KR101960352B1 - Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berry having antimicrobial activity against pathogenic microorganism, antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme secretion activity, acid resistance activity, bile resistance activity, heat resistance activity, prebiotics substrate availability and not producing biogenic amine and uses thereof - Google Patents

Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berry having antimicrobial activity against pathogenic microorganism, antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme secretion activity, acid resistance activity, bile resistance activity, heat resistance activity, prebiotics substrate availability and not producing biogenic amine and uses thereof Download PDF

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KR101960352B1 KR1020170152265A KR20170152265A KR101960352B1 KR 101960352 B1 KR101960352 B1 KR 101960352B1 KR 1020170152265 A KR1020170152265 A KR 1020170152265A KR 20170152265 A KR20170152265 A KR 20170152265A KR 101960352 B1 KR101960352 B1 KR 101960352B1
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양희종
류명선
정성엽
정도연
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재단법인 발효미생물산업진흥원
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Abstract

The present invention provides a Lactobacillus brevis SBB07 strain (KCCM12102P) from fermented berries, having great antimicrobial activities against harmful microorganisms, antibiotic resistance, antioxidant activities, enzyme secretion ability, acid resistance, bile resistance, heat resistance, probiotics substrate availability and not producing a biogenic amine; and a probiotic composition and an antimicrobial composition against harmful microorganisms, comprising the strain or a culture medium thereof as an active ingredient.

Description

유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스 SBB07 균주 및 이의 용도{Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berry having antimicrobial activity against pathogenic microorganism, antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme secretion activity, acid resistance activity, bile resistance activity, heat resistance activity, prebiotics substrate availability and not producing biogenic amine and uses thereof}Lactobacillus brevis SBB07 strain derived from a fermentation product of berries, which is excellent in antimicrobial activity, antibiotic resistance, antioxidative activity, acid secretion ability, acid resistance, biliary properties, heat resistance and prebiotics substrate availability and does not produce biogenic amines against harmful microorganisms And its use {Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berries having antimicrobial activity against pathogenic microorganism, antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme secretion activity, acid resistance activity, uses thereof}

본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스 SBB07 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a bacterium which is excellent in antibacterial activity, antibiotic resistance, antioxidative activity, enzyme releasing ability, acid resistance, bacteriostatic resistance, heat resistance and prebiotic substrate availability against harmful microorganisms, Brevis SBB07 strains and uses thereof.

발효식품은 다양한 미생물의 발효 과정을 통해 만들어지는 식품으로 발효 과정에 관여하는 미생물에 따라 식품의 성분이 분해되고 새로운 물질이 합성되어 독특한 풍미를 형성하게 되며, 미생물로부터 다양한 대사산물이 생성되어 발효 식품의 영양가와 저장성을 높일 수 있다. 하지만, 발효를 통해 바이오제닉 아민과 같은 유해한 물질 또한 생성되어 최근에는 국내뿐만 아니라 국외에서도 발효식품 내의 바이오제닉 아민의 높은 함량이 인체에 해로운 수준이라고 그 위험성을 보고하고 있다. 바이오제닉 아민은 식품의 발효과정에서 흔히 아미노산 탈카르복실화 효소(amino acid decarboxylase) 생산 미생물에 의해 생성되는 물질로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 아플라톡신(aflatoxin)과 같이 식품의 안전을 좌우하는 주요 인자 중 하나이다. 특히, 인체 내의 질소원, 호르몬 및 핵산과 같은 단백질의 전구체로서 생리 기능 조절에 관여하는 질소화합물로 체내 대사과정을 통해 균형을 이루고 있으나 과잉 섭취 시 구토, 알레르기, 혈압저하, 발암물질 등의 독성을 유발하게 된다. 사람이 섭취하게 되는 바이오제닉 아민은 식품을 통해 체내 축적되게 되며 한국인의 주요 섭취 식품인 전통 장류나 김치, 젓갈과 같은 발효식품에 높은 함량으로 존재하고 이는 발효 과정 중 발효 미생물의 아미노산, 온도, 산소 농도 및 pH와 같은 외부 환경에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 하지만, 국내의 발효식품의 경우, 일부 미생물의 작용에 의해 발효가 진행되는 것이 아니라 다양한 미생물이 관여하여 발효가 이루어지기 때문에 미생물에 의해 생성되는 바이오제닉 아민의 제어는 어려운 실정이다. 따라서 국내에서는 이를 해결하기 위해 식품의 발효 과정에서 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 등과 같은 바이오제닉 아민 비생성 및 분해 미생물을 활용해 바이오제닉 아민의 저감화를 위한 연구가 진행되고 있는 추세이다.Fermented foods are foods that are produced through the fermentation process of various microorganisms. Depending on the microorganisms involved in the fermentation process, the food components are decomposed and new substances are synthesized to form unique flavors. Various metabolites are produced from the microorganisms, The nutritional value and storage stability of the composition can be improved. However, harmful substances such as biorenic amines have also been produced through fermentation, and recently, it has been reported that the high content of biorenic amines in fermented foods is harmful to human body as well as at home and abroad. Biogenic amines are substances that are produced by microorganisms that produce amino acid decarboxylase, which is often used in the fermentation process of food. It is a major factor that affects food safety, such as Bacillus cereus and aflatoxin. It is one of the arguments. Especially, it is a precursor of proteins such as nitrogen source, hormone and nucleic acid in the body. It is a nitrogen compound that is involved in the regulation of physiological function. It is balanced through metabolic processes in the body. However, excessive intake causes toxicity such as vomiting, allergy, . Biogenic amines, which are consumed by humans, accumulate in the body through foods. They are present in high content in fermented foods such as traditional soy sauces, kimchi, and fermented foods, which are the main foods consumed by Koreans. This means that amino acids, It is known to be produced by an external environment such as concentration and pH. However, in the case of domestic fermented foods, it is difficult to control the biogenic amines produced by the microorganisms because fermentation proceeds not by the action of some microorganisms but by various microorganisms involved in fermentation. Therefore, in order to solve this problem, Bacillus subtilis , Bacillus Lee Kenny Po Ms (B. licheniformis), Saccharomyces cerevisiae ), Research is underway to reduce biogenic amines by utilizing biogenic amine non-producing and degrading microorganisms such as Lactobacillus plantarum .

유산균은 대표적인 GRAS(Generally recognized as safe) 균주로 발효식품에 존재하는 바이오제닉 아민의 생산을 저해하거나 분해하고, 발효과정에서 병원성 미생물의 증식 억제와 유기산과 단백질, 전분, 섬유소 등과 같은 분해효소를 생산함으로써 독특한 풍미와 조직감을 유지시켜줄 뿐만 아니라 체내 유용 장내 미생물로 존재하며 항암 및 혈중 콜레스테롤 저감 작용과 면역력 증진 등에 도움을 준다고 알려져 있어 의약품이나 건강기능 식품의 개발에 있어 사람의 건강에 이로운 작용을 하는 프로바이오틱스로 주목받고 있다. 프로바이오틱스는 프리바이오틱스인 락투로오스(lactulose), 락토수크로오스(lactosucrose), 올리고당(oligosaccharides), 라피노오스(raffinose), 이눌린(inulin), 스타키오스(stachyose) 등 복합다당류를 탄소원으로 사용하여 대표적인 프로바이오틱스인 바실러스(Bacillus)와 같은 고초균과 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균의 성장을 선택적으로 촉진시켜 주며, 인간과 동물의 장내 유해균을 제어함으로써 장내 환경을 개선시키는 역할을 한다고 보고되고 있다. 또한, PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ) 활성화를 통한 염증 억제 효과, 아토피성 피부염, 만성 신장질환 등에 대한 효능이 밝혀지고 있으며, 프리바이오틱스 소재를 활용한 신바이오틱스의 염증성 질환에 대한 효과, 장내 미생물 및 소화효소 활성에 미치는 영향 등과 같이 프로바이오틱스와 식품 원료로 사용가능한 프리바이오틱스를 조합하여 장내 환경을 효과적으로 개선할 수 있는 신바이오틱스에 대한 연구가 국내외에서 활발히 진행되고 있다. 특히, 국내에서도 건강에 대한 인식이 날로 증가하고 자연식품에 대한 선호나 항생제 남용으로 인한 문제 등으로 프로바이오틱스의 사용이 권장되고 있는 추세이나 대부분의 프로바이오틱스가 외국에서 수입한 생균을 원료로 사용하여 상품화되고 있기 때문에 수입대체 및 국내의 독자적 프로바이오틱스 균주의 개발과 관련 기술의 확보가 무엇보다도 중요한 시기이다.Lactic acid bacteria is a typical GRAS (Generally recognized as safe) strain that inhibits or degrades the production of biogenic amines present in fermented foods, inhibits the growth of pathogenic microorganisms during fermentation, and produces degradation enzymes such as organic acids, proteins, starch and fibrin , It is known that it maintains unique flavor and texture, and it is present as useful intestinal microorganism. It is known to help anticancer and blood cholesterol lowering function and immunity enhancement. Therefore, in the development of medicines and health functional foods, probiotics . Probiotics is a representative example of the use of complex polysaccharides such as lactulose, lactosucrose, oligosaccharides, raffinose, inulin, stachyose, etc., as prebiotics. Probiotic Bacillus Bacillus subtilis and bifidobacteria gambling, such as (Bacillus) Te Solarium (Bifidobacterium) and Lactobacillus (Lactobacillus) gives by selectively promoting the growth of the genus Lactobacillus, by controlling the intestinal harmful bacteria in humans and animals, reported to serve to improve the intestinal environment . In addition, the efficacy of PPAR-γ (peroxisome proliferator activated receptor-γ) activation inhibition of inflammation, atopic dermatitis, and chronic kidney disease has been revealed, and the efficacy of prebiotics in inflammatory diseases of synbiotics Effect on intestinal microorganism and digestive enzyme activity, and the like, which are capable of effectively improving the intestinal environment by combining probiotics and prebiotics usable as food materials, have been actively studied at home and abroad. Particularly, in Korea, the awareness of health is increasing day by day, and the use of probiotics is recommended due to the preference for natural food or the problem caused by the abuse of antibiotics, but most probiotics are commercialized using live bacteria imported from foreign countries Therefore, import substitution and development of independent probiotic strains in Korea and securing related technologies are the most important times.

