KR101961025B1 - Method for forming fine pattern of Fertilized egg culture apparatus - Google Patents

Method for forming fine pattern of Fertilized egg culture apparatus Download PDF

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허윤석
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Abstract

The present invention comprises: a main body in which a culture space for culturing fertilized eggs is formed; a fine pattern which is formed on the bottom surface of the culture space of the main body such that the fertilized eggs are seated on the fine pattern; and a cell membrane which is formed on the surface of the fine pattern to implement a model of giving a chemical stimulus to the fertilized eggs cultured in the culture space. The present invention provides a method for forming a fine pattern of a fertilized egg culture apparatus, which forms a fine pattern copying a body mucosal fold with a plurality of fine grooves of which cross-sections are formed in a semicircular shape by an inter-diffusion region, where the etching solution and the non-etching solution are mixed, by alternately flowing an etching solution performing a laminar flow at a low Reynolds number in a culture space, where fertilized eggs are cultured, along with a non-etching solution, and provides a culture environment similar to that of an actual body by implementing a model that can give a chemical stimulus and a physical stimulus to fertilized eggs cultured in the culture space.

Description

수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법{Method for forming fine pattern of Fertilized egg culture apparatus}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a method of forming a fine pattern of a fertilized egg culture apparatus,

본 발명은 수정란을 배양하는 배양장치를 구성하는데, 수정란이 배양되는 배양공간에 식각 용액의 농도 구배 및 유속에 따른 식각 작용을 이용한 식각을 통해 생체의 점막주름을 모사한 미세패턴을 형성하고, 상기 배양공간에서 배양되는 수정란에 화학적 자극과 물리적 자극을 줄 수 있는 모델 구현하여 실제 생체와 유사한 형태의 배양 환경을 제공하는 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법에 관한 것이다.The present invention provides a culture apparatus for culturing an embryo, comprising: forming a fine pattern simulating a mucosal wrinkle of a living body through etching using a concentration gradient of an etching solution and an etching action according to a flow rate; The present invention relates to a method for forming a fine pattern of an embryo culture apparatus that provides a culture environment similar to that of a living body by implementing a model capable of imparting chemical stimulation and physical stimulation to an embryo cultured in a culture space.

동물 체세포의 체외배양법은 이미 수십 년 전부터 여러 종류의 배양액이 개발되어 체외에서도 증식을 양호하게 시킬 수 있게 되었으나, 생식세포인 난자의 연구 역사는 비교적 짧은 편이다. In vitro culture of animal somatic cells has already been developed several decades ago to improve the proliferation in vitro, but the research history of oocytes, which are reproductive cells, is relatively short.

아직 이런 짧은 연구로 인하여 난자의 대사생리가 아직 명확히 구명되지 않은 상태이고, 최근에는 포유동물의 생체 외(in vitro) 배양 시스템은 계속하여 개발되어 오고 있는데, 구체적으로 많은 배양조건의 변화를 꾀하고자 하였으며, 예를 들면 난관의 상피세포로 수정란(embryos)을 배양하거나, 또는 공동-배양(co-culture) 시스템 및 연속하여 paired media를 사용하거나 연속 배지를 사용하는 등의 시도가 있었다. The ovarian metabolic physiology has not yet been clarified due to this short study. In recent years, the in vitro culture system of mammals has been continuously developed. Specifically, in order to change a lot of culture conditions There have been attempts, for example, to cultivate embryos with the epithelial cells of the fallopian tubes, or to use a co-culture system and successive paired media or continuous media.

지금까지, 착상 전 수정란 배양의 최적화는 영양 요소, 즉 화학적으로 확정된 배지 내 성분에 대하여 초점이 맞춰져 왔다(Summers M.C. et al., 2003). 화학적으로 확정된 배지의 경우, 원하는 경우 다시 만들 수 있으며 효소와 성장인자와 같은 알려지지 않은 생물학적 활성이 없는 점의 이점을 가지고 있지만, 여전히 생체 내 시스템과는 거리가 있으며 수정란 발달에 최적의 조건으로는 적합하지는 않다.Up to now, optimization of pre-implantation incubation has been focused on nutritional factors, ie chemically defined media components (Summers M.C. et al., 2003). The chemically defined medium can be reconstituted if desired and has the advantage of no known biological activity such as enzymes and growth factors but is still far from the in vivo system and is the optimal condition for embryonic development It is not appropriate.

