KR101953374B1 - Protein nanoparticle based multivalent vaccines - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 나노입자 기반의 복합백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는, B형 간염 바이러스의 캡시드 단백질의 표면에 면역증강제 또는 항원을 발현하는 단백질 나노입자 소단위체들이 혼합된 키메릭 구조를 갖는 단백질 나노입자를 제공한다. 상기 단백질 나노입자는 하나의 단백질 나노입자 표면에 항원과 면역증강제를 동시에 표출시킴으로써 단백질 나노입자에 의한 면역세포 인식을 향상시키고, 면역증강제로 스타필로코컬 단백질 에이를 사용하여 항원의 면역세포로의 타겟팅 효율을 높임으로써 백신의 면역원성을 향상시키는 효과가 있다. The present invention relates to a complex vaccine based on protein nanoparticles, and more particularly, to a protein vaccine comprising a protein having a chimeric structure in which a protein nanoparticle subunit expressing an immunostimulating agent or an antigen is mixed on the surface of a capsid protein of hepatitis B virus Nanoparticles. The protein nanoparticle enhances immune cell recognition by protein nanoparticles by simultaneously expressing an antigen and an immune enhancer on the surface of one protein nanoparticle, and targeting the antigen to an immune cell by using a staphylococcal protein aRNA as an immune enhancer By increasing the efficiency, the immunogenicity of the vaccine is improved.

Description

단백질 나노입자 기반의 복합백신{Protein nanoparticle based multivalent vaccines}[0001] Protein nanoparticle based multivalent vaccines [0002]

본 발명은 B형 간염 바이러스의 캡시드 단백질의 표면에 면역증강제 또는 항원을 표출하는 단백질 나노입자 소단위체들이 혼합된 키메릭 구조를 갖는 단백질 나노입자를 B형 간염 백신에 사용하는 단백질 나노입자 기반의 복합백신에 관한 것이다.
The present invention relates to a protein nano-particle-based complex protein nanoparticle having a chimeric structure in which a protein nanoparticle subunit expressing an immune enhancer or an antigen is mixed on the surface of a capsid protein of hepatitis B virus Vaccine.

일반적으로 백신은 생백신, 약독화백신, 사백신, 재조합 백신이 있다. 생백신 및 약독화 백신은 바이러스의 제조 시일이 오래 걸리고 생산 단가가 높을 뿐 아니라 안정성 문제를 수반하고 있다. 그러므로 안정성이 뛰어나고 생산 효율이 좋은 재조합 백신의 연구 개발이 활발히 진행되고 있으나 재조합 백신의 경우 기존 바이러스 유래의 백신에 비해 면역원성이 낮은 단점이 있다.Generally, the vaccine is a live vaccine, an attenuated vaccine, a vaccine, and a recombinant vaccine. Live vaccines and attenuated vaccines require long production times of viruses, high production costs, and stability problems. Therefore, research and development of a recombinant vaccine having excellent stability and high production efficiency is actively carried out, but a recombinant vaccine has a disadvantage that immunogenicity is lower than that of a vaccine derived from a conventional virus.

이를 극복하기 위하여 면역원성을 향상시킬 수 있는 면역보조제 (면역증강제, Adjuvant)의 개발이 요구되어 왔다. 사용 중인 면역증강제로는 수산화 알루미늄 겔, 동물 또는 식물 유래의 오일, 미네랄 오일 등이 주로 사용되고 있으나 세포성 면역유발 효과가 떨어지는 단점이 있다. 특히 미국 식약청의 허가를 받아 제품화 된 면역증강제로인 산화 알루미늄 겔은 세포성 면역 유발 효과가 낮으며, 면역증강제가 첨가된 백신은 주사 후에 과민반응을 일으킬 수 있음이 알려져 그 사용범위가 넓지는 않다. 또한 알루미늄 젤은 생체에 축적되어 생체 독성을 나타낼 뿐 아니라 알러지 반응 등 유발한다고 알려지면서 생체 안정성 문제가 대두되고 있다(Petrovsky, N. and Aguilar, J.C., Immunol Cell Biol. 2004, 82:488-96). 때문에 더 나은 면역증강제의 개발이 요구되는 실정이다.In order to overcome this problem, development of an immunoadjuvant (adjuvant) which can improve immunogenicity has been demanded. As the immune enhancer in use, aluminum hydroxide gel, animal or plant-derived oil, mineral oil and the like are mainly used, but the effect of inducing cellular immunity is poor. In particular, the aluminum oxide gel, which is manufactured by the US Food and Drug Administration (KFDA), is low in inducing cellular immunity, and the vaccine added with an immunopotentiator can cause hypersensitivity after injection. In addition, aluminum gels are known to accumulate in living organisms and cause not only bio-toxicity but also allergic reactions, resulting in biostability problems (Petrovsky, N. and Aguilar, JC, Immunol Cell Biol . 2004, 82: 488-96). Therefore, development of a better immune enhancer is required.