따라서 본 발명에서는 블루베리 및 복분자와 같은 베리류와 베리류를 활용한 식초 및 엑기스로부터 프로바이오틱스 균주로 사용 가능한 유산균을 확보하고, 이들 분리주를 대상으로 바이오제닉 아민의 생성 여부와 항산화 및 효소 활성과 같은 다양한 기능성 효과를 검증하여 우수 균주를 선별하고 최종 선별한 유산균을 대상으로 프로바이오틱스 소재로의 활용 가능성을 검증하기 위한 연구를 진행하였다.Therefore, in the present invention, lactic acid bacteria which can be used as a probiotic strain can be obtained from vinegar and extracts using berries and berries such as blueberries and brambles, and a variety of functionalities such as production of biogenic amines and antioxidative and enzymatic activities The results of this study were as follows: 1.

한편, 한국등록특허 제1734367호는 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 락토바실러스 브레비스 SCML67 균주 및 이의 용도를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1734363호는 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 세포외 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 바실러스 서틸리스 SCM688 균주 및 이의 용도를 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스 SBB07 균주 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent No. 1734367 discloses a lactic acid bacteria-derived Lactobacillus brevis strain which is excellent in antibacterial activity, antibiotic resistance, antioxidant activity,? -Glucosidase and extracellular enzyme secretory activity against harmful microorganisms, Korean Patent No. 1734363 discloses a SCML67 strain and its use, and Korean Patent No. 1734363 discloses a strain of Bacillus subtilis SCM688, which has antibacterial activity against extracellular harmful microorganisms and an ability to secrete an extracellular enzyme and does not produce a biogenic amine, And its use. However, the present invention is not limited to the use of a fermented product derived from a fermented vermiculate which is excellent in antimicrobial activity, antibiotic resistance, antioxidative activity, enzyme releasing ability, acid resistance, biliary properties, heat resistance and prebiotics substrate availability, The Lactobacillus brevis SBB07 strain and its use have not yet been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 베리류 발효물에서 분리된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주(KCCM12102P)가 유해 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성, 10종의 항생제 내성, 항산화 활성, β-갈락토시다제(β-galactosidase), 셀룰라제(cellulase), 루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 계열의 프로테아제(protease), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin) 및 산성인산가수분해효소(acid phosphatase) 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention has been made in view of the above needs, and it is an object of the present invention to provide an antibacterial activity against Lactobacillus brevis SBB07 strain (KCCM12102P) isolated from a fermented vermiculis, Bacillus cereus which is a harmful microorganism, 10 antibiotic resistance, antioxidant activity,? -Galactosidase, cellulase, leucine arylamidase protease,? -Chymotrypsin (? -Chymotrypsin ) And acid phosphatase releasing activity, acid resistance, bile resistance, heat resistance and prebiotics substrate availability, and does not produce a biogenic amine. Thus, the present invention has been completed.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주(KCCM12102P)를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method for producing a biogenic amine which is excellent in antimicrobial activity against a harmful microorganism, antibiotic resistance, antioxidative activity, enzyme secretory ability, acid resistance, biliary properties, heat resistance and prebiotic substrate availability, Lactobacillus brevis SBB07 strain (KCCM12102P) derived from a fermentation product of berries is provided.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition for a harmful microorganism comprising the strain or a culture solution thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.The present invention also provides a probiotic composition comprising the above strain or a culture thereof as an active ingredient.

본 발명에서는 베리류 발효물에서 분리한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주가 유해 미생물의 증식을 억제하고, β-갈락토시다제(β-galactosidase), 셀룰라제(cellulase), 루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 계열의 프로테아제(protease), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin) 및 산성인산가수분해효소(acid phosphatase)를 분비하며, 항생제 내성, 항산화 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해세균에 대한 항균용 조성물 및 프로바이오틱 조성물에 매우 유용하게 사용될 수 있다.In the present invention, Lactobacillus brevis ( Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > brevis SBB07 strain inhibits the proliferation of harmful microorganisms and inhibits proliferation of β-galactosidase, cellulase, leucine arylamidase protease, alpha-chymotrypsin chymotrypsin and acid phosphatase and is excellent in antibiotic resistance, antioxidant activity, acid resistance, biliary properties, heat resistance and prebiotics substrate availability, and does not produce a biogenic amine Respectively. Therefore, the present invention can be very usefully used for antibacterial compositions and probiotic compositions for harmful bacteria containing Lactobacillus brevis SBB07 strain or a culture thereof as an active ingredient.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 선별된 5종의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 분리주들의 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 최종 선별된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 최종 선별된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주의 내산성(A), 내담즙성(B) 및 내열성(C)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 최종 선별된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주의 프리바이오틱스 기질에 따른 이용능을 비교한 것이다.FIG. 1 shows the antioxidative activities of the five isolates of Lactobacillus brevis selected according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 shows the results of phylogenetic analysis of the finally selected Lactobacillus brevis strain SBB07 according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows the acid resistance (A), bile resistance (B) and heat resistance (C) of the finally selected Lactobacillus brevis strain SBB07 according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a graph comparing the usability of the finally selected Lactobacillus brevis SBB07 strain according to the prebiotics substrate according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주(KCCM12102P)를 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides an antimicrobial activity, an antibiotic resistance, an antioxidative activity, an enzyme releasing ability, an acid resistance, a bile resistance, a heat resistance and a prebiotics substrate utilization ability of a harmful microorganism, Lactobacillus brevis SBB07 strain (KCCM12102P) derived from fermented berries is provided.

상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주(KCCM12102P)는 베리 발효물에서 분리하였으며, 유해 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 길항 능력을 가지며, β-갈락토시다제(β-galactosidase), 셀룰라제(cellulase), 루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 계열의 프로테아제(protease), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin) 및 산성인산가수분해효소(acid phosphatase) 분비능, 항산화 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질인 갈락토올리고당(galactooligosaccharide)의 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 균주이다. 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 8월 23일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM12102P).The Lactobacillus brevis strain SBB07 (KCCM12102P) was isolated from the fermentation product of berry, and has antagonistic ability against Bacillus cereus , which is a harmful microorganism, and β-galactosidase, A protease of alpha-chymotrypsin and an acid phosphatase, an antioxidative activity, an acid resistance, a bile acid resistance, an antioxidant activity, a cellulase, a leucine arylamidase protease, It is a strain which has excellent heat resistance and availability of galactooligosaccharide which is a prebiotic substrate and does not produce biogenic amine. The Lactobacillus brevis SBB07 strain was cultured in Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) Deposited on August 23, 2017 (Accession No .: KCCM12102P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to an embodiment of the present invention, the harmful microorganism may be Bacillus cereus , but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 항생제는 아미카신(amikacin), 세팔로신(cephalothin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 콜리스틴(colistin), 린코마이신(lincomycin), 카나마이신(kanamycin), 노르플록사신(norfloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to one embodiment of the present invention said antibiotic is selected from the group consisting of amikacin, cephalothin, ciprofloxacin, colistin, lincomycin, kanamycin, But are not limited to, norfloxacin, streptomycin, tetracycline, and trimethoprim / sulfamethoxazole.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 효소는 에스테라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase) 및 시스틴 아릴아미다제(cystine arylamidase) 계열의 프로테아제(protease), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성인산가수분해효소(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드로라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), 알파-글루코시다제(α-glucosidase), 베타-글루코시다제(β-glucuronidase) 및 N-아세틸-베타-글루코사미니다제(N-acetyl-β-glucosaminidase)일 수 있으며, 바람직하게는 β-갈락토시다제(β-galactosidase), 셀룰라제(cellulase), 루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 계열의 프로테아제(protease), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin) 및 산성인산가수분해효소(acid phosphatase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to an embodiment of the present invention, the enzyme is selected from the group consisting of an esterase lipase, a leucine arylamidase, a valine arylamidase, and a cystine arylamidase protease protease, alpha-chymotrypsin, acid phosphatase, Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, beta-galactosidase Glucuronidase, beta-glucosidase, beta-glucuronidase, alpha-glucosidase, beta-glucuronidase and N-acetyl-beta-glucosamidase. (N-acetyl-β-glucosaminidase), preferably β-galactosidase, cellulase, leucine arylamidase protease, , Alpha-chymotrypsin and acid phosphatase (acid ph osphatase). < / RTI >

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 내산성은 pH 2~5에 대한 내산성이며, 상기 내담즙성은 0.1~1%(w/v)의 담즙에 대한 내담즙성이며, 상기 내열성은 30~60℃의 온도에 대한 내열성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the strain according to an embodiment of the present invention, the acid resistance is an acid resistance to a pH of 2 to 5, and the bile resistance is an intragastric bility of a bile of 0.1 to 1% (w / v) Lt; RTI ID = 0.0 > 60 C, < / RTI >

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to an embodiment of the present invention, the biogenic amine may be histamine or tyramine, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 프리바이오틱스 기질은 갈락토올리고당(galactooligosaccharide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to an embodiment of the present invention, the prebiotic substrate may be, but is not limited to, a galactooligosaccharide.

