KR101963502B1 - Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof - Google Patents

Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof Download PDF

Info

Publication number
KR101963502B1
KR101963502B1 KR1020170072443A KR20170072443A KR101963502B1 KR 101963502 B1 KR101963502 B1 KR 101963502B1 KR 1020170072443 A KR1020170072443 A KR 1020170072443A KR 20170072443 A KR20170072443 A KR 20170072443A KR 101963502 B1 KR101963502 B1 KR 101963502B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
val
glu
gly
thr
Prior art date
Application number
KR1020170072443A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20180134568A (en
Inventor
권영은
김다희
전현진
Original Assignee
동국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동국대학교 산학협력단 filed Critical 동국대학교 산학협력단
Priority to KR1020170072443A priority Critical patent/KR101963502B1/en
Publication of KR20180134568A publication Critical patent/KR20180134568A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101963502B1 publication Critical patent/KR101963502B1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명의 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법은 살아있는 세포 내에서 형광 신호의 위치 변화를 통해 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 실시간으로 관찰하여 외부자극 또는 생체신호에 대한 세포의 반응을 검출할 수 있기 때문에 위양성 신호가 매우 적다. 보다 구체적으로, 샘플 확보로부터 결과를 얻는데 걸리는 시간이 수 분 내지 수 시간으로 매우 짧은 검출 반응을 나타내며, 매우 향상된 검출 민감도를 지니고 있고, 실제 감염성이 있거나 세포 독성을 지니고 있는 미생물을 선택적으로 검출해 낼 수 있다. 또한, 미지의 물질을 검출할 수 있어, 신변종 바이러스, 박테리아, 또는 독성 기작이 알려지지 않은 독소에 적용이 가능하여 다종의 생체 위해 물질의 검출에 활용될 수 있으며, 그 위해성 또는 작용 기작이 알려지지 않은 새로운 병원균의 검출에도 널리 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 및/또는 생체신호물질 센싱 방법은 환경 모니터링, 식품 내 병원균 검출, 생화학적 무기 검출, 의약품 개발, 및/또는 각종 질병의 진단 등의 다양한 분야에 응용될 것으로 기대된다.The method for sensing an external stimulus material or a biological signal material in a living cell of the present invention is a method for sensing the intensity of an external stimulus or a change in a biological signal in real time through a change in the position of a fluorescent signal in a living cell, Because the reaction of the cells can be detected, the false positive signal is very small. More specifically, the time taken to obtain results from sample acquisition is very short, ranging from a few minutes to a few hours, and it is possible to selectively detect microorganisms that have very improved detection sensitivity and are actually infectious or cytotoxic . In addition, it is possible to detect an unknown substance, and thus it can be applied to a toxin which does not reveal a human vivarium virus, bacteria, or toxic mechanism, and thus can be used for detection of various kinds of living materials. It can be widely used for the detection of new pathogens. Accordingly, the method for sensing external stimuli and / or biological signal substances in living cells according to the present invention is applicable to various fields such as environmental monitoring, detection of pathogens in foods, detection of biochemical weapons, development of medicines, and / Is expected to be applied to.

Description

살아있는 세포 기반 바이오센서 및 이를 이용한 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법{Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a living cell-based biosensor and a method of sensing external stimuli or bio-signal molecules using the same,

본 발명은 라이브 세포 기반 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to a live cell-based biosensor, and more particularly, to a method for sensing an external stimulus material or a biological signal substance in living cells and a biosensor using the same.

바이오센서(Biosensor)는 주로 단백질, DNA, 및 저분자 물질과 같은 생물학적 분자를 검출하고 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 분자 센서로서, 바이오센서는 생물학의 기초 연구뿐만 아니라 의료 및 환경 검사를 포함한 다양한 응용 분야에서 활용되고 있다. 이러한 바이오센서의 활용을 극대화하기 위해서는 응답 속도가 빠르고, 민감도 및 선택성이 향상된 바이오센서의 개발이 필요한 상황이며, 따라서 적절한 시험관 내 및/또는 생체 내 센싱 플랫폼을 개발하기 위해, 칩(chip), 미생물, 살아있는 세포(living cells) 또는 동물과 같은 다양한 플랫폼을 이용한 바이오센서 개발이 진행중이다. 이 중에서 살아있는 세포를 이용한 바이오센서는 보다 생물학적으로 관련성이 높은 정보를 제공할 수 있고, 값싸고 지속가능한 플랫폼이기 때문에 그 활용 가능성이 매우 높다.Biosensors are molecular sensors that can detect biological molecules such as proteins, DNAs, and low molecular substances and monitor interactions. Biosensors are used for basic research in biology as well as for various applications including medical and environmental examinations . In order to maximize the utilization of such a biosensor, it is necessary to develop a biosensor having a high response speed and improved sensitivity and selectivity. Therefore, in order to develop an appropriate in vitro and / or in vivo sensing platform, Biosensors using various platforms such as living cells or animals are under development. Among them, biosensors using living cells can provide more biologically relevant information and are very cheap and sustainable platforms, so that they are very useful.

한편, 센서는 대개 표적 인식 장치, 판독 가능한 출력으로 자극을 변화시키는 변환기 및 기계 신호 증폭 또는 처리 시스템으로 구성되며, 바이오센서는 보통 분자 센서(molecular sensors), 세포 센서(cellular sensors) 및 조직 센서(tissue sensors)와 같은 표적 인식 장치(target-recognition units)의 구성에 따라 분류된다. 상기 분자 센서는 종종 단백질 및 DNA와 같은 정제된 생체 분자를 인식 단위로 사용하여 높은 특이성으로 시험관 내에서 표적 분자를 검출할 수 있고, 세포 센서 및 조직 센서는 생체 분자 등 다양한 생물 분자가 공존하는 환경에서 표적 분자를 검출하고 기능 및 상호 작용을 모니터링 할 수 있다.Sensors, on the other hand, usually consist of a target recognition device, a transducer that changes the stimulus to a readable output, and a mechanical signal amplification or processing system. Biosensors are typically molecular sensors, cellular sensors and tissue sensors tissue sensors). < / RTI > The molecular sensor can detect target molecules in a test tube with high specificity by using purified biomolecules such as protein and DNA as a recognition unit. The cell sensor and the tissue sensor can detect the environment in which various biomolecules such as biomolecules coexist To detect the target molecule and to monitor its function and interaction.

이러한 세포 기반 센서 중에서 라이브 세포 기반 바이오센서는 살아있는 세포를 기존의 소재에 마이크로 제조기법을 적용하여 만든 복합 장치 시스템으로, 세포 기반 센서는 외부 물질을 감지하고 세포 내에서 수용체/리간드 결합반응에 의해 신호 전달 캐스케이드 과정을 거친다. 상기 과정을 통해 증폭된 유전자 발현이나 세포막 전위변화, 단백질 분비 등의 세포 반응이 발현됨으로써 감지한 외부 물질에 대한 측정 가능한 신호가 나타나기 때문에, 라이브 세포 기반 바이오센서는 바이러스나 박테리아와 같은 미생물이나 물리적 자극, 독소 및 생체물질 또는 미확인 물질에 대해 특이적이며 높은 민감도를 가지게 되어, 기존 동물 실험을 대체한 제약 산업 관련 분야의 비용 절감 및 윤리적 측면에서 바람직한 대안이 되고 있다.Among these cell-based sensors, a live cell-based biosensor is a complex device system made by applying a micro-fabrication technique to a living cell to a living cell. A cell-based sensor senses an external substance and detects a signal by a receptor / ligand- Passing cascade process. Since the cell response such as amplified gene expression, cell membrane potential change and protein secretion is expressed through the above process, a measurable signal for the foreign substance detected is displayed. Therefore, the live cell-based biosensor can be used for detecting microorganisms such as viruses and bacteria, , Toxins and biomaterials, or unidentified substances, which have become a desirable alternative in terms of cost reduction and ethics in the field of the pharmaceutical industry that replaces existing animal experiments.

이 중에서, 생체 내(in vivo) 외부자극물질 또는 생체신호물질을 검출 또는 센싱하는 기술은 대부분 포유세포에 형광 단백질을 도입하여 유전적으로 조절된 단백질을 활용하고 있다. 이 때 사용되는 분석법은 형광 공명 에너지 전이, 이분자 형광 상보법, 발광효소 분석법, 또는 순환 치환 형광 단백질을 이용하며, 이는 형광 파장의 변화 및/또는 형광 신호의 활성화/비활성화를 외부에서 검출 가능한 신호로 변환하여 판별할 수 있도록 한다.Among them, techniques for detecting or sensing external stimulating substances or biological signal substances in vivo mostly utilize genetically regulated proteins by introducing fluorescent proteins into mammalian cells. In this case, fluorescence resonance energy transfer, bifunctional fluorescence complement method, luminescence enzyme analysis method, or circulating substitution fluorescent protein is used. This is an externally detectable signal of fluorescence wavelength change and / or activation / deactivation of fluorescence signal So that it can be discriminated by conversion.

보다 구체적으로, 형광 공명 에너지 전이(FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer)는 주게(Donor) 및 받게(Acceptor) 형광을 각각 포함하는 두 타겟 단백질이 결합하였을 때 발생하는 형광 파장이 변화하는 점을 이용한 측정 방법이다. 적절하게 최적화된 FRET 시스템은 신뢰성 있는 정보를 제공할 수 있으나, 대부분 최적화에 많은 노력과 시간이 필요하며 성공률이 낮고, 또한 단백질의 농도가 높은 경우 위양성(false positive) 결과를 내는 문제점이 있다.More specifically, the fluorescence resonance energy transfer (FRET) is a measurement method using a point at which a fluorescence wavelength generated when two target proteins each containing a donor and an acceptor fluorescence are bonded to each other to be. Properly optimized FRET systems can provide reliable information, but most require much effort and time to optimize, have a low success rate, and have a false positive result when the protein concentration is high.

또한, 이분자 형광 상보법(BiFC: Bimolecular Fluorescence Complementation)은 단백질 상호작용을 분석에 있어 FRET의 단점을 보완할 수 있는 기법으로, 형광 단백질을 N 말단 및 C 말단 절편으로 나눈 후, 상호작용을 알아보고자 하는 두 단백질 뒤에 각각 발현되게 한 후, 두 단백질이 반응을 하기 위해 가까워졌을 때. 형광 단백질의 두 절편이 다시 형광 단백질로 재구성되어 나타나는 형광 신호를 분석하는 기법이다. 이는 FRET과 마찬가지로 최적화가 어렵고 분할된 형광 단백질 절편간의 친화작용에 의해 종종 위양성 또는 높은 백그라운드 신호가 검출되는 제약이 있다.In addition, BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) is a technique that can complement the disadvantages of FRET in analyzing protein interactions. It divides fluorescence proteins into N-terminal and C-terminal fragments and then examines the interaction. After each of the two proteins is expressed, the two proteins are approached to react. It is a technique to analyze the fluorescence signal in which two fragments of the fluorescent protein are reconstructed again with the fluorescent protein. As with FRET, it is difficult to optimize and the affinity between segmented fluorescent protein fragments often limits the detection of false or high background signals.

또한, 발광효소 분석법(Luciferase assay, reporter gene assay)은 발광 효소(Luciferase)를 이용하여, 관심 유전자 발현 유무를 측정하는 실험 방법으로서 특정 유전자의 promotor 혹은 조절인자를 클로닝을 통해 제작하고, 유효 화합물의 처리에 따른 promotor의 활성변화에 의해 전사-번역된 효소의 활성을 확인하는 방법이다.The luciferase assay (reporter gene assay) is an experimental method for measuring the presence or absence of a gene of interest by using a luciferase. The promoter or regulator of a specific gene is cloned to prepare an effective compound And the activity of the transcription-translated enzyme is confirmed by the change of the activity of the promotor according to the treatment.

또한, 최근 사용되고 있는 순환 치환 형광 단백질(cpFP: circularly permuted fluorescent protein) 기법은 형광 단백질(FP) 사이에 센싱 도메인으로 작용하는 지지체 단백질들이 융합되는 방법으로, 타겟이 인식되면 센싱 도메인은 FP (또는 cpFP)의 구조적 변화를 야기하고, 형광 강도의 변화를 일으켜, 이를 검출하는 기법이다.Recently, a circularly permutated fluorescent protein (cpFP) technique is a method in which scaffold proteins functioning as a sensing domain are fused between fluorescent proteins (FPs). When a target is recognized, the sensing domain is FP (or cpFP ), Causing a change in the fluorescence intensity and detecting the fluorescence intensity.

다만, 현재 활용되는 분자분석 및/또는 면역분석에 기반한 센싱 시스템의 경우, 상기와 같은 위양성, 단백질 구조의 복잡성이나 단백질 변형의 문제로 인하여 새롭게 나타나는 병원균이나 유전적 특성이 변이된 미생물의 검출에 있어서 어려움이 있으며, 또한 그 영향이 밝혀지지 않은 알러젠 등의 검출에 활용하는데 제약이 있다.(한국 등록 특허: 10-1280014) 따라서 본 발명은 살아있는 세포 내에서 외부자극물질 또는 생체신호물질을 센싱하여 실시간 및 정량적으로 측정할 수 있는 세포 기반 바이오센싱 시스템을 구축하였다.However, in the case of a sensing system based on currently used molecular analysis and / or immunoassay, in the detection of newly emerging pathogens or mutated microorganisms due to the problem of complexity or protein modification of the protein structure, (Korean Patent No. 10-1280014). Accordingly, the present invention provides a method for detecting an external stimulating substance or a biological signal substance in a living cell, And a cell-based biosensing system that can measure quantitatively.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 또는 생체신호물질을 실시간 및 정량적으로 측정할 수 있는 세포 기반 바이오센싱 시스템을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a cell-based biosensing system capable of measuring an external stimulus material or a biological signal material in living cells in real time and quantitatively, Thereby completing the present invention.