기존 연구에 따르면 대장균 장독소 단백질인 콜레라 톡신의 효소 활성 부위인 A 도메인(Cholera Toxin A, 또는 CTA)와 스태필로코커스 유래의 항체 결합 단백질 A의 D 도메인(Staphylococcus aureus protein A의 domain D, 또는 DD) 을 결합 시킨 단백질 (CTA1-DD) 가 가용성 단백질 항원에 대한 항체 형성률을 증가시키는 것으로 나타났다. 이는 콜레라 톡신 중 세포 결합 수용체와 결합하는 콜레라 톡신 B 도메인(cholera toxine B, 또는 CTB)이 제거되어 콜레라 톡신이 세포에 영향을 미치지 못하지만 CTB를 항체 결합 도메인으로 치환함으로써 B세포 표적이 가능하게 했기 때문이다. 즉, 항체 결합 단백질은 B 림프구 및 수지상세포의 표면 수용체와 결합이 가능하므로 독소 효소 활성을 가지는 CTA를 면역세포(B 림프구 또는 수지상세포)에 전달 가능하므로 면역 증강 효과를 나타내는 것이다(Eriksson, A. and Lycke, N., Vaccine. 2003,22:185-93; Leonetti, M. et al . J Immunol. 1998, 160:3820-7). Previous studies have shown that the A domain (Cholera Toxin A, or CTA), the enzyme active site of cholera toxin, the E. coli enterotoxin protein, and the D domain of the antibody-binding protein A from staphylococcus ( Staphylococcus aureus protein A domain D, or DD) (CTA1-DD) was found to increase the antibody-forming rate to soluble protein antigens. This is because the cholera toxin B (or cholera toxin B, or CTB) that binds to the cell binding receptor in cholera toxin is removed and cholera toxin does not affect the cell, but B cell targeting is enabled by replacing CTB with the antibody binding domain to be. That is, since the antibody-binding protein can bind to surface receptors of B lymphocytes and dendritic cells, CTA having a toxic enzyme activity can be delivered to immune cells (B lymphocytes or dendritic cells), thereby exhibiting an immunostimulating effect (Eriksson, A. and Lycke, N., Vaccine 2003, 22: 185-93, Leonetti, M. et al . J Immunol . 1998, 160: 3820-7).

또한 재조합 백신 제작에 있어서 바이러스 유래의 단백질 나노입자는 운반체로 널리 사용되고 있다. 특히 B형 간염 바이러스의 캡시드 단백질(Hepatitis B virus core antigen 또는 HBVcAg 또는 HVcAg)는 대장균에서 수용성으로 발현이 되어 자가조립을 통해 구형의 나노입자를 만들 뿐 아니라 외래 단백질을 융합할 경우 외래 단백질의 고집적 표출이 가능하다. 또한 자가조립을 통해 35 nm 정도의 구형을 이루며 이는 면역 세포에 의해 쉽게 인식되고, 항원단백질의 융합 발현을 통해 항원이 고밀도로 표출된 단백질 나노입자를 제작할 수 있으므로 재조합 항원 개발 시 운반체로 활용하기 위한 연구가 진행되어 왔다(Pumpens, P. and Grens, E. Intervirology, 2001, 44:98-114;Schodel, F. et al ., J. Biotechnol., 1996, 44:91-6). In addition, virus-derived protein nanoparticles are widely used as carriers in the production of recombinant vaccines. In particular, the capsid protein (hepatitis B virus core antigen or HBVcAg or HVcAg) of hepatitis B virus is expressed in a water-soluble form in E. coli to make spherical nanoparticles through self-assembly. In addition, when the exogenous protein is fused, This is possible. In addition, it forms a spherical shape of about 35 nm through self-assembly. It can be easily recognized by immune cells, and protein nanoparticles expressed with high density of antigen through fusion expression of antigen protein can be produced. Therefore, Studies have been conducted (Pumpens, P. and Grens, E. Intervirology , 2001, 44: 98-114; Schodel, F. et al ., J. Biotechnol ., 1996,44: 91-6).