본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.The biogenic amine of the present invention is formed from an amino acid by the action of an amino acid decarboxylase of a microorganism. When a biogenic amine is ingested from a food in excess of the decomposition limit of the human body, the biogenic amine may cause rash, local skin inflammation, Vomiting, nausea and diarrhea.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition for a harmful microorganism comprising the strain or a culture solution thereof as an active ingredient.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the antimicrobial composition according to one embodiment of the present invention, the harmful microorganism may be Bacillus cereus , but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the antimicrobial composition according to one embodiment of the present invention, the composition may preferably be in the form of a food, a food additive, a feed additive, or a medicament, and the food includes dairy products (milk, soy milk, processed milk), fermented milk , Ice cream, soups, beverages, alcoholic beverages, and vitamins, and may be selected from the group consisting of, but not limited to, beverages, beverages, yogurts), drinks, meats, sausages, breads, chocolates, candies, snacks, confections, pizzas, It is not limited.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산(folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.The food of the present invention may contain a functional food. In the functional food of the present invention, in addition to the above-mentioned active ingredients, various auxiliary ingredients may be added as necessary. In the case of the functional food of the present invention, vitamins such as vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B6, vitamin B12, folic acid, vitamin C, vitamin D3 and vitamin E, Iron, magnesium, potassium, zinc, etc., or lactic acid bacteria.

또한, 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.In addition, among the functional foods of the present invention, health drinks may contain various flavors or natural carbohydrates as additional components such as ordinary beverages. Examples of the flavoring agent include natural sweetening agents such as tau martin and stevia extract, and synthetic sweetening agents such as saccharine and aspartame. Examples of natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.

본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.When the strain obtained in the step of culturing the strain of the present invention or a culture solution thereof is used as a food additive, the strain or the culture thereof may be directly added, used in combination with other food or food ingredients, . The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use.

본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.The feed additive of the present invention is added to the base feed at a certain ratio. The basic diet may be composed of corn, soybean meal, whey, fish meal, molasses, salt, vitamin premix, and mineral premix. The vitamin premix can be composed of vitamin A, vitamin D, vitamin E, riboflavin and niacin, and the mineral premix can be composed of manganese, iron, zinc, calcium, copper, cobalt and selenium.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.The present invention also provides a probiotic composition comprising the above strain or a culture thereof as an active ingredient.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 프로바이오틱 조성물 제조방법에 따라 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조하여 이용할 수 있다. The composition of the present invention may further comprise conventional pharmaceutical carriers and excipients in addition to the above-mentioned active ingredients. Such compositions may be prepared by heat drying or freeze-drying according to a conventional method for producing a probiotic composition, .

상기와 같은 우수한 프로바이오틱 효과로 인해 상기 균주는 프로바이오틱 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 효과로 인해서 다양한 프로바이오틱 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.Due to the excellent probiotic effect as described above, the strain can be used for the production of a probiotic composition. In particular, the strain can be used for the production of foods, medicines, cosmetics, and health foods containing various probiotic compositions .

본 발명의 프로바이오틱 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
The manufacture of foods, medicines, cosmetics, health foods and the like containing the probiotic composition of the present invention can be manufactured by a method generally used in the industry.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.

재료 및 방법Materials and methods

1. 균주 분리 및 배양 1. Isolation and culture

프로바이오틱스 유산균으로 활용하기 위한 균주의 선별을 위해, 전라북도 순창군에서 재배된 베리류(블루베리, 복분자, 오디 및 아로니아) 생과와 베리류를 전통적으로 발효시켜 제조한 식초 및 엑기스 약 40여 종을 수집하여 균원 시료로 사용하였고, 수집한 1g의 시료를 채취하여 멸균된 0.85% NaCl용액 9㎖에 각 단계별로 희석한 후 희석액 100㎕을 락토바실러스 MRS 아가(DifcoTM, MI, USA) 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차로 분리주를 선별한 후 다시 순수 배양하여 균주를 분리하였다. 분리한 미생물은 다음 연구에 사용을 위하여 -80℃에서 보관하여 사용하였다.
For the selection of strains for probiotic lactic acid bacteria, about 40 kinds of vinegar and extract prepared by fermentation of berries (blueberry, bokbunja, audi and aronia) cultivated in Sunchang - gun, 1 g of the collected sample was sampled and diluted in 9 ml of sterilized 0.85% NaCl solution at each step. 100 μl of the diluted solution was plated on Lactobacillus MRS agar (Difco ™ , MI, USA) For 24 hours. Using the morphological differences of the microorganisms, isolates were firstly selected and then cultured again to isolate the strains. The separated microorganisms were stored at -80 ° C for use in the next study.

2. 2. 세포외Extracellular 효소 활성 Enzyme activity

분리 균주의 세포외 효소들 중 프로테아제(protease) 및 셀룰라아제(cellulase)의 활성은 양 등의 방법(Yang, H. J. et al., 2016, J. Life Sci., 26, 571-583)에 따라 측정하였다. 프로테아제 분비능은 스킴 밀크(skim milk)를 기질로 선택하여 2% 스킴 밀크(DifcoTM)에 1.5% 아가를 첨가한 스킴 밀크 아가 배지를 제조하여 사용하였고, 셀룰라제 분비능은 카르복실메틸 셀룰로오스(carboxylmethyl cellulose, CMC, JUNSEI chemical Co. Ltd.)을 기질로 선택하여 1% 카르복실메틸 셀룰로오스를 함유한 CMC 아가 배지를 제조하여 사용하였다. 상기 제조된 각각의 효소 분비능 측정배지에 각 균주의 배양 상등액을 0.45μm의 시린지 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100㎕씩을 직경 8mm의 준비한 웰(well)에 분주하여 25℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 프로테아제 및 셀룰라제 분비능을 투명환의 직경으로 프로테아제 및 셀룰라아제 분비능을 측정하였다.The activity of protease and cellulase in the extracellular enzymes of the isolate was determined by Yang et al., (1986), J. Life Sci. 26, 571-583). Protease secretion is skim milk (skim milk) for selecting as a substrate by 2% skim milk (Difco TM) 1.5% agar a scheme was prepared by using the milk agar medium was added to, cellulase secretion is carboxymethyl cellulose (carboxylmethyl cellulose , CMC, JUNSEI chemical Co. Ltd.) was used as a substrate to prepare a CMC agar medium containing 1% of carboxymethyl cellulose. The culture supernatant of each strain was sterilized with a 0.45 μm syringe filter (Sartorius, Frankfurt, Germany), and 100 μl of each supernatant was dispensed into a well of a diameter of 8 mm, After incubation for a time, protease and cellulase secretion ability was measured by the diameter of the transparent ring and protease and cellulase secretion.

또한, 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 효소활성을 분석하기 위해, 1.0% 에스쿨린(esculin) 및 0.5% 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate)을 첨가하여 제조한 락토바실러스 MRS 아가 플레이트에 분리주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 콜로니 주변에 생기는 검정색 투명환의 유무에 따라 베타-글루코시다제 효소활성을 조사하였다.
Further, in order to analyze the activity of β-glucosidase enzyme, a lactobacillus MRS agar plate prepared by adding 1.0% esculin and 0.5% ferric ammonium citrate was added with a separator After inoculation and incubation at 37 ° C for 24 hours, the activity of beta-glucosidase enzyme was examined according to the presence or absence of black transparent rings around the colonies.

3. 식품 부패 원인균에 대한 항균 활성3. Antimicrobial activity against food-causing bacteria

선별 균주의 식품 부패 원인균에 대한 항균 활성 측정은 병원성 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM40935 및 KCTC3624 균주가 각각 포함되어 있는 0.8% 소프트 아가 플레이트를 제조하여 한천 확산법(Lee, J. H. et al., 2009. Food Sci. Biotechnol., 18, 959-964)에 준하여 조사하였으며 0.45㎛의 멤브레인 필터(Sartorius)로 제균한 분리주의 배양 상등액 100㎕을 각각의 항균 활성 측정 배지에 분주한 뒤 30℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 억제환의 크기에 따라 항균 활성의 유무를 측정하였다.
The antimicrobial activity of the selective strains against the food spoilage bacteria was determined by preparing 0.8% soft agar plates containing the pathogenic bacteria Bacillus cereus KCCM40935 and KCTC3624, respectively, and using the agar diffusion method (Lee, JH et al., 2009 100 μl of the culture supernatant from the culture supernatant which was sterilized by a membrane filter (Sartorius) of 0.45 μm was dispensed into each of the antimicrobial activity measuring media and cultured at 30 ° C. for 24 hours The presence of antimicrobial activity was measured according to the size of the inhibitory ring formed by incubation.

4. 항산화 활성 측정4. Antioxidant activity measurement

분리주에 대한 항산화 활성은 DPPH(2,2-dipheyl-1-picryl-hydrazyl, Sigma-aldrich, MO, USA)을 일부 변환하여 사용하여 측정하였다(Lee, J. H. et al., 2009. Food Sci. Biotechnol., 18, 959-964). 100μM의 DPPH 에탄올 용액 180㎕에 20㎕의 배양 상등액을 첨가한 후, 반응 산물을 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 UV/VIS 스펙트로포토미터(SPECORD200, Analytic jena)로 517㎚에서 흡광도를 측정하여 하기식에 따라 항산화 활성을 측정하였다. 대조구로는 배양 배지만을 첨가한 실험구를 사용하여 동일하게 측정하였다.The antioxidant activity of the isolates was measured by partial conversion of DPPH (2,2-dipheyl-1-picryl-hydrazyl, Sigma-aldrich, MO, USA) (Lee, JH et al., 2009. Food Sci. Biotechnol , 18, 959-964). 20 mu l of culture supernatant was added to 180 mu l of a 100 mu M DPPH ethanol solution, the reaction product was reacted at room temperature for 30 minutes, and the absorbance at 517 nm was measured with a UV / VIS spectrophotometer (SPECORD200, Analytic jena) The antioxidant activity was measured according to the formula. As a control, the same experiment was carried out using a test tube containing a culture medium.

