KR101959741B1 - Maker and kit for detection of Ilyonectria mors-panacis and method for detecting of Ilyonectria mors-panacis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 인삼뿌리썩음병 강병원성균주 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 종래 인삼에서 검출되는 인삼뿌리썩음병원균 복합체(I. radicicola species complex) 중 강병원성 균주만을 특이적이고, 높은 민감도로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 강병원성 균주 식별방법에 대한 것이다.The present invention relates to a ginseng root rot steel pathogenic strain detection primer set for, and more particularly, to only a specific, high sensitivity steel pathogenic strain of ginseng root rot Won Kyun complexes (I. radicicola species complex) to be detected in the conventional ginseng A kit comprising the primer set, and a method for identifying a strongly pathogenic strain.
인삼(Panax ginseng)은 다년생의 반음지성 숙근초(宿根草)로 오가피과에 속하며 생육적온은 20℃전후로 주로 북반구의 극동지방에 자생하거나 재배되며 우리나라의 주산지는 경기 북부지역과 풍산 및 금산 지방이다. 인삼의 주 약리성분은 사포닌으로서 자양강장, 면역증강, 피로회복, 중추신경계 조절, 항스트레스, 항당뇨, 항종양활성 등의 우수한 효능이 밝혀짐에 따라 그 소비가 증가추세에 있으며 특히 고려인삼의 우수함이 밝혀짐에 따라 그 소비 또한 꾸준히 늘어날 것으로 전망된다.Ginseng ( Panax ginseng ) is a perennial semi-silky ginseng root, which belongs to the acanthaceae family. Its optimum growth temperature is around 20 ℃. It grows or grows mainly in the Far East region of the northern hemisphere. Korea's main region is Gyeonggi region, Poongsan and Geumsan provinces. The main pharmacological component of ginseng is saponin, its consumption has been on the rise due to its excellent efficacy as nutritional supplement, immunity enhancement, fatigue recovery, central nervous system regulation, antistress, antidiabetic and antitumor activity. Consumption is expected to steadily increase as excellence is revealed.
그러나, 인삼의 이러한 뛰어난 효능과 소비 욕구에도 불구하고 인삼은 다년생의 반 음지성 숙근초로서 반음지성식물이기 때문에 빛이 가장 중요한 생육제한요소이며, 높은 온도에서 생육이 저해되는 저온성 식물로서, 고온 및 고광도에 약한 식물이다. 또한 인삼은 상기 생육제한 요소 이외에 내병성이 약하고 효과적인 방제법이 적어 재배하기 어려운 식물로 평가되었다.However, in spite of the excellent efficacy and consumption desire of ginseng, ginseng is a perennial ophthalmic plant, which is a semi-oily plant. Therefore, ginseng is the most important growth limiting factor and is a low temperature plant which inhibits growth at high temperature. It is a weak plant with high light intensity. In addition, ginseng was evaluated as a plant which is difficult to cultivate because of its weak tolerance and effective control method in addition to the above-mentioned growth inhibition factors.
또한, 인삼의 식물체는 땅 밑에 뿌리와 뇌두(腦頭), 땅 위에는 줄기, 잎, 꽃(열매)으로 이루어져 있으며, 다년생이므로 매년 봄이 되면 땅속의 뿌리에서 새싹이 나오고 줄기는 매년 가을이 되면 고사한다. 인삼은 4 ~ 6년 동안 동일 포장에서 장기간 재배를 하여야 하고, 인삼을 수확한 후 다른 작물을 재배하지 않고 1 ~ 2년간 경작 예정지 관리 후 다시 인삼을 경작하는 연작방식 때문에 각종 병해에 의한 피해가 매우 크고 연작장해의 발생 가능성이 높은 식물이다.In addition, the plant of ginseng consists of root and head under the ground, stem, leaf, flower (fruit) on the ground, and it is a perennial, so every spring the bud emerges from the root in the ground. do. Ginseng should be cultivated for 4 ~ 6 years in the same packaging for a long time, and after the ginseng is harvested, it is cultivated again for 1 ~ 2 years without cultivation of other crops, It is a plant with a high probability of occurrence of large and continuous obstacles.
인삼에서 연작장해를 일으키는 병해준 대표적인 것이 뿌리썩음병인데, 뿌리썩음병의 주요 병원균으로는 일리오넥트리아 라디시콜라(Ilyonectria radicicola), 푸자리움솔라니(Fusarium solani), 라이조토니아솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스시네레아(Botryis cinerea), 파이토프소라캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움(Pythium sp.), 알타나리아파낙스(Alternaria panax)등 7종이 보고되어있으며, 이런 병원균들이 단독으로 또는 복합적으로 작용하기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있다.Root rottenness is one of the most common diseases caused by ginseng. Root rot is mainly caused by Ilyonectria radicicola , Fusarium solanii , solani , Rhizoctonia solani , Botryis < RTI ID = 0.0 > cinerea , Phytophthora cactorum , Pythium, sp .), Alternaria panax ) have been reported, and these pathogens are known to occur either singly or in combination.
최근 농업기술원 연구결과에 따르면 4년근 이상 인삼의 결주 원인은 지역과 병해 종류 및 발생 정도의 차이는 있지만 뿌리썩음병 35%, 잿빛곰팡이병 32%, 점무늬병 등이 15%를 차지하고 있다. 특히 인삼뿌리썩음병원균(Ilyonectria radicicola)는 토양에서 월동하면서 뿌리에 직접 병을 일으키기 때문에 인삼 식재 후 방제가 어렵고, 병에 의한 결주율 피해가 초작지 4년근 21.8%, 6년근 50% 이상이며, 재작지 4년근에는 30 ~ 80%에 이르는 등 인삼생산에 있어 최대의 적으로 평가되고 있다.According to recent research results from the Agricultural Research Institute of Korea, the causes of ginseng rooting for 4 years or longer are 35% for root rot, 32% for gray mold, and 15% for spotted fungus, In particular, Ilyonectria radicicola is the most effective treatment for ginseng roots because it induces a disease directly in the roots while wintering in the soil. Therefore, it is difficult to control after the planting of ginseng. In the 4-year-old, it is estimated to be the biggest enemy of ginseng production, ranging from 30 to 80%.
인삼뿌리썩음병의 초기 증상은 잎가장자리가 붉게 변하거나 잎이 안쪽으로 오므라드는 증상을 보이다가 고사하며, 이와 같은 증상을 나타내는 뿌리는 끝 또는 중간 부분에 적갈색 또는 흑갈색 병반을 형성하며, 적갈색으로 변색되어 부패한다. 또한 인삼뿌리썩음병은 묘삼에서부터 6년생까지 모든 연생에서 발생하며 고년생으로 갈수록 발생이 많아지는 등, 국내 인삼 재배 농가에서 가장 큰 문제로 손꼽히고 있다.The initial symptom of ginseng root rot disease is reddish leaf edge or leaf inward till the symptom is shown. The roots showing such symptom form reddish brown or black brown lesion at the end or middle part, It is corrupt. Also, ginseng root rot disease is the most serious problem in Korean ginseng cultivation farms, such as from seedling ginseng to 6 years old, occurring in all the years and becoming more and more generations to high birth rate.