고효율 복합 백신을 생산하기 위해서는 1) 질병 특이적인 항원 단백질과 항원 운반체의 조합 가능성 분석, 2) 복합 백신의 면역원성 증대 3) 면역증강제와의 효율적 조합을 위한 기술 개발이 우선되어야 하며 특히 면역원성이 높은 복합 백신의 생산 시스템의 구축이 우선시 되어야 한다. 즉, 제조 설비 구축 및 장기간의 기술 개발 기간이라는 이유로 신규 업체의 조기 시장 진입이 어려운 백신 산업 시장에 있어서, 빠른 백신 후보 물질의 검증, 재조합 단백질의 생산 공정 단축을 위한 단백질 나노입자 설계 및 재조합 단백질 생산 기술 개발이 요구되는 실정이다. In order to produce a high-efficiency complex vaccine, it is necessary to 1) analyze the possibility of combining disease-specific antigen proteins and antigen carriers, 2) increase the immunogenicity of the combined vaccine, and 3) develop techniques for efficient combination with the immunostimulant. The construction of a high complex vaccine production system should be prioritized. In the vaccine market, which is difficult for new companies to enter the early market due to the construction of manufacturing facilities and long-term technological development period, it is necessary to verify the candidate substances for rapid vaccines, to design protein nanoparticles for shortening the production process of recombinant proteins and to produce recombinant proteins Technology development is required.

이러한 문제를 근본적으로 해결하기 위해서는 새로운 개념의 고효율 백신 생산 시스템 및 응용 분야의 대변화 등 기존 백신 생산 시스템이 가지고 있는 단점을 혁신적으로 해결 할 수 있는 기술이 확립되어야 한다.
In order to fundamentally solve these problems, technologies that can revolutionize the disadvantages of existing vaccine production systems, such as a new concept of high-efficiency vaccine production system and a change of application field, should be established.

1. 대한민국 공개특허 제2011-0090347호1. Korean Patent Publication No. 2011-0090347 2. 대한민국 등록특허 제10-0836745호2. Korean Patent No. 10-0836745

1. The Korean Journal of Hepatology, vol.14, pp.446-464, 20081. The Korean Journal of Hepatology, vol.14, pp.446-464, 2008 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.96, pp.1915-1920, 1999.03.022. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.96, pp.1915-1920, Mar. 03, 1999

본 발명의 목적은 항원과 면역증강제를 동시에 표출하는 키메릭 단백질 나노입자를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide chimeric protein nanoparticles simultaneously expressing an antigen and an immunostimulant.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 나노입자를 기반으로 하여 세포성 면역 유도 효과를 높이고 부작용을 줄일 수 있는 효과적인 B형 간염 백신을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide an effective hepatitis B vaccine based on the protein nanoparticles, which can enhance a cellular immunity inducing effect and reduce side effects.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체(subunit); 및 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 1종 이상의 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체를 포함하는 복합 단백질 나노입자를 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus capsid that expresses an immunostimulant or an immunostimulating agent and an antigen on at least one site selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C- Subunit; And a subunit of protein hepatitis virus capsid-derived protein nanoparticles that express one or more antigens at one or more sites selected from the group consisting of spike tips, N-terminal and C-terminal .