항산화 활성(%) = [1-(Abs517nm of sample)/(Abs517nm of control)]×100
Antioxidant activity (%) = [1- (Abs 517 nm of sample ) / (Abs 517 nm of control )] 100

5. 5. 바이오제닉Biogenic 아민Amine 생성 여부 조사 Investigation of creation

선별 분리주의 바이오제닉 아민 생성 여부 조사는 MRS 액체 배지에 각 분리주를 접종한 후, 37℃ 현탁 배양기(VS-1203P3V, Vision Scientific Co. Ltd., Daejeon, Korea)로 150 rpm에서 24시간 전배양 후, 1㎖의 전배양액을 히스타민 및 티라민 전구체 아미노산인 히스티딘 및 티로신이 0.1% 포함된 MRS 액체 배지 9㎖에 접종하고 37℃ 현탁 배양기에서 150 rpm으로 24시간 동안 본 배양하였다. 본 배양액은 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 바이오제닉 아민 분석을 위한 시료로 사용하였다. 시료 용액 및 표준 용액을 각각 0.5 ㎖ 취한 후 0.25㎖의 1,7-디아미노헵탄(1,7-diaminoheptane, Sigma-aldrich), 0.25㎖의 포화 Na2CO3 용액(Sigma-aldrich), 1% 아세톤(Sigma-aldrich) 및 0.4㎖의 댄실 클로라이드(dansyl chloride, Sigma-aldrich)을 혼합한 후 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 한 시료에 0.25㎖의 10% 프롤린(Sigma-aldrich)을 가한 후 잔량의 댄실 클로라이드를 제거한 뒤 2.5㎖의 에틸 에테르(Samchun, Seoul, Korea)를 가하여 3분간 진탕한 후, 분리된 상등액을 취하여 증발시키고 남은 잔사를 0.5㎖의 아세토니트릴에 정용하여 0.45㎛의 시린지 필터(Sartorius)로 여과하여 분석에 사용하였다. 바이오제닉 아민 분석을 위한 기기 분석 조건은 양 등의 조건(Yang, H. J. et al., 2016. J. Life Sci. 26, 571-583)에 따라 분석하였다.
In order to investigate whether biogenetic amines were produced, each isolate was inoculated into MRS broth and cultured at 37 ° C in a suspension incubator (VS-1203P3V, Vision Scientific Co. Ltd., Daejeon, Korea) for 24 hours at 150 rpm , 1 ml of the preculture was inoculated into 9 ml of MRS liquid medium containing 0.1% histidine and tyrosine amino acids histamine and tyramine precursor amino acids and cultured at 150 rpm for 24 hours in a 37 ° C suspension incubator. The culture broth was centrifuged at 13,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was used as a sample for biogenic amine analysis. 0.5 ml of each of the sample solution and the standard solution was taken and then 0.25 ml of 1,7-diaminoheptane (Sigma-aldrich), 0.25 ml of saturated Na 2 CO 3 solution (Sigma-aldrich) Acetone (Sigma-aldrich) and 0.4 ml of dansyl chloride (Sigma-aldrich) were mixed and derivatized at 45 ° C for 1 hour. To the derivatized sample, 0.25 ml of 10% proline (Sigma-aldrich) was added, and the remaining dansyl chloride was removed. 2.5 ml of ethyl ether (Samchun, Seoul, Korea) was added and the mixture was shaken for 3 minutes. The residue was evaporated and the residue was taken up in 0.5 ml of acetonitrile and filtered through a 0.45 μm syringe filter (Sartorius) for analysis. Instrumental assay conditions for biogenetic amine analysis are given in Yang et al. (Yang, HJ et al., 2016. J. Life Sci. 26, 571-583).

6. 선별 균주의 동정 및 계통수(phylogenic tree) 작성6. Identification of selection strains and phylogenic tree creation

최종 선별 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였다. 균주의 동정을 위하여 균체를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하고 ZR 균류/세균의 DNA 미니트렙 키트(Zymo Research Corp., CA., USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 유니버설 프라이머인 27F 및 1492R 프라이머로 합성하여 유전자 단편을 증폭시켰고(Jeong, S. J. et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 43, 550-556), 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR 정제 키트(QIAGEN)로 정제한 후 ㈜마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석한 후, 결과를 NCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 BLAST를 사용하여 GeneBank에 등록된 염기서열과 상동성을 비교하였다. 염기서열은 ExTaxone-e 서버(http://www.eztaxon.org)를 통해 표준 균주의 염기서열(서열번호 1)을 확보하여 MEGA 6.0 프로그램(Kumar, S. et al., 2004. Briefings Bioinf., 5, 150-163)을 사용하여 염기서열 간 상호 비교 후 계통도를 작성하였다. 계통도는 인접-결합(Neighbor-joining) 알고리즘(Saitou, N. and Nei, M., 1987, Mol. Biol. Evol., 4, 406-425)을 사용하였으며, 1,000회 반복으로 부트스트랩핑(bootstrapping)하여 작성한 계통도의 견고성을 확인하였다.
16S rRNA gene analysis was performed to identify the final selection strains. In order to identify the strain, the cells were inoculated into the MRS liquid medium, cultured at 37 ° C for 24 hours, centrifuged to recover the cells, and the ZR fungus / microbial DNA microtrep kit (Zymo Research Corp., CA., USA) And DNA was extracted. The extracted DNA was synthesized with universal primers 27F and 1492R primers to amplify the gene fragment (Jeong, SJ et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 43, 550-556) After purification by a PCR purification kit (QIAGEN), it was analyzed by the manufacturer of Macrogen, and the results were analyzed using the BLAST of NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Md., USA) The homology was compared. The nucleotide sequence can be obtained from the MEGA 6.0 program (Kumar, S. et al., 2004. Briefings Bioinf.) By securing the nucleotide sequence of the standard strain (SEQ ID NO: 1) through ExTaxone-e server (http://www.eztaxon.org). , 5, 150-163). The systematic diagram is shown in the Neighbor-joining algorithm (Saitou, N. and Nei, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4, 406-425) was used, and bootstrapping was performed 1000 times to confirm the robustness of the system.

7. API 7. API ZYM을ZYM 이용한 효소 활성 조사 Enzyme activity investigation

최종 선발한 균주의 효소 활성을 조사하기 위해, API ZYM 키트(bioMeriux Co., France)를 사용하여 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase) 외 18가지 효소 활성을 검사하였다. 최종 선발 균주를 MRS 고체배지에서 배양한 후 균체만을 회수하여 멸균수에 3회 세척한 후 멸균수에 현탁하여 시료를 준비하였다. 500㎕의 현탁액을 5㎖의 현탁 배지에 풀어준 후 Mcfarland(bioMerieux)로 탁도 5~6으로 조정하였다. 현택액을 ZYM 키트의 각 큐플에 접종하여 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 표현 활성 증가와 용해를 도와주는 ZYM A 및 B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨린 후 5분간 반응 후 색깔의 변화를 관찰하여 효소 활성 정도를 조사하였다. 색의 변화 정도에 따라 0~5까지의 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (=40 nanomoles)는 최대 강도의 반응이고 4~1은 각각 30, 20, 10 및 5 nmoles의 중간 값을 나타내며 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
To investigate the enzymatic activity of the final selected strains, 18 enzymatic activities were examined by using API ZYM kit (bioMeriux Co., France) and alkaline phosphatase. After the final selection strain was cultured in MRS solid medium, only cells were recovered and washed three times in sterilized water, and suspended in sterilized water to prepare a sample. 500 [mu] l of the suspension was dissolved in 5 ml of suspension medium and then adjusted to a turbidity of 5-6 with McFarland (bioMerieux). The current solution was inoculated on each cube of the ZYM kit and incubated at 37 ° C for 4 hours. ZYM A and B reagents were added dropwise to each cuplet to increase the expression activity and dissolve. After 5 minutes of reaction, And the degree of enzyme activity was examined. According to the degree of change of color, 0 to 5 values are indicated, 0 is negative reaction, 5 (= 40 nanomoles) is the maximum intensity response, 4 ~ 1 are medium values of 30, 20, 10 and 5 nmoles And 3 cases were positive.

8. 8. 내산성Acid resistance , , 내담즙성My bile 및 내열성 분석 And heat resistance analysis

위산에 대한 저항성을 확인하기 위해 pH 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0(in 0.1N HCl)로 조정한 MRS 액체배지에 균주(106 CFU/ml)를 접종하여 30분 정치 후 시료를 회수하여 생균수를 측정하였다. 생존율은 대조구와 비교하여 생균수가 증가한 실험구를 내산성을 가진 것으로 평가하였다. 내담즙성 평가는 옥스갈(Oxgall, Sigma-aldrich)을 0, 0.1, 0.3, 0.5 및 1.0%(w/v)의 농도로 첨가하여 제조한 MRS 액체배지에 유산균 배양액 1%(2.0×109 CFU/ml)를 접종한 후 37℃에서 6시간 동안 배양하여 내산성과 동일한 방법으로 균의 생존율을 측정하였다. 열에 대한 안전성은 30℃, 40℃, 50℃ 및 60℃로 유지된 MRS 액체배지에 일정량의 균주를 접종한 후 10분간 정치한 이후에 생존한 미생물 수를 계수하여 측정하였다.
To confirm the resistance to gastric acid, strains (10 6 CFU / ml) were inoculated into the MRS liquid medium adjusted to pH 2.0, 3.0, 4.0 and 5.0 (in 0.1 N HCl) and allowed to stand for 30 minutes. Were measured. The survival rate of the experimental group was higher than that of the control group. To evaluate the biliary properties, 1% (2 × 10 9) of the lactic acid bacteria culture was added to the MRS liquid medium prepared by adding Oxgall (Sigma-aldrich) at the concentrations of 0, 0.1, 0.3, 0.5 and 1.0% (w / v) CFU / ml) and incubated at 37 ° C for 6 hours. The survival rate of bacteria was measured by the same method as that of acid tolerance. The safety for heat was determined by counting the number of surviving microorganisms after inoculating a certain amount of strain into the MRS liquid medium maintained at 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C and 60 ° C, and allowing to stand for 10 minutes.