생체 외 배양 조건 중 물리적인 환경 (또는 인자)에 대한 관심이 증대되고 있다. 물리적인 인자 중에서 수정란의 밀도가 수정란 발달을 결정할 수 있는 중요한 인자로 여겨지고 있다. Interest in the physical environment (or factor) of the in vitro culture conditions is increasing. Among the physical factors, the density of the embryo is considered to be an important factor in determining embryo development.

이전의 연구들(Wiley etal., 1986; Paria and Dey, 1990; Lane and Gardner, 1992)들은 생체 외에서의 수정란의 발달은 수정란과 배양배지와의 부피 비율이 증가할수록 증가됨을 보고하고 있다.Previous studies (Wiley et al., 1986; Paria and Dey, 1990; Lane and Gardner, 1992) report that the development of embryos in vitro increases as the volume ratio between embryos and culture medium increases.

수정란의 밀도를 증가시킴으로써 성장인자들이 수정란 주위에 축적될 수 있어 배양 배지에 성장인자를 추가하는 것과 유사한 효과가 얻어질 수 있다는 것이다.By increasing the density of the embryo, growth factors can accumulate around the fertilized egg and an effect similar to adding a growth factor to the culture medium can be obtained.

생체 조건 즉, 자연임신이 이루어지는 체내 환경 조건과 체외수정과 배양의 체외 환경 조건(복강 내의 압력 또는 미지 인자) 은 반드시 일치하지 않을 수도 있다는 점에 착안하여 포배단계의 수정란을 기초실험모델로 하여 배양액의 삼투압을 체액보다 낮게 조절하여 사람을 포함한 포유동물의 높은 임신율을 유지하고자 하였다.In view of the fact that in vivo conditions, that is, in-vivo environmental conditions in which natural pregnancy occurs and in vitro environmental conditions (in vitro or in vivo pressure or unknown factors) of in vitro fertilization and culture may not necessarily coincide with each other, To maintain the high pregnancy rate of mammals including humans.

한국공개특허공보 제10-2004-60348호는, 체세포 복제 수정란의 체외배양시 배양액에 항산화제 및 산화질소 제거자를 함유시킴으로써 체세포 복제 수정란의 배발달 단계에서 배아 할구의 아폽토시스 발생을 효과적으로 저하시켜 배반포 발달율을 효과적으로 향상시키는 효과를 나타냄을 개시하고 있다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2004-60348 discloses that when an embryo cloned from a somatic cell cloned embryo contains an antioxidant and a nitric oxide eliminator in a culture solution, the generation of apoptosis in the embryo-transferring embryos is effectively reduced during the embryo development stage of somatic cell cloned embryos, Of the present invention.

한국공개특허공보 제2005-81524호는 양수세포를 인간배아 줄기세포 배양을 위한 영양세포층으로 이용하는 방법과, 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 이용하는 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법으로 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 유지하고, 분화 조건에서 배아체를 잘 형성하여, 다양한 조직으로 분화되는 능력을 지니는 것으로 기재되어 있다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 2005-81524 discloses a method of using amniotic fluid cells as a nutrient cell layer for culturing human embryonic stem cells and a method of using amniotic fluid cells as a culture medium for human embryonic stem cells . Human embryonic stem cells cultured in this manner are described to maintain cytolytic, immunological and genetic characteristics of undifferentiated cells, to form embryoid bodies under differentiation conditions, and to have the ability to differentiate into various tissues.

통상적으로 수정란 및 난자는 플라스틱 재질의 용기 또는 유리 접시(dish) 및 플라스크(flask)등으로 된 인큐베이터(incubator) 내에서 배양된다. 이와 같은 인큐베이터의 내부는 수정란 및 난자의 배양에 적당한 환경으로 유지된다. Generally, fertilized eggs and eggs are cultured in an incubator made of plastic containers or glass dishes and flasks. The interior of such an incubator is maintained in an environment suitable for culturing embryos and oocytes.