본 발명은 또한 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 1종 이상의 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터를 숙주세포에 도입하여 상기 두 개의 벡터를 모두 포함하는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 본 발명의 복합 단백질 나노입자의 제조방법을 제공한다.
The present invention also relates to a vector expressing a chimeric protein into which an immunostimulant or an immunostimulant and an antigen are inserted in at least one site selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C-terminal of hepatitis B virus capsid protein, A vector expressing a chimeric protein into which at least one antigen is inserted at one or more sites selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C-terminal of a hepatitis virus capsid protein is introduced into a host cell, The method comprising the steps of: (1) selecting a transformant containing the protein nanoparticles according to the present invention;

본 발명은 상기 복합 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
The present invention relates to the above-mentioned complex protein nanoparticles; And a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명은 하나의 단백질 나노입자 표면에 항원과 면역증강제를 동시에 표출시킴으로써 단백질 나노입자에 의한 면역세포 인식을 향상시키고, 면역증강제로 스타필로코컬 단백질 에이를 사용하여 항원의 면역세포로의 타겟팅 효율을 높임으로써 백신의 면역원성을 향상시키는 효과가 있다. The present invention improves immune cell recognition by protein nanoparticles by simultaneously expressing an antigen and an immunostimulant on the surface of one protein nanoparticle and enhances the targeting efficiency of an antigen to an immune cell by using a staphylococcal protein a as an immunostimulating agent Thereby enhancing the immunogenicity of the vaccine.

또한, 항원 및 면역증강제를 동시에 표출하는 복합 백신 단백질 나노입자를 대장균에서 대량생산함으로써 제조시간과 비용을 절감할 수 있다. In addition, the mass production of the combined vaccine protein nanoparticles expressing the antigen and the immunostimulant simultaneously in Escherichia coli can reduce manufacturing time and cost.

아울러, 유전공학적 기법을 통해 다양한 항원에 대한 연구가 가능하므로 새로운 백신 개발 및 면역원성 검증에 활용할 수 있다.
In addition, since it is possible to study various antigens through genetic engineering techniques, it can be used for development of new vaccines and immunogenicity verification.

