한 CD는 소수성 공동(hydrophobic cavity)을 가지고 있어서 소수성 약물을 담지할 수도 있다. 본원 발명의 특징은 아지도 베타 CD(azido β-cyclodextrin)과 삼중 결합을 가진 소수성 알킬 그룹과 클릭 반응에 의해 만들어진 트리아졸(triazole) 그룹을 가진 사이클로덱스트린을 만들고, 이후에 트리아졸(triazole)에 메틸 아이오다이드(methyl iodide)를 이용, 알킬레이션 반응(alkylation reaction)을 하여 트리아졸륨(triazolium)을 포함하는 양이온성 CD를 합성하고 이 물질을 이용하여 약물을 담지할 수 있는 리포좀을 만드는 것을 특징으로 한다. 본원 발명에서는 약물의 예로서 독소루비신(Doxorubicin)을 이용하였다.

이상과 같이 본원 발명은 양이온성 CD를 사용하여 약물을 전달할 수 있는 특징이 있다. 특히 본원 발명은 CD를 이용하여 리포좀을 형성함으로써, 종래의 리포좀 형성을 위한 별도의 단계가 필요 없고, 리포좀 내부의 친수성 부분에는 친수성 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라, 리포좀의 인지질 부분에 해당하는 소수성 부분에는 소수성 약물을 담지할 수 있는 다양한 경우에 적용할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 대표적인 CD의 구조로서 α-CD, β-CD, γ-CD의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 CD의 입체적 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 특허문헌 1에 기재된 종래의 CD 유도체의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 CD로 구성된 구형태의 리포좀의 단면을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5는 비특허문헌 5에 기재된 종래의 CD와 리포좀을 이용하여 약물을 전달하는 시스템을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본원 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 CD 합성의 개략적인 반응 스킴이다.
도 7은 화합물 2a의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 8은 화합물 2a의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 9는 화합물 2a의 HR-MS (FAB+) 스펙트럼이다.
도 10은 화합물 3a의 ESI-MS spectrum이다.
도 11은 화합물 2b의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 12는 화합물 3b의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 13은 화합물 3b의 ¹³C NMR spectrum이다.
도 14는 화합물 3b의 ESI-MS spectrum이다.
도 15는 화합물 3b 관련하여 익스트루더 사용 전(a)과 사용 후(b) 나노입자 운반체 형성과 관련된 Dynamic Light Scattering의 측정 결과이다.
도 16은 Uranyl acetate로 염색된 투과 전자 현미경(Scale bar : 100㎚) 사진이다.
도 17은 본원 발명의 일 실시예에 따른 리포좀에 독소루비신 약물을 담지한 후 젤 필터레이션 후 형광을 측정한 결과이다.
도 18은 본원 발명의 일 실시예에 따른 리포좀에 독소루비신 약물을 담지한 후 발색된 결과이다.

1. 양이온성 CD의 합성.

도 6은 본원 발명의 일 실시예에 따른 양이온성 CD 합성의 개략적인 반응 스킴을 보여주고 있다. 아래에서 각 화합물인 2a, 3a, 2b, 3b 화합물의 제조 방법을 설명한다.

가. 헵타키스{6-(3-메틸-4-부틸-1H-[1,2,3]트리아졸-1-일)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린 (2a)

헵타키스-(6-아지도-6-디옥시)-β-사이클로덱스트린(1g, 0.73mmol)를 DMF(디메틸포름아미드)(2㎖)에 녹인 후, 1-헥사인(1-Hexyne)(0.74㎖, 6.1mol, 1.2 당량)을 넣고 요오드화제일구리(copper iodide)(30㎎, 0.15mmol)와 N,N-디이소프로필에틸 아민(Diisopropylethyl amine)(65㎕, 0.46mmol)을 넣어 녹인 후 마이크로웨이브용 바이알에 넣는다. 100℃, 30W, 30min 조건으로 마이크로웨이브를 이용하여 반응시킨다. 구리를 큐프리소브(CupriSorb)를 사용하여 제거한 후 로터리 증발기(Rotary evaporator)를 이용해 용매를 제거한다. 물을 넣어 고체가 생기면 물로 세척 후 감압 하에 여과시킨다. 흰색 고체(2a)가 생성된다(0.5g, 35%).; ¹H NMR(600㎒, DMSO-d₆): δ7.63(s,1H), 6.01-6.02(d,1H), 5.92(s,1H), 5.04(s,1H), 4.15-4.28(m,2H), 3.99(s,1H), 3.66-3.67(d,1H), 3.31-3.33(d,1H), 3.27(s,1H), 2.28-2.34(m,2H), 1.38-1.42(m,2H), 1.20-1.23(m,2H), 0.79-0.81(t,3H); ¹³C NMR(600MHz, DMSO-d₆): δ146.5, 123.0, 101.6, 82.9, 72.28, 71.87, 69.6, 49.9, 30.9, 24.3, 21.7, 13.5; HR-MS (FAB+): m/z 197.9 [M+Na]⁺

도7은 화합물 2a의 ¹H NMR 스펙트럼이다. 7.6ppm에서 7번 proton이 발견되었고, 0-2ppm에서 10-12번 proton이 확인됨으로서 2a물질을 확인하였다.