또한, 인큐베이터 내부에는 수정란 및 난자에 양분을 주는 것과 동시에 배양에 적당한 산도(pH)를 지키기 위하여 매일 혹은 수일에 한번씩 배양액의 교환이 이루어진다.In addition, in the incubator, the culture medium is exchanged every day or every several days to feed the fertilized eggs and eggs and to keep the pH suitable for the culture.

한편, 배란 후 수정된 배아가 자궁에 착상하기 전까지 대부분의 시간을 난관에서 보내는데, 난관의 내부는 복잡한 굴곡진 형상으로 형성된 점막주름 및 내강 등을 포함하나, 수정란이 배양되는 종래의 유체 칩은 그 배양공간이 평탄한 면으로 이루어져 생체와 같은 환경을 제공하지 못하는 문제점이 있었다.On the other hand, most of the time is spent in the fallopian tube until fertilization of the embryo after ovulation is completed. The inner part of the fallopian tube includes mucosal wrinkles and lumens formed in a complex curved shape, but the conventional fluid chip, The culture space has a flat surface and thus it is not possible to provide an environment similar to a living body.

본 발명은 수정란이 배양되는 배양공간에 낮은 레이놀즈 수(Reynolds Number)로 층류 유동하는 식각 용액과, 비식각 용액을 서로 교번으로 함께 흘려주어, 상기 식각 용액과 비식각 용액이 섞이는 상호확산영역(Interdiffusion region)에 의해 단면이 반원 형태를 이루는 복수 개의 미세홈으로 생체의 점막주름을 모사한 미세패턴을 형성하고, 상기 배양공간에서 배양되는 수정란에 화학적 자극과 물리적 자극을 줄 수 있는 모델 구현하여 실제 생체와 유사한 형태의 배양 환경을 제공하는 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. In the present invention, an etching solution which flows in a laminar flow with a low Reynolds number in a culture space in which an embryo is cultured and a non-etching solution are alternately flowed together to form an interdiffusion region in which the etching solution and the non- The present invention provides a method of forming a fine pattern that simulates the mucosal wrinkles of a living body with a plurality of micro grooves having a semicircular cross section by a region and realizing a model in which chemical stimulation and physical stimulation can be given to the embryo cultured in the culture space, The present invention provides a method of forming a fine pattern of an embryo culture apparatus that provides a culture environment similar to that of the embryo culture apparatus.

본 발명에 따른 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법은 수정란이 배양되는 배양공간을 내부에 형성한 본체와, 상기 본체의 배양공간 바닥면에 형성되어, 수정란을 안착하는 미세패턴, 및 상기 미세패턴의 그 표면에 형성되어, 상기 배양공간에서 배양되는 수정란에 화학적 자극모델을 구현하는 세포막을 포함하는 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치를 제조함에 있어서, 상기 미세패턴은 상기 본체의 배양공간에 전, 후방 길이를 따라 층류 유동하는 식각 용액과, 비식각 용액을 서로 교번으로 함께 흘려주어, 상기 식각 용액과 비식각 용액이 섞이는 상호확산영역(Interdiffusion region)에 의해 단면이 반원 형태를 이루는 복수 개의 미세홈들이 패턴으로 형성된다.A fine pattern forming method of an embryo culture apparatus according to the present invention comprises a body having a culture space in which an embryo is cultivated, a fine pattern formed on a bottom surface of the culture space of the body for seating an embryo, Wherein the micropattern is formed in a culture space of the main body and has a front and rear lengths in the culture space, And a plurality of fine grooves having a semicircular cross section are formed by an interdiffusion region in which the etching solution and the non-etching solution are mixed with each other, .

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여기서 본 발명에 따른 상기 패턴은 복수 개의 미세홈들이 상기 본체의 좌, 우 길이방향을 따라 일정한 간격으로 형성되어 파형(波形)의 패턴으로 이루어질 수 있다.The pattern according to the present invention may be formed in a pattern of a waveform by forming a plurality of fine grooves at regular intervals along the longitudinal direction of the main body.