9. 선별 균주의 항생제 감수성 측정9. Antimicrobial Susceptibility Measurement of Screening Strain

항생제 감수성 시험은 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)의 디스크 확산법(disk diffusion)으로 실시하였다. 사용한 항생제 디스크(BBL Sensi-disc, Becton Dickinson Co., USA)는 아미카신(amikacin, 30㎍, AN), 아목시실린/클라불란산(amoxicillin/clavulanic acid, 20㎍/10㎍, AMC), 암피실린(ampicillin, 10㎍, AM), 세팔로신(cephalothin, 30㎍, CF), 시프로플록사신(ciprofloxacin, 5㎍, CIP), 콜리스틴(colistin, 10㎍, CL), 독시사이클린(doxycycline, 30㎍, D), 에리스로마이신(erythromycin, 15㎍, E), 젠타마이신(gentamicin, 10㎍, GM), 린코마이신(lincomycin, 2㎍, L), 카나마이신(kanamycin, 30㎍, K), 네오마이신(neomycin, 30㎍,, N), 노르플록사신(norfloxacin, 10㎍, NOR), 스트렙토마이신(streptomycin, 10㎍, S), 테트라사이클린(tetracycline, 30㎍, TE), 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole, 1.25㎍/23.75㎍, SXT)로 총 16종을 사용하였다. 감수성 시험 방법은 균주를 물러-힌트 액체배지(Merck, Germany)에 접종하고 37℃에서 5시간 동안 배양한 후 Macfarland(bioMerieux) No. 0.5로 탁도를 맞춘 후 물러-힌트 아가(Difco)에 도말하여 30분간 건조시킨 후 상기 16종의 항생제 디스크를 놓은 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 각 항생제에 대한 억제환의 크기를 측정하고 CLSI 가이드라인에 의해 감수성과 내성을 판정하였다.
Antibiotic susceptibility testing was performed by disk diffusion of the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Amikacin (30 μg, AN), amoxicillin / clavulanic acid (20 μg / 10 μg, AMC), ampicillin (Becton Dickinson Co., USA) 10 μg of AM), cephalothin (30 μg of CF), ciprofloxacin (5 μg of CIP), colistin (10 μg of CL), doxycycline ), Erythromycin (15 g, E), gentamicin (10 g, GM), lincomycin (2 g, L), kanamycin (30 g, K), neomycin Streptomycin, 10 μg, S), tetracycline (30 μg, TE), trimethoprim / sulfamethoxazole (trimethoprim) / sulfamethoxazole, 1.25 / / 23.75,, SXT). For the susceptibility test, the strain was inoculated into a Leek-hint liquid medium (Merck, Germany) and incubated at 37 ° C for 5 hours. 0.5, dried on a Muller hint agar (Difco), and dried for 30 minutes. The 16 antibiotic disks were then placed and cultured at 37 ° C for 24 hours. After the culture was completed, the size of inhibitory rings for each antibiotic was measured and sensitivity and tolerance were determined by CLSI guideline.

10. 10. 프리바이오틱스Prebiotics 기질 이용 능력 Ability to use substrate

최종 선별 균주의 프리바이오틱스 기질 사용 능력은 앤 등의 방법(Ann, E. Y. et al., 2007. Int. J. Food Sci. Technol., 42, 411-419)을 일부 변형하여 측정하였다. 프리바이오틱스 기질로는 글루코오스(glucose), 자일리톨(xylitol), D-타가토오스(D-Tagatose), 이눌린(inulin), 락티톨(lactitol), 락툴로오스(lactulose), 프락토올리고당(fructooligosaccharide, FOS) 및 갈락토올리고당(galactooligosaccharide, GOS)으로 총 8종을 사용하였으며, 96-웰 플레이트를 이용하여 프리바이오틱 최소배지(0.5% 펩톤, 0.25% 아세트산나트륨, 0.05% 1M MgSO4·7H2O, 0.05 1M MgSO4·4H2O, 0.5% 트윈 80, 0.1% 디암모늄 시트르산, 0.1% 디포타슘 포스페이트 및 2% 프리바이오틱 기질)와 기질이 첨가되지 않은 배지에 선별 균주의 배양액을 1.0×106 CFU/ml가 되도록 접종한 다음 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 배양액을 회수하여 600㎚에서 흡광도를 측정하여 기질 이용 능력을 측정하였다.
The prebiotics substrate capacity of the final screening strains was measured by the method of Ann et al., Ann. EY et al., 2007. Int. J. Food Sci. Technol., 42, 411-419. Examples of the prebiotics substrate include glucose, xylitol, D-tagatose, inulin, lactitol, lactulose, fructooligosaccharide, (0.5% peptone, 0.25% sodium acetate, 0.05% 1M MgSO 4 .7H 2 (0.5%), and the like) in a 96-well plate using a total of 8 kinds of microorganisms O, 0.05 1M MgSO 4 .4H 2 O, 0.5% Tween 80, 0.1% diammonium citrate, 0.1% dipotassium phosphate and 2% prebiotic substrate) and the medium to which the substrate was not added, 10 6 CFU / ml, cultured at 37 ° C for 24 hours and 48 hours, and the absorbance was measured at 600 nm to measure the substrate utilization ability.

실시예Example 1. 미생물의 분리 1. Isolation of microorganisms

프로바이오틱스 유산균의 분리를 위해 전라북도 순창군에서 재배된 베리류(블루베리, 복분자, 오디 및 아로니아) 생과와 베리류를 전통적인 방법으로 발효시켜 제조된 식초 및 엑기스 48종을 수집하였다. 수집한 시료는 단계 희석법을 이용하여 유산균 선택 배지에 배양하고 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 42종의 분리주를 확보하였다.
For the isolation of probiotic Lactobacillus, 48 kinds of vinegar and extracts were prepared by fermenting berries (blueberry, bokbunja, audi and aronia) cultivated in Sunchang - gun, Jeollabuk - do with traditional methods. The collected samples were cultured in lactic acid bacteria selective medium using the stepwise dilution method and 42 kinds of isolates were obtained with the naked eye according to the morphological characteristics such as the shape and color of the colonies.

실시예Example 2. 분리주의  2. Removing Attention 세포외Extracellular 효소 활성 Enzyme activity

일반적으로 유산균은 종류에 따라 엔도펩티다제(endopeptidase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 디펩티다제(dipeptidase) 등 다양한 종류의 프로테아제(protease)를 생산하여 발효식품에서 구수한 맛 성분인 유리 아미노산의 함량에 영향을 주며, 특히 발효 중 프로테아제 이외에도 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 등과 같은 다양한 효소를 생성하여 식품의 풍미 및 조직감뿐만 아니라 다양한 기능성을 갖는 2차 산물이 생성된다고 알려져 있다(Law, J. and Haandrikman, A., 1997, Int. Dairy J. 7, 1-11). 따라서 앞서 선별한 42종의 분리주를 대상으로 프로테아제, 셀룰라아제 및 β-글루코시다제 3종에 대한 세포외 효소 활성을 측정한 결과, 9종의 분리주에서 프로테아제, 셀룰라아제 및 β-글루코시다제 3가지 효소를 생성하는 것을 확인하였다(표 1). 특히, 비배당체의 형성과 이소플라본 배당체의 가수분해에 필요한 촉매작용을 한다고 보고된 β-글루코시다제에 대하여 활성을 갖고 있어(Esaki, H. et al., 2004. J. Jpn. Soc. Food Sci. Technol., 51, 47-53), 전통발효식품에 주로 존재하는 대두 이소플라본 배당체인 제니스틴 및 다이드진의 체내 흡수를 위해 비배당체 형태로 전환하는 생물 전환 공정에 활용가능성을 갖는 β-글루코시다제 활성이 우수한 SBB07, SBB11 및 SOD62 분리주를 선별하였다.Generally, lactic acid bacteria produce various kinds of protease such as endopeptidase, aminopeptidase and dipeptidase according to the kind of free amino acid, which is a flavor ingredient in fermented foods. It is known that a secondary product having diverse functions as well as flavor and texture of food is produced by producing various enzymes such as amylase and cellulase in addition to protease during fermentation (Law, J and Haandrikman, A., 1997, Int. Dairy J. 7, 1-11). As a result of measuring the extracellular enzyme activities of protease, cellulase and β-glucosidase in the 42 isolates selected from the above, it was found that the protease, the cellulase and the β-glucoside three enzymes (Table 1). In particular, it has activity against β-glucosidase reported to catalyze the formation of non-glycosides and hydrolysis of isoflavone glycosides (Esaki, H. et al., 2004. J. Jpn. Soc. Food Sci. Technol., 51, 47-53), β-glucosyltransferase (β-glucosyltransferase), which has potential to be used in the bioconversion process to convert non-glycosyltransferable forms of soybean isoflavone glycosides, genistin and daidzin, SBB07, SBB11 and SOD62 isolates with excellent cytidase activity were selected.