이에 최근에는 인삼뿌리썩음병을 유발하는 병원균의 식별과 관련된 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 대부분의 연구는 인삼뿌리썩음병을 유발하는 병원균 복합체인(I. radicicola species complex) 모두를 진단할 수 있는 비-종특이적인 프라이머에 대한 것들이다. 이에 인삼뿌리썩음병원균 복합체(I. radicicola species complex) 중 병원성이 강한 균주만을 검출할 수 있는 특이적인 프라이머에 대한 개발이 시급한 실정이다.In recent years, however it made active research related to the identification of the pathogen that causes root rot of ginseng, most studies to diagnose both the (I. radicicola species complex) complex pathogen that causes root rot of ginseng Non-kind Specific primers. The ginseng root rot Won Kyun complexes (I. radicicola species complex) is the pathogenic situation is urgent the development of a specific primer capable of detecting only the strong strain of.
이에 본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출된 것으로, 인삼뿌리썩음병원균 복합체(I. radicicola species complex) 중에서 종특이적으로 강병원성 균주만을 용이하고, 높은 민감도로 식별할 수 있는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 강병원성 균주의 식별방법을 제공하는데 목적이 있다. Accordingly, the present invention has been made in consideration of the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a method of isolating ginseng root rot caused by ginseng root rot disease bacteria ( Mors-panacis ) detection kit, a kit containing the same, and a method for identifying a pathogenic strain.
또한, 본 발명은 높은 병원성이 있는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)에 의한 인삼뿌리썩음병을 용이하게 확인 및 진단할 수 있는 인삼뿌리병 진단용 조성물과, 이를 이용하여 인삼뿌리썩음병을 진단할 수 있는 진단방법을 제공하는데 다른 목적이 있다. The present invention also relates to a composition for diagnosing ginseng roots disease, which can easily identify and diagnose ginseng root rot disease caused by ginseng root rot disease disease ( I. mors-panacis ) having high pathogenicity, and to diagnose ginseng root rot disease There are other purposes in providing diagnostic methods that can be used.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2로 표시되는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 동정용 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)의 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)의 식별방법을 제공한다.(A) separating DNA from a sample to obtain a sample DNA; (b) contacting the sample DNA obtained in the step (a) with the DNA of SEQ ID NO: 1 and 2 ( I ) obtaining a PCR product by performing a polymerase chain reaction (PCR) with a composition comprising a primer set for identification of ginseng root rot rot disease ( I. mors-panacis ), and (c) ( I. mors-panacis ) of the ginseng root rot disease disease ( I. mors-panacis ) is identified by analyzing the mors-panacis of the ginseng root rot.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 시료는 인삼(Panax ginseng)시료일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the sample may be a ginseng ( Panax ginseng ) sample.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 프라이머 세트는 시료 DNA에 포함된 폴리갈락투로네이즈 유전자를 증폭하는 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, a primer set of ginseng root rot rot ( I. mors-panacis ) may be one which amplifies a polygalacturonase gene contained in a sample DNA.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the polymerase chain reaction may be a real-time polymerase chain reaction.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a primer set for detecting ginseng root rot disease I. mors-panacis represented by SEQ ID NOs: 1 and 2.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 염기서열은 상기 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) DNA의 폴리갈락투로네이즈 유전자를 증폭시키는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence may be one in which the polygalacturonase gene of the ginseng root rot virus I. mors-panacis DNA is amplified.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 폴리갈락투로네이즈 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the polygalacturonase gene may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명은 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출용 프라이머 세트 및 증폭용 시약을 포함하는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출 또는 정량분석용 키트를 제공한다.Also, the present invention provides a kit for detection or quantitative analysis of ginseng root rot rotavirus disease ( I. mors-panacis ) comprising a primer set for detection of ginseng root rot disease I. mors-panacis and an amplification reagent.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭용 시약은 dNTP 혼합물, DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이때, 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the amplification reagent may include at least one selected from the group consisting of a dNTP mixture, a DNA polymerase and a buffer solution. At this time, the dNTP mixture may include at least one selected from the group consisting of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 인삼뿌리병 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing ginseng root disease comprising a primer set represented by SEQ ID NOS: 1 and 2.
또한, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료에 인삼뿌리썩음병이 발병 또는 발병예정인지 판정하는 단계를 포함하는 인삼뿌리썩음병 진단방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for preparing a DNA sample, comprising the steps of: (a) separating DNA from a sample to obtain a sample DNA, (b) a sample DNA obtained in step (a) and a primer set represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 And (c) analyzing the PCR product to determine whether the ginseng roots rot disease is to be caused or to be caused by the sample. To provide a method for diagnosing ginseng root rot disease.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.Hereinafter, terms of the present invention will be described.
본 발명의 "폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase) 유전자"는 식물세표벽을 분해하는 효소를 암호화하는 유전자로써, 상기 유전자가 발현된 폴리갈락투로네이즈는 식물의 세포벽 주성분 중 하나인 펙틴산의 α-1,4 갈락투로닐 결합을 가수분해하는 효소이다. 병원균에서 발현된 폴리갈락투로네이즈는 식물과 병원균 간의 상호작용으로 숙주인 식물 세포벽을 분해 및 파괴시켜 숙주 내부로 병원균이 침투 가능하도록 하며, 이를 통해 병원균으로 인한 식물의 감염과 이로 인한 병의 유발에 연관된 기작에 직접적 및/또는 간접적으로 관여하게 된다. 따라서, 병원균이 폴리갈락투로네이즈 유전자를 구비하는지 여부에 따라서 병원균에 대한 식물의 1차 방어선인 세포벽이 분해/파괴될 수 있는지가 달라질 수 있고, 폴리갈락투로네이즈 유전자를 갖는 병원균은 병원성이 높다고 평가될 수 있다. The " polygalacturonase gene " of the present invention is a gene that encodes an enzyme that degrades a plant cell wall. The polygalacturonase in which the gene is expressed is an alpha -1,4-galacturonyl bond. Polygalacturonase expressed in pathogens is an interaction between plants and pathogens, which breaks down and destroys host cell walls to enable pathogens to penetrate into the host. Through this, infection of plants caused by pathogens and induction of diseases And / or indirectly to the mechanism involved in the disease. Therefore, depending on whether the pathogen has a polygalacturonase gene, whether or not the cell wall, which is the primary line of defense against the pathogen, can be decomposed / destroyed can be changed. Pathogens having the polygalacturonase gene are pathogenic It can be evaluated as high.
또한, 본 발명의 "프라이머"는 복제하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으며, 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 상기 프라이머의 바람직한 길이는 5 ~ 50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. Further, the "primer" of the present invention refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be duplicated and can serve as a starting point for the synthesis of a primer extension product. The primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures. The lengths of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art and the length and sequence of the primers should be allowed to initiate the synthesis of extended products. The preferred length of the primer is 5 to 50 nucleotides. The specific length and sequence will depend on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 일 예로, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the primers may, if necessary, comprise labels that are detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of the label include, but are not limited to, enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and the like, radioactive isotopes such as 33P and the like, and chemical groups such as biotin and fluorescent molecules.