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본 발명의 일 실시예에 따른 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법은 다음과 같은 효과를 가진다.The method of forming a fine pattern of an embryo culture apparatus according to an embodiment of the present invention has the following effects.

첫째, 낮은 레이놀즈 수(Reynolds Number)로 층류 유동하는 식각 용액과, 비식각 용액을 서로 교번으로 함께 흘려주어, 상기 식각 용액과 비식각 용액이 섞이는 상호확산영역(Interdiffusion region)에 의해 단면이 반원 형태를 이루는 복수 개의 미세홈으로 수정란이 배양되는 배양공간에 생체의 점막주름을 모사한 미세패턴을 형성하면서, 수정란에 화학적 자극을 주는 모델 및 물리적 자극주는 모델을 제공하여, 생체의 배양 환경과 가까운 배양 환경을 구현하면서 생체 배양모델을 모사하여, 기존 윤리적 문제를 수반하던 동물실험 및 임상실험을 일정부분 대체할 수 있는 효과를 가진다.First, an etching solution that flows in a laminar flow with a low Reynolds number and a non-etching solution are alternately flowed together, and the cross-sectional area is divided into semicircular shapes by an interdiffusion region where the etching solution and the non- A model providing a chemical stimulus to a fertilized egg and a physical stimulus model providing a microphotograph that mimics the mucosal wrinkles of a living body in a culture space in which a fertilized egg is cultured, By simulating the bio-culture model while implementing the environment, it has the effect of replacing some of the animal experiment and clinical experiment accompanied with the existing ethical problem.

둘째, 낮은 레이놀즈 수(Reynolds Number)로 층류 유동하는 식각 용액의 농도 구배 및 유속에 따른 식각 작용을 이용하여 식각 용액과 비식각용액의 상호확산영역(interdiffusion region)의 제어로 일정한 형태 또는 다양한 형태의 미세홈으로 생체 배양환경을 모사하므로, 종래보다 저렴하면서 고품질의 수정란 배양장치를 제공할 수 있는 효과를 가진다.Second, by controlling the interdiffusion region of the etch solution and the non-etch solution by using the concentration gradient and flow rate of the etchant flowing in a laminar flow with a low Reynolds Number, Since the living body culture environment is simulated with the fine grooves, it is possible to provide an inexpensive and high quality embryo culture apparatus that is cheaper than the conventional art.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치를 보인 예시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치가 제조되는 상태를 보인 예시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치의 미세패턴 상에 세포막을 형성한 상태를 보인 예시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치에 인장수단을 구비한 상태를 보인 예시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치에 셰이커를 구비한 상태를 보인 예시도이다.1 is an exemplary view showing an embryo culture apparatus using a fine pattern according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is an exemplary view showing a state in which an embryo culture apparatus using a fine pattern according to an embodiment of the present invention is manufactured.
FIG. 3 is a view illustrating a state where a cell membrane is formed on a fine pattern of an embryo culture apparatus using a fine pattern according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 illustrates an embryo culturing apparatus using a fine pattern according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 5 is a view illustrating an embryo culturing apparatus using a fine pattern according to an embodiment of the present invention with a shaker.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Prior to this, terms and words used in the present specification and claims should not be construed as limited to ordinary or dictionary terms, and the inventor should appropriately interpret the concepts of the terms appropriately The present invention should be construed in accordance with the meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들은 대체할 수 있는 균등한 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.Therefore, the embodiments described in the present specification and the configurations shown in the drawings are merely the most preferred embodiments of the present invention, and not all of the technical ideas of the present invention are described. Therefore, at the time of the present application, It should be understood that variations can be made.

본 발명은 수정란을 배양하는 배양장치를 구성하는데, 수정란이 배양되는 배양공간에 식각 용액의 농도 구배 및 유속에 따른 식각 작용을 이용한 식각을 통해 생체의 점막주름을 모사한 미세패턴을 형성하고, 상기 배양공간에서 배양되는 수정란에 화학적 자극과 물리적 자극을 줄 수 있는 모델 구현하여 실제 생체와 유사한 형태의 배양 환경을 제공하는 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법에 관한 것으로, 도면을 참조하여 더욱 상세하게 살펴보면 다음과 같다.The present invention provides a culture apparatus for culturing an embryo, comprising: forming a fine pattern simulating a mucosal wrinkle of a living body through etching using a concentration gradient of an etching solution and an etching action according to a flow rate; The present invention relates to a method of forming a fine pattern of an embryo culture apparatus that provides a culture environment similar to that of a living body by implementing a model capable of imparting chemical stimulation and physical stimulation to an embryo cultured in a culture space. More specifically, As follows.