도 8은 화합물 2a의 ¹³C NMR 스펙트럼이다. Carbon의 개수가 2a와 일치하여 합성된 것을 확인하였다.

도 9는 화합물 2a의 HR-MS (FAB+) 스펙트럼이다. 2a의 질량을 확인하였다.

나. 헵타키스{6-(3-메틸-4-뷰틸-1H-[1,2,3]트리아졸리움)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린 아이오다이드 (3a)

헵타키스{6-(3-메틸-4-부틸-1H-[1,2,3]트리아졸-1-일)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린(0.49g, 0.26mmol)을 DMF(1㎖)에 녹인 후 1-아이오딘화메틸(1-Iodomethane)(0.23㎖, 6.36mmol, 2당량)을 마이크로웨이브용 바이알에 넣고 100℃, 1hr, 30W 조건으로 반응시킨다. 물을 넣고 고체가 생기면 감압 하에 여과시키면 흰색 고체(3a)가 얻어진다.(30㎎, 4 %); ESI-MS: m/z 284.2 [M-7I]⁷⁺,592.6[M-4I]⁴⁺,832.4[M-3I]³⁺,1312.0[M-2I]²⁺.

도 10은 화합물 3a의 ESI-MS spectrum이다. 3a의 질량을 확인하였다.

다. 헵타키스{6-(4-옥틸-1H-[1,2,3]트리아졸-1-일)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린 (2b).

헵타키스-(6-아지도-6-디옥시)-β-사이클로덱스트린(0.5g, 0.38165mmol), N,N-디이소프로필에틸 아민(2.6715mmol, 0.5㎖), 1-데카인(1-Decyne)(1.2당량, 3.2mmol, 0.57㎖), 요오드화제일구리(CuI)(30㎎, 0.2mmol)를 비수화 DMF(4.0㎖)에 섞은 후 교반한다(100℃, 1h, in oil bath). TLC를 통해 반응상태를 확인한다. 구리를 제거하기 위해서 큐프리소브(CupriSorb)(2.0g)를 넣어준 후 밤새 교반시킨 후 필터 처리 한다. 로터리 증발기를 이용해 용매를 증발시킨다. 아세톤(80㎖)을 넣고 교반한다(20min). 생성된 침전물을 감압여과한 후, 아세톤으로 2번 씻은 후 건조한다. 고체(2b)가 얻어진다.(0.7121g, 0.31262mmol, 81.9%); ¹H NMR (600MHz, DMSO-d₆): δ7.59(s,1H), 6.00-6.01(d,1H), 5.91(s,1H), 5.01(s,1H), 3.94-4.15(t,2H), 3.63-3.64(d,1H), 3.29(s,1H), 3.26(s,1H), 2.21-2.24(q,2H), 1.39(s,2H), 1.17(s,10H), 0.79-0.81(t,3H).

도 11은 화합물 2b의 ¹H NMR 스펙트럼이다. 7.5ppm에서 7번 proton이 발견되었고, 0-2ppm에서 10-16번 proton이 확인됨으로서 2b물질을 확인하였다.

라. 헵타키스{6-(3-메틸-4-옥틸-1H-[1,2,3]트리아졸리움)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린 아이오다이드 (3b)

헵타키스{6-(4-옥틸-1H-[1,2,3]트리아졸-1-일)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린(0.53g, 0.25mmol), 아이오딘화메틸(Iodomethane)(2당량, 3.6mmol, 220㎕)을 DMF(1.5㎖)에 섞고 교반한다(60℃, in oil bath, 질소상태). TLC를 통해 반응 상태를 확인한다. 로터리 증발기를 이용해 용매를 증발시킨다. 아세톤(80㎖)을 넣는다. 생성된 침전물을 감압 여과한 후, 아세톤, 에테르 순으로 씻은 후 건조하여 고체(3b)를 얻는다.(0.3498g, 0.1069mmol, 42.76%); ¹H NMR (600MHz, DMSO-d₆): δ9.00(s,1H), 6.12(d,1H), 6.01(s,1H), 5.15-5.16(d,1H), 5.08(s,1H), 4.51-4.52(d,1H), 4.31(s,3H), 4.23-4.24(d,1H), 3.70-3.72(t,1H), 3.40-3.45(m,1H), 3.34(s,1H), 2.88(s,2H), 1.96-1.57(m,2H), 1.33(s,1H), 1.23-1.26(m,8H), 0.84-0.85(t,3H); ¹³C NMR (850MHz, DMSO-d₆): δ143.69, 130.18, 101.75, 101.75, 81.68, 72.21, 71.59, 68.64, 52.88, 37.85, 31.31, 28.70, 28.52, 26.55, 22.43, 22.11, 13.94; ESI-MS: m/z 340.22[M-7I]⁷⁺, 690.57[M-4I]⁴⁺, 963.06[M-3I]³⁺.