세포외 효소 활성 측정Measurement of extracellular enzyme activity 효소enzyme 선별 분리주Screening separator SBB07SBB07 SBB11SBB11 SBBJ43SBBJ43 SBBJ56SBBJ56 SOD62SOD62 프로테아제a Protease a 1414 1313 1515 1313 1313 셀룰라아제a Cellulase a 1212 88 88 1212 88 β-글루코시다제a β-glucosidase a 2121 1515 88 88 2020

a클리어존 크기(직경, mm)
 a Clear zone size (diameter, mm)

실시예Example 3. 식품유해미생물에 대한 항균 활성 측정 3. Measurement of antimicrobial activity against food harmful microorganisms

유산균은 발효 중 생산하는 각종 유기산에 의해 식중독 원인균 및 부패 세균과 같은 유해미생물의 증식을 억제하고, 식품의 저장성을 높여주기 때문에 항균 활성이 있는 유산균 및 이를 이용한 식품 제조에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다(Lim, S. M. et al., 2014. Kor. J. Microbiol., 50, 334-344). 식품유해미생물에 대한 항균 활성은 앞서 효소활성 측정을 통하여 선별한 1차 분리주 9종을 대상으로 바실러스 세레우스에 대하여 항균 활성을 조사하였다. 바실러스 세레우스 KCTC 3624 및 KCCM 40935으로 2종에 대하여 항균 활성을 측정한 결과, 9종의 선별 균주 모두 유해미생물에 대하여 항균 활성을 갖고 있었으며(데이터 미제시), 분리주 중에서도 SBB07, SBB11, SBBJ43, SBBJ56 및 SOD62 5종이 바실러스 세레우스 KCTC 3624 및 KCCM 40935에 대하여 우수한 항균 활성을 지니고 있었다(표 2). 따라서 앞서 선별한 9종의 분리주는 식품유해미생물에 대해 항균 활성을 모두 지니므로 식품 내의 부패균의 증식을 억제하여 식품 보존 및 유통과정에서의 산업적 적용이 가능한 분리주로 활용성이 높음을 확인하였다. Lactic acid bacteria inhibit the growth of harmful microorganisms such as food poisoning causative bacteria and spoilage bacteria by various organic acids produced during fermentation and increase the storage stability of foods, so that there are many studies on the production of lactic acid bacteria having antimicrobial activity and foods using them (Lim, SM et al., 2014. Kor J. Microbiol., 50, 334-344). Antimicrobial activity against food harmful microorganisms was investigated in nine primary isolates selected by enzyme activity measurement. Among the isolates, SBB07, SBB11, SBBJ43, and SBBJ56 were found to have antimicrobial activity against the harmful microorganisms when the antibacterial activity of Bacillus cereus KCTC 3624 and KCCM 40935 was measured. And SOD62 5 had excellent antibacterial activity against Bacillus cereus KCTC 3624 and KCCM 40935 (Table 2). Therefore, it was confirmed that the nine isolates selected above have high antimicrobial activity against food harmful microorganisms, so that they can suppress the propagation of spoilage bacteria in food and have high availability for industrial application in food preservation and distribution process.

항균 활성 측정Antimicrobial activity measurement 바실러스 세레우스Bacillus cereus 선별 분리주Screening separator SBB07SBB07 SBB11SBB11 SBBJ43SBBJ43 SBBJ56SBBJ56 SOD62SOD62 KCTC 3624a KCTC 3624 a 1515 1515 1616 1616 1616 KCCM 40935a KCCM 40935 a 1818 1616 1515 1414 1414

a클리어존 크기(직경, mm)
 a Clear zone size (diameter, mm)

실시예Example 4. 항산화 활성 4. Antioxidant activity

상기 세포외 효소 활성 및 항균 활성 측정 실험을 통해 선발된 5종의 분리주를 대상으로 DPPH에 의한 자유 라디칼 제거 효과를 측정하는 방법으로 항산화 활성을 조사하였다. DPPH는 항산화 활성을 측정하기 위한 대표적인 기질로 페놀성 물질에 대한 항산화 작용의 지표 중 하나이며, 항산화제는 식용 유지나 지방질 식품의 가공 및 저장 중에 산화로 산패, 냄새, 풍미의 변화 및 변색의 방지를 위해 자유 라디칼에 전자를 공여하는 식품 내 지방질 산화를 억제하고(Jang, J. K. and Han, J. Y., 2002. Korean J. Food Sci. Technol., 34, 524-528), 인체 내 산소 자유 라디칼 반응이 생체 조직의 노화나 질병에 영향을 미치며 다양한 페놀성 물질들은 이러한 자유 라디칼 소거능이 우수하여 노화나 질병 예방하는데 중요한 역할을 한다(Park, C. K. et al., 2000. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 29, 518-524). 따라서 DPPH를 이용하여 분리주의 항산화 활성을 측정한 결과, 선별 균주 중 SBB07, SBBJ56 및 SBBJ62 분리주가 15% 이상의 DPPH 활성을 나타냈으며, 특히 SBB07 분리주가 24.25%로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다(도 1).
The antioxidant activity of 5 different isolates selected from the extracellular enzyme activity and antimicrobial activities was determined by measuring the free radical scavenging effect by DPPH. DPPH is one of the indicators of antioxidant activity against phenolic substances as a representative substrate for measuring antioxidant activity, and antioxidants are used to prevent oxidative degradation, odor, change of flavor and discoloration during processing and storage of edible oils and fats (Jang, JK and Han, JY, 2002. Korean J. Food Sci. Technol., 34, 524-528), the oxygen free radical reaction in the human body inhibits the lipid oxidation The effects of various phenolic substances on the aging and disease of tissues are excellent because of their excellent free radical scavenging ability (Park, CK et al., 2000. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. , 29, 518-524). As a result, DPPH activity was measured using DPPH. As a result, DPPH activity of SBB07, SBBJ56 and SBBJ62 isolates showed 15% or more, and SBV07 isolate showed the highest antioxidative activity (Figure 1 ).

실시예Example 5.  5. 바이오제닉Biogenic 아민Amine 생성 확인 Confirm creation

바이오제닉 아민은 주로 단백질 함유량이 높은 국내 전통 식품이 발효 및 숙성되거나 부패되는 과정에서 아미노산의 탈탄산 반응에 의해 생성되거나 탈탄산효소활성을 갖는 미생물에 의해 생성된다. 특히, 히스타민과 티라민은 사람이 섭취 시 알레르기를 유발시키거나 혈압상승 및 두통을 일으킬 수도 있어(Yang, H. J. et al., 2016. J. Life Sci. 26, 571-583), 식품 안전성 측면에서 바이오제닉 아민에 대한 조사가 매우 중요하다. 따라서 선별 분리주를 대상으로 전구체 히스티딘과 티로신이 포함된 액체 배지에 선별 균주 5종을 접종 및 배양하여 분리주가 생성한 히스타민 및 티라민의 함량을 HPLC로 측정하였다. 그 결과, 하기 표 3에 개시한 바와 같이 SBB11, SBBJ56 및 SOD62 분리주에서는 바이오제닉 아민이 검출은 되었지만 정량이 되지 않는 매우 낮은 수치를 나타내었고, SBB07 및 SBBJ43 분리주에서는 히스타민과 티라민이 모두 검출되지 않은 것을 확인하였다. 식품 내의 히스타민 및 티라민은 약 100㎎ 이상을 섭취해야 중독 증상을 일으킬 수 있다고 보고되고 있어, 정량은 되지 않았지만 검출이 된 3종의 분리주도 모두 유해한 수준은 아님을 확인하였다. 따라서 선별한 균주 5종을 대상으로 효소 활성, 항균 활성 및 항산화 활성 측정 결과와 바이오제닉 아민 분석결과를 비교하였을 때, SBB07 분리주의 활성이 가장 우수하고 다양한 식품 분야에 적용이 가능하기 때문에 최종 선별 균주로 SBB07 분리주를 선택하였다. Biogenic amines are mainly produced by microorganisms that are produced by decarboxylation of amino acids or have decarboxylase activity during the fermentation, aging, or decay of domestic traditional foods with high protein content. In particular, histamine and tyramine may induce allergies or hypertension and headaches in human intake (Yang, HJ et al., 2016. J. Life Sci. 26, 571-583) Research on genic amines is very important. Therefore, the amount of histamine and tyramine produced by the isolate strain was measured by HPLC by inoculating and culturing 5 kinds of the selected strains in the liquid medium containing the precursor histidine and tyrosine. As a result, as shown in the following Table 3, SBB11, SBBJ56 and SOD62 isolates showed a very low value in which biogenic amines were detected but not quantified, and SBB07 and SBBJ43 isolates did not detect histamine and tyramine Respectively. It has been reported that histamine and tyramine in foods should be ingested more than 100 mg to cause poisoning symptoms. Therefore, it was confirmed that not all of the three isolates that were detected were harmful. Therefore, when the results of enzyme activity, antimicrobial activity and antioxidative activity of the five selected strains were compared with those of the biogenic amine analysis, the SBB07 isolating activity was the most excellent and it could be applied to various food fields, Was selected as the SBB07 isolate.

세포외 효소 활성 측정Measurement of extracellular enzyme activity 바이오제닉 아민Biogenic amine 선별 분리주Screening separator SBB07SBB07 SBB11SBB11 SBBJ43SBBJ43 SBBJ56SBBJ56 SOD62SOD62 히스타민Histamine NDb ND b NDND NDND NQc NQ c NQNQ 티라민Tyramine NDND NQNQ NDND NQNQ NDND

bN.D: 미검출 b ND: Not detected

cN.Q: 미정량
c NQ:

실시예Example 6. 최종 선별 균주의 동정 6. Identification of the final selection strains

최종 선별한 SBB07 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과를 이용하여 BLAST 검색 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 판명되었으며, Eztaxon 서버에서 표준 균주와 상동성을 비교 분석하였다. 서열 정렬(sequence alignment) 분석에 사용한 파라미터(parameter) 및 옵션(option) 값은 단백질 무게 매트릭스로 고넷 시리즈를 사용하였고, 갭 오프팅(gap opening) 15, 갭 익스텐션(gap extension) 6.66 및 딜레이 트랜지션 웨이트 0.5로 설정하였고, 갭 패널티 5, 케이-투플 사이즈 2, 탑 디아그널스 4 및 윈도우 사이즈 4로 설정하였다. 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 SBB07 균주(1302bp)는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) ATCC 367(NC 008497) 균주와 99%의 상동성을 나타내었다. 염기서열을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위해 진화 거리(evolutionary distances)의 추론은 MSL(maximum composite Likehood) 방법을 모델로 사용하였다. 최종적으로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07로 명명하였고, SBB07 균주는 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 락토바실러스 브레비스 KCCM 12102P로 기탁하였다.
The result of BLAST search was confirmed to be Lactobacillus brevis using the 16S rRNA gene sequence analysis result of SBB07 strain selected last time, and the homology with the standard strain was compared and analyzed in Eztaxon server. Parameter and option values used for sequence alignment analysis were Gonet series as the protein weight matrix and were used for gap opening 15, gap extension 6.66 and delay transition weight 0.5, a gap penalty of 5, a K-tuple size of 2, a top diagonal of 4, and a window size of 4. As a result, SBB07 strain (1302 bp) showed 99% homology with Lactobacillus brevis ATCC 367 (NC 008497) strain as shown in Fig. Inference of evolutionary distances to create a phylogenetic tree using base sequences was modeled using the maximum composite Likehood (MSL) method. Finally, the strain SBB07 was named Lactobacillus brevis SBB07, and the strain SBB07 was deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) with Lactobacillus brevis KCCM 12102P.