도 1은 본 발명의 발현 벡터 모식도로, (A)는 SpaB 표출 단백질 나노입자, (B)는 MHR 표출 단백질 나노입자, (C)는 MHR 표출 단백질 나노입자의 아미노 말단에 SpaB 가 융합된 단백질 나노입자, (D)는 MHR 표출 단백질 나노입자의 아미노 말단에 SpaB 가 두 번 중복되게 융합된 단백질 나노입자, (E)는 PreS1과 MHR을 표출하는 단백질 나노입자, (F)는 PreS2와 SpaB를 융합한 단백질 나노입자 생산을 위한 발현 벡터이다.
도 2는 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 형질전환 된 대장균에서 재조합 단백질의 발현 결과 및 정제 후 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것으로, (A)는 MHR 표출 단백질 나노입자 발현 결과 및 정제 결과, (B)는 도 1(A) 및 도 1(B)에 명시된 두 개의 발현 벡터를 동시에 형질전환 시킨 대장균에서 재조합 단백질 생산 후 정제한 결과이다. (C)는 도 1(E) 및 도 1(F)에 명시된 두 개의 발현 벡터를 동시에 형질전환 시킨 대장균에서 재조합 단백질 생산 후 정제한 결과이다.
도 3는 ELISA 를 이용한 항체가 분석에 사용되는 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 SpaB의 면역증강효과 검증을 위한 1차 동물 실험 결과를 나타낸 것으로, (A)는 동물 실험에 적용한 백신군, (B)는 백신군 투여 후 쥐 혈청 내 B형 간염 바이러스 항체 농도 측정을 통한 항체 양전률 비교 결과 [Seroconverted rate: 각 백신군 별 접종 후 20마리 쥐에서 추출한 혈청 내 B형 간염 바이러스 항체 농도가 4mlU/mL 이상인 쥐 마리수의 백분율 (%), GMT: 항체 농도의 기하평균 (mlU/mL]와 혈청 내 B형 간염 바이러스 항체 중 IgG1 농도/IgG2a 값의 기하평균(IgG/IgG2a), IgG1/IgG2a의 비율이 1이상인 개체수의 백분율(IgG1/IgG2a>1)]이다.
도 5는 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 형질전환 된 대장균에서 재조합 단백질의 발현 결과 및 정제 후 SDS-PAGE 결과로, (A)는 MHR 표출 단백질 나노입자의 아미노 말단에 SpaB 가 융합된 단백질 나노입자 발현 및 정제 결과, (B)는 MHR 표출 단백질 나노입자의 아미노 말단에 SpaB 가 두 번 중복되게 융합된 단백질 나노입자 발현 및 정제 결과이다.
도 6은 SpaB의 융합 위치에 따른 면역원성 비교를 위한 2차 동물 실험 결과로, (A)는 동물 실험에 적용한 백신군, (B)는 백신군 투여 후 쥐 혈청 내 B형 간염 바이러스 항체 농도 측정을 통한 항체 양전률 비교 결과 [Seroconverted rate: 각 백신 군 별 접종 후 20마리 쥐에서 추출한 혈청 내 B형 간염 바이러스 항체 농도가 4mlU/mL 이상인 쥐 마리 수의 백분율 (%), GMT: 항체 농도의 기하평균 (mlU/mL], (C)는 혈청 내 B형 간염 바이러스 항체 중 IgG1 농도/IgG2a 값의 기하평균(IgG/IgG2a)]이다.1 is a schematic diagram of an expression vector of the present invention, wherein (A) is a SpaB expressed protein nanoparticle, (B) is an MHR expressed protein nanoparticle, and (C) is a protein nano (D) is a protein nanoparticle in which SpaB is fused twice to the amino terminal of the MHR expressed protein nanoparticle, (E) is a protein nanoparticle expressing PreS1 and MHR, (F) is a fusion protein of PreS2 and SpaB It is an expression vector for the production of a protein nanoparticle.
FIG. 2 shows results of expression and SDS-PAGE after purification of recombinant proteins in E. coli transformed with the expression vector of the present invention. FIG. 2 (A) shows the expression and purification results of the MHR expressed protein nanoparticles, Is the result of purification after production of recombinant protein in E. coli transformed with the two expression vectors shown in FIG. 1 (A) and FIG. 1 (B) simultaneously. (C) shows the result of purification after production of recombinant protein in E. coli transformed with two expression vectors shown in FIG. 1 (E) and FIG. 1 (F) simultaneously.
Figure 3 shows the standard curve used for antibody analysis using ELISA.
FIG. 4 shows the results of the first animal experiment for the purpose of verifying the immunopotentiation effect of SpaB, wherein (A) is a vaccine group applied to an animal experiment, and (B) Seroconverted rate: Percentage (%) of rats with a hepatitis B virus antibody concentration of 4 mlU / mL or more in serum from 20 rats after inoculation by each vaccine group, GMT: Geometric mean of antibody concentration (IgG1 / IgG2a> 1) of the ratio of IgG1 / IgG2a to the geometric mean (IgG / IgG2a) of the IgG1 concentration / IgG2a value in the serum of the hepatitis B virus antibody.
FIG. 5 is a graph showing the results of SDS-PAGE analysis of recombinant protein in Escherichia coli transformed using the expression vector of the present invention and purification after SDS-PAGE, wherein (A) shows protein nanoparticles fused with SpaB at the amino terminus of MHR- As a result of the expression and purification, (B) is the result of protein nanoparticle expression and purification in which SpaB is fused twice to the amino terminal of MHR expressed protein nanoparticle.
FIG. 6 shows the result of the second animal test for comparison of immunogenicity according to the fusion position of SpaB, wherein (A) shows the vaccine group applied to the animal experiment and (B) shows the antibody concentration of the hepatitis B virus [Seroconverted rate: Percentage (%) of rats with a hepatitis B virus antibody concentration of 4 mlU / mL or more in serum from 20 rats after inoculation by each vaccine group, GMT: Geometry of antibody concentration (IgG / IgG2a) of the IgG1 concentration / IgG2a value in the hepatitis B virus antibody in the serum].