본 발명의 "실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)”은 목표 DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시 실시하는 방법으로, DNA샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위하여, 실시간 중합효소연쇄반응은 검출과 양의 측정을 할 수 있는 방법이다. 계량은 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 셀 수 있다.The term " real-time PCR " of the present invention is a method for simultaneously amplifying a target DNA molecule and measuring the amount thereof. For one or more specific sequences in a DNA sample, a real- It is a method that can detect and measure quantities. Weighing can count absolute number of copies or relative amount.
본 발명에서 개시하는 “염기서열”은 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형의 비제한적인 예로써, 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The " base sequence " disclosed in the present invention includes modifications using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with analogs, and modifications between nucleotides such as uncharged linkers (e.g., methylphosphonate, phosphotriester, Amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
본 발명에 따른 인삼뿌리썩음병 강병원성 균주(I. mors - panacis) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병 강병원성 균주(I. mors - panacis) 식별방법은 종래 인삼에서 발견된다고 보고된 인삼뿌리썩음병원균 복합체(I. radicicola species complex) 중 강병원성 균주인 I. mors-panacis에 대해서 특이적으로 검출가능하고, 높은 민감도로 식별할 수 있고, 관련하여 인삼뿌리썩음병에 대해 용이하게 진단할 수 있다.Ginseng root rot steel pathogenic strains according to the invention (I. mors - panacis) detection primer set for, and a kit using the same ginseng root rot steel pathogenic strains containing the same (I. mors - panacis) identification method that found in conventional ginseng the reported ginseng root rot Won Kyun complexes (I. radicicola species complex) can be identified in a high sensitivity and can be detected specifically, with respect to the steel pathogenic strain I. mors-panacis, in relation to facilitate for the ginseng root rot Can be diagnosed.
도 1은 실시예 3에서 본 발명의 프라이머를 사용하여 인삼뿌리썩음병원균 표준균주(I. radicicola species complex) 중 강병원성 균주(I. mors-panacis)를 검출한 결과이다.
도 2는 비교예 1 내지 3의 종래 공지된 프라이머를 사용하여 인삼뿌리썩음병원균 표준균주(I. radicicola species complex) 표준균주들을 검출한 결과이다.
도 3은 비교예 4를 통해 Histone H3의 PCR 산물을 염기서열을 분석하여 계통분석을 통해 강병원성 균주와 약병원성 균주로 group되어진 결과이다.
도 4 및 도 5는 I. radicicola species complex 중 I. robusta , I. cyclaminicola , I. mors -panacis 각각에 대해 인삼 절편 및 묘삼을 이용한 병원성 검정 사진이다.
도 6은 비교예 5에 따른 프라이머쌍을 사용하여 인삼뿌리썩음병원균 표준균주(I. radicicola species complex) 표준균주들을 검출한 결과이다.Figure 1 shows the result of detecting a pathogenic strain (I. mors-panacis) steel of the present invention using the primer of the ginseng root rot Won Kyun type strain (I. radicicola species complex) in Example 3. Fig.
FIG. 2 shows the results of detection of the standard strains of the radicicola species complex of ginseng root rot by using the known primers of Comparative Examples 1 to 3.
FIG. 3 is a result of analysis of the nucleotide sequence of the Histone H3 PCR product through Comparative Example 4, and as a result of the systematic analysis, it was grouped into a pathogenic strain and a pathogenic strain.
FIGS. 4 and 5 are photographs of pathogenicity test using ginseng slices and seedling ginsengs against I. robusta , I. cyclaminicola and I. mors- panacis in the I. radicicola species complex.
Figure 6 shows the result of detecting the ginseng roots by using a pair of primers rot Won Kyun type strain (I. radicicola species complex) type strain according to the comparative Example 5.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
상술한 바와 같이, 인삼 재배 농가에 많은 피해를 유발하는 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex) 중 강병원성 균주(I. mors - panacis)를 효과적으로 검출할 수 있는 프라이머에 대한 개발이 미비한 실정이다. 구체적으로 도 3의 I. radicicola species complex에 대한 계통도를 통해 확인할 수 있듯이, I. radicicola species complex는 I. robusta , I. cyclaminicola , I. mors - panacis 등을 포함하는데, 도 4 및 도 5를 통해 확인할 수 있듯이 I . radicicola species complex 중 I. mors - panacis가 강병원성 균주임에 따라서 I. radicicola species complex 중 I. mors - panacis만을 특이적이며, 높은 민감도로 식별, 검출 및 정량할 수 있는 프라이머에 대한 개발이 매우 시급하다.As described above, Ginseng Panax ginseng root that causes a lot of damage to the farmer rot Won Kyun (I. radicicola species complex) of the steel pathogenic strain situation is the development of the primers capable of effectively detecting (I. mors panacis) insufficient . As can be seen particularly also through the schematics for 3 I. radicicola species complex, I. radicicola species complex is I. robusta, I. cyclaminicola, I. mors - panacis To include, 4 and 5 As can be seen also via the I. radicicola species of complex I. mors - according to the river panacis pathogenic strain being I. radicicola species of complex I. mors - only a specific panacis, development is very urgent to identify with a high sensitivity, and detection can be quantified primer Do.
이에 본 발명은 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)에 함유된 DNA 중 소정의 타겟 영역의 DNA를 증폭시킬 수 있는, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출용 프라이머 세트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. Accordingly, the present invention relates to a method for producing ginseng root rot disease fungus ( I. ginseng), which is capable of amplifying DNA of a predetermined target region among DNA contained in ginseng root rot disease I. mors-panacis . mors-panacis ) detection primer set.
이를 통해 종래 인삼에서 발병한다고 보고된 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex) 중 병원성이 약한 균주에서는 PCR 증폭이 되지 않고, 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)만을 증폭시켜, 이의 존재가 보다 효과적으로 검출 및 식별될 수 있다.In this study, we investigated the effects of ginseng root rot rot ( I. radicicola species complex) on the growth of ginseng root rot rot ( I. mors-panacis ) Can be detected and identified more effectively.
먼저, 본 발명에 따른 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출용 프라이머 세트는 염기서열이 서열번호 1로 표시되는 프라이머와 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.First, the primer set for detecting ginseng root rot rot disease I. mors-panacis according to the present invention is not particularly limited as long as the base sequence comprises a primer represented by SEQ ID NO: 1 and a primer represented by SEQ ID NO: 2, Addition, deletion or substitution of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2.