이에, 본 발명의 목적은 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법으로서, (1) 제1 타겟단백질, 효소, 및 제1 신호펩티드로 구성된 제1 접합체; 제2 타겟단백질, 효소, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계; (2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for sensing an external stimulating substance or biological signal substance in a living cell, which comprises: (1) a first conjugate composed of a first target protein, an enzyme, and a first signal peptide; A second conjugate consisting of a second target protein, an enzyme, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells; (2) measuring a change in fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And (3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescent signal is detected in the living cell, will be.

또한, 본 발명의 다른 목적은 (1) 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계; (2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is also (1) a method for producing a recombinant vector comprising (1) a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; A second conjugate consisting of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells; (2) measuring a change in fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And (3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescent signal is detected in the living cell, will be.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 제1 타겟단백질, 효소, 및 제1 신호펩티드로 구성된 제1 접합체; 및 제2 타겟단백질, 효소, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for detecting a signal peptide comprising: a first conjugate consisting of a first target protein, an enzyme, and a first signal peptide; And a second conjugate composed of a second target protein, an enzyme, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide, wherein the second conjugate is a living biomolecule Sensor.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 및 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for producing a target protein, comprising: a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; And a second conjugate composed of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide. Sensor.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법으로서,(1) 제1 타겟단백질, 효소, 및 제1 신호펩티드로 구성된 제1 접합체; 제2 타겟단백질, 효소, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계; (2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 제공한다. In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for sensing an external stimulating substance or biological signal substance in a living cell, the method comprising: (1) a first conjugate consisting of a first target protein, an enzyme, and a first signal peptide; A second conjugate consisting of a second target protein, an enzyme, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells; (2) measuring a change in fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And (3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescence signal is detected in the living cell, .

또한 본 발명은, (1) 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계; (2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 제공한다. (1) a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; A second conjugate consisting of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells; (2) measuring a change in fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And (3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescence signal is detected in the living cell, .

본 발명의 일 구현예로서, 상기 단계 (3)에서, 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출되는 경우, 외부자극의 강도 또는 생체신호물질의 농도가 증가한 것으로 판정하는 것을 특징으로 한다. According to an embodiment of the present invention, in the step (3), when the change of the fluorescent signal is detected in the living cell, it is determined that the intensity of the external stimulus or the concentration of the biological signal substance is increased.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 형광 신호의 변화는 상기 제1 및 2 신호펩티드가 활성화되어, 상기 형광단백질이 상기 살아있는 세포 내 특정 위치로 이동하는 위치 변화에 의해 일어나는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the change in the fluorescence signal is caused by a change in position of the first and second signal peptides being activated and moving the fluorescent protein to a specific position in the living cell.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 효소는 스플릿 인틴 단백질(split-intein protein) 또는 인틴 단백질(intein protein)인 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the enzyme is a split-intein protein or an intein protein.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 스플릿 인틴 단백질 또는 인틴 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 19으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the split intestine protein or the intestine protein comprises any one of the amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 형광단백질은 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 청록색형광단백질(Cyan fluorescent protein, CFP), 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 주황색형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 또는 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP)인 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the fluorescent protein is selected from the group consisting of a blue fluorescent protein (BFP), a cyan fluorescent protein (CFP), a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein a yellow fluorescent protein (YFP), an orange fluorescent protein (OFP), or a red fluorescent protein (RFP).

또한, 본 발명은 제1 타겟단백질, 효소, 및 제1 신호펩티드로 구성된 제1 접합체; 및 제2 타겟단백질, 효소, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체;를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit comprising a first conjugate consisting of a first target protein, an enzyme, and a first signal peptide; And a second conjugate composed of a second target protein, an enzyme, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide, and a biosensor for sensing an external stimulating substance or a living body signal substance in living cells do.

또한, 본 발명은 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 및 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체;를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서를 제공한다. Also, the present invention provides a method for producing a target protein, comprising: a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; And a second conjugate composed of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide, and a biosensor for sensing an external stimulating substance or a living body signal substance in living cells do.

또한, 본 발명은 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 이용한 키트를 제공한다.Also, the present invention provides a kit using an external stimulating substance in living cells or a biological signal substance sensing method.

본 발명의 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법은 살아있는 세포 내에서 형광 신호의 위치 변화를 통해 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 실시간으로 관찰하여 외부자극 또는 생체신호에 대한 세포의 반응을 검출할 수 있기 때문에 위양성 신호가 매우 적다. 보다 구체적으로, 샘플 확보로부터 결과를 얻는데 걸리는 시간이 수 분 내지 수 시간으로 매우 짧은 검출 반응을 나타내며, 매우 향상된 검출 민감도를 지니고 있고, 실제 감염성이 있거나 세포 독성을 지니고 있는 미생물을 선택적으로 검출해 낼 수 있다. 또한, 미지의 물질을 검출할 수 있어, 신변종 바이러스, 박테리아, 또는 독성 기작이 알려지지 않은 독소에 적용이 가능하여 다종의 생체 위해 물질의 검출에 활용될 수 있으며, 그 위해성 또는 작용 기작이 알려지지 않은 새로운 병원균의 검출에도 널리 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 및/또는 생체신호물질 센싱 방법은 환경 모니터링, 식품 내 병원균 검출, 생화학적 무기 검출, 의약품 개발, 및/또는 각종 질병의 진단 등의 다양한 분야에 응용될 것으로 기대된다.The method for sensing an external stimulus material or a biological signal material in a living cell of the present invention is a method for sensing the intensity of an external stimulus or a change in a biological signal in real time through a change in the position of a fluorescent signal in a living cell, Because the reaction of the cells can be detected, the false positive signal is very small. More specifically, the time taken to obtain results from sample acquisition is very short, ranging from a few minutes to a few hours, and it is possible to selectively detect microorganisms that have very improved detection sensitivity and are actually infectious or cytotoxic . In addition, it is possible to detect an unknown substance, and thus it can be applied to a toxin which does not reveal a human vivarium virus, bacteria, or toxic mechanism, and thus can be used for detection of various kinds of living materials. It can be widely used for the detection of new pathogens. Accordingly, the method for sensing external stimuli and / or biological signal substances in living cells according to the present invention is applicable to various fields such as environmental monitoring, detection of pathogens in foods, detection of biochemical weapons, development of medicines, and / Is expected to be applied to.

도 1a는 라이브 세포 기반 바이오 센서의 구성간에 접합 반응을 이용한 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 라이브 세포 기반 바이오 센서의 구성간에 절단 반응을 이용한 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 FKBP와 FRB로 유도된 상호작용을 이용한 RAP 센싱 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 라이브 세포 기반 바이오센서를 이용하여 라파마이신 검출한 결과이다.
도 3a는 CaM와 CaMBD로 유도된 상호작용을 이용한 Ca2 +의 센싱 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 라이브 세포 기반 바이오센서를 이용하여 칼슘이온을 검출한 결과이다.
도 4a는 GR로 유도된 상호작용을 이용한 glucocorticoid의 센싱 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명의 라이브 세포 기반 바이오센서를 이용하여 당질코르티코이드를 검출한 결과이다.FIG. 1A is a conceptual schematic diagram of a method for sensing an external stimulus material or a biological signal substance in a living cell using a junction reaction between constitutions of a live cell-based biosensor.
FIG. 1B is a conceptual diagram of a method for sensing an external stimulus material or a biological signal substance in a living cell using a cleavage reaction between constitutions of a live cell-based biosensor.
2A is a conceptual schematic diagram of a RAP sensing method using FKBP and FRB-induced interactions.
FIG. 2B shows the result of detection of rapamycin using the live cell-based biosensor of the present invention.
Figure 3a illustrates a conceptual schematic diagram of the sensing of the Ca 2 + method using the interaction leading to CaM and CaMBD.
FIG. 3B shows the result of detection of calcium ions using the live cell-based biosensor of the present invention.
Figure 4a is a conceptual schematic diagram of a method for sensing glucocorticoid using GR-induced interactions.
FIG. 4B shows the result of detection of glucocorticoid using the live cell-based biosensor of the present invention.

본 발명자들은 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질 또는 생체신호물질을 실시간 및 정량적으로 측정할 수 있는 세포 기반 바이오센싱 시스템을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have identified a cell-based biosensing system capable of real-time and quantitatively measuring external stimulants or biological signal substances in living cells, and have completed the present invention based on the findings.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법으로서, (1) 제1 타겟단백질, 효소, 및 제1 신호펩티드로 구성된 제1 접합체; 제2 타겟단백질, 효소, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계; (2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호 또는 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 형광 신호 또는 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for sensing an external stimulating substance or biological signal substance in living cells, comprising the steps of: (1) a first conjugate consisting of a first target protein, an enzyme, and a first signal peptide; A second conjugate consisting of a second target protein, an enzyme, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells; (2) measuring a change in fluorescence signal or fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And (3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescence signal or the fluorescence signal is detected in the living cell, wherein the external stimulating substance or the biological signal substance sensing method .

본 발명의 상기 (1) 단계의 구성에 의해, 상기 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법은 상기 신호펩티드들의 접합 반응에 의해 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정할 수 있다.According to the construction of the step (1) of the present invention, the living cell intracellular external stimulating substance or biological signal substance sensing method can determine the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal by the bonding reaction of the signal peptides.

또한, 본 발명은 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법으로서, (1) 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계; (2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호 또는 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 형광 신호 또는 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 제공하는 것이다.Also, the present invention provides a method for sensing an intracellular external stimulating substance or a biological signal substance, comprising: (1) a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; A second conjugate consisting of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells; (2) measuring a change in fluorescence signal or fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And (3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescence signal or the fluorescence signal is detected in the living cell, wherein the external stimulating substance or the biological signal substance sensing method .

본 발명의 상기 (1) 단계의 구성에 의해, 상기 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법은 상기 제2 접합체의 특정 부위가 효소에 의해 절단되어 활성화 되는 반응에 의해 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제2 접합체는 상기 제1 신호펩티드, 상기 제2 신호펩티드, 상기 제1 신호펩티드 및 상기 제2 신호펩티드에 부착되어 각각의 펩티드를 연결하는 효소, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성되어 있다. 이 때, 상기 효소와 제1 접합체를 구성하는 효소의 상호작용이 있기 전에는 제1 신호펩티드만 활성화되어 제1 신호펩티드에 의해 제2 접합체는 세포의 핵 내부로 이동할 수 있으며, 상기 효소들의 상호작용 이후에는 상기 제2 접합체의 특정 부위 절단에 의해 제2 신호펩티드가 활성화되어 상기 형광단백질과 결합한 제2 신호펩티드가 세포막으로 이동할 수 있다(도 1 참조). 상기에 따라, 효소의 상호작용 전후로 형광 신호가 검출되는 세포 내의 위치는 제1 및 제2 신호펩티드에 의해 결정되며, 세포막 및 핵 내부 뿐만 아니라 제1 및 제2 신호펩티드의 종류에 따라 다양할 수 있다.According to the structure of the step (1) of the present invention, the living cell intracellular external stimulating substance or biological signal substance sensing method is characterized in that a specific region of the second conjugate is cleaved by an enzyme and activated, It is possible to determine a change in the biological signal. More specifically, the second conjugate comprises an enzyme that is attached to the first signal peptide, the second signal peptide, the first signal peptide, and the second signal peptide to link each of the peptides and the second signal peptide It is composed of attached fluorescent protein. At this time, only the first signal peptide is activated so that the second conjugate can move into the nucleus of the cell by the first signal peptide before the interaction between the enzyme and the enzyme constituting the first conjugate, Thereafter, the second signal peptide is activated by cleavage of a specific site of the second conjugate, and the second signal peptide bound to the fluorescent protein can be transferred to the cell membrane (see FIG. 1). According to the above, the position in the cell where the fluorescent signal is detected before and after the interaction of the enzyme is determined by the first and second signal peptides, and may be varied depending on the type of the first and second signal peptides as well as inside the cell membrane and nucleus have.

이 때, 본 발명의 상기 단계 (3)에서, 상기 형광 신호 또는 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출되는 경우, 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화가 높은 것으로 판정할 수 있다.At this time, in the step (3) of the present invention, when the change of the fluorescence signal or the fluorescence signal is detected in the living cell, it can be judged that the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal is high.

본 발명에서, 상기 형광 신호 또는 형광 신호의 변화는 상기 외부자극물질 또는 생체신호물질에 따른 상기 제1 타겟단백질 및 제2 타겟단백질의 상호작용에 의해 일어날 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 상호작용은 하기의 단계에 의해 이루어질 수 있다. (a) 상기 외부자극물질 또는 생체신호물질이 상기 제1 및/또는 2 타겟단백질과 결합하는 단계; (b) 상기 제1 및/또는 2 신호펩티드의 결합 또는 분리에 의해 상기 신호펩티드가 활성화 되는 단계; 및 (c) 상기 신호펩티드가 활성화 됨에 따라, 상기 신호펩티드에 의해 상기 형광단백질이 세포 내 특정 위치로 이동하는 단계.In the present invention, the change of the fluorescence signal or the fluorescence signal may be caused by the interaction of the first target protein and the second target protein according to the external stimulus material or the biological signal substance. More specifically, the interaction may be accomplished by the following steps. (a) combining the external stimulus material or the biological signaling material with the first and / or second target protein; (b) activating said signal peptide by binding or separation of said first and / or second signal peptide; And (c) moving the fluorescent protein to a specific location in the cell by the signal peptide as the signal peptide is activated.