도 1 및 도 2를 참조한 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치는 내부에 형성된 배양공간(101)에 수정란이 배양되는 본체(100)가 구비되는데, 상기 본체(100)는 폴리디메틸실록산(PDMS, Polydimethylsiloxane(폴리디메틸실록산)) 재질로 이루어진 고형의 PDMS구조체로, 통상의 기술과 같이 리소그라피 방식으로 육면체로 제조되고, 그 내부에는 수정란이 수용되어 배양되는 배양공간(101)이 형성된다.1 and 2, an embryo culture apparatus using a fine pattern according to an embodiment of the present invention includes a body 100 in which an embryo is cultured in a culture space 101 formed therein, A solid PDMS structure made of polydimethylsiloxane (PDMS, polydimethylsiloxane (polydimethylsiloxane)), which is manufactured in a hexagonal shape by a lithography method as in the conventional technique, and a culture space 101 in which a fertilized egg is housed and cultured .

이때 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 본체(100)의 배양공간(101) 바닥면에는 생체의 점막주름을 모사한 미세패턴(110)이 형성되는데, 상기 미세패턴(110)은 복수 개의 미세홈들이 집합되어 점막주름을 모사한다.At this time, a fine pattern 110 is formed on the bottom surface of the culture space 101 of the main body 100 according to an embodiment of the present invention. The fine pattern 110 is formed of a plurality of fine grooves 110, To collect mucosal wrinkles.

여기서 상기 복수 개의 미세홈들은 도 2에 도시한 바와 같이 PDMS로 이루어진 본체(100)를 식각 용액으로 식각하여 형성하는 것으로, 상기 배양공간(101) 전, 후 길이방향으로 식각 용액을 흘려, 식각 용액의 흐름에 의해 미세홈이 형성된다.As shown in FIG. 2, the plurality of fine grooves are formed by etching a body 100 made of PDMS with an etching solution. An etching solution is flowed in the longitudinal direction before and after the culture space 101, The fine grooves are formed.

이때 상기 식각 용액의 농도 구배 및 유속에 따른 식각 작용으로 상기 복수 개의 미세홈들은 본체(100)의 전, 후방을 따라 길이를 갖고, 미세홈의 단면이 반원 형태를 이룬다. At this time, the plurality of fine grooves have a length along the front and rear sides of the main body 100 by the etching operation according to the concentration gradient and the flow rate of the etching solution, and the cross section of the fine grooves has a semicircular shape.

상기 본체(100)를 식각하는 식각 용액인 TBAF(Tetrabutylammonium fluoride)는 낮은 레이놀즈 수(Reynolds Number)로 인하여 층류로 유동하는데, 상기 층류 유동 특성을 이용하여 식각 용액과 비식각 용액(NMP(1-Methyl-2-pyrrolidinone))을 상기 본체(100)에 함께 흘려주면 분자 확산에 의해 상호확산영역(Interdiffusion region)이 형성된다.TBAF (Tetrabutylammonium fluoride), which is an etching solution for etching the main body 100, flows in a laminar flow due to a low Reynolds number. Using the laminar flow characteristics, etching solution and non-etching solution (NMP -2-pyrrolidinone) is flowed together with the main body 100, an interdiffusion region is formed by molecular diffusion.

상기한 상호확산영역은 그 폭(너비)이 유체의 평균 속도에 반비례하고 확산계수에 비례되며, 상기 식각 용액의 흐름 길이가 길어짐에 따라 식각 용액과 비식각 용액이 섞이는 상호확산영역이 증가하게 되어, 식각에 의해 형성되는 홈의 단면 종횡비(aspect Ratio)가 증가한다. The width of the interdiffusion region is inversely proportional to the average velocity of the fluid and is proportional to the diffusion coefficient. As the flow length of the etching solution increases, the interdiffusion region where the etching solution and the non-etching solution are mixed increases , The aspect ratio of the groove formed by the etching increases.