상기 프라이머 세트는 시료에 포함된 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 포함 여부를, 종-특이적으로 매우 용이하고 높은 민감도로 식별할 수 있는 이점이 있다. 또한, 상기 식별은 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)에 포함되어 있는 폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase) 유전자를 검출하는 것일 수 있다. 상기 폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase) 유전자는 식물세표벽을 분해하는 효소를 암호화하는 유전자로써, 상기 유전자가 발현된 폴리갈락투로네이즈는 식물의 세포벽 주성분 중 하나인 펙틴산의 α-1,4 갈락투로닐 결합을 가수분해하고, 이를 통해 숙주인 식물 세포벽을 분해 및 파괴시켜 숙주 내부로 병원균이 침투 가능하도록 하는 등의 병원균으로 인한 식물의 감염과 이로 인한 병의 유발에 연관된 기작에 직접적 및/또는 간접적으로 관여되는 폴리갈락투로네이즈를 발현시키는 유전자이다. 따라서, 병원균이 폴리갈락투로네이즈 유전자를 구비하는지 여부에 따라서 병원균에 대한 식물의 1차 방어선인 세포벽이 분해/파괴될 수 있는지가 달라질 수 있고, 폴리갈락투로네이즈 유전자를 갖는 병원균은 병원성이 높다고 평가될 수 있다. 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이미어 세트를 통해 위와 같이 인삼에 대한 높은 병원성에 연관될 수 있는 인삼 유전자를 타겟할 수 있고, 이에 더해 매우 우수한 종특이성, 높은 민감도로 인삼뿌리썩음병 병원균 복합체에서 강병원성균주를 식별할 수 있다.The primer set has the advantage that the presence of ginseng root rot-bacterium (I. mors-panacis) contained in the sample can be discriminated by species-specificity very easily and with high sensitivity. In addition, the identification may be to detect a polygalacturonase gene contained in ginseng root rot disease I. mors-panacis . The polygalacturonase gene is a gene that encodes an enzyme that degrades a plant cell wall. The polygalacturonase in which the gene is expressed is an α-1,4- The present invention relates to a method for directly and indirectly treating a plant infection caused by a pathogen such as hydrolyzing a galacturonyl bond and thereby degrading and destroying the host plant cell wall to allow pathogens to penetrate into the host, / RTI > and / or polygalacturonase that is indirectly involved. Therefore, depending on whether the pathogen has a polygalacturonase gene, whether or not the cell wall, which is the primary line of defense against the pathogen, can be decomposed / destroyed can be changed. Pathogens having the polygalacturonase gene are pathogenic It can be evaluated as high. The primer set having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 according to the present invention can target the ginseng gene which can be related to the high pathogenicity to ginseng as described above. In addition, the ginseng gene having excellent species specificity, high sensitivity , It is possible to identify a pathogenic strain in the ginseng root rot disease pathogen complex.
상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.The primer need not be exactly complementary to the sequence of the template but can be complementary enough to form a hybridcomplex with the template.
또한, 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 일 예로, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the primers can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, " capping ", replacement of natural nucleotides with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers, such as methylphosphonate, But are not limited to, phosphoramidate, phosphoramidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). In addition, the primers may, if necessary, comprise labels which can be detected directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of the label include, but are not limited to, enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and the like, radioactive isotopes such as 33P and the like, and chemical groups such as biotin and fluorescent molecules.
또한, 상기 주형의 서열은 통상적인 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)에 함유된 폴리갈락투로네이즈 유전자의 DNA라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 매우 우수한 종특이성, 높은 민감도 등을 고려하여 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.In addition, the sequence of the template is not particularly limited as long as it is a DNA of a polygalacturonase gene contained in a common ginseng root rot disease I. mors-panacis , but preferably has excellent species specificity and high sensitivity And may include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명은 상술한 것과 같은 프라이머 세트를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출 또는 정량분석용 키트로 구현된다.The present invention is also embodied as a kit for detection or quantitative analysis of ginseng root rot disease ( I. mors-panacis ) comprising the primer set as described above.
상기 키트는 상술한 프라이머 세트 이외에 증폭용 시약을 포함한다. 또한, 상기 키트는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 검출에 도움을 줄 수 있는 다른 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.The kit includes an amplification reagent in addition to the above-described primer set. In addition, the kit may further include a primer set having a different base sequence that can aid in the detection of ginseng root rot disease I. mors-panacis .
상기 증폭용 시약은 통상적으로 식물병을 유발하는 균주 동정용 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 이들은 공지된 것을 적절한 함량으로 선택 및 조절할 수 있음에 따라서 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않으며, 구체적인 설명을 생략한다.The amplification reagent is not particularly limited as long as it is contained in a kit for identifying a strain that usually causes plant diseases. For example, it may contain at least one of dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA polymerase and buffer solution, which can be selected and adjusted in a proper amount The present invention is not particularly limited thereto, and a detailed description thereof will be omitted.
또한, 본 발명은 상술한 프라이머 세트 또는 키트를 이용하여 시료에서 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)의 유무 식별할 수 있을 뿐만 아니라 정량적 분석이 가능하다. In addition, the present invention can identify quantitative analysis as well as identify the presence or absence of ginseng root rot disease ( I. mors-panacis ) in the sample using the primer set or kit described above.
이에 대한 일 실시예로써 상술한 프라이머 세트를 이용한 식별방법에 대해 설명하면, (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2로 표시되는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 동정용 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계 및 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)의 포함 여부를 식별하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다. In one embodiment of the present invention, an identification method using the primer set described above will be described. (A) A step of separating DNA from a sample to obtain a sample DNA, (b) DNA and a primer set for identification of ginseng roots rot ( I mors-panacis ) represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 to obtain a PCR product And (c) analyzing the PCR product to identify whether or not the ginseng root rot -bacterium ( I. mors-panacis ) is contained in the sample.
먼저, 본 발명에 따른 (a) 단계로써, 시료로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득한다.First, in step (a) according to the present invention, DNA is isolated from a sample to obtain a sample DNA.
상기 시료는 통상적으로 인삼뿌리썩음병원균 중 강병원성 균주의 포함 여부 식별이 필요한 시료라면 특별히 제한하지 않으며, 일예로써 인삼(Panax ginseng), 인삼이 경작될 예정이거나 경작중인 토지의 토양시료 등일 수 있고, 바람직하게는 인삼시료일 수 있다. 또한, 상기 인삼의 경우 통상적으로 인삼으로 인식하는 것인 경우 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.The sample is not particularly limited as long as it is a sample requiring identification of whether or not the pathogenic strain of the ginseng root rot disease is included in the ginseng root rot disease bacteria. For example, the sample may be ginseng ( Panax ginseng ), a soil sample of ginseng to be cultivated or cultivated land, Preferably a ginseng sample. In the case of the ginseng, the present invention is not particularly limited as long as it is commonly recognized as ginseng.
상기 DNA 분리는 통상적으로 시료에서 제노믹 DNA(Genomic DNA, gDNA)를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 퀴아젠(Qiagen)사의 DNeasy mini kit를 이용할 수 있다.The DNA separation is not particularly limited as long as it is a method for separating genomic DNA (gDNA) from a sample. For example, a DNeasy mini kit from Qiagen can be used.
다음으로 본 발명에 따른 (b)단계로써, 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2로 표시되는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 동정용 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계를 수행한다.Next, in step (b) according to the present invention, a composition comprising the sample DNA obtained in step (a) and a primer set for identification of ginseng root rot rot disease ( I. mors-panacis ) represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 (Polymerase chain reaction, PCR) to obtain a PCR product.
상기 조성물은 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 동정용 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균 gDNA 서열 중 소정의 영역에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase) DNA를 증폭할 수 있는 염기서열로써, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함한다.The composition comprises a primer for identification of ginseng root rot disease I. mors-panacis , wherein the primer is an oligonucleotide having a sequence complementary to a predetermined region of the ginseng root rot fungus germline gDNA sequence, 1 and SEQ ID NO: 2, which is capable of amplifying the polygalacturonase DNA contained in the DNA of the present invention.
또한, 상기 조성물은 상기 프라이머 이외에 중합효소연쇄반응에 필요한 성분을 더 포함할 수 있고, 일예로 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the composition may further include components necessary for the polymerase chain reaction in addition to the primers. For example, the composition may be a dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), a DNA polymerase and a buffer solution, It is not.