또한, 본 발명에서 상기 생체신호물질은 세포 내 신호전달물질(intracellular messenger)일 수 있으며, 자극에 대한 최종효과로의 신호전달에 관여하는 저분자량의 화학물질로서, 보다 구체적으로, 칼슘, cAMP, 호르몬 또는 이노시톨 1,4,5-트리스인산 등 단백질-단백질의 상호작용, 단백질 인산화효소에 의한 단계적 인산화 등과 같이 세포 내 신호전달계에 관여하는 물질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the present invention, the bio-signal material may be an intracellular messenger, and is a low molecular weight chemical substance involved in signal transmission to a final effect on stimulation. More specifically, calcium, cAMP, Refers to a substance involved in an intracellular signal transduction system, such as, but not limited to, the interaction of a protein-protein such as a hormone or inositol 1,4,5-trisphosphate, or step phosphorylation by a protein kinase.

또한, 본 발명에서 상기 형광 신호 또는 형광 신호의 변화는 상기 제1 및/또는 2 신호펩티드가 활성화되어, 상기 형광단백질이 상기 살아있는 세포 내 특정 위치로 이동하는 위치 변화에 의해 일어날 수 있다.In the present invention, the change of the fluorescence signal or the fluorescence signal may be caused by a change in position of the first and / or second signal peptide activated and the fluorescent protein moving to a specific position in the living cell.

본 발명에서, 상기 타겟단백질 및 상기 신호펩티드는 상기 효소에 의해 연결될 수 있으며, 이 때, 상기 타겟단백질은 외부자극물질 또는 생체신호물질에 의해 활성화될 수 있다. 상기 신호펩티드는 상기 효소 간의 상호작용에 의해서 접합체들이 특이적 접합 반응 또는 끊어짐 반응, 보다 구체적으로, 절단 반응이 일어나 활성화 될 수 있다.In the present invention, the target protein and the signal peptide may be connected by the enzyme, and the target protein may be activated by an external stimulating substance or a biological signal substance. The signal peptide can be activated by the interaction between the enzymes, whereby the conjugates undergo a specific binding reaction or a cleavage reaction, more specifically a cleavage reaction.

본 발명에서, 상기 효소는 스플릿 인틴 단백질(split-intein protein) 또는 인틴 단백질(intein protein)일 수 있다. 또한, 상기 스플릿 인틴 단백질 또는 인틴 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 19으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 스플릿 인틴 단백질 또는 인틴 단백질은 자가 촉매 반응 또는 단백질 접합 반응을 일으킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the enzyme may be a split-intein protein or an intein protein. In addition, the split intestine protein or the intestine protein may be any amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19, but is not limited thereto. In addition, the split intestine protein or the intestine protein may cause an autocatalytic reaction or a protein conjugation reaction, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 용어, “인틴(intein)”은 진핵세포 RNA의 인트론에 대응하는 단백질로, 진핵 세포, 원핵세포, 및 고세균에서 발견되며, 상기 단백질 접합 반응은 인틴을 가진 단백질이 겪는 자발적 반응으로서, 단백질의 접힘 과정 이후에 인틴의 N- 및 C-말단에 인접한 엑스틴 (인틴이 분리된 후 잔류하는 성숙한 단백질)의 펩티드 결합의 절단과 접합 과정을 통해, 인틴과 N- 및 C-엑스틴이 펩티드 결합으로 결합된 성숙한 두 개의 단백질이 분리 생성되는 과정을 말한다. 보다 구체적으로, 인틴의 일반적인 단백질 접합 반응은 4 단계 과정으로 일어나며, 첫 번째 단계에서 인틴과 N-엑스틴 사이의 펩티드 결합이 인틴의 N-말단에 존재하는 시스틴 또는 세린 잔기의 친핵성 공격을 받아 황화에스테르 또는 에스테르 전환이 일어난다. 그 후, 에스테르 교환 반응을 통하여 N-엑스틴이 N-인틴의 첫 번째 잔기에서 C-인틴 (주로 시스틴, 세린, 또는 트레오닌) 의 첫 번째 잔기로 이동한다. 이 과정에서 N- 및 C-엑스틴과 인틴의 C-말단이 결합된 형태가 되며 N-엑스틴이 에스테르 결합을 통해 곁가지를 형성하게 된다. 그 후, N-엑스틴과 C-엑스틴을 연결하는 에르테르 작용기가 인틴의 G 모티프의 보존 서열인 아스파라진 잔기의 고리화에 의해 끊어지며, 엑스틴 간의 에르테르 결합이 유지된 형태로 인틴과 분리되며, 분리된 인틴의 C-말단에는 아미노 숙신이미드가 형성된다. 마지막 단계에서 N- 및 C-엑스틴을 연결하고 있는 에스테르 결합은 O-N 또는 S-N 아실 재배열을 통하여 본래의 펩티드 결합이 형성되며, 인틴의 C-말단에 형성된 아미노 숙신이미드는 자발적인 수화를 통해 일반적인 단백질의 C-말단 형태로 돌아가 온전한 형태의 두 개의 단백질로 분리된다. 인틴의 단백질 접합은 하나의 미성숙 단백질에서 일어나는 시스 접합 반응 외에 두 개의 미성숙 단백질 사이에서 일어나는 트랜스 접합 반응으로 구분된다. 트랜스 접합 반응이 일어나는 인틴은 자연적으로 존재하기도 하지만, 큰 인틴에서 단백질 접합 반응과 관련되지 않은 DOD 도메인을 제거하는 방법 또는 미니 인틴의 연결 영역을 절단하는 단백질 공학적 기법을 통하여 인공적으로 제작되기도 한다. 뿐만 아니라 펩티드 결합을 인틴의 양 말단이 아닌 한쪽에서만 일어나도록 변형한 것 또한 존재한다.As used herein, the term " intein " is a protein corresponding to the intron of eukaryotic RNA, found in eukaryotes, prokaryotes, and archaea, and the protein binding reaction is a spontaneous response Through the cleavage of the peptide bond of the extin (a mature protein remaining after the cleavage of the intestine) adjacent to the N- and C-termini of the intein after the protein folding process, Tin is a process in which two mature proteins bound by a peptide bond are separated and produced. More specifically, the general protein-binding reaction of intestine occurs in a four-step process in which the peptide bond between the intestine and the N-xtin is subjected to a nucleophilic attack of the cystine or serine residue present at the N- Sulfide ester or ester conversion occurs. After the transesterification, N-xylotin is then transferred to the first residue of C-lysine (mainly cystine, serine, or threonine) at the first residue of the N-intestine. In this process, the C-terminus of N-and C-x-tine and the intestine is combined and the N-x-tine forms a side branch through ester bond. Thereafter, the erter functional group linking N-xtin and C-xtin is cleaved by the cyclization of the asparagine residue, which is the conserved sequence of the G motif of the intin, And aminosuccinimide is formed at the C-terminus of the separated intestine. In the last step, the ester bond connecting N- and C-xtin forms the original peptide bond through ON or SN acyl rearrangement, and the aminosuccinimide formed at the C-terminus of the intestine forms a common protein To the C-terminal form of the protein. Protein junctions of the proteins are separated by a trans-junction reaction that occurs between two immature proteins in addition to the covalent reaction occurring in one immature protein. Although the naturally occurring intrinsics of the trans-splicing reaction occur, they are artificially produced through protein engineering techniques that cut the DOD domain that is not associated with the protein-binding reaction in the large intestine, or cut the connecting region of miniin. In addition, there is also a modification in which peptide bonds occur only on one side of the intestine, rather than on both ends.

또한, 본 발명의 용어 “신호펩티드”는 분비단백질이나 막단백질의 N-말단 및/또는 C말단에 위치하며 단백질이 막을 통과할 때 신호가 되는 폴리펩티드로써, 대표적으로 하기 표 1에 기재된 종류를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term " signal peptide " of the present invention is a polypeptide which is located at the N-terminal and / or C-terminal of a secretory protein or membrane protein and is a signal when the protein passes through the membrane. Typically, But is not limited thereto.

TargetTarget SourceSource SequenceSequence NucleusNucleus SV-40 large T antigenSV-40 large T antigen PPKKKRKVPPKKKRKVPPKKKRKVPPKKKRKV NucleusNucleus Tat protein of HIVTat protein of HIV YGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR Endoplasmic reticulumEndoplasmic reticulum KDELA KDELA KDELA KDELKDELA KDELA KDELA KDEL MitochondriaMitochondria Cytochrome CCytochrome C SVTTPLLLRGLTGARRLPVPRAKIHSLSVTTPLLLRGLTGARRLPVPRAKIHSL peroxisomeperoxisome SKLA SKLA SKLA SKLASKLA SKLA SKLA SKLA Cell membraneCell membrane GAP-43GAP-43 MLCCMRRTKQVKNDEDQKIMLCCMRRTKQVKNDEDQKI Golgi bodyGolgi body ARF-1ARF-1 (MXXE)4(MXXE) 4 EGFREGFR EEEEYFELVEEEEYFELV NucleusNucleus AdenovirusAdenovirus CGGFSTSLRARKACGGFSTSLRARKA IntegrinIntegrin CKKKKKKGGRGDMFGCKKKKKKGGRGDMFG Phosphatidylinositol4,5-phosphate kinase(PIP5K)Phosphatidylinositol4,5-phosphate kinase (PIP5K) Rac1Rac1 CPPPVICKKRKRCPPPVICKKRKR Alpha(Ⅱb)beta(3) integrinAlpha (IIb) beta (3) integrin KVGFFKRKVGFFKR

또한, 본 발명의 상기 형광단백질은 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 청록색형광단백질(Cyan fluorescent protein, CFP), 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 주황색형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 또는 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the fluorescent protein of the present invention can be used as a fluorescent protein, such as a blue fluorescent protein (BFP), a cyan fluorescent protein (CFP), a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein YFP), an orange fluorescent protein (OFP), or a red fluorescent protein (RFP).

보다 구체적으로, 본 발명은 세포 내에서 타겟단백질의 위치 이동, 타겟단백질의 위치 변화, 또는 타겟단백질 간 상호작용 존재 여부에 따라 형광 신호의 위치를 변경시키는 신호펩티드와 결합된 타겟단백질을 디자인하여, 형광 신호를 내는 리포터 태그로서 사용될 수 있는 다양한 형광 단백질(auto fluorescent protein)을 타겟단백질에 유전자 재조합 방식을 이용해서 도입한다. 두 개의 타겟단백질 중 하나의 타겟단백질에만 형광단백질을 라벨링 시키고 두 개의 타겟단백질의 위치가 가까워지면 두 타겟단백질에 각각 접합된 효소 간의 상호작용에 의해서 특이적 접합 반응 또는 끊어짐 반응이 촉발된다. 이때 사용되는 효소는 자가 촉매 반응 또는 단백질 접합 반응을 일으키는 스플릿 인틴 단백질이다. 상기 접합 반응 결과로, 형광단백질에 세포의 특정 위치로 이동하게 하는 신호서열이 활성화되고, 상기 신호에 의해서 형광단백질이 핵, 세포막 또는 미토콘드리아 등 특정 위치로 이동하는 것을 관찰함으로써 살아있는 세포 내에서 외부자극물질 또는 생체신호물질을 검출, 센싱 및/또는 측정한다. 이때, 상기 검출, 센싱 및/또는 측정은 형광 현미경으로 수행될 수 있다.More specifically, the present invention relates to a method for designing a target protein bound to a signal peptide that changes the position of a fluorescent signal according to the positional shift of a target protein, the change of a position of a target protein, A variety of auto fluorescent proteins, which can be used as reporter tags for fluorescent signals, are introduced into the target protein using recombinant techniques. When a fluorescent protein is labeled only in one target protein of two target proteins and the position of the two target proteins becomes close to each other, a specific binding reaction or a cleavage reaction is triggered by the interaction between the enzymes bound to the two target proteins. The enzyme used here is a split -in protein that causes autocatalysis or protein-binding reaction. As a result of the junction reaction, a signal sequence for causing the fluorescent protein to move to a specific position of the cell is activated, and by observing that the fluorescent protein is moved to a specific position such as nucleus, cell membrane or mitochondria by the signal, Sensing, sensing and / or measuring a material or a biological signaling material. At this time, the detection, sensing and / or measurement can be performed with a fluorescence microscope.

또한, 외부자극물질 또는 생체신호물질에 의해서 본 발명의 상기 두 접합체의 상호작용이 일어나거나 끊어짐 현상이 유발되고, 이에 의해 상기 신호펩티드가 활성화되면 신호펩티드에 결합된 형광 태그가 세포 안의 특정위치로 이동하게 되며, 이때의 세포 내 각 위치의 형광 신호의 비를 측정함으로써 외부자극 또는 생체신호의 정도 및/또는 변화를 측정할 수 있다.In addition, the interaction between the two conjugates of the present invention occurs or is interrupted by an external stimulus material or a biosignal material, whereby when the signal peptide is activated, a fluorescent tag bound to the signal peptide binds to a specific position in the cell And the degree and / or the change of the external stimulus or the biological signal can be measured by measuring the ratio of the fluorescence signal at each position in the cell at this time.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 제1 타겟단백질, 효소, 및 제1 신호펩티드로 구성된 제1 접합체; 및 제2 타겟단백질, 효소, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체;를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서를 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a kit comprising a first conjugate consisting of a first target protein, an enzyme, and a first signal peptide; And a second conjugate composed of a second target protein, an enzyme, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide, and a biosensor for sensing an external stimulating substance or a living body signal substance in living cells do.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 및 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체;를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서를 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; And a second conjugate composed of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide, and a biosensor for sensing an external stimulating substance or a living body signal substance in living cells do.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법을 이용한 키트를 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a kit for using an external stimulating substance in living cells or a biological signal substance sensing method.