도 12는 화합물 3b의 ¹H NMR 스펙트럼이다. 7.5ppm에서 7번 proton이 발견되었고, 0-2ppm에서 10-16번 proton이 확인됨으로서 3b물질을 확인하였다.

도 13은 화합물 3b의 ¹³C NMR spectrum이다. 카본의 개수가 3b와 일치하여 합성된 것을 확인하였다.

도 14는 화합물 3b의 ESI-MS spectrum이다. 3b의 질량을 확인하였다.

2. 리포좀의 제조 실험.

헵타키스{6-(3-메틸-4-옥틸-1H-[1,2,3]트리아졸리움)-6-디옥시}-β-사이클로덱스트린 아이오다이드 (3b)(4㎎, 0.00012mmol)을 메탄올(4㎖)에 녹인다. 로터리 증발기를 이용해 용매를 증발시킨다. 1X PBS Buffer(2㎖)를 넣은 후 20분간 방치한다. 이후 40℃로 가열하면서 30분간 초음파로 혼합한다.

도 15는 화합물 3b 관련하여 익스트루더 사용 전(a)과 사용 후(b) 나노입자 운반체 형성과 관련된 Dynamic Light Scattering의 측정 결과이다. (b)에서 268.8㎚에서의 피크를 확인 할 수 있다.

도 16은 Uranyl acetate로 염색된 투과 전자 현미경(Scale bar : 100㎚) 사진이다. 구형의 입자가 형성된 것을 알 수 있다.

3. 약물 담지 실험.

도 17은 본원 발명의 일 실시예에 따른 리포좀에 독소루비신 약물을 담지한 후 젤 필터레이션 후 형광을 측정한 결과이다.

도 18은 본원 발명의 일 실시예에 따른 리포좀에 독소루비신 약물을 담지한 후 발색된 결과를 보여준다.

이상과 같이 본원 발명에 따른 CD를 이용한 리포좀을 소수성 물질에 대한 약물전달 시스템으로 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims

삭제
하기 화학식 2의 사이클로덱스트린 유도체;

(2)
여기서 n은 1 내지 10의 자연수,
m은 6 내지 10의 자연수,
X는 각각 독립적으로 N, O, S, C 중 하나로 치환될 수 있으며, 그에 따른 밸런스를 맞추기 위해서 X를 포함하는 고리형 작용기의 이중 결합의 유무 또는 위치가 결정된다.
청구항 2에 있어서,
n은 2 또는 6,
m은 7,
X는 N인 사이클로덱스트린 유도체.
삭제
하기 화학식 4의 사이클로덱스트린 유도체;

(4)
여기서 n은 1 내지 10의 자연수,
m은 6 내지 10의 자연수,
R₁은 F, Cl, Br, I 중의 하나,
X는 각각 독립적으로 N, O, S 중 하나로 치환될 수 있으며, 그에 따른 밸런스를 맞추기 위해서 X를 포함하는 고리형 작용기의 이중 결합의 유무 또는 위치가 결정된다.
청구항 5에 있어서,
n은 2 또는 6,
m은 7,
X는 N,
R₁은 I인 사이클로덱스트린 유도체.
청구항 2, 3, 5, 6항 중 어느 한 항에 따른 사이클로덱스트린 유도체를 하기의 단계에 따라 제조하는 방법;
1) 아지도 베타-사이클로덱스트린과 삼중 결합을 가진 알킬 그룹과 클릭 반응에 의해 Ar이 부가된 사이클로덱스트린을 제조하는 단계;이며 필요에 따라서
2) 상기 1) 단계의 화합물에 R₁-CH₃를 알킬레이션 반응에 의해서 양이온 사이클로덱스트린으로 변환하는 단계를 부가하는 단계를 포함한다.
청구항 5 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 사이클로덱스트린 유도체를 이용하여 제조한 리포좀.
청구항 8에 따른 리포좀에 약학적으로 활성이 있는 화합물을 담지시킨 조성물.