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 새로운 개념의 고효율 백신 생산 시스템을 개발하고자 항원과 면역증강제를 동시에 발현하는 백신 시스템을 제작하였다. 면역세포 타겟팅을 통한 면역 증강 효과가 있다고 알려진 스타필로코커스 아루레우스 단백질 에이(Staphylococcus aureus protein A)의 B 도메인(SpaB)을 HBVcAg의 표면에 표출시키고, 이 단백질 나노입자에 항원 단백질을 동시에 표출시켜 고효율 복합 백신을 개발하고자 하였다. 모델 질환으로는 B형 간염으로 선정하였고, B형 간염 백신용 항원으로 B형 간염 바이러스의 표면 단백질 중 주요 항원 부위라고 알려진 MHR(Major hydrophilic region)을 선정하여 단백질 나노입자와 융합 발현함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have developed a vaccine system that simultaneously expresses an antigen and an immunostimulant to develop a new concept of high-efficiency vaccine production system. The B domain (SpaB) of Staphylococcus aureus protein A, which is known to have an immune enhancing effect through immune cell targeting, is expressed on the surface of HBVcAg, and the protein protein is simultaneously expressed on the protein nanoparticle And to develop a high-efficiency complex vaccine. MHR (Major hydrophilic region), which is known as the major antigenic site among the surface proteins of hepatitis B virus, was selected as the model disease and fused with protein nanoparticles to express the present invention Completed.

따라서, 본 발명은 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체(subunit); 및 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 1종 이상의 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체를 포함하는 복합 단백질 나노입자를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a method for screening a protein subunit of a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus capsid expressing an immunopotentiator or an immunogen and an antigen at one or more sites selected from the group consisting of spike tips, N-terminal and C- ; And a subunit of protein hepatitis virus capsid-derived protein nanoparticles that express one or more antigens at one or more sites selected from the group consisting of spike tips, N-terminal and C-terminal .

본 명세서에서, 용어 "재조합 단백질(recombinant protein) 또는 융합 단백질(fusion protein)"은 하나의 단백질의 특정 부위, N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. As used herein, the term " recombinant protein or fusion protein " refers to a protein in which a protein is linked to another protein at a specific site, N-terminal or C-terminal, do.

용어, "키메릭 단백질" 또는 "키메릭 나노입자" 또는 "복합 단백질 나노입자"는 최광의 의미로 사용된 것으로서 유전공학 또는 단백질공학 기술을 바탕으로 단백질 나노입자의 표면에 외래 생체 물질을 결합시킴으로써 다양한 기능성이 부여된 단백질 또는 단백질 나노입자를 의미한다. 비록 본 발명에서는 HBV 캡시드가 면역증강제 또는 항원의 표면 표출을 모델 바이러스 스캐폴드(scaffold)로 사용되었지만, 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 입자들도 표면 항원 또는 면역증강제를 표출하는 키메릭 단백질 또는 키메릭 나노입자 또는 복합 단백질 나노입자의 생성에 사용될 수 있다.The term " chimeric protein " or " chimeric nanoparticle " or " multiprotein nanoparticle " is used in the broadest sense and refers to a biomolecule that binds exogenous biomaterials to the surface of protein nanoparticles based on genetic engineering or protein engineering techniques Quot; means a protein or protein nanoparticle to which various functions are imparted. Although HBV capsid is used as a model virus scaffold for surface expression of immunopotentiators or antigens in the present invention, other viruses or virus-like particles can also be used as chimeric proteins or chimeric nano- Particles or complex protein nanoparticles.

용어, "표출" 또는 "발현"은 단백질 나노입자의 표면, 예컨대, 스파이크 팁, N-말단(또는 아미노 말단), 또는 C-말단(또는 카르복시 말단) 등에 외래 단백질을 제시할 때 사용하는 의미로, 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단, 또는 C-말단 등에 외래 단백질이 삽입되어 캡시드 단백질의 자가 조립 시 캡시드의 3차 구조를 유지하면서 스파이크 팁, N-말단, 또는 C-말단 등에 외래 단백질이 표면 표출 또는 발현할 수 있다.The term " expression " or " expression " is used to refer to the surface of protein nanoparticles, such as spike tips, N-terminus (or amino terminus), or C- terminus (or carboxy terminus) , Exogenous proteins such as spike tips, N-terminus, or C-terminus of a virus capsid protein are inserted into the spike tip, N-terminus, or C-terminus while retaining the tertiary structure of the capsid during self- Can be expressed or expressed.