따라서, 본 발명은 살아있는 세포 내에서의 외부자극 정도 및/또는 생체신호 변화를 형광 신호의 위치 변화로 실시간 변환하고, 이를 이용하여 외부자극 및/또는 생체신호에 대한 세포의 반응을 검출, 센싱 및/또는 측정할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a method and apparatus for real-time conversion of a degree of external stimulus and / or a biological signal change in a living cell to a change in the position of a fluorescence signal and using the same to detect, / RTI >

보다 구체적으로, 본 발명의 살아있는 새포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법은 샘플 확보로부터 결과를 얻는데 걸리는 시간이 수 분 내지 수 시간으로 매우 짧은 검출 반응을 나타내며, 100 개 이하의 미생물 또는 100 ng 이하의 독성물질을 검출할 수 있어 매우 향상된 검출 민감도를 지니고 있다.More specifically, the method for sensing an external stimulus material or a biological signal substance in a live pouch of the present invention shows a very short detection reaction from several minutes to several hours to obtain a result from securing the sample, The following toxic substances can be detected and have a very improved detection sensitivity.

또한, 본 발명의 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법은 자가 복제 시스템을 통해, viable/active agent의 스크리닝이 가능하여, 실제 감염성이 있거나 세포 독성을 지니고 있는 미생물을 선택적으로 검출해 낼 수 있다. 또한, 미지의 물질을 검출 할 수 있어, 신변종 바이러스나 박테리아, 독성 기작이 알려지지 않은 독소에 적용이 가능하여 다종의 생체 위해 물질의 검출에 활용될 수 있으며, 그 위해성 또는 작용 기작이 알려지지 않은 새로운 병원균의 검출에도 널리 활용될 수 있다.In addition, the method for sensing an external stimulus material or a biological signal substance of the present invention can selectively detect viable or cytotoxic microorganisms by screening viable / active agents through a self-replicating system. In addition, it is possible to detect an unknown substance, and thus it can be applied to a toxin which is not known to a human vivarium virus, a bacterium or a toxic mechanism, and thus can be used for the detection of various kinds of biological harmful substances. It can be widely used for the detection of pathogens.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 인틴 단백질(Sce VMA intein)을 이용한 라파마이신의 검출Example 1 Detection of Rapamycin Using an Intin Protein (Sce VMA intein)

본 발명의 살아있는 세포 내에서의 외부자극물질을 실시간 및 정량적으로 측정하고자, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 인틴 단백질을 이용하여, 세포를 디자인하고, 하기와 같이 라파마이신의 검출을 확인하였다. 먼저, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 1과 2의 접합체 서열이 삽입된 재조합 유전자를 세포에 형질주입하여 48 시간 동안 배양시켜 발현과정을 거쳤다. 세포 내에서의 이합체화(dimerization)를 유도하고자, 세포를 30 ℃에서 2 시간 동안 10 nM의 라파마이신 (rapamycine; Sigma)으로 처리하였다. 2 시간 내지 3 시간 후, 37 ℃로 예열된 PBS를 이용하여, 세포를 세척하고 라파마이신 또는 이오노마이신을 각각 제거하였다. 세포의 핵을 염색하기 위해 1 mM SYTO9 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 처리하였다. 그 후, 세포를 형광현미경 하에서 시각화하고 NIS-Elements Viewer 소프트웨어 프로그램을 사용하여 이미지를 처리하고 정량화하였다. 공초점 형광 이미지(Confocal fluorescence images)는 Eclipse Ti (Nikon Instruments)로 획득하였으며, 적절한 레이저 및 필터 세트는 적색 형광(Red fluorescence) 및 녹색 형광(green fluorescence)을 선택하였다.In order to measure the external stimuli in the living cells of the present invention in real time and quantitatively, the cells were designed using the protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention and the detection of rapamycin was performed as follows Respectively. First, as shown in FIG. 2A, a recombinant gene having a junction sequence of 1 and 2 inserted therein was transfected into cells and cultured for 48 hours. To induce dimerization in the cells, cells were treated with 10 nM rapamycin (Sigma) at 30 ° C for 2 hours. After 2 to 3 hours, the cells were washed with PBS pre-warmed to 37 < 0 > C and rapamycin or ionomycin was removed, respectively. The cells were treated with 1 mM SYTO9 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) to stain the nuclei. The cells were then visualized under fluorescence microscopy and the images were processed and quantified using the NIS-Elements Viewer software program. Confocal fluorescence images were acquired with Eclipse Ti (Nikon Instruments), and a suitable set of lasers and filters selected red fluorescence and green fluorescence.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 라이브 세포 기반 바이오센서를 이용하여, 외부자극물질인 라파마이신을 검출하였다. As a result, as shown in FIG. 2B, the live cell-based biosensor of the present invention was used to detect rapamycin, which is an external stimulant.

실시예 2. 인틴 단백질(Sce VMA intein)을 이용한 칼슘이온의 검출Example 2. Detection of calcium ion using an intestine protein (Sce VMA intein)

칼슘이온(Ca2 +)의 이동을 모니터링하기 위해, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 5과 6의 접합체 서열이 삽입된 재조합 유전자를 세포에 형질주입하여 48 시간 동안 배양시켜 발현과정을 거친 후, 세포를 30 ℃에서 3 시간 동안 10nM의 이오노마이신(ionomycin; Sigma) 및 5mM의 CaCl2를 처리하였다. 보다 구체적으로 다른 외인성 요소가 제1 및 제2 접합체 단백질의 접합 (trans-splicing)을 제어하는지 확인하고자, 칼슘이온 (Ca2 +)이 단백질의 조건부 접합(conditional splicing)을 개시할 것으로 가정하고, CaCl2를 시약으로 사용하여 적색 형광(mcherry fluorescent)의 trans-localization을 관찰하였다. 칼슘이온은 일반적으로 근육 수축, 신경 전달, 수정 및 호르몬 분비 등 세포 신호 전달 과정에서 여러 생물학적 현상을 조절하는 2차 전달자이다. 본 발명의 라이브 세포 기반 바이오센서는 칼슘이온을 사용하여, 기존의 PPI(protein-protein interaction) 검출 모델 시스템에 일반적으로 사용되는 FKBP12/FRB 대신, calmodulin (CaM) 및 Calmodulin binding domain (CaMBD)을 사용하였다. 5 mM CaCl2 및 10nM ionomycin을 3 시간 처리한 후, CaM 및 CaMBD의 결합을 유도하였다. To monitor the migration of calcium ions (Ca < 2 + & gt ; ), as shown in Fig. 3A, a recombinant gene in which a junction sequence of 5 and 6 was inserted was transfected into cells and cultured for 48 hours. Was treated with 10 nM ionomycin (Sigma) and 5 mM CaCl 2 at 30 ° C for 3 hours. More specifically, it is assumed that calcium ion (Ca < 2 + & gt ; ) initiates conditional splicing of the protein in order to confirm that other exogenous factors control trans-splicing of the first and second conjugate proteins, Trans-localization of mcherry fluorescent was observed using CaCl 2 as a reagent. Calcium ions are generally secondary messengers that regulate many biological phenomena in cell signaling processes, such as muscle contraction, neurotransmission, fertilization, and hormone secretion. The live cell-based biosensor of the present invention uses calmodulin (CaM) and calmodulin binding domain (CaMBD) instead of FKBP12 / FRB commonly used in existing protein-protein interaction detection system systems using calcium ions Respectively. 5 mM CaCl 2 and 10 nM ionomycin for 3 hours, followed by binding of CaM and CaMBD.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, Ca2 +과 Ionomycine이 처리된 5+6 모델에서는 적색 형광(mcherry fluorescent)의 trans-localization만을 확인할 수 있었다. 그러나, Ca2 +과 Ionomycine이 처리된 6 모델에서는 적색 형광(mcherry fluorescent)의 trans-localization이 관찰되지 않았다. 음성대조군으로 5 mM의 CaCl2 및 1 μM의 이오노마이신을 처리하지 않은 5+6 모델의 경우, 본 발명의 접합 시스템을 활성화 시키지 못하였으며, trans-localization 역시 일어나지 않았다. 이는 본 발명의 라이브 세포 기반 바이오센서가 적색 형광(mcherry fluorescent)의 trans-localization을 이용한 라이브 세포 기반 센서로 활용될 수 있음을 보여준다.As a result, as shown in Figure 3b, in the 5 + 6 model is Ca 2 + and Ionomycine processed was confirmed only trans-localization of the red fluorescence (fluorescent mcherry). However, the Ca 2 + and six models of this process the trans-Ionomycine localization of red fluorescence (fluorescent mcherry) was not observed. In the case of the 5 + 6 model which was not treated with 5 mM CaCl 2 and 1 μM ionomycin as a negative control, the conjugation system of the present invention was not activated and no trans-localization occurred. This shows that the live cell-based biosensor of the present invention can be used as a live cell-based sensor using trans-localization of mcherry fluorescent.

실시예 3. 인틴 단백질(Npu intein)을 이용한 당질코르티코이드의 검출Example 3. Detection of glucocorticoids using an intrin protein (Npu intein)