또한, 상기 시료 DNA에 포함된 폴리갈락투로네이즈 DNA는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)에 특이적으로 존재하는 폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase)인 경우 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, 이를 통해 보다 높은 민감도로 인삼뿌리썩음병원균 복합체에서 강병원성 균주를 식별 및 검출하기에 용이하다.In addition, the polygalacturonase DNA contained in the sample DNA is not particularly limited in the case of polygalacturonase which is specifically present in ginseng root rot disease I. mors-panacis , 3, and thus it is easy to identify and detect a pathogenic strain in the ginseng root rot disease pre-infection complex with higher sensitivity.
또한, 중합효소연쇄반응은 당업계에 공지된 방법과 조건을 적절히 선택 및 변경하여 수행할 수 있고, 이에 대한 일예는 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있으며, 상기 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 구체적 방법이나 조건은 공지된 것을 채용할 수 있음에 따라서 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.In addition, the polymerase chain reaction can be carried out by suitably selecting and changing the methods and conditions known in the art. An example of such a method may be a real-time PCR reaction, a specific method for the real- Since the known conditions can be employed, the present invention is not particularly limited to this.
다음으로 본 발명에 따른 (c) 단계로써, 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 포함 여부를 식별하는 단계를 수행한다.Next, in step (c) according to the present invention, the step of analyzing the PCR product to identify whether the sample contains ginseng root rot disease I. mors-panacis is performed.
상기 PCR 산물 분석은 통상적으로 당업계에서 많이 채용되는 PCR 수행결과인 PCR 산물을 분석하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.The PCR product analysis is not particularly limited as long as it is a method of analyzing the PCR product, which is generally the result of PCR employed in the art.
일예로, PCR 산물의 크기 분석은 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 크기를 분석하여 수행하는 분석방법을 의미하는 것으로써, 바람직하게는 PCR 산물의 크기가 200 내지 500 염기쌍(베이스페어; base pair; bp)일 경우, 시료는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)를 포함하는 것으로 식별할 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 3의 염기서열인 경우 PCR 산물 크기가 약 300 염기쌍일 수 있고, 이의 확인을 통해 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)를 포함하는 것으로 식별될 수 있다.For example, the size of the PCR product refers to an analysis method performed by analyzing the size of the PCR product obtained using the primer. Preferably, the size of the PCR product is 200 to 500 base pairs (base pair ; bp), the sample can be identified as containing ginseng root rot rot ( I. mors-panacis ). More specifically, in the case of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, the PCR product size may be about 300 base pairs and it can be identified as containing the ginseng root rot disease I. mors-panacis .
또한, 본 발명은 상술한 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하여 인삼뿌리병 진단용 조성물을 구현할 수 있다.In addition, the present invention can include a primer represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 to form a composition for diagnosing ginseng root disease.
상기 조성물은 상술한 식별방법에 대한 설명에서 (b) 단계에서 설명된 조성물과 동일할 수 있다. The composition may be the same as the composition described in step (b) in the description of the identification method described above.
또한, 이러한 인삼뿌리병 진단용 조성물은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료에 인삼뿌리썩음병이 발병 또는 발병예정인지 판정하는 단계를 포함하는 인삼뿌리썩음병 진단방법에 이용될 수 있다.The composition for diagnosing ginseng root disease comprises the steps of: (a) obtaining DNA from a sample by separating the DNA; (b) contacting the sample DNA obtained in the step (a) with the DNA of SEQ ID NO: (C) obtaining a PCR product by performing a polymerase chain reaction (PCR) with a composition containing a primer set, and (c) analyzing the PCR product to determine whether the ginseng root rot disease is expected to occur or is expected to occur And the method for diagnosing ginseng root rot disease.
본 발명에 따른 인삼뿌리썩음병 진단용 조성물과 진단방법의 경우 인삼뿌리썩음병에 매우 높은 강병원성 균주인 I. mors - panacis의 식별과 검출에 매우 민감도 높고 종 특이적임에 따라서 I. mors - panacis의 식별과 검출을 통해 시료에 인삼뿌리썩음병이 발생가능한지 예상하거나 이미 발생했는지 보다 용이하게 진단 가능한 이점이 있다.The composition and method for the diagnosis of ginseng root rot disease according to the present invention are highly sensitive and specific for the identification and detection of I. mors - panacis , which is a highly virulent pathogenic strain, in ginseng root rot disease. Therefore, identification of I. mors - panacis There is an advantage that it is possible to predict whether the ginseng root rot disease can occur in the sample through the detection or to diagnose it more easily.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to explain the present invention to the average person skilled in the art in more detail.
프라이머 제작Primer production
먼저, 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola)의 게놈분석을 수행하였다. 먼저 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola) 표준균주(KACC41077)의 게놈을 Hybrid sequencing(Roche 454와 Illumina Hiseq)을 사용해 분석하여 약 64Mb의 유전정보를 획득하였다. 이 유전정보를 Maker version 2.31.8을 사용해 유전자 위치를 예측하고 UniProt Swiss-Prot (2010506)에 Protein BLAST를 수행하였다. 약 13,833개의 유전자가 존재하고 있음을 확인했고, 이 중 여러 개의 polygalacturonase 유전자를 선발하였으며, 그 중에서 특이적으로 인삼뿌리썩음병 강병원성 균주(I. mors - panacis)를 동정할 수 있는 polygalacturonase 유전자(polygalacturonase 1)를 선발했다. 선발한 polygalacturonase 유전자를 Primer3 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용해 PCR 산물이 약 200~500bp에서 생성되도록 하기 표 1과 같은 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍(Cy10576)을 제작하였다. 인삼뿌리썩음병 강병원성 균주(I. mors-panacis)에 종특이적인 polygalacturonase 유전자에 대하여 하기 표 1의 프라이머쌍(서열번호 1 및 2)이 증폭하는 polygalacturonase DNA(서열번호 3)를 하기 표 1에 나타내었다.First, genomic analysis of ginseng root rot rot ( I. radicicola ) was performed. Genomic analysis of ginseng radicicola I. radicicola strain (KACC41077) was performed using hybrid sequencing (Roche 454 and Illumina Hiseq) to obtain genomic information of about 64 Mb. This genetic information was predicted using Maker version 2.31.8 and Protein BLAST was performed on UniProt Swiss-Prot (2010506). Among them, polygalacturonase gene (polygalacturonase 1), which is able to identify the pathogenic strain of ginseng root rot ( I. mors - panacis ), was identified. ). The selected polygalacturonase gene was amplified by PCR using the
시료 병원균 준비 및 gDNA 추출Sample pathogen preparation and gDNA extraction
본 발명에서 사용한 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex) 표준균주 11종의 상세정보를 하기 표 2에 기재하였다. To the ginseng root rot Won Kyun (I. radicicola species complex) type strain of 11 details used in the present invention are shown in Table 2.