따라서 상기 식각 용액의 농도 구배에 따른 식각 구배 형성을 통해 PDMS구조체에서 다양한 너비(w)와 깊이(δ), 비식각영역(G)의 변수를 제어하여 일정한 형태 또는 다양한 형태의 미세홈을 구현할 수 있다.Therefore, it is possible to realize a constant shape or various types of fine grooves by controlling various widths (w), depths (δ) and non-etching regions (G) in the PDMS structure through the etching gradient according to the concentration gradient of the etching solution have.

그리고 상기 미세패턴(110)은 상기한 식각 공정에 의해 형성된 미세홈의 집합으로 형성되는데, 이때 상기 미세홈을 상기 몸체(100)의 좌측, 우측방향을 따라 연속반복으로 형성하여, 상기 미세패턴(110)을 파형(波形)의 패턴으로 형성할 수 있다.The fine pattern 110 is formed as a set of fine grooves formed by the etching process. At this time, the fine grooves are continuously and repeatedly formed along the left and right directions of the body 100, 110 can be formed in a pattern of a waveform.

따라서 본 발명의 일 실시에에 따른 배양장치는 그 배양공간에는 복수 개의 미세홈이 연속반복형성되어 파형(波形)의 패턴으로 형성한 미세패턴(110)이 구비되어, 수정란이 생체의 점막주름을 따라 유동하면서 배양되는 배양환경을 모사할 수 있다. Therefore, the culture apparatus according to one embodiment of the present invention is characterized in that the culture space is provided with fine patterns 110 formed by a plurality of fine grooves continuously formed repeatedly in the form of a waveform (waveform) It is possible to simulate the culture environment that is cultured while flowing.

또한, 도 3에 도시한 바와 같이 상기 미세패턴(110)의 그 표면에는 수정란에 화학적 자극을 주는 화학적 자극모델인 세포막(111)을 형성하여 더욱 생체 난관에 가까운 환경을 제공할 수 있다.In addition, as shown in FIG. 3, a cell membrane 111, which is a chemical stimulation model that gives a chemical stimulus to the fertilized eggs, is formed on the surface of the fine pattern 110, thereby providing an environment closer to the inferior horn.

이때 상기 세포막(111)은 하이드로젤 등 천연 고분자 생체 재료를 이용하여 난관 상피세포인 Peg cells, Ciliated cells, intercalated cells 등을 배양하여 형성한 것으로, 상기 세포막(111) 상에 위치되는 수정란에 세포성장인자(Growth factors)가 제공하는 화학적 자극을 제공하여 수정란의 안정적 트랩 및 분화를 돕는다.The cell membrane 111 is formed by cultivating Peg cells, ciliated cells, intercalated cells, and the like, which are oviductal epithelial cells, using natural biomaterials such as hydrogels. In the cell membrane 111, Growth factors provide chemical stimuli to aid in the stable trapping and differentiation of embryos.

여기서 수정란은 그 특성상 대부분의 세포들과 같이 바닥에 붙어사는 부착 세포(adherent cell)가 아니라 둥둥 떠다니는 유동적인 세포(floating cell)이므로 단순히 확산만으로는 세포막(111)에서 분비된 성장인자를 받아들이지 않으므로, 확산(diffusion)과 대류(convection)가 혼합된 환경을 구현해 주어야 제대로 분화 및 성장이 가능하다.Because embryos are not floating adherent cells like floating cells in most of the cells, floating cells are floating cells. Therefore, they do not accept growth factors secreted from cell membrane (111) Diffusion and convection must be mixed to enable proper differentiation and growth.