본 발명의 살아있는 세포 내에서의 생체신호물질을 실시간 및 정량적으로 측정하고자, 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 인틴 단백질을 이용하여, 세포를 디자인하고, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 같이 당질코르티코이드(Glucocorticoid)의 검출을 확인하였다. 세포에 당질코르티코이드를 처리한 후, 37 ℃에서 15 시간 동안 처리한 후, 관찰하였으며, 상기 실시예 1에 기재된 방법으로 공초점 형광 이미지를 획득하였다.In order to measure the bio-signal material in living cells of the present invention in real time and quantitatively, a cell was designed using the protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of the present invention, and the method described in Example 1 Likewise, the detection of glucocorticoid was confirmed. Cells were treated with saccharide corticoids, followed by treatment at 37 ° C for 15 hours and then observed. Confocal fluorescence images were obtained by the method described in Example 1 above.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 당질코르티코이드에 의해 활성화된 효소(Npu 인틴 단백질) 및 타겟 단백질(GR) 접합체(NpuIc-GR, 도 4a, 9)가 세포질에서 핵으로 이동하여, 핵에 있는 적색 형광 단백질(mCherry), 제 2 신호펩티드(CAAX), Npu 인틴 단백질 및 제1 신호펩티드로 구성된 mCherry-CAAX-NpuIn-NLS 복합체 (도 4a, 8)와 만나게 되고, 가까워진 접합체의 인틴은 절단 반응을 일으켜, mCherry-CAAX 서열이 만들어지며, 이 결과, 세포막으로 이동하게 하는 CAAX tag가 활성화된다. 활성화된 태그에 의해 핵에 있던 mCherry 형광 신호가 세포막으로 이동하게 된다.As a result, as shown in Fig. 4B, the enzyme (Npu intestine protein) and the target protein (GR) conjugate activated by glucocorticoid (NpuIc-GR, Figs. 4A and 9) migrate from the cytoplasm to the nucleus, (Fig. 4A, 8) composed of the red fluorescent protein (mCherry), the second signal peptide (CAAX), the Npu intestine protein and the first signal peptide, and the intestine of the conjugate that is close to the mCherry- CAAX-NpuIn- , Resulting in mCherry-CAAX sequences, which result in the activation of the CAAX tag that leads to the cell membrane. The activated tag moves the mCherry fluorescent signal in the nucleus to the cell membrane.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof <130> MP16-221 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sce VMA intein <400> 1 Gly Cys Phe Ala Lys Gly Thr Asn Val Leu Met Ala Asp Gly Ser Ile 1 5 10 15 Glu Cys Ile Glu Asn Ile Glu Val Gly Asn Lys Val Met Gly Lys Asp 20 25 30 Gly Arg Pro Arg Glu Val Ile Lys Leu Pro Arg Gly Arg Glu Thr Met 35 40 45 Tyr Ser Val Val Gln Lys Ser Gln His Arg Ala His Lys Ser Asp Ser 50 55 60 Ser Arg Glu Val Pro Glu Leu Leu Lys Phe Thr Cys Asn Ala Thr His 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Arg Thr Pro Arg Ser Val Arg Arg Leu Ser Arg Thr 85 90 95 Ile Lys Gly Val Glu Tyr Phe Glu Val Ile Thr Phe Glu Met Gly Gln 100 105 110 Lys Lys Ala Pro Asp Gly Arg Ile Val Glu Leu Val Lys Glu Val Ser 115 120 125 Lys Ser Tyr Pro Ile Ser Glu Gly Pro Glu Arg Ala Asn Glu Leu Val 130 135 140 Glu Ser Tyr Arg Lys Ala Ser Asn Lys Ala Tyr Phe Glu Trp Thr Ile 145 150 155 160 Glu Ala Arg Asp Leu Ser Leu Leu Gly Ser His Val Arg Lys Ala Thr 165 170 175 Tyr Gln Thr Tyr Ala Pro Ile Leu Tyr Glu Asn Asp His Phe Phe Asp 180 185 190 Tyr Met Gln Lys Ser Lys Phe His Leu Thr Ile Glu Gly Pro Lys Val 195 200 205 Leu Ala Tyr Leu Leu Gly Leu Trp Ile Gly Asp Gly Leu Ser Asp Arg 210 215 220 Ala Thr Phe Ser Val Asp Ser Arg Asp Thr Ser Leu Met Glu Arg Val 225 230 235 240 Thr Glu Tyr Ala Glu Lys Leu Asn Leu Cys Ala Glu Tyr Lys Asp Arg 245 250 255 Lys Glu Pro Gln Val Ala Lys Thr Val Asn Leu Tyr Ser Lys Val Val 260 265 270 Arg Gly Asn Gly Ile Arg Asn Asn Leu Asn Thr Glu Asn Pro Leu Trp 275 280 285 Asp Ala Ile Val Gly Leu Gly Phe Leu Lys Asp Gly Val Lys Asn Ile 290 295 300 Pro Ser Phe Leu Ser Thr Asp Asn Ile Gly Thr Arg Glu Thr Phe Leu 305 310 315 320 Ala Gly Leu Ile Asp Ser Asp Gly Tyr Val Thr Asp Glu His Gly Ile 325 330 335 Lys Ala Thr Ile Lys Thr Ile His Thr Ser Val Arg Asp Gly Leu Val 340 345 350 Ser Leu Ala Arg Ser Leu Gly Leu Val Val Ser Val Asn Ala Glu Pro 355 360 365 Ala Lys Val Asp Met Asn Gly Thr Lys His Lys Ile Ser Tyr Ala Ile 370 375 380 Tyr Met Ser Gly Gly Asp Val Leu Leu Asn Val Leu Ser Lys Cys Ala 385 390 395 400 Gly Ser Lys Lys Phe Arg Pro Ala Pro Ala Ala Ala Phe Ala Arg Glu 405 410 415 Cys Arg Gly Phe Tyr Phe Glu Leu Gln Glu Leu Lys Glu Asp Asp Tyr 420 425 430 Tyr Gly Ile Thr Leu Ser Asp Asp Ser Asp His Gln Phe Leu Leu Ala 435 440 445 Asn Gln Val Val Val His Asn Cys 450 455 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Npu DnaE intein <400> 2 Tyr Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Leu 1 5 10 15 Leu Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr 20 25 30 Ser Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala Gln Trp 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly 50 55 60 Ser Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val Asp Gly 65 70 75 80 Gln Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp Leu Met 85 90 95 Arg Val Asp Asn Leu Pro Asn Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu 100 105 110 Gly Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr Asp Ile Gly Val Glu Arg 115 120 125 Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe Ile Ala Ser Asn 130 135 140 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaB intein <400> 3 Cys Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Lys Ile Glu Cys Ser Val Tyr Ser 20 25 30 Val Asp Pro Glu Gly Arg Val Tyr Thr Gly Ala Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Leu Glu Tyr Glu Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Ser Asp His Arg Phe Leu Thr Thr Asp Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Leu Ala Ile Glu Glu Ile Phe Ala Arg Gln Leu Asp Leu Leu Thr 85 90 95 Leu Glu Asn Lys Gln Thr Glu Glu Ala Leu Asp Asn His Arg Leu Pro 100 105 110 Phe Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Leu Lys Met Val Lys Val Ile Gly 115 120 125 Arg Arg Ser Leu Gly Val Gln Arg Ile Phe Asp Ile Gly Leu Pro Gln 130 135 140 Asp His Asn Phe Leu Leu Ala Asn Gly Ala Ile Ala Ala Asn 145 150 155 <210> 4 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaB intein <400> 4 Cys Leu Ala Gly Gly Thr Pro Val Val Thr Val Glu Tyr Gly Val Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gln Thr Ile Val Glu Gln Glu Leu Leu Cys His Val Tyr Ser 20 25 30 Val Asp Ala Gln Gly Leu Ile Tyr Ala Gln Leu Ile Glu Gln Trp His 35 40 45 Gln Arg Gly Asp Arg Leu Leu Tyr Glu Tyr Glu Leu Glu Asn Gly Gln 50 55 60 Met Ile Arg Ala Thr Pro Asp His Arg Phe Leu Thr Thr Thr Gly Glu 65 70 75 80 Leu Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu Ala Ala 85 90 95 Trp Ala Val Pro Asp Ser Leu Pro Arg Thr Ala Met Val Lys Ile Ile 100 105 110 Arg Arg Lys Phe Ile Gly His Ala Pro Thr Tyr Asp Ile Gly Leu Ser 115 120 125 Gln Asp His Asn Phe Leu Leu Gly Gln Gly Leu Ile Ala Ala Asn Cys 130 135 140 Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Trp Thr Val Glu Tyr Gly Ala Met Pro 145 150 155 160 Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Lys Ile Glu Cys Ser Val Tyr Thr Val 165 170 175 Asp Glu Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His Pro 180 185 190 Arg Gly Gln Gln Glu Ile Ile Glu Tyr Thr Leu Glu Asp Gly Arg Lys 195 200 205 Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Met Met Thr Glu Ser Gly Glu Met 210 215 220 Leu Pro Ile Glu Glu Ile Phe Gln Arg Glu Leu Asp Leu Lys Val Glu 225 230 235 240 Thr Phe His Glu Met Ser Leu Leu Arg Arg Gly Ala Lys Met Val Lys 245 250 255 Ile Ile Lys Arg Gln Ser Leu Gly Arg Gln Asn Val Tyr Asp Val Cys 260 265 270 Val Glu Thr Asp His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Cys Val Ala Ser 275 280 285 Asn <210> 5 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter intein <400> 5 Cys Leu Thr Tyr Glu Thr Glu Ile Met Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Tyr Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Met Gln Glu Val Tyr Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Thr 50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Pro Glu His Lys Phe Met Thr Glu Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Cys 85 90 95 Leu Gly Thr Leu Glu Met Val Lys Ile Val Ser Arg Lys Leu Ala Lys 100 105 110 Thr Glu Asn Val Tyr Asp Ile Gly Val Thr Lys Asp His Asn Phe Val 115 120 125 Leu Ala Asn Gly Leu Ile Ala Ser Asn 130 135 <210> 6 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rma DnaB intein <400> 6 Cys Leu Ala Gly Asp Thr Leu Ile Thr Leu Ala Asp Gly Arg Arg Val 1 5 10 15 Pro Ile Arg Glu Leu Val Ser Gln Gln Asn Phe Ser Val Trp Ala Leu 20 25 30 Asn Pro Gln Thr Tyr Arg Leu Glu Arg Ala Arg Val Ser Arg Ala Phe 35 40 45 Cys Thr Gly Ile Lys Pro Val Tyr Arg Leu Thr Thr Arg Leu Gly Arg 50 55 60 Ser Ile Arg Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Pro Gln Gly Trp 65 70 75 80 Lys Arg Val Asp Glu Leu Gln Pro Gly Asp Tyr Leu Ala Leu Pro Arg 85 90 95 Arg Ile Pro Ala Gln Ser Asp Val Tyr Trp Asp Pro Ile Val Ser Ile 100 105 110 Glu Pro Asp Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro 115 120 125 His Asn Phe Val Ala Asn Asp Ile Ile Ala His Asn 130 135 140 <210> 7 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaB1 intein <400> 7 Cys Ala Ala Tyr Asp Thr Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Ser Leu Val 1 5 10 15 Thr Leu Ala Glu Val Tyr Lys Arg Gln Glu Ile Glu Leu Leu Thr Leu 20 25 30 Gly Lys Asn Ser Lys Phe Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Ala Phe Ile Asp 35 40 45 Asp Gly Ile Lys Pro Ile Phe Arg Val Thr Thr Lys Leu Gly Arg Phe 50 55 60 Val Glu Thr Thr Ile Thr His Pro Phe Leu Thr Val Asn Gly Trp Lys 65 70 75 80 Pro Leu Ser Lys Leu Gln Val Gly Glu Lys Ile Ala Val Pro Arg Arg 85 90 95 Glu Asn Ser Asp Ile Phe Trp Asp Lys Ile Val Ser Ile Glu Pro Val 100 105 110 Gly Glu Lys Gln Val Tyr Asp Leu Thr Val Pro Glu Thr His Asn Phe 115 120 125 Val Ala Asn Asp Ile Cys Leu His Asn 130 135 <210> 8 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaE2 intein <400> 8 Cys Leu Ser Gly Ser Thr Lys Val Ile Asp Ala Ala Thr Gly Asn Leu 1 5 10 15 Phe Ser Leu Lys Glu Ile Ala Ala Gln Pro Glu Tyr Trp Leu Ser Arg 20 25 30 Lys Val Phe Ser Leu Asp Leu Lys Ser Gln Gln Val Val Gln Gln Pro 35 40 45 Ile Thr Glu Ile His Pro Asn Gly Val Arg Asp Val Trp Gln Ile Thr 50 55 60 Thr Arg Thr Asn Arg Lys Val Cys Ala Thr Asp Asp His Leu Phe Tyr 65 70 75 80 Thr Val Leu Gly Trp Lys Pro Leu Lys Asp Phe Ser Val Gly Asp Arg 85 90 95 Leu Gly Leu Pro Asn Lys Asp Val Phe Trp Asp Glu Ile Ile Ser Ile 100 105 110 Glu Tyr Ile Gly Lys Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Ile Pro Glu Thr 115 120 125 His Asn Phe Ile Ala Asn Asp Phe Ile Val His Asn 130 135 140 <210> 9 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter ThyX intein <400> 9 Cys Leu Ser Gly Asn Thr Lys Val Arg Phe Arg Tyr Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Gln Glu Ala Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Lys Leu Ala Asn Leu 20 25 30 Trp His Tyr Gly Ser Lys Asn Gln Tyr Thr Ser Lys Asp Ala Lys Cys 35 40 45 Met Gln Glu Asn Ile Ser Ser Arg Asn Ile Phe Thr Leu Asp Thr Gln 50 55 60 Thr Asn Gln Ile Val Ser Ser Lys Ile Thr Asn Ile Tyr Ile Asn Gly 65 70 75 80 Glu Lys Glu Thr Tyr Thr Ile Lys Thr Val Ser Gly Lys Glu Ile Arg 85 90 95 Ala Thr Leu Glu His Gln Phe Trp Thr Asn Gln Gly Trp Lys Arg Leu 100 105 110 Lys Asp Phe Asn Asn Ser Thr Gln Leu Cys Glu Val Gln Leu Gly Val 115 120 125 Phe Val Glu Ile Glu Ser Ile Glu Lys Phe Gly Lys Glu Ile Thr Tyr 130 135 140 Asp Leu Glu Val Glu His Pro Glu His Asn Phe Ile Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Val Val His Asn <210> 10 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaX intein <400> 10 Ile Asp Glu Cys Leu Thr Gly Asp Ser Gln Val Leu Thr Arg Asn Gly 1 5 10 15 Leu Met Ser Ile Asp Asn Pro Gln Ile Lys Gly Arg Glu Val Leu Ser 20 25 30 Tyr Asn Glu Thr Leu Gln Gln Trp Glu Tyr Lys Lys Val Leu Arg Trp 35 40 45 Leu Asp Arg Gly Glu Lys Gln Thr Leu Ser Ile Lys Thr Lys Asn Ser 50 55 60 Thr Val Arg Cys Thr Ala Asn His Leu Ile Arg Thr Glu Gln Gly Trp 65 70 75 80 Thr Arg Ala Glu Asn Ile Thr Pro Gly Met Lys Ile Leu Ser Pro Pro 85 90 95 Gln Trp His Thr Asn Phe Glu Glu Val Glu Ser Val Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Val Glu Lys Val Tyr Asp Leu Glu Val Glu Asp Asn His Asn Phe Val 115 120 125 Ala Asn Gly Leu Leu Val His Asn 130 135 <210> 11 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp GyrB intein <400> 11 Cys Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val Ala Leu Thr Asp Gly Arg Ser Val 1 5 10 15 Ser Phe Glu Gln Leu Val Glu Glu Glu Lys Gln Gly Lys Gln Asn Phe 20 25 30 Cys Tyr Thr Ile Arg His Asp Gly Ser Ile Gly Val Glu Lys Ile Ile 35 40 45 Asn Ala Arg Lys Thr Lys Thr Lys Thr Asn Ala Lys Val Thr Leu Asp 50 55 60 Asn Gly Glu Ser Ile Ile Cys Thr Pro Asp His Lys Phe Met Leu Arg 65 70 75 80 Asp Gly Ser Tyr Lys Cys Ala Met Asp Leu Thr Leu Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Met Pro Leu His Arg Lys Ile Ser Thr Thr Glu Asp Ser Gly His Met 100 105 110 Glu Ala Val Leu Asn Tyr Asn His Arg Ile Val Asn Ile Glu Ala Val 115 120 125 Ser Glu Thr Ile Asp Val Tyr Asp Ile Glu Val Pro His Thr His Asn 130 135 140 Phe Ala Leu Ala Ser Gly Val Phe Val His Asn 145 150 155 <210> 12 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR2 intein <400> 12 Cys His Ser Gly Asp Thr Leu Val Ser Thr Asp Gln Gly Leu Ile Ala 1 5 10 15 Ile Gln Asp Leu Val Gly Lys Gln Phe Gln Ala Leu Val Asp Leu Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Leu Ser Gly Val Arg Leu Thr Asp Ala Ile Ala Phe Ala 35 40 45 Thr Gly Val Lys Thr Thr Tyr Gln Val Ile Leu Asn Asn Gly Met Met 50 55 60 Arg Cys Thr Gly Asp His Gln His Phe Thr Ser Arg Gly Trp Val Ser 65 70 75 80 Thr Arg Asp Leu Thr Asp Asp Asp Asn Ile Tyr Ile Gln Gly Gly Lys 85 90 95 Phe Ile Ser Lys Val Lys Lys Val Glu Glu Phe Gly Glu Glu Val Val 100 105 110 Tyr Asp Leu His Val Pro Leu Thr Asn Ser Phe Ile Ala Asn Gly Cys 115 120 125 Leu Thr His Asn 130 <210> 13 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaE3 intein <400> 13 Cys Leu Thr Tyr Glu Thr Glu Ile Met Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Tyr Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Met Gln Glu Val Tyr Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Thr 50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Pro Glu His Lys Phe Met Thr Glu Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Cys 85 90 95 Leu Gly Thr Leu Glu Val Lys Ile Val Ser Arg Lys Leu Ala Lys Thr 100 105 110 Glu Asn Val Tyr Asp Ile Gly Val Thr Lys Asp His Asn Phe Val Leu 115 120 125 Ala Asn Gly Leu Ile Ala Ser Asn 130 135 <210> 14 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tth RIR1 intein <400> 14 Cys Leu His Pro Asp Thr Leu Val His Thr Asp Arg Gly Thr Leu Arg 1 5 10 15 Leu Arg Glu Leu Val Asp Pro Phe Arg Arg Gly Trp Gln Pro His Thr 20 25 30 Leu Ser Val Ala Thr Asp Glu Gly Trp Arg Pro Ser Pro Glu Gly Tyr 35 40 45 Asn Asn Gly Val Ala Pro Thr Leu Arg Val Val Leu Glu Asn Gly Leu 50 55 60 Glu Val Gln Gly Thr Leu Asn His Lys Leu Lys Val Leu Arg Glu Asp 65 70 75 80 Gly Thr Arg Glu Trp Val Glu Leu Gln Asp Leu Arg Pro Gly Asp Trp 85 90 95 Val Ile Trp Val Leu Asp Glu Ala Glu Pro Phe Pro Phe Asn Glu Tyr 100 105 110 Tyr Val Arg Val Ala Ser Val Glu Pro Gly Gly Glu Ile Leu Thr Leu 115 120 125 Asp Leu Ser Val Glu Gly Asn His Thr Tyr Leu Ala Asn Gly Leu Val 130 135 140 Ser His Asn 145 <210> 15 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR1 intein <400> 15 Cys Leu Pro Glu Gly Ala Leu Val His Thr Ala Ser Gly Leu Val Ala 1 5 10 15 Ile Glu Lys Ile Arg Ile Gly Asp Arg Val Leu Thr Ser Gln Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Val Thr Asn Phe Phe Asp Gln Gly Ile Gln Ser Leu Cys Arg 35 40 45 Ile Gln Thr Glu Asp Gly Tyr Phe Glu Cys Thr Pro Asp His Lys Val 50 55 60 Ala Val Leu Gln Asp Leu Tyr Gly Asn Tyr Lys Met Ile Lys Ala Lys 65 70 75 80 Asp Leu Gln Glu Gly Asp Arg Leu Ile Phe Val Pro Gln Asp Ala Thr 85 90 95 Asp Leu Ile Pro Val Lys Val Lys Lys Val Glu Met Asp Val Arg Glu 100 105 110 Ala Ser Thr Tyr Asp Ile Glu Val Ala Ser Ile His Glu Phe Val Cys 115 120 125 Gln Gly Ile Leu Val Ser Asn 130 135 <210> 16 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaE - 1 intein <400> 16 Cys Leu Pro Lys Gly Thr Leu Ile Asp Gln Pro Asp Gly Ser Arg Glu 1 5 10 15 Ala Ile Glu Asn Ile Lys Ser Gly Glu Val Ile Leu Thr Ser Asp Gly 20 25 30 Arg Lys Val Trp Glu Ala Lys Val Ala Lys Gln Trp Arg Ser Gly Val 35 40 45 Arg Glu Ile Leu Lys Ile Thr Leu Ser Ser Gly Thr Val Ile Tyr Ser 50 55 60 Gly Lys Asn His Arg Phe Leu Thr Pro Glu Gly Asp Lys Phe Ala Trp 65 70 75 80 Glu Leu Gln Pro Gln Val Gly Arg Val Lys Asn Ala Leu Ile Tyr Gly 85 90 95 Ser Gln Asp Val Arg Val Val His Val Val Ser Val Glu Glu Val Gly 100 105 110 Glu Ala Glu Cys Phe Asp Leu Glu Met Glu Asp Gln Ser Ser Pro Tyr 115 120 125 Phe Leu Ala Glu Gly Val Val Val His Asn 130 135 <210> 17 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR - 4 intein <400> 17 Cys Leu Asp Lys Thr Ala Leu Arg Ile Phe Asn Gln Gly Leu Leu Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Glu Val Val Thr Pro Gly Ser Gly Glu Thr Val Gly Leu Gly 20 25 30 Leu Thr Val Arg Asn Gly Ile Gly Ala Ser Thr Ala Ile Ala Asn Gln 35 40 45 Pro Met Glu Leu Val Glu Ile Lys Leu Ala Asn Gly Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Met Thr Pro Asn His Arg Met Ser Val Lys Gly Lys Trp Ile His Ala 65 70 75 80 Cys Asn Leu Lys Pro Gly Met Leu Leu Asp Tyr Ser Ile Gly Glu Pro 85 90 95 Tyr Lys Ile Glu Ser Val Asn Ile Gly Ala Val Cys Asp Tyr Ser Tyr 100 105 110 Asp Phe Ala Ile Glu Gly Ile Asn Asp Asn Asp Ser Trp Tyr Trp Gln 115 120 125 Gly Ala Leu Lys Ser His Asn 130 135 <210> 18 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR - 3 intein <400> 18 Cys Val Ser Gly Asp Thr Leu Leu Ile Thr Arg Asp Ser Ile His Lys 1 5 10 15 Ile Lys Asp Val Val Gly Gln Lys Ile Glu Ile Trp Asn Gly Lys Asn 20 25 30 Trp Ser Gln Val Ile Pro Leu Lys Thr Gly Lys Asp Arg Lys Leu Tyr 35 40 45 Arg Val Arg Phe Gly Asp Gly Ser Tyr Leu Asp Val Thr Glu Tyr His 50 55 60 Arg Phe Phe Val Lys Asp Arg Phe Gly Lys Lys Tyr Glu Glu Val Gln 65 70 75 80 Thr Lys Asp Leu Leu Thr His Ser Lys Tyr Glu Ala Lys Phe Gln Gly 85 90 95 Lys Tyr Gln Thr Ile Gln Asn Val Glu Glu Leu Pro Gly Leu His Asp 100 105 110 Thr Tyr Cys Phe Glu Glu Pro Glu Phe His Lys Gly Val Phe Gly Asn 115 120 125 Ala Leu Thr Gly Asn 130 <210> 19 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CneA Prp8 intein <400> 19 Cys Leu Gln Asn Gly Thr Arg Leu Leu Arg Ala Asp Gly Ser Glu Val 1 5 10 15 Leu Val Glu Asp Val Gln Glu Gly Asp Gln Leu Leu Gly Pro Asp Gly 20 25 30 Thr Ser Arg Thr Ala Ser Lys Ile Val Arg Gly Glu Glu Arg Leu Tyr 35 40 45 Arg Ile Lys Thr His Glu Gly Leu Glu Asp Leu Val Cys Thr His Asn 50 55 60 His Ile Leu Ser Met Tyr Lys Glu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Ala His 65 70 75 80 Ser Pro Ser Ala Asp Leu Ser Leu Thr Asp Ser His Glu Arg Val Asp 85 90 95 Val Thr Val Asp Asp Phe Val Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gln Gln Lys 100 105 110 Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ala Ser Val Arg His Glu Arg Pro Ser 115 120 125 Thr Ser Lys Leu Asp Thr Thr Leu Leu Arg Ile Asn Ser Ile Glu Leu 130 135 140 Glu Asp Glu Pro Thr Lys Trp Ser Gly Phe Val Val Asp Lys Asp Ser 145 150 155 160 Leu