실시예Example 7. API  7. API ZYMZYM 키트를Kit 이용한  Used 락토바실러스Lactobacillus 브레비스Brevis SBB07SBB07 균주의 Strain 효소 활성Enzyme activity

일반적으로 유산균이 프로바이오틱스로 사용되기 위해서는 이들이 생산하는 효소 또한 매우 중요한 부분을 차지하고 있어 최종 선별한 SBB07 균주의 효소 생산 여부를 확인하기 위해 API ZYM 키트를 이용하여 조사하였다. 그 결과, 하기 표 4에 개시한 바와 같이 SBB07 균주는 10 nmole의 루신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase) 및 시스틴 아릴아미다제(cystine arylamidase) 계열의 프로테아제 효소 활성을 나타내었고, 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase)의 경우, 30 nmole의 높은 활성을 나타내었으며, β-갈락토시다제(β-galactosidase)는 40 nmole 이상의 높은 활성을 나타내어 한국인이 갖고 있는 우유 중 락토오스에 의한 유당 불내증의 저하에 많은 도움이 될 것이다. 또한, 발암 효소로 알려진 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)의 경우 벤조피렌과 같은 독성물질이 체내 들어왔을 때, 간에서 글루쿠론산(glucuronic acid)과 결합되어 그 독성이 증가하지만, 결합된 물질이 소장에서 담즙과 함께 장내 배설되어 장내 세균의 β-글루쿠로니다제에 의해 탈포합 되면 다시 독성이 생길 수 있기 때문에(Cole, C. B. et al., 1989. Microb. Ecol. Health Dis. 2, 223-225.), 프로바이오틱스 유산균으로 사용되기 위해서는 활성이 낮은 균주가 바람직하며, SBB07 균주의 경우 10 nmole 이하로 활성이 미약하여 프로바이오틱스 균주로 인한 발암 유발의 위험이 없음을 확인하였다.In order to use lactic acid bacteria as a probiotic, the enzymes produced by these bacteria are very important. In order to confirm the production of SBB07, the API ZYM kit was used. As a result, as shown in Table 4 below, the SBB07 strain exhibited a protease activity of 10 nmole of leucine arylamidase, valine arylamidase and cystine arylamidase In the case of Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, the activity of 30 nmole was high, while the content of β-galactosidase was higher than 40 nmole And it is very helpful to decrease the lactose intolerance caused by lactose in Korean milk. In the case of β-glucuronidase, which is known as a carcinogenic enzyme, when a toxic substance such as benzopyran enters the body, it is combined with glucuronic acid in the liver to increase its toxicity, (Cole, CB et al., 1989. Microb., Ecol. Health Dis., ≪ / RTI > 2, 223-225). In order to be used as a probiotic lactic acid bacterium, it is preferable that the strain is low in activity. In case of SBB07 strain, the activity is weak to 10 nmole or less, and thus it is confirmed that there is no risk of carcinogenesis caused by probiotic strain.

API ZYM 분석에 의한 효소 활성 측정Determination of enzyme activity by API ZYM analysis 효소enzyme 락토바실러스 브레비스 SBB07Lactobacillus brevis SBB07 대조구(Control)Control (control) 0a 0 a Alkaline phosphataseAlkaline phosphatase 00 Esterase(C4)Esterase (C4) 00 Esterase lipase(C8)Esterase lipase (C8) 55 Lipase(C14)Lipase (C14) 00 Leucine arylamidaseLeucine arylamidase 1010 Valine arylamidaseValine arylamidase 1010 Cystine arylamidaseCystine arylamidase 1010 TrypsinTrypsin 00 α-chymotrypsinalpha-chymotrypsin 55 Acid phosphataseAcid phosphatase 1010 Naphthol-AS-BI-phosphohydrolaseNaphthol-AS-BI-phosphohydrolase 3030 α-galactosidasealpha -galactosidase 00 β-galactosidaseβ-galactosidase ≥40≥40 β-glucuronidaseβ-glucuronidase 1010 α-glucosidaseα-glucosidase 2020 β-glucosidaseβ-glucosidase 3030 N-acetyl-β-glucosaminidaseN-acetyl-β-glucosaminidase 1010 α-mannosidasealpha-mannosidase 00 α-fucosidasealpha-fucosidase 00

a0은 효소활성 없는 것을 나타내며 5, 10, 20, 30 및 40은 각각 가수분해된 기질(nanomoles)을 나타냄.
 a 0 indicates no enzyme activity, and 5, 10, 20, 30, and 40 represent hydrolyzed substrates (nanomoles), respectively.

실시예Example 8.  8. 락토바실러스Lactobacillus 브레비스Brevis SBB07SBB07 균주의  Strain 내산성Acid resistance , , 내담즙성My bile 및 내열성 And heat resistance

유산균을 식품과 함께 섭취 시 프로바이오틱스로서의 효과를 나타내기 위해서는 소화액 수준인 pH 3 이하의 낮은 pH 조건과 장내 담즙산의 농도보다 고농도의 담즙산이 함유된 배지에서 생장할 수 있는 조건이 요구되어야 한다(Gilliland, S. E. and Speck, M. L., 1977. Appl. Environ. Microbiol., 33, 15-18.). 따라서 SBB07 균주의 내산성 및 내담즙성을 조사한 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 초기 접종 균수와 비교하였을 때 pH 3까지는 전혀 영향을 받지 않았으며, pH 2에서 약 14%가 감소하였지만, 약 86%가 생육하였다. 또한, 인공 담즙에 대한 저항성은 장내 담즙 농도(0.3%)보다 높은 옥스갈(oxgall)이 0.5% 함유된 배지에서 약 54%, 1.0% 함유된 배지에서는 약 46%가 생육하여 내담즙성도 우수한 것을 확인하였으며, SBB07 균주의 내열성은 MRS 액체배지에 SBB07 균주를 접종한 후 30℃, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 10분간 정치 후 생존하는 수를 측정한 결과, 60℃에서도 약 113% 생존율을 보여 매우 높은 내열성을 나타내었다. 결론적으로 SBB07 균주는 유산균 제제의 제품화에 가장 큰 문제점이 되는 안정성과 보존성이 우수하며, 이로 인해 급격한 활력 저하와 사멸률에 대해 유리한 프로바이오틱스 소재로 활용 가능함을 확인하였다.
In order to demonstrate the effect of lactic acid bacteria as a probiotics, it is necessary to have a low pH condition at pH 3, which is the level of digestive juices, and a condition capable of growing in medium containing bile acids at a higher concentration than intestinal bile acid concentration (Gilliland, SE and Speck, ML, 1977. Appl. Environ. Microbiol., 33, 15-18.). Therefore, as shown in FIG. 3, the SBB07 strain showed no significant effect on the acidity and biliary properties of the strains when compared to the initial inoculum number, and about 14% at pH 2, but about 86% Respectively. The resistance to artificial bile was about 54% in the medium containing 0.5% of oxgall, which is higher than the intestinal bile (0.3%), and about 46% in the medium containing 1.0% The survival rate of SBB07 strain was found to be 113% survival rate at 60 ℃ after 10 minutes incubation at 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃ and 60 ℃ after inoculation of SBB07 strain in MRS liquid medium. Showing very high heat resistance. In conclusion, SBB07 strain has excellent stability and preservability, which is the biggest problem in the commercialization of lactic acid bacteria preparation, and thus it is confirmed that it can be advantageously used as a probiotic material for the rapid decrease in vitality and mortality rate.

실시예Example 9.  9. 락토바실러스Lactobacillus 브레비스Brevis SBB07SBB07 균주의 항생제 내성 Antibiotic resistance of the strain

최종 선별 균주 SBB07에 대한 항생제 감수성을 조사한 결과, 아목시실린/클라불란산(Amocicillin/Clavulanic acid), 독시사이클린(doxycycline) 및 에리스로마이신(erythromycin)에 대하여 생육이 억제됨을 확인하였고, 아미카신(amikacin), 세팔로신(cephalothin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 콜리스틴(colistin), 린코마이신(lincomycin), 카나마이신(kanamycin), 노르플록사신(norfloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole) 계열의 항생제에 대하여는 내성을 지니고 있음을 확인하였다(표 5). Antimicrobial susceptibility to the final strain SBB07 was examined and it was confirmed that the growth was suppressed against amoxicillin / clavulanic acid, doxycycline and erythromycin, and amikacin, But are not limited to, cephalothin, ciprofloxacin, colistin, lincomycin, kanamycin, norfloxacin, streptomycin, tetracycline, And antimicrobial resistance against trimethoprim / sulfamethoxazole (Table 5).