더불어 도 4에 도시한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치는 상기 본체(100)의 좌, 우측에는 인장수단(200)이 각각 구비되는데, 상기 인장수단(200)은 상기 본체(100)를 선택적으로 좌, 우측방향으로 당겨, 상기 본체(100)를 팽창시키거나, 당기는 것을 해제하여 상기 본체(100)를 이완시켜, 상기 미세패턴(11) 상에 위치되어 배양되던 수정란에 물리적 자극을 주는 모델을 구현한다.4, the embryo culturing apparatus using the fine pattern according to the embodiment of the present invention is provided with tensile means 200 on the left and right sides of the main body 100, The main body 100 is selectively pulled in the left and right directions to relax the main body 100 by releasing the expansion or pulling of the main body 100. The main body 100 is positioned on the fine pattern 11, And implements a model that gives physical stimulation to the embryo.

이때 인장수단(200)의 일례로 공압챔버를 이용한 예를 살펴보면, 상기 인장수단(200)은 상기 본체(100)을 양단을 선택적으로 인장하여 상기 미세패턴(110)의 형상을 변형하기 위해 상기 본체(100)의 양단에 공압챔버를 형성하고, 상기 인장수단(200)인 공압챔버와 연결되는 에어흡입수단을 별도로 구비한다. The tensile means 200 may be configured to selectively stretch both ends of the main body 100 to deform the shape of the fine pattern 110, A pneumatic chamber is formed at both ends of the pneumatic cylinder 100, and air suction means connected to the pneumatic chamber, which is the tension means 200, is separately provided.

이때 상기 한 쌍의 공압챔버는 에어흡입수단과 연결되어 선택적으로 에어가 유입되거나 외부로 배출된다. At this time, the pair of pneumatic chambers are connected to the air suction means so that air is selectively introduced or discharged to the outside.

한편, 상기 한 쌍의 공압챔버는 사이에는 상기 본체(100)의 미세패턴(110)이 형성된 배양공간이 배치되어, 수정란의 배양이 이루어지도록 하고, 상기 에어흡입수단은 상기 공압챔버로 에어를 흡입하여 상기 공압챔버 내부를 선택적으로 진공상태로 만든다. A culture space in which the fine pattern 110 of the main body 100 is formed is disposed between the pair of pneumatic chambers to allow the culture of the embryo to be performed and the air suction unit sucks air into the pneumatic chamber Thereby selectively evacuating the inside of the pneumatic chamber.

여기서 상기 공압챔버에 진공이 걸리면 상기 본체(100)의 좌, 우측이 외측 방향으로 인장력이 발생하여, 상기 미세패턴(110)이 좌, 우방향으로 당겨지면서 미세패턴의 형태가 변형되고, 상기 공압챔버로 다시 에어를 주입하면 상기 공압챔버에 걸린 진공이 해제되면서 인장력이 소멸하여, 상기 미세패턴(110)이 원상태로 복원된다.Here, when a vacuum is applied to the pneumatic chamber, tensile force is generated in the left and right sides of the main body 100 to deform the shape of the fine pattern as the fine pattern 110 is pulled in the left and right directions, When the air is injected into the chamber again, the vacuum applied to the pneumatic chamber is released, and the tensile force disappears, so that the fine pattern 110 is restored to its original state.

따라서 상기 본체(100)의 미세패턴(110)을 기준하여 좌, 우측에 배치된 공압챔버에 에어가 흡입 또는 주입됨에 따라 상기 미세패턴(110)의 형태가 확장 또는 복원(수축)되는 것으로, 상기 미세패턴(110) 상에 배양되는 수정란에 물리적 자극을 제공할 수 있다.Accordingly, as the air is sucked or injected into the pneumatic chambers disposed on the left and right sides of the fine pattern 110 of the main body 100, the shape of the fine pattern 110 is expanded or restored (contracted) And may provide physical stimulation to the embryos cultured on the fine pattern (110).

상기 미세패턴(110)의 인장 및 복원을 반복하는 것으로, 배양공간 내에 확산(diffusion)과 대류(convection)가 발생하는 환경을 구현해 줌으로써 자궁을 비롯한 난관 내 운동 주파수에 따라 지속적 물리적 자극을 줄 수 있다. By repeatedly stretching and restoring the fine pattern 110, diffusion and convection are generated in the culture space, thereby providing continuous physical stimulation according to the frequency of intracavitary exercise including the uterus .