Tyr Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn 165 170 <110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli          or bio-signal molecules using it <130> MP16-221 <160> 19 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sce VMA intein <400> 1 Gly Cys Phe Ala Lys Gly Thr Asn Val Leu Met Ala Asp Gly Ser Ile   1 5 10 15 Glu Cys Ile Glu Asn Ile Glu Val Gly Asn Lys Val Met Gly Lys Asp              20 25 30 Gly Arg Pro Arg Glu Val Ile Lys Leu Pro Arg Gly Arg Glu Thr Met          35 40 45 Tyr Ser Val Val Gln Lys Ser Gln His Arg Ala His Lys Ser Asp Ser      50 55 60 Ser Arg Glu Val Pro Glu Leu Leu Lys Phe Thr Cys Asn Ala Thr His  65 70 75 80 Glu Leu Val Val Arg Thr Pro Arg Ser Val Arg Arg Leu Ser Arg Thr                  85 90 95 Ile Lys Gly Val Glu Tyr Phe Glu Val Ile Thr Phe Glu Met Gly Gln             100 105 110 Lys Lys Ala Pro Asp Gly Arg Ile Val Glu Leu Val Lys Glu Val Ser         115 120 125 Lys Ser Tyr Pro Ile Ser Glu Gly Pro Glu Arg Ala Asn Glu Leu Val     130 135 140 Glu Ser Tyr Arg Lys Ala Ser Asn Lys Ala Tyr Phe Glu Trp Thr Ile 145 150 155 160 Glu Ala Arg Asp Leu Ser Leu Leu Gly Ser His Val Arg Lys Ala Thr                 165 170 175 Tyr Gln Thr Tyr Ala Pro Ile Leu Tyr Glu Asn Asp His Phe Phe Asp             180 185 190 Tyr Met Gln Lys Ser Lys Phe His Leu Thr Ile Glu Gly Pro Lys Val         195 200 205 Leu Ala Tyr Leu Leu Gly Leu Trp Ile Gly Asp Gly Leu Ser Asp Arg     210 215 220 Ala Thr Phe Ser Val Asp Ser Arg Asp Thr Ser Leu Met Glu Arg Val 225 230 235 240 Thr Glu Tyr Ala Glu Lys Leu Asn Leu Cys Ala Glu Tyr Lys Asp Arg                 245 250 255 Lys Glu Pro Gln Val Ala Lys Thr Val Asn Leu Tyr Ser Lys Val Val             260 265 270 Arg Gly Asn Gly Ile Arg Asn Asn Leu Asn Thr Glu Asn Pro Leu Trp         275 280 285 Asp Ala Ile Val Gly Leu Gly Phe Leu Lys Asp Gly Val Lys Asn Ile     290 295 300 Pro Ser Phe Leu Ser Thr Asp Asn Ile Gly Thr Arg Glu Thr Phe Leu 305 310 315 320 Ala Gly Leu Ile Asp Ser Asp Gly Tyr Val Thr Asp Glu His Gly Ile                 325 330 335 Lys Ala Thr Ile Lys Thr Ile His Thr Ser Val Arg Asp Gly Leu Val             340 345 350 Ser Leu Ala Arg Ser Leu Gly Leu Val Val Ser Val Asn Ala Glu Pro         355 360 365 Ala Lys Val Asp Met Asn Gly Thr Lys His Lys Ile Ser Tyr Ala Ile     370 375 380 Tyr Met Ser Gly Gly Asp Val Leu Leu Asn Val Leu Ser Lys Cys Ala 385 390 395 400 Gly Ser Lys Lys Phe Arg Pro Ala Pro Ala Ala Ala Phe Ala Arg Glu                 405 410 415 Cys Arg Gly Phe Tyr Phe Glu Leu Gln Glu Leu Lys Glu Asp Asp Tyr             420 425 430 Tyr Gly Ile Thr Leu Ser Asp Asp Ser Asp His Gln Phe Leu Leu Ala         435 440 445 Asn Gln Val Val Val His Asn Cys     450 455 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Npu DnaE intein <400> 2 Tyr Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Leu   1 5 10 15 Leu Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr              20 25 30 Ser Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala Gln Trp          35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly      50 55 60 Ser Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val Asp Gly  65 70 75 80 Gln Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp Leu Met                  85 90 95 Arg Val Asp Asn Leu Pro Asn Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu             100 105 110 Gly Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr Asp Ile Gly Val Glu Arg         115 120 125 Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe Ile Ala Ser Asn     130 135 140 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaB intein <400> 3 Cys Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu   1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Lys Ile Glu Cys Ser Val Tyr Ser              20 25 30 Val Asp Pro Glu Gly Arg Val Tyr Thr Gly Ala Ile Ala Gln Trp His          35 40 45 Asp Arg Gly Glu Glu Glu Val Leu Glu Tyr Glu Leu Glu Asp Gly Ser      50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Ser Asp His Arg Phe Leu Thr Thr Asp Tyr Gln  65 70 75 80 Leu Leu Ala Ile Glu Glu Ile Phe Ala Arg Gln Leu Asp Leu Leu Thr                  85 90 95 Leu Glu Asn Lys Gln Thr Glu Glu Ala Leu Asp Asn His Arg Leu Pro             100 105 110 Phe Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Leu Lys Met Val Lys Val Ile Gly         115 120 125 Arg Arg Ser Leu Gly Val Gln Arg Ile Phe Asp Ile Gly Leu Pro Gln     130 135 140 Asp His Asn Phe Leu Leu Ala Asn Gly Ala Ile Ala Ala Asn 145 150 155 <210> 4 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaB intein <400> 4 Cys Leu Ala Gly Gly Thr Pro Val Val Thr Val Glu Tyr Gly Val Leu   1 5 10 15 Pro Ile Gln Thr Ile Val Glu Gln Glu Leu Leu Cys His Val Tyr Ser              20 25 30 Val Asp Ala Gln Gly Leu Ile Tyr Ala Gln Leu Ile Glu Gln Trp His          35 40 45 Gln Arg Gly Asp Arg Leu Leu Tyr Glu Tyr Glu Leu Glu Asn Gly Gln      50 55 60 Met Ile Arg Ala Thr Pro Asp His Arg Phe Leu Thr Thr Thr Gly Glu  65 70 75 80 Leu Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu                  85 90 95 Trp Ala Val Pro Asp Ser Leu Pro Arg Thr Ala Met Val Lys Ile Ile             100 105 110 Arg Arg Lys Phe Ile Gly His Ala Pro Thr Tyr Asp Ile Gly Leu Ser         115 120 125 Gln Asp His Asn Phe Leu Leu Gly Gln Gly Leu Ile Ala Ala Asn Cys     130 135 140 Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Trp Thr Val Glu Tyr Gly Ala Met Pro 145 150 155 160 Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Lys Ile Glu Cys Ser Val Tyr Thr Val                 165 170 175 Asp Glu Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His Pro             180 185 190 Arg Gly Gln Gln Glu Ile Ile Glu Tyr Thr Leu Glu Asp Gly Arg Lys         195 200 205 Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Met Met Thr Glu Ser Gly Glu Met     210 215 220 Leu Pro Ile Glu Glu Ile Phe Gln Arg Glu Leu Asp Leu Lys Val Glu 225 230 235 240 Thr Phe His Glu Met Ser Leu Leu Arg Arg Gly Ala Lys Met Val Lys                 245 250 255 Ile Ile Lys Arg Gln Ser Leu Gly Arg Gln Asn Val Tyr Asp Val Cys             260 265 270 Val Glu Thr Asp His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Cys Val Ala Ser         275 280 285 Asn     <210> 5 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter intein <400> 5 Cys Leu Thr Tyr Glu Thr Glu Ile Met Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu   1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Tyr Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr              20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His          35 40 45 Asn Arg Gly Met Gln Glu Val Tyr Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Thr      50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Pro Glu His Lys Phe Met Thr Glu Asp Gly Gln  65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Cys                  85 90 95 Leu Gly Thr Leu Glu Met Val Lys Ile Val Ser Arg Lys Leu Ala Lys             100 105 110 Thr Glu Asn Val Tyr Asp Ile Gly Val Thr Lys Asp His Asn Phe Val         115 120 125 Leu Ala Asn Gly Leu Ile Ala Ser Asn     130 135 <210> 6 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rma DnaB intein <400> 6 Cys Leu Ala Gly Asp Thr Leu Ile Thr Leu Ala Asp Gly Arg Arg Val   1 5 10 15 Pro Ile Arg Glu Leu Val Ser Gln Gln Asn Phe Ser Val Trp Ala Leu              20 25 30 Asn Pro Gln Thr Tyr Arg Leu Glu Arg Ala Arg Val Ser Arg Ala Phe          35 40 45 Cys Thr Gly Ile Lys Pro Val Tyr Arg Leu Thr Thr Arg Leu Gly Arg      50 55 60 Ser Ile Arg Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Pro Gln Gly Trp  65 70 75 80 Lys Arg Val Asp Glu Leu Gln Pro Gly Asp Tyr Leu Ala Leu Pro Arg                  85 90 95 Arg Ile Pro Ala Gln Ser Asp Val Tyr Trp Asp Pro Ile Val Ser Ile             100 105 110 Glu Pro Asp Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro         115 120 125 His Asn Phe Val Ala Asn Asp Ile Ile Ala His Asn     130 135 140 <210> 7 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaB1 intein <400> 7 Cys Ala Ala Tyr Asp Thr Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Ser Leu Val   1 5 10 15 Thr Leu Ala Glu Val Tyr Lys Arg Gln Glu Ile Glu Leu Leu Thr Leu              20 25 30 Gly Lys Asn Ser Lys Phe Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Ala Phe Ile Asp          35 40 45 Asp Gly Ile Lys Pro Ile Phe Arg Val Thr Thr Lys Leu Gly Arg Phe      50 55 60 Val Glu Thr Thr Ile Thr His Pro Phe Leu Thr Val Asn Gly Trp Lys  65 70 75 80 Pro Leu Ser Lys Leu Gln Val Gly Glu Lys Ile Ala Val Pro Arg Arg                  85 90 95 Glu Asn Ser Asp Ile Phe Trp Asp Lys Ile Val Ser Ile Glu Pro Val             100 105 110 Gly Glu Lys Gln Val Tyr Asp Leu Thr Val Pro Glu Thr His Asn Phe         115 120 125 Val Ala Asn Asp Ile Cys Leu His Asn     130 135 <210> 8 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaE2 intein <400> 8 Cys Leu Ser Gly Ser Thr Lys Val Ile Asp Ala Ala Thr Gly Asn Leu   1 5 10 15 Phe Ser Leu Lys Glu Ile Ala Ala Gln Pro Glu Tyr Trp Leu Ser Arg              20 25 30 Lys Val Phe Ser Leu Asp Leu Lys Ser Gln Gln Val Val Gln Gln Pro          35 40 45 Ile Thr Glu Ile His Pro Asn Gly Val Arg Asp Val Trp Gln Ile Thr      50 55 60 Thr Arg Thr Asn Arg Lys Val Cys Ala Thr Asp Asp His Leu Phe Tyr  65 70 75 80 Thr Val Leu Gly Trp Lys Pro Leu Lys Asp Phe Ser Val Gly Asp Arg                  85 90 95 Leu Gly Leu Pro Asn Lys Asp Val Phe Trp Asp Glu Ile Ile Ser Ile             100 105 110 Glu Tyr Ile Gly Lys Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Ile Pro Glu Thr         115 120 125 His Asn Phe Ile Ala Asn Asp Phe Ile Val His Asn     130 135 140 <210> 9 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter ThyX intein <400> 9 Cys Leu Ser Gly Asn Thr Lys Val Arg Phe Arg Tyr Ser Ser Ser Ser   1 5 10 15 Gln Glu Ala Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Lys Leu Ala Asn Leu              20 25 30 Trp His Tyr Gly Ser Lys Asn Gln Tyr Thr Ser Lys Asp Ala Lys Cys          35 40 45 Met Gln Glu Asn Ile Ser Ser Arg Asn Ile Phe Thr Leu Asp Thr Gln      50 55 60 Thr Asn Gln Ile Val Ser Ser Lys Ile Thr Asn Ile Tyr Ile Asn Gly  65 70 75 80 Glu Lys Glu Thr Tyr Thr Ile Lys Thr Val Ser Gly Lys Glu Ile Arg                  85 90 95 Ala Thr Leu Glu His Gln Phe Trp Thr Asn Gln Gly Trp Lys Arg Leu             100 105 110 Lys Asp Phe Asn Asn Ser Thr Gln Leu Cys Glu Val Gln Leu Gly Val         115 120 125 Phe Val Glu Ile Glu Ser Ile Glu Lys Phe Gly Lys Glu Ile Thr Tyr     130 135 140 Asp Leu Glu Val Glu His Pro Glu His Asn Phe Ile Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Val Val His Asn                 <210> 10 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaX intein <400> 10 Ile Asp Glu Cys Leu Thr Gly Asp Ser Gln Val Leu Thr Arg Asn Gly   1 5 10 15 Leu Met Ser Ile Asp Pro Gln Ile Lys Gly Arg Glu Val Leu Ser              20 25 30 Tyr Asn Glu Thr Leu Gln Gln Trp Glu Tyr Lys Lys Val Leu Arg Trp          35 40 45 Leu Asp Arg Gly Glu Lys Gln Thr Leu Ser Ile Lys Thr Lys Asn Ser      50 55 60 Thr Val Arg Cys Thr Ala Asn His Leu Ile Arg Thr Glu Gln Gly Trp  65 70 75 80 Thr Arg Ala Glu Asn Ile Thr Pro Gly Met Lys Ile Leu Ser Pro Pro                  85 90 95 Gln Trp His Thr Asn Phe Glu Glu Val Glu Ser Val Thr Lys Gly Gln             100 105 110 Val Glu Lys Val Tyr Asp Leu Glu Val Glu Asp Asn His Asn Phe Val         115 120 125 Ala Asn Gly Leu Leu Val His Asn     130 135 <210> 11 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp GyrB intein <400> 11 Cys Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val Ala Leu Thr Asp Gly Arg Ser Val   1 5 10 15 Ser Phe Glu Gln Leu Val Glu Glu Glu Lys Gln Gly Lys Gln Asn Phe              20 25 30 Cys Tyr Thr Ile Arg His Asp Gly Ser Ile Gly Val Glu Lys Ile Ile          35 40 45 Asn Ala Arg Lys Thr Lys Thr Lys Thr Asn Ala Lys Val Thr Leu Asp      50 55 60 Asn Gly Glu Ser Ile Ile Cys Thr Pro Asp His Lys Phe Met Leu Arg  65 70 75 80 Asp Gly Ser Tyr Lys Cys Ala Met Asp Leu Thr Leu Asp Asp Ser Leu                  85 90 95 Met Pro Leu His Arg Lys Ile Ser Thr Thr Glu Asp Ser Gly His Met             100 105 110 Glu Ala Val Leu Asn Tyr Asn His Arg Ile Val Asn Ile Glu Ala Val         115 120 125 Ser Glu Thr Ile Asp Val Tyr Asp Ile Glu Val Pro His Thr His Asn     130 135 140 Phe Ala Leu Ala Ser Gly Val Phe Val His Asn 145 150 155 <210> 12 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR2 intein <400> 12 Cys His Ser Gly Asp Thr Leu Val Ser Thr Asp Gln Gly Leu Ile Ala   1 5 10 15 Ile Gln Asp Leu Val Gly Lys Gln Phe Gln Ala Leu Val Asp Leu Arg              20 25 30 Ser Ile Gly Leu Ser Gly Val Arg Leu Thr Asp Ala Ile Ala Phe Ala          35 40 45 Thr Gly Val Lys Thr Thr Tyr Gln Val Ile Leu Asn Asn Gly Met Met      50 55 60 Arg Cys Thr Gly Asp His Gln His Phe Thr Ser Arg Gly Trp Val Ser  65 70 75 80 Thr Arg Asp Leu Thr Asp Asp Asp Asn Ile Tyr Ile Gln Gly Gly Lys                  85 90 95 Phe Ile Ser Lys Val Lys Lys Val Glu Glu Phe Gly Glu Glu Val Val             100 105 110 Tyr Asp Leu His Val Pro Leu Thr Asn Ser Phe Ile Ala Asn Gly Cys         115 120 125 Leu Thr His Asn     130 <210> 13 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaE3 intein <400> 13 Cys Leu Thr Tyr Glu Thr Glu Ile Met Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu   1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Tyr Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr              20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His          35 40 45 Asn Arg Gly Met Gln Glu Val Tyr Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Thr      50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Pro Glu His Lys Phe Met Thr Glu Asp Gly Gln  65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Cys                  85 90 95 Leu Gly Thr Leu Glu Val Lys Ile Val Ser Arg Lys Leu Ala Lys Thr             100 105 110 Glu Asn Val Tyr Asp Ile Gly Val Thr Lys Asp His Asn Phe Val Leu         115 120 125 Ala Asn Gly Leu Ile Ala Ser Asn     130 135 <210> 14 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tth RIR1 intein <400> 14 Cys Leu His Pro Asp Thr Leu Val His Thr Asp Arg Gly Thr Leu Arg   1 5 10 15 Leu Arg Glu Leu Val Asp Pro Phe Arg Arg Gly Trp Gln Pro His Thr              20 25 30 Leu Ser Val Ala Thr Asp Glu Gly Trp Arg Pro Ser Pro Glu Gly Tyr          35 40 45 Asn Asn Gly Val Ala Pro Thr Leu Arg Val Val Leu Glu Asn Gly Leu      50 55 60 Glu Val Gln Gly Thr Leu Asn His Lys Leu Lys Val Leu Arg Glu Asp  65 70 75 80 Gly Thr Arg Glu Trp Val Glu Leu Gln Asp Leu Arg Pro Gly Asp Trp                  85 90 95 Val Ile Trp Val Leu Asp Glu Ala Glu Pro Phe Pro Phe Asn Glu Tyr             100 105 110 Tyr Val Arg Val Ala Ser Val Glu Pro Gly Gly Glu Ile Leu Thr Leu         115 120 125 Asp Leu Ser Val Glu Gly Asn His Thr Tyr Leu Ala Asn Gly Leu Val     130 135 140 Ser His His 145 <210> 15 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR1 intein <400> 15 Cys Leu Pro Glu Gly Ala Leu Val His Thr Ala Ser Gly Leu Val Ala   1 5 10 15 Ile Glu Lys Ile Arg Ile Gly Asp Arg Val Leu Thr Ser Gln Gly Phe              20 25 30 Tyr Pro Val Thr Asn Phe Phe Asp Gln Gly Ile Gln Ser Leu Cys Arg          35 40 45 Ile Gln Thr Glu Asp Gly Tyr Phe Glu Cys Thr Pro Asp His Lys Val      50 55 60 Ala Val Leu Gln Asp Leu Tyr Gly Asn Tyr Lys Met Ile Lys Ala Lys  65 70 75 80 Asp Leu Gln Glu Gly Asp Arg Leu Ile Phe Val Pro Gln Asp Ala Thr                  85 90 95 Asp Leu Ile Pro Val Lys Val Lys Lys Val Glu Met Asp Val Arg Glu             100 105 110 Ala Ser Thr Tyr Asp Ile Glu Val Ala Ser Ile His Glu Phe Val Cys         115 120 125 Gln Ile Leu Val Ser Asn     130 135 <210> 16 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter DnaE-1 intein <400> 16 Cys Leu Pro Lys Gly Thr Leu Ile Asp Gln Pro Asp Gly Ser Arg Glu   1 5 10 15 Ala Ile Glu Asn Ile Lys Ser Gly Glu Val Ile Leu Thr Ser Asp Gly              20 25 30 Arg Lys Val Trp Glu Ala Lys Val Ala Lys Gln Trp Arg Ser Gly Val          35 40 45 Arg Glu Ile Leu Lys Ile Thr Leu Ser Ser Gly Thr Val Ile Tyr Ser      50 55 60 Gly Lys Asn His Arg Phe Leu Thr Pro Glu Gly Asp Lys Phe Ala Trp  65 70 75 80 Glu Leu Gln Pro Gln Val Gly Arg Val Lys Asn Ala Leu Ile Tyr Gly                  85 90 95 Ser Gln Asp Val Arg Val Val His Val Val Ser Val Glu Glu Val Gly             100 105 110 Glu Ala Glu Cys Phe Asp Leu Glu Met Glu Asp Gln Ser Ser Pro Tyr         115 120 125 Phe Leu Ala Glu Gly Val Val Val His Asn     130 135 <210> 17 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR-4 intein <400> 17 Cys Leu Asp Lys Thr Ala Leu Arg Ile Phe Asn Gln Gly Leu Leu Tyr   1 5 10 15 Ala Asp Glu Val Val Thr Pro Gly Ser Gly Glu Thr Val Gly Leu Gly              20 25 30 Leu Thr Val Arg Asn Gly Ile Gly Ala Ser Thr Ala Ile Ala Asn Gln          35 40 45 Pro Met Glu Leu Val Glu Ile Lys Leu Ala Asn Gly Arg Lys Leu Arg      50 55 60 Met Thr Pro Asn His Arg Met Ser Val Lys Gly Lys Trp Ile His Ala  65 70 75 80 Cys Asn Leu Lys Pro Gly Met Leu Leu Asp Tyr Ser Ile Gly Glu Pro                  85 90 95 Tyr Lys Ile Glu Ser Val Asn Ile Gly Ala Val Cys Asp Tyr Ser Tyr             100 105 110 Asp Phe Ala Ile Glu Gly Ile Asn Asp Asn Asp Ser Trp Tyr Trp Gln         115 120 125 Gly Ala Leu Lys Ser His Asn     130 135 <210> 18 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter RIR-3 intein <400> 18 Cys Val Ser Gly Asp Thr Leu Leu Ile Thr Arg Asp Ser Ile His Lys   1 5 10 15 Ile Lys Asp Val Val Gly Gln Lys Ile Glu Ile Trp Asn Gly Lys Asn              20 25 30 Trp Ser Gln Val Ile Pro Leu Lys Thr Gly Lys Asp Arg Lys Leu Tyr          35 40 45 Arg Val Arg Phe Gly Asp Gly Ser Tyr Leu Asp Val Thr Glu Tyr His      50 55 60 Arg Phe Phe Val Lys Asp Arg Phe Gly Lys Lys Tyr Glu Glu Val Gln  65 70 75 80 Thr Lys Asp Leu Leu Thr His Ser Lys Tyr Glu Ala Lys Phe Gln Gly                  85 90 95 Lys Tyr Gln Thr Ile Gln Asn Val Glu Glu Leu Pro Gly Leu His Asp             100 105 110 Thr Tyr Cys Phe Glu Glu Pro Glu Phe His Lys Gly Val Phe Gly Asn         115 120 125 Ala Leu Thr Gly Asn     130 <210> 19 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CneA Prp8 intein <400> 19 Cys Leu Gln Asn Gly Thr Arg Leu Leu Arg Ala Asp Gly Ser Glu Val   1 5 10 15 Leu Val Glu Asp Val Gln Glu Gly Asp Gln Leu Leu Gly Pro Asp Gly              20 25 30 Thr Ser Arg Thr Ala Ser Lys Ile Val Arg Gly Glu Glu Arg Leu Tyr          35 40 45 Arg Ile Lys Thr His Glu Gly Leu Glu Asp Leu Val Cys Thr His Asn      50 55 60 His Ile Leu Ser Met Tyr Lys Glu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Ala His  65 70 75 80 Ser Pro Ser Ala Asp Leu Ser Leu Thr Asp Ser His Glu Arg Val Asp                  85 90 95 Val Thr Val Asp Asp Phe Val Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gln Gln Lys             100 105 110 Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ala Ser Val Arg His Glu Arg Pro Ser         115 120 125 Thr Ser Lys Leu Asp Thr Thr Leu Leu Arg Ile Asn Ser Ile Glu Leu     130 135 140 Glu Asp Glu Pro Thr Lys Trp Ser Gly Phe Val Val Asp Lys Asp Ser 145 150 155 160 Leu Tyr Leu Arg His Hisp Tyr Leu Val Leu His Asn                 165 170