표 2와 같은 균주들을 CM 액체배지(1L 당 NaNO3 2 g, Bacto-peptone 2.5 g, Bacto-yeast extract 1.0 g, sucrose 30.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO42O 0.5 g, KCl 0.5 g, trace element solution 0.2 ㎖ 및 vitamin stock solution 10.0 ㎖를 포함)에 접종하여 25℃ 항온기에서 7일간 현탁배양하였다. 배양된 균사들을 동결건조한 후 마쇄하고 CTAB 추출용액(cetyltrimethylammonium bromide buffer, 2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0 및 1.4 M NaCl를 포함)을 이용해 genomic DNA(gDNA)를 추출하였다. 추출된 gDNA는 20 ng/㎕ 농도로 맞추어 PCR 증폭에 이용될 수 있도록 준비하였다.The strains shown in Table 2 were suspended in CM liquid medium (NaNO 3 per 1 L 2 g, Bacto-peptone 2.5 g, Bacto-yeast extract 1.0 g, sucrose 30.0 g, KH 2 PO 4 1.0 g, MgSO 42 O 0.5 g , KCl 0.5 g, trace element solution comprises a 0.2 ㎖ and vitamin stock solution 10.0 ㎖) was 7 days in suspension culture was inoculated in 25 ℃ thermostat. The cultured mycelia were lyophilized, and the genomic DNA (gDNA) was extracted with CTAB extract solution (containing cetyltrimethylammonium bromide buffer, 2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0 and 1.4 M NaCl) . The extracted gDNA was prepared to be used for PCR amplification at a concentration of 20 ng / μl.
PCR에 의한 식물세포벽 분해효소 polygalacturonase 유전자의 증폭Amplification of plant cell wall degrading enzyme polygalacturonase gene by PCR
상기 표 1의 서열번호 1의 프라이머(10 pmol) 0.5㎕, 서열번호 2의 프라이머(10 pmol) 0.5㎕, 실시예 2에서 추출한 균주별 gDNA(20 ng/㎕) 1㎕, dNTP(10 mM) 0.4㎕, 10X Taq 완충액 2 ㎕, Inclone™ taq(5 units/㎕) 0.2㎕ 및 멸균수 15.4 ㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 이후 상기 혼합액 20㎕를 PCR 반응에 사용하였다.0.5 μl of the primer (10 pmol) of SEQ ID NO: 1 in Table 1, 0.5 μl of the primer (10 pmol) of SEQ ID NO: 2, 1 μl of the gDNA (20 ng / , 2 μl of 10 × Taq buffer, 0.2 μl of Inclone ™ taq (5 units / μl) and 15.4 μl of sterilized water were mixed to prepare a mixed solution. Then, 20 μl of the mixed solution was used for the PCR reaction.
구체적으로, PCR 반응은 혼합액 20㎕를 94℃에서 5분 동안 최초변성(predenaturation)시킨 다음 94℃에서 20초 변성(denature), 62℃에서 20초 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 확장(extension)하는 싸이클을 1 싸이클로 하여 35 싸이클을 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 최종 확장(final elongation) 하였다.Specifically, 20 μl of the mixed solution was subjected to initial denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, denaturation at 94 ° C. for 20 seconds, annealing at 62 ° C. for 20 seconds, extension at 72 ° C. for 30 seconds 35 cycles were repeated with one cycle as a cycle of extension, followed by final elongation at 72 ° C for 10 minutes.
이후 상기 PCR반응에서 수득한 PCR 산물은 1.2% 아가로스(agarose) 겔에 전기영동하여 확인하였다. 전기영동 결과는 도면 1에 나타냈다.Thereafter, the PCR product obtained in the PCR reaction was confirmed by electrophoresis on a 1.2% agarose gel. Electrophoresis results are shown in FIG.
도 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머로 분양받은 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주들을 증폭한 결과, 강병원성 균주(I. mors-panacis)만 증폭 산물이 형성된 것을 확인할 수 있었다.As can be seen in FIG. 1, amplification of standard strains of ginseng root rot rot ( I. radicicola species complex) pre- emulsified with the primer of the present invention revealed that amplification products were formed only in the pathogenic strain ( I. mors-panacis ) I could confirm.
이로 인해, 본 발명의 프라이머는 인삼뿌리썩음병 강병원성 균주(I. mors-panacis)를 효과적으로 동정하는데 적합한 것을 알 수 있었다.Thus, it was found that the primer of the present invention is suitable for effectively identifying a pathogenic strain ( I. mors-panacis ) of ginseng root rot disease.
[비교예 1][Comparative Example 1]
종래 ITS1-ITS4 primer(Waite et al., 1990)로 알려진 하기 표 3과 같은 서열번호 4 내지 5의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리했다. 이후 94℃에서 20초 변성, 55℃에서 1분 결합, 72℃에서 1분간 확장하는 1싸이클을 35 싸이클 반복하여 PCR 반응을 수행하였고, 전기영동 결과는 도면 2에 나타냈다.PCR mixtures were treated in the same amounts as in Example 3, except that the primers of SEQ ID NOS: 4 to 5 were used, which are known as conventional ITS1-ITS4 primers (Waite et al ., 1990) Thereafter, the PCR reaction was performed by repeating 35 cycles of 20 sec denaturation at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 1 min at 72 ° C, and the result of electrophoresis was shown in FIG.
도 2에서 확인되는 바와 같이, 기존에 발명된 ITS1-ITS4 프라이머로 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주들을 증폭한 결과, 병원성에 상관없이 전부 증폭 산물이 형성된 것을 확인할 수 있었다. As can be seen in FIG. 2, the standard strains of the radicicola species complex of Ginseng Root Rotor with the previously invented ITS1-ITS4 primer were amplified, and it was confirmed that all amplification products were formed regardless of pathogenicity.
[비교예 2][Comparative Example 2]
비교예1에서 실시한 ITS1-ITS4 프라이머를 이용하여 1차 PCR 반응을 실시한 후, Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 키트를 사용하여 그 PCR 산물을 정제하였다. 이후 정제한 1차 PCR 산물을 주형 DNA로 하고 종래 Dest1-Dest4 primer(Hamelin et al.,1996)로 알려진 하기 표 3과 같은 서열번호 6 내지 7의 프라이머를 사용한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리한 후 95℃에서 35초 변성, 55℃에서 1분 결합, 72℃에서 2분간 확장하는 1싸이클을 30싸이클 반복하여 Nested PCR 반응을 수행하였다. 전기영동 결과는 도면 2에 나타냈다.The first PCR reaction was performed using the ITS1-ITS4 primer of Comparative Example 1, and the PCR product was purified using a Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) kit. The purified first PCR product was used as template DNA and the same primers as those of Example 3 except that the primers of SEQ ID NOS: 6 to 7 as shown in Table 3 below, known as Dest1-Dest4 primer (Hamelin et al ., 1996) Nested PCR was performed by repeating 30 cycles of 1 cycle at 95 ° C for 35 sec denaturation, 55 ° C for 1 min, and 72 ° C for 2 min. The electrophoresis results are shown in FIG.
도 2에서 확인되는 바와 같이, 기존에 발명된 Dest1-Dest4 프라이머로 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주들을 증폭한 결과, 병원성에 상관없이 전부 증폭 산물이 형성된 것을 확인할 수 있었다. As can be seen in FIG. 2, amplification of the standard strains of ginseng root rot rotavirus ( I. radicicola species complex) with the previously invented Dest1-Dest4 primer revealed that all amplification products were formed regardless of pathogenicity.