또한, 도 5에 도시한 바와 같이 수정란의 또 다른 물리적 자극수단으로 셰이커(300)를 제공할 수 있는데, 상기 셰이커(300)는 상기 본체(100)의 하부에서 상기 본체(100)를 지지하면서, 상기 본체(100)를 선택적으로 좌측편 또는 우측편으로 기울어지도록 시소운동시켜, 배양공간에 수용된 수정란이 미세패턴(110)의 미세홈들을 따라 좌측편 또는 우측편으로 연동되도록 한다.5, a shaker 300 may be provided as another physical stimulation means of the embryo. The shaker 300 supports the main body 100 in the lower part of the main body 100, The main body 100 is seesawed so as to be tilted to the left or right side so that the embryos housed in the culture space are interlocked with the left or right side along the fine grooves of the fine pattern 110.

따라서 상기 수정란 이동시 발생하는 전단응력에 의해 수정란의 분화율이 향상되는데, 배아 세포가 외부 유체의 흐름에 의해 휩쓸려 이동하게 되면 필연적으로 배아 스스로가 내놓는 자가분비생장인자(autocrine growth factor)들이 씻겨지는 현상이 발생되어, 배아가 더이상 분화를 하지 않는 단계로 들어가나, 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 세이커(300)에 의한 수정란의 이동은 외부 유체의 유입이 없는 상태에서, 공배양되어 있는 환경 내에서 주기적으로 왕복 이동을 하게 되면, 자체 손실이 없이 기계적, 화학적 자극의 이득을 얻게 되는 우수한 배양 환경을 제공할 수 있다.Therefore, when the embryonic cells are swept away by the flow of the external fluid, the autocrine growth factors released by the embryo themselves are washed away The embryo is moved to a stage in which the embryo no longer differentiates. However, according to one embodiment of the present invention, the movement of the embryo by the shaker 300 is performed in an environment in which co- Periodic reciprocal movement within the culture medium can provide an excellent culture environment in which mechanical and chemical stimulation benefits without self-loss.

본 발명은 도면에 도시된 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. Accordingly, the true scope of the present invention should be determined by the technical idea of the appended claims.

100: 본체
101: 배양공간
110: 미세패턴
111: 세포막
200: 인장수단
300: 셰이커100:
101: Culture space
110: fine pattern
111: cell membrane
200: tensile means
300: Shaker

Claims (6)

수정란이 배양되는 배양공간을 내부에 형성한 본체와, 상기 본체의 배양공간 바닥면에 형성되어, 수정란을 안착하는 미세패턴, 및 상기 미세패턴의 그 표면에 형성되어, 상기 배양공간에서 배양되는 수정란에 화학적 자극모델을 구현하는 세포막을 포함하는 미세패턴을 이용한 수정란 배양장치를 제조함에 있어서,
상기 미세패턴은
상기 본체의 배양공간에 전, 후방 길이를 따라 층류 유동하는 식각 용액과, 비식각 용액을 서로 교번으로 함께 흘려주어, 상기 식각 용액과 비식각 용액이 섞이는 상호확산영역(Interdiffusion region)에 의해 단면이 반원 형태를 이루는 복수 개의 미세홈들이 패턴으로 형성되는 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법.
A micropattern formed on the bottom surface of the culture space of the main body and on which the embryo is placed, and an embryo formed on the surface of the micropattern, the embryo being cultured in the culture space, In the production of an embryo culture apparatus using a fine pattern including a cell membrane that implements a chemical stimulation model,
The fine pattern
The etching solution and the non-etching solution which flow in a laminar flow flow along the front and rear lengths are alternately flowed together in the culture space of the main body, and the cross-sectional area is changed by the interdiffusion region in which the etching solution and the non- A method for forming a micropattern of an embryo culture apparatus in which a plurality of semicylindrical fine grooves are formed in a pattern.
청구항 1에 있어서,
상기 패턴은
복수 개의 미세홈들이 상기 본체의 좌, 우 길이방향을 따라 일정한 간격으로 형성되어 파형(波形)의 패턴으로 이루어진 수정란 배양장치의 미세패턴 형성방법.The method according to claim 1,
The pattern
Wherein a plurality of fine grooves are formed at regular intervals along the longitudinal direction of the body so as to form a pattern of a corrugated pattern. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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