Claims (9)

삭제delete (1) 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체; 및 외부자극물질 또는 생체신호물질을 살아있는 세포에 처리하는 단계;
(2) 상기 살아있는 세포 내 상기 형광단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계; 및
(3) 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출됨에 따라 외부자극의 강도 또는 생체신호의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법으로서,
상기 제1 타겟 단백질은 당질코르티코이드 수용체(Glucocorticoid receptor; GR)이고, 상기 제1 접합체에 포함된 효소는 Npu 인틴 단백질(Nostoc punctiforme-C Intein; Npu-Ic)이며, 상기 제 2 접합체에 포함되어 있는 효소는 Npu 인틴 단백질(Nostoc punctiforme-N Intein; Npu-In)이고, 제 1 신호펩티드는 NLS(Neclear lacation sigmal)이며, 제 2 신호펩티드는 CAAX이고, 상기 형광단백질은 mCherry인 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법.
(1) a first conjugate consisting of a first target protein and an enzyme; A second conjugate consisting of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to said second signal peptide; And treating the external stimulating material or the biological signaling material to live cells;
(2) measuring a change in fluorescence signal of the fluorescent protein in the living cell; And
(3) determining the intensity of the external stimulus or the change of the biological signal as the change of the fluorescence signal is detected in the living cell, the method comprising the steps of:
Wherein the first target protein is a glucocorticoid receptor (GR), the enzyme contained in the first conjugate is an Npu protein, Nostoc punctiforme-C Intein (Npu-Ic) Characterized in that the enzyme is Nostoc punctiforme-N Intein (Npu-In), the first signal peptide is NLS (Neclear lacation sigmal), the second signal peptide is CAAX and the fluorescent protein is mCherry. A method for sensing external stimulants or biological signaling substances in living cells.
제2항에 있어서,
상기 단계 (3)에서, 상기 형광 신호의 변화가 상기 살아있는 세포 내에서 검출되는 경우, 외부자극의 강도 또는 생체신호물질의 농도가 증가한 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein in the step (3), when the change of the fluorescence signal is detected in the living cell, it is determined that the intensity of the external stimulus or the concentration of the biological signal substance is increased. Method of sensing signal material.
제2항에 있어서,
상기 형광 신호의 변화는 상기 제1 및 2 신호펩티드가 활성화되어, 상기 형광단백질이 상기 살아있는 세포 내 특정 위치로 이동하는 위치 변화에 의해 일어나는 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the change in the fluorescence signal is caused by a change in position of the first and second signal peptides being activated and the fluorescent protein moving to a specific position in the living cell, Sensing method.
삭제delete 제 2항에 있어서,
상기 제1 접합체에 포함된 효소인 Npu 인틴 단백질(Nostoc punctiforme-C Intein; Npu-Ic) 또는 상기 제 2 접합체에 포함되어 있는 효소인 Npu 인틴 단백질(Nostoc punctiforme-N Intein; Npu-In)은 서열번호 1 내지 서열번호 19으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱 방법.
3. The method of claim 2,
The Npu protein is an enzyme contained in the first conjugate, Nostoc punctiforme-C Intein (Npu-Ic), or an enzyme contained in the second conjugate, Npuctin protein-N Intein (Npu-In) Wherein the amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19.
삭제delete 삭제delete 제1 타겟단백질, 및 효소로 구성된 제1 접합체; 및 효소, 제1 신호펩티드, 제2 신호펩티드, 및 상기 제2 신호펩티드에 부착된 형광단백질로 구성된 제2 접합체;를 포함하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서로서,
상기 제1 타겟 단백질은 당질코르티코이드 수용체(Glucocorticoid receptor; GR)이고, 상기 제1 접합체에 포함된 효소는 Npu 인틴 단백질(Nostoc punctiforme-C Intein; Npu-Ic)이며, 상기 제 2 접합체에 포함되어 있는 효소는 Npu 인틴 단백질(Nostoc punctiforme-N Intein; Npu-In)이고, 제 1 신호펩티드는 NLS(Neclear lacation sigmal)이며, 제 2 신호펩티드는 CAAX이고, 상기 형광단백질은 mCherry인 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포 내 외부자극물질 또는 생체신호물질 센싱용 바이오센서.A first conjugate consisting of a first target protein, and an enzyme; And a second conjugate composed of an enzyme, a first signal peptide, a second signal peptide, and a fluorescent protein attached to the second signal peptide, wherein the biosensor is a biosensor for sensing an external stimulus material or a biological signal substance in a living cell,
Wherein the first target protein is a glucocorticoid receptor (GR), the enzyme contained in the first conjugate is an Npu protein, Nostoc punctiforme-C Intein (Npu-Ic) Characterized in that the enzyme is Nostoc punctiforme-N Intein (Npu-In), the first signal peptide is NLS (Neclear lacation sigmal), the second signal peptide is CAAX and the fluorescent protein is mCherry. A biosensor for sensing external stimulants or biological signal substances in living cells.
KR1020170072443A 2017-06-09 2017-06-09 Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof KR101963502B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170072443A KR101963502B1 (en) 2017-06-09 2017-06-09 Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170072443A KR101963502B1 (en) 2017-06-09 2017-06-09 Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180134568A KR20180134568A (en) 2018-12-19
KR101963502B1 true KR101963502B1 (en) 2019-03-28