[비교예 3][Comparative Example 3]
종래 CYLH3F-CYLH3R primer(Ismail et al., 2013)로 알려진 하기 표 3과 같은서열번호 7 내지 8의 프라이머를 사용한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리했다. 이후 94℃에서 30초 변성, 61℃에서 30초 결합, 72℃에서 30초간 확장하는 1싸이클을 35 싸이클 반복하여 PCR 반응을 수행하였고, 전기영동 결과는 도면 2에 나타냈다.The PCR mixture was treated in the same amounts as in Example 3, except that the primers of SEQ ID NOS: 7 to 8 as shown in the following Table 3, which were known as conventional CYLH3F-CYLH3R primers (Ismail et al ., 2013) Thereafter, the PCR reaction was performed by repeating 35 cycles of 30 sec denaturation at 94 ° C, 30 sec denaturation at 61 ° C and 30 sec elongation at 72 ° C, and electrophoresis results are shown in FIG.
도 2에서 확인되는 바와 같이, 기존에 발명된 CYLH3F-CYLH3R 프라이머로 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주들을 증폭한 결과, 병원성에 상관없이 전부 증폭 산물이 형성된 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 2, the standard strains of the radicicola species complex of the ginseng root rot with the CYLH3F-CYLH3R primer which was previously invented were amplified, and it was confirmed that the whole amplification product was formed regardless of the pathogenicity.
결국, 도 1과 도 2에서 확인되는 바와 같이 상기 표 3의 비교예 1 내지 4의 종래 프라이머들을 이용하여 분양받은 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주들을 증폭한 결과, 모든 표준 균주들에서 증폭 산물을 확인할 수 있었으며, 이에 따라서 종래의 프라이머들로는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)를 구별할 수 없었다. 그러나 도 1과 같이 표 1의 서열번호 1 및 2의 프라이머를 통해서는 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주 중 강병원성 균주만을 동정하는데 매우 효과적임을 확인할 수 있다.As a result, as shown in FIG. 1 and FIG. 2, the standard strains of the radicicola species complexes of the ginseng root rot by using the conventional primers of Comparative Examples 1 to 4 in Table 3 were amplified, The amplification product was confirmed in the strains. Therefore, the conventional primers could not distinguish ginseng root rot rot ( I. mors-panacis ). However, as shown in FIG. 1, it can be confirmed that the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 in Table 1 are very effective in identifying only the pathogenic strain among the standard strains of the ginseng root rot rot A. bromicola species complex.
[비교예 4][Comparative Example 4]
비교예3에서 실시한 CYLH3F-CYLH3R 프라이머를 이용하여 1차 PCR 반응을 실시한 후, Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 키트를 사용하여 그 PCR 산물을 정제하였다. 이후 정제한 1차 PCR 산물을 주형 DNA로 하고 CYLH3F-CYLH3R 프라이머를 사용해 direct sequencing을 실시하였다. 분석된 균주들의 염기서열을 계통분석을 수행하였다. 계통분석 결과는 도면 3에 나타냈다.The PCR product was purified using a Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) kit after performing a primary PCR reaction using the CYLH3F-CYLH3R primer of Comparative Example 3. Direct sequencing was performed using the purified first PCR product as template DNA and CYLH3F-CYLH3R primer. Sequence analysis of the analyzed strains was performed. The results of the system analysis are shown in FIG.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 표 3의 비교예 3 내지 4의 종래 CYLH3F-CYLH3R 프라이머로 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주를 증폭한 후, 염기서열을 분석하고 계통분석을 통해야만 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex) 중 I. robusta, I. cyclaminicola, I. mors-panacis로 확인이 가능하고, 이를 통해 강병원성 균주(I. mors-panacis)를 동정할 수 있었다. 그러나 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트는 상술한 실험결과들을 통해 확인할 수 있듯이, PCR 이후의 염기서열 분석 및 계통분석 없이도 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex) 중 강병원성 균주(I. mors-panacis)만을 식별할 수 있어서 I. mors-panacis의 동정에 매우 적합하다. As shown in FIG. 3, the standard strains of the radicicola species complex of ginseng root rot with the conventional CYLH3F-CYLH3R primers of Comparative Examples 3 to 4 in Table 3 were amplified, I. robusta, I. cyclaminicola, and I. mors-panacis among the radicicola species complexes of ginseng root rot ( I. mors-panacis ) can be identified. there was. However, as can be seen from the above-mentioned experimental results, the primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2 according to the present invention can be used for the pathogenicity of the radicicola species complex of ginseng root rot, It is able to identify only the strain ( I. mors-panacis ) and is therefore well suited for identification of I. mors-panacis .
[비교예 5][Comparative Example 5]
실시예1과 동일한 방법으로 실시하여 분석된 여러 개의 polygalacturonase 유전자 중 실시예1의 polygalacturonase 유전자와 다른 polygalacturonase 유전자(polygalacturonase 2)를 선발했다. 선발한 polygalacturonase 2를 Primer3 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용해 PCR 산물이 약 200~500bp에서 생성되도록 하기 표 4와 같은 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머쌍(Cy00453)을 제작하였다.A polygalacturonase gene (polygalacturonase 2) different from the polygalacturonase gene of Example 1 was selected from among several polygalacturonase genes analyzed by the same method as in Example 1. The selected polygalacturonase 2 was amplified by PCR using the
이후 실시예3과 동일한 방법으로 실시하되, 서열번호 1과 2의 프라이머쌍 대신에 서열번호 10과 11의 프라이머쌍을 이용하여 PCR반응을 실시하고, 수득한 PCR 산물은 1.2% 아가로스(agarose) 겔에 전기영동하여 확인하였다. 전기영동 결과는 도 6에 나타냈다.Then, the PCR reaction was carried out in the same manner as in Example 3 except that the primer pairs of SEQ ID NOs: 10 and 11 were used instead of the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2. PCR products obtained were subjected to 1.2% agarose- The gel was confirmed by electrophoresis. The results of the electrophoresis are shown in Fig.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 비교예 5에 따른 프라이머로 분양받은 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex)의 표준 균주들을 증폭한 결과, 강병원성 균주(I. mors-panacis)를 비롯한 병원성이 약하거나 없는 균주까지 모두 증폭 산물이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 단순히 polygalacturonase 유전자라고 하여 인삼뿌리썩음병원균(I. radicicola species complex) 중 강병원성 균주(I. mors-panacis)를 종-특이적으로 동정할 수 있는 것은 아니라는 것을 확인할 수 있었다. As can be seen in FIG. 6, the amplification of the standard strains of the radicicola species complex of Ginseng root rot, which had been pre-treated with the primer according to the comparative example 5, showed that pathogenic bacteria including I. mors-panacis It was confirmed that the amplification product was formed in both the weak and the non-resistant strains. Thus, it can be confirmed that the polygalacturonase gene can not be identified species-specifically in the I. radicicola species complex of the ginseng root rot I. mors-panacis .