용어, "단백질 나노입자의 소단위체"란 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질(HBVcAg)이 숙주세포, 예컨대, 대장균에서 발현될 경우 240개의 소단위체가 모여서 하나의 나노입자로 자가 조립될 때, 재조합 단백질 나노입자의 소단위체들이 혼합되어 하나의 단백질 나노입자를 이루는데, 이러한 단백질 나노입자의 240개의 각 단위를 단백질 나노입자의 소단위체로 명명한다. 상기 소단위체들은 종류가 같거나 상이한 재조합 단백질로부터 제조될 수 있다. 종류가 상이한 재조합 단백질로부터 제조되는 소단위체들이 자가 조립되는 경우 단백질 나노입자는 키메릭 3차 구조를 나타낸다. 이러한 키메릭 3차 구조는 외래 단백질을 다양한 위치에서 표출할 수 있어 당업자의 목적에 따라 조절될 수 있다.The term " subunit of protein nanoparticle " means that when hepatitis B virus capsid protein (HBVcAg) is expressed in host cells such as Escherichia coli, when 240 subunits are assembled into one nanoparticle, recombinant protein nanoparticles Of the protein nanoparticles are combined to form a single protein nanoparticle. Each of the 240 units of the protein nanoparticle is referred to as a subunit of the protein nanoparticle. The subunits may be prepared from recombinant proteins of the same or different kinds. When the subunits prepared from recombinant proteins of different kinds are self-assembled, the protein nanoparticles exhibit a chimeric tertiary structure. Such a chimeric tertiary structure can express foreign proteins at various positions and can be adjusted according to the purpose of the person skilled in the art.

용어, "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다. The term " expression vector " is a linear or circular DNA molecule consisting of a fragment encoding a polypeptide of interest operably linked to an additional fragment provided in the transcription of the expression vector. Such additional fragments include promoter and termination coding sequences. The expression vector also includes at least one replication origin, at least one selection marker, a polyadenylation signal, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or contain both elements.

용어 "B형 간염 표면 항원" 또는 "HBaAg"은 임의의 HBsAg 항원 또는 HBV 표면 항원의 항원성을 나타내는 이것의 단편을 포함한다. B형 간염 바이러스 표면 항원은 3개의 교호번역 개시코돈(alternate translational start codon)으로부터 생산되는 3개의 서로 관련된 외피단백질(envelope protein)로 구성된다. B형 간염 바이러스 표면 항원의 주요한 성분인 S 단백질은 226개의 아미노산으로 구성되며, 당쇄화 여부에 따라서 p24와 gp27로 명명된다. 중간크기인 M 단백질은 S 도메인의 N말단 부위에 preS2 도메인인 55개 아미노산이 추가된 형태로 당쇄화 여부에 따라서 gp33과 gp36으로 명명된다. 가장 큰 크기의 단백질인 L 단백질은 S 도메인과 preS2 도메인으로 구성된 M 단백질의 N 말단에 preS1 도메인인 119개의 아미노산이 추가된 형태로 당쇄화 여부에 따라 p39와 gp42로 명명된다. 실제 바이러스 외피에서는 이들 L 단백질, M 단백질 및 S 단백질의 S도메인이 이황화결합(disulfide bonds)으로 연결되어 바이러스 입자를 형성한다. 상기 B형 간염 표면 항원은 둘 이상의 면역원성 도메인 또는 동일한 항원으로부터의 에피토프, 둘 이상의 항원 면역원성 도메인들, 또는 동일한 세포, 조직 또는 유기체로부터의 에피토프, 또는 둘 이상의 다른 항원, 둘 이상의 면역원성 도메인, 또는 세포, 조직 또는 유기체로부터의 에피토프(epitopes)를 포함할 수 있다. The term " hepatitis B surface antigen " or " HBaAg " includes any fragment of HBsAg antigen or a fragment thereof that exhibits antigenicity of HBV surface antigens. The hepatitis B virus surface antigen consists of three mutually related envelope proteins produced from three alternate translational start codons. The S protein, a major component of the hepatitis B virus surface antigen, is composed of 226 amino acids and is named p24 and gp27 depending on the glycosylation. The medium-sized M protein is named as gp33 and gp36, depending on the glycosylation, in which 55 amino acids, the preS2 domain, are added to the N-terminal region of the S domain. The L protein, which is the largest protein, is named as p39 and gp42 by the addition of 119 amino acids, preS1 domain, to the N terminus of the M protein consisting of the S domain and the preS2 domain. In the actual virus envelope, the S domains of these L, M and S proteins are linked to disulfide bonds to form virus particles. Wherein the Hepatitis B surface antigen is an epitope from two or more immunogenic domains or the same antigen, two or more antigen immunogenic domains, or an epitope from the same cell, tissue or organism, or two or more different antigens, two or more immunogenic domains, Or epitopes from cells, tissues or organisms.