Family

ID=65009023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170072443A KR101963502B1 (en) 2017-06-09 2017-06-09 Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101963502B1 (en)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anal. Chem., 2005, Vol. 77, pp 6588-6593.
김다희, ‘Analysis of protein trans-splicing kinetics and development of live-cell based sensors for protein-protein interaction monitoring’, 동국대학교 석사학위논문, (2016.02.), pp 1-33. 1부.*
전현진, ‘질병 진단 바이오칩 및 생체 신호 전달 물질 검출을 위한 바이오센서 개발’, 동국대학교 석사학위논문, (2017.02.), pp 1-43. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180134568A (en) 2018-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4195815B2 (en) Method of using O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase (AGT)
CA2724780C (en) Methods, devices, kits and compositions for detecting roundworm, whipworm, and hookworm
Subramanyam et al. Ion channel engineering: perspectives and strategies
JP2004532028A5 (en)
PT1869459E (en) Lipophilic dye-based fret assays for clostridial toxin activity
JP2016502405A (en) Means and methods for determining the biological activity of a botulinum neurotoxin
US20200393458A1 (en) Engineered red blood cell-based biosensors
JP7265487B2 (en) Chimeric receptors for use in whole-cell sensors for detecting analytes of interest
EP3268394A1 (en) Universal antibody-mediated biosensor
US6747135B1 (en) Fluorescent dye binding peptides
KR101963502B1 (en) Live cell-based biosensor and sensing method for external stimuli or bio-signal molecules using thereof
US10160967B2 (en) Methods and compositions for identifying a peptide having an intermolecular interaction with a target of interest
US20220236260A1 (en) Methods of detection of compound, antibody or protein using recombinant endospores or bacteria as sensing element
Li et al. Development of a fluorescent probe for the detection of hPD-L1
KR101670188B1 (en) Botulinum neurotoxin type E-specific polypeptides and uses thereof
CA3062431A1 (en) Genetically encoded potassium ion indicators
Verrier et al. Members of a mammalian SNARE complex interact in the endoplasmic reticulum in vivo and are found in COPI vesicles
JP5816412B2 (en) Target protein detection method using split reporter protein
JP6525199B2 (en) Insulin detection method and insulin detection kit
CN109777833A (en) The method of the special adaptor protein SLP-76 ubiquitin-like of T cell and corresponding external efficiently identification
Prischich et al. Light-dependent inhibition of clathrin-mediated endocytosis in yeast unveils conserved functions of the AP2 complex
TWI826663B (en) Methods of detection of compound, antibody or protein using recombinant endospores or bacteria as sensing element
US20220390461A1 (en) Method for the detection of clostridium neurotoxins using a novel substrate
WO2000023463A2 (en) Fluorescent dye binding peptides
WO2022108741A1 (en) Monitoring membrane protein trafficking for drug discovery and drug development

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right