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Maker and kit for detection of Ilyonectria mors-panacis and method for detecting of Ilyonectria mors-panacis <130> 1063062 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy10576_primer(F) <400> 1 cagcactgca tcgccaacca 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy10576_primer(R) <400> 2 tggcgtacgt caaccggata acatt 25 <210> 3 <211> 1281 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy10576 <400> 3 atggtgtccc ttctctcttg cattgccatt gcggcttgct atttgtcgtg cagcactgca 60 tcgccaacca ggcacttttc cagacaggcg caatggccaa atggtccatt cttcagcaac 120 ggcaatcgca tggttgatgc gtcgaacaac accatcaagt atgctggcac aaattggccg 180 ggacatggcg aggcaatggt cccagagggt ctgcagtacc agtcaatcgc gacgatagtc 240 tcggatatca agagtctcgg catgaatgtt atccggttga cgtacgccat cgaaatgatt 300 gatcaaatct acgaaaatga tggtcaggac atccgtttgg acactgcctt taccgaggca 360 cttggatcaa ccaacggaac aaaggttttg aaccaggtgc tggcaaacaa tcccgagttc 420 acagctgcta gcacaaggct tgagcttttt gatgccattg cggcagagtg tgccaagcaa 480 gaaatctaca ttcatctgga caaccacatc tcccaggcca agtggtgctg tggcggagcc 540 gacggaaacg cctggtttgg agactcgggt ttccccgtcg acaactggat gagaggactg 600 gtcttcatgg caaaccacgg aaaatcttgg tcaaacttcg tgtccatctc actccgcaat 660 gagctccgcc agccgaccgg cactgcctca agtacccttg agtcgtacga ttgggcgaca 720 tggtacaaac atgttaagct tgccactgct gccatcaacg cagccaaccc ggaccctctc 780 attttccttt ctggtctcaa ctatgacaca accctccagc ccgtcgtcca gggtactgca 840 ctcacccccg ggacgacggt ctttgacgat gatgacttcc ccggattccg aaacaagctt 900 gttctggagc tgcacaacta ctccaattcc gccacgagct gctcagcgtt gaagtcggac 960 ttgggtacga agggattcca gtccatggac ccatcgaact ctgctgtcaa gaatgtcttc 1020 ccggtgttga tgactgagtg gggtttcctc cagaccgaca gcacttggaa gggagtgtat 1080 acatcgtgcc ttgccgagtt ccttcccgaa agcagtgctg gatggatgta ctgggtgctg 1140 gtgggaagct actacatcag gtcgggaact caggatttcg aggaaacttg gggtttgtta 1200 gcccatgact ggtccggttg gaggaacaat gactacatcc aggggtcact cgttccgatg 1260 gtggaagcgt cattggcgta a 1281 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1_primer <400> 4 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4_primer <400> 5 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest1_primer <400> 6 ttgttgcctc ggcggtgcct g 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest4_primer <400> 7 ggtttaacgg cgtggccgcg ctgtt 25 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYLH3F_primer <400> 8 aggtccactg gtggcaag 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYLH3R_primer <400> 9 agctggatgt ccttggactg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy00453_primer(F) <400> 10 cccatctcgg cgaccaatct 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy00453_primer(R) <400> 11 ggcatcccac cactcctgtc cata 24 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Maker and kit for detection of Ilyonectria mors-panacis and method for detecting Ilyonectria mors-panacis <130> 1063062 <160> 11 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy10576_primer (F) <400> 1 cagcactgca tcgccaacca 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy10576_primer (R) <400> 2 tggcgtacgt caaccggata acatt 25 <210> 3 <211> 1281 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy10576 <400> 3 atggtgtccc ttctctcttg cattgccatt gcggcttgct atttgtcgtg cagcactgca 60 tcgccaacca ggcacttttc cagacaggcg caatggccaa atggtccatt cttcagcaac 120 ggcaatcgca tggttgatgc gtcgaacaac accatcaagt atgctggcac aaattggccg 180 ggacatggcg aggcaatggt cccagagggt ctgcagtacc agtcaatcgc gacgatagtc 240 tcggatatca agagtctcgg catgaatgtt atccggttga cgtacgccat cgaaatgatt 300 gatcaaatct acgaaaatga tggtcaggac atccgtttgg acactgcctt taccgaggca 360 cttggatcaa ccaacggaac aaaggttttg aaccaggtgc tggcaaacaa tcccgagttc 420 acagctgcta gcacaaggct tgagcttttt gatgccattg cggcagagtg tgccaagcaa 480 gaaatctaca ttcatctgga caaccacatc tcccaggcca agtggtgctg tggcggagcc 540 gacggaaacg cctggtttgg agactcgggt ttccccgtcg acaactggat gagaggactg 600 gtcttcatgg caaaccacgg aaaatcttgg tcaaacttcg tgtccatctc actccgcaat 660 gagctccgcc agccgaccgg cactgcctca agtacccttg agtcgtacga ttgggcgaca 720 tggtacaaac atgttaagct tgccactgct gccatcaacg cagccaaccc ggaccctctc 780 attttccttt ctggtctcaa ctatgacaca accctccagc ccgtcgtcca gggtactgca 840 ctcacccccg ggacgacggt ctttgacgat gatgacttcc ccggattccg aaacaagctt 900 gttctggagc tgcacaacta ctccaattcc gccacgagct gctcagcgtt gaagtcggac 960 ttgggtacga agggattcca gtccatggac ccatcgaact ctgctgtcaa gaatgtcttc 1020 ccggtgttga tgactgagtg gggtttcctc cagaccgaca gcacttggaa gggagtgtat 1080 acatcgtgcc ttgccgagtt ccttcccgaa agcagtgctg gatggatgta ctgggtgctg 1140 gtgggaagct actacatcag gtcgggaact caggatttcg aggaaacttg gggtttgtta 1200 gcccatgact ggtccggttg gaggaacaat gactacatcc aggggtcact cgttccgatg 1260 gtggaagcgt cattggcgta a 1281 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1_primer <400> 4 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4_primer <400> 5 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest1_primer <400> 6 ttgttgcctc ggcggtgcct g 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest4_primer <400> 7 ggtttaacgg cgtggccgcg ctgtt 25 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYLH3F_primer <400> 8 aggtccactg gtggcaag 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYLH3R_primer <400> 9 agctggatgt ccttggactg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy00453_primer (F) <400> 10 cccatctcgg cgaccaatct 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ilyonectria radicicola_Cy00453_primer (R) <400> 11 ggcatcccac cactcctgtc cata 24
Claims (11)
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2로 표시되는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis) 동정용 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)의 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균(I. mors-panacis)의 식별방법.(a) separating DNA from a sample to obtain a sample DNA;
(b) a composition comprising the sample DNA obtained in the step (a) and a primer set for identification of ginseng root rot rot disease ( I. mors-panacis ) represented by SEQ ID NOS: 1 and 2, and a polymerase chain reaction , PCR) to obtain a PCR product; And
(c) analyzing the PCR product to identify the presence of the ginseng root rot -bacterium ( I. mors-panacis ) in the sample; and identifying the mors-panacis ginseng root rot.
According to claim 1, wherein said polymerase chain reaction is a method for identifying ginseng root rot Won Kyun (I. mors-panacis), characterized in that real-time polymerase chain reaction.
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료에 인삼뿌리썩음병이 발병 또는 발병예정인지 판정하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병 진단방법.(a) separating DNA from a sample to obtain a sample DNA;
(b) obtaining a PCR product by performing a polymerase chain reaction (PCR) with a composition comprising the sample DNA obtained in the step (a) and a primer set represented by SEQ ID NOS: 1 and 2; And
(c) analyzing the PCR product to determine whether the ginseng root rot disease is onset or onset in the sample.
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