항생제 내성 측정Antibiotic resistance measurement 항생제Antibiotic Code/Disc potencyCode / Disc potency ResultResult AmikacinAmikacin AN/30㎍AN / 30 g NDND Amoxicillin/clavulanic acidAmoxicillin / clavulanic acid AMC/20㎍, 10㎍AMC / 20 [mu] g, 10 [mu] g SSSS AmpicillinAmpicillin AM/10㎍AM / 10 g SSSS CephalothinCephalothin CF/30㎍CF / 30 g NDND CiprofloxacinCiprofloxacin CIP/5㎍CIP / 5 g NDND ColistinColistin CL/10㎍CL / 10 g NDND DoxycyclineDoxycycline D/30㎍D / 30 g SSSS ErythromycinErythromycin E/15㎍E / 15 g SSSS GentamicinGentamicin GM/10㎍GM / 10 g SS LincomycinLincomycin L/2㎍L / 2 g NDND KanamycinKanamycin K/30㎍K / 30 g NDND NeomuycinNeomuycin N/30㎍N / 30 g SS NorfloxacinNorfloxacin NOR/10㎍NOR / 10 g NDND StreptomycinStreptomycin S/10㎍S / 10 g NDND TetracyclineTetracycline TE/30㎍TE / 30 g NDND Trimethoprim/sulfamethoxazoleTrimethoprim / sulfamethoxazole SXT/1.25㎍, 23.75㎍SXT / 1.25 [mu] g, 23.75 [ NDND

직경: cm, ND: 미검출, S: 1.2~1.5, SS: 1.6~2.0.
Diameter: cm, ND: Not detected, S: 1.2 to 1.5, SS: 1.6 to 2.0.

실시예Example 10.  10. 락토바실러스Lactobacillus 브레비스Brevis SBB07SBB07 균주의  Strain 프리바이오틱스Prebiotics 기질 이용 능력 Ability to use substrate

프리바이오틱스는 사람이나 동물에 의해 잘 소화되지 않는 난소화성 성분으로 프로바이오틱스 균주의 탄소원이 되어 장내 유익균의 생장을 선택적으로 촉진시켜 장내 환경을 개선하는데 도움을 주는 복합 당류로 알려져 있고, 대부분 탄수화물이나 식이섬유 형태로 존재하는 것으로 보고되고 있다(Roberfroid, M., 2007. J. Nutr., 137, 830S-837S). 최근 프로바이오틱스 균주와 프리바이오틱스를 함께 처리하는 신바이오틱스 제제가 개발되고 있는 추세로 기존 프로바이오틱스 균주를 활용한 제제와 비교해 증식 및 장내 정착 능력이 더욱 우수한 것으로 밝혀졌다(Ann, E. Y. et al., 2007. Int. J. Food Sci. Technol., 42, 411-419). 따라서 최종 선별 균주 SBB07의 프리바이오틱스 기질 이용 능력을 조사하기 위해, 프리바이오틱스 기질로, 글루코오스(glucose), 자일리톨(xylitol), D-타가토오스(D-Tagatose), 이눌린(inulin), 락티톨(lactitol), 락툴로오스(lactulose), 프락토올리고당(fructooligosaccharide, FOS) 및 갈락토올리고당(galactooligosaccharide, GOS)으로 8가지를 이용하여 24시간 동안 균주의 성장률을 측정하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 GOS에서 글루코오스 대비 O.D 1.27로 가장 높은 성장률을 나타내었고, 다음으로 FOS 및 이눌린 순으로 높게 측정되었다. 락티톨, 락툴로오스, D-타가토오스 및 자일리톨에서는 O.D 0.4 이하로 낮은 성장률을 보였다(p<0.05). 결론적으로, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 SBB07 균주는 세포외 효소 및 항균 활성이 우수하며, 내담즙, 내산성, 내열성 및 항생제 내성을 지니고 있으며, GOS와 같은 프리바이오틱스 기질 이용 능력도 우수한 프로바이오틱스 소재로 활용 가능성이 높은 균주로 판단된다.
Prebiotics is an indigestible ingredient that is not digested well by humans or animals. It is known as a complex saccharide which helps improve the intestinal environment by selectively promoting the growth of beneficial bacteria in the intestines by becoming a carbon source of the probiotics strain. (Roberfroid, M., 2007. J. Nutr., 137, 830S-837S). Recently, a synbiotics preparation which treats probiotic strains and prebiotics together has been developed, and it has been found that the proliferation and intestinal colonization ability are superior to those using the existing probiotic strains (Ann, EY et al., 2007 Int. J. Food Sci. Technol., 42, 411-419). Therefore, in order to investigate the prebiotic substrate utilization ability of SBB07 as the final selection strain, glucose, xylitol, D-Tagatose, inulin, The growth rate of the strain was measured for 24 hours using 8 kinds of lactitol, lactulose, fructooligosaccharide (FOS) and galactooligosaccharide (GOS). As a result, as shown in Fig. 4, GOS showed the highest growth rate with respect to glucose at OD 1.27, followed by FOS and inulin, respectively. Lactitol, lactulose, D-tagatose, and xylitol showed a low growth rate of less than OD 0.4 (p <0.05). In conclusion, the SBB07 strain, which does not produce biogenic amines, has excellent extracellular enzymes and antimicrobial activity, is resistant to bile, acid, heat, and antibiotics, and is also a probiotic material with excellent prebiotic substrate utilization ability such as GOS It is considered to be a highly effective strain.

한국미생물보존센터(국외)Korea Microorganism Conservation Center (overseas) KCCM12102PKCCM12102P 2017082320170823

<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berry having antimicrobial activity against pathogenic microorganism, antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme secretion activity, acid resistance activity, bile resistance activity, heat resistance activity, prebiotics substrate availability and not producing biogenic amine and uses thereof <130> PN17406 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1291 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 1 agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa atctgcccag aagcagggga taacacttgg 60 aaacaggtgc taataccgta taacaacaaa atccgcatgg attttgtttg aaaggtggct 120 tcggctatca cttctggatg atcccgcggc gtattagtta gttggtgagg taaaggccca 180 ccaagacgat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac 240 ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat 300 ggagcaatgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag 360 aacacctttg agagtaactg ttcaagggtt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa 420 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 480 taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa 540 gtgcatcgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg 600 gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct agtctgtaac 660 tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc 720 cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca 780 ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt 900 cttgacatct tctgccaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacag aatgacaggt 960 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1020 aacccttatt atcagttgcc agcattcagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa 1080 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1140 gtgctacaat ggacggtaca acgagtcgcg aagtcgtgag gctaagctaa tctcttaaag 1200 ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa tcgctagtaa 1260 tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt t 1291 <110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berry having          antimicrobial activity against pathogenic microorganism,          antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme          secretion activity, acid resistance activity, even resistance          activity, heat resistance activity, prebiotics substrate          availability and not producing biogenic amines and uses thereof <130> PN17406 <160> 1 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1291 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 1 agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa atctgcccag aagcagggga taacacttgg 60 aaacaggtgc taataccgta taacaacaaa atccgcatgg attttgtttg aaaggtggct 120 tcggctatca cttctggatg atcccgcggc gtattagtta gttggtgagg taaaggccca 180 ccaagacgat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac 240 ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat 300 ggagcaatgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag 360 aacacctttg agagtaactg ttcaagggtt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa 420 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 480 taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa 540 gtgcatcgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg 600 gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct agtctgtaac 660 tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc 720 cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca 780 ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt 900 cttgacatct tctgccaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacag aatgacaggt 960 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1020 aacccttatt atcagttgcc agcattcagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa 1080 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1140 gtgctacaat ggacggtaca acgagtcgcg aagtcgtgag gctaagctaa tctcttaaag 1200 ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa tcgctagtaa 1260 tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt t 1291

Claims (4)

유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주(KCCM12102P). Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis), which is excellent in antimicrobial activity, antibiotic resistance, antioxidative activity, enzyme releasing ability, acid resistance, brittle resistance, heat resistance and prebiotic substrate utilization ability against harmful microorganisms and does not produce biogenic amine brevis) SBB07 strain (KCCM12102P). 제1항에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)이며, 상기 항생제는 아미카신(amikacin), 세팔로신(cephalothin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 콜리스틴(colistin), 린코마이신(lincomycin), 카나마이신(kanamycin), 노르플록사신(norfloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)이며, 상기 효소는 β-갈락토시다제(β-galactosidase), 셀룰라제(cellulase), 루신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 계열의 프로테아제(protease), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin) 및 산성인산가수분해효소(acid phosphatase)이며, 상기 프리바이오틱스 기질은 갈락토올리고당(galactooligosaccharide)이며, 상기 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)인 것을 특징으로 하는 균주.The method according to claim 1, wherein the harmful microorganism is Bacillus cereus , and the antibiotic is selected from the group consisting of amikacin, cephalothin, ciprofloxacin, colistin, lincomycin, kanamycin, norfloxacin, streptomycin, tetracycline and trimethoprim / sulfamethoxazole, and the enzyme is? -galactosidase a β-galactosidase, a cellulase, a leucine arylamidase protease, an α-chymotrypsin and an acid phosphatase, and the free Wherein the biotin substrate is a galactooligosaccharide, and the biogenic amine is histamine and tyramine. 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물.A composition for antibacterial activity against Bacillus cereus comprising the strain of Lactobacillus brevis SBB07 or a culture thereof according to claim 1 or 2 as an active ingredient. 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SBB07 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.A probiotic composition comprising the strain of Lactobacillus brevis SBB07 of claim 1 or 2 or a culture thereof as an active ingredient.
KR1020170152265A 2017-11-15 2017-11-15 Lactobacillus brevis SBB07 strain from fermented berry having antimicrobial activity against pathogenic microorganism, antibiotic resistance activity, antioxidant activity, enzyme secretion activity, acid resistance activity, bile resistance activity, heat resistance activity, prebiotics substrate availability and not producing biogenic amine and uses thereof KR101960352B1 (en)

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