바람직하게는, 본 발명은 B형 간염 바이러스 중 C형 유전자 아형에 속하는 adr 혈청형이 한국 환자에게서 가장 빈번하게 발견된다고 알려져 있으므로(차충환 외, Korean J Lab Med, 2009) adr 혈청형의 HBVsAg 중 주요항원 부위라고 알려진 97 내지 169번째 아미노산 서열인 MHR(Major hydrophilic region)(서열번호 1), PreS1(서열번호 14), PreS2(서열번호 15) 등을 B형 간염 표면 항원으로 사용할 수 있다. Advantageously, because the present invention is adr type serum belonging to the C-type genetic subtypes of the hepatitis B virus is known to be the most frequently detected in patients with Korea (outer chachunghwan, Korean J Lab Of Med, 2009) 97 to 169 amino acid sequence of MHR (Major hydrophilic region known as the major antigenic site of HBVsAg of adr serotype) (SEQ ID NO: 1), PreS1 (SEQ ID NO: 14), PreS2 (SEQ ID NO: 15), such as B Can be used as a hepatitis surface antigen.

용어, "아쥬반트"는 면역 반응 형성에서 면역원을 보조할 수 있는 물질로, 항원의 생물학적 또는 면역학적 반감기 증가; 항원 제공 서열로의 항원 전달 개선; 항원 제공 세포에 의한 항원 프로세싱 및 제공의 개선; 및 면역조절성 사이토카인의 생산 유도를 포함하는 하나 이상의 기작과 같은 여러 기작을 통해 작용할 수 있다. The term " adjuvant " is a substance capable of supporting an immunogen in the formation of an immune response, which includes increasing the biological or immunological half-life of the antigen; Improved antigen delivery to antigen-presenting sequences; Improvement of antigen processing and delivery by antigen presenting cells; And induction of production of immunomodulatory cytokines. ≪ Desc / Clms Page number 2 >

상기 아쥬반트로 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 기타 다른 알루미늄 염, 인산칼슘, DNA CpG 모티프, 모노포스포릴 지질 A, 콜레라 독소, 대장균 열불활화 독소, 백일해 독소, 뮤라밀 디펩타이드, 프로인트 불완전 아쥬반트, MF59, SAF, 면역자극성 복합체, 리포좀, 생체분해성 미소구, 사포닌, 비이온성 블록 공중합체, 뮤라밀 펩타이드 유사체, 폴리포스파젠, 합성 폴리뉴클레오타이드, IFN-γ, IL-2, IL-12, 또는 ISCOMS 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. The adjuvant may be selected from the group consisting of aluminum hydroxide, aluminum phosphate or other aluminum salts, calcium phosphate, DNA CpG motif, monophosphoryl lipid A, cholera toxin, Escherichia coli heat-activated toxin, pertussis toxin, muramyldipeptide, MF59, SAF, immunostimulatory complexes, liposomes, biodegradable microspheres, saponins, nonionic block copolymers, muramyl peptide analogs, polyphosphazenes, synthetic polynucleotides, IFN- ?, IL-2, IL-12, or ISCOMS May be used alone or in combination of two or more.

본 발명의 복합 단백질 나노입자는 스파이크 팁, N-말단 또는 C-말단 등에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체와, 스파이크 팁, N-말단 또는 C-말단 등에 1종 이상의 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체가 혼합되어 있는 키메릭 구조를 갖는다. The complex protein nanoparticle of the present invention is characterized by comprising a subunit of a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus hepatitis B virus-expressing an immune enhancer or an immunostimulant and an antigen at a spike tip, N-terminal or C-terminal, Or a chimeric structure in which subunits of protein nanoparticles derived from hepatitis B virus capsid expressing one or more antigens at the C-terminus are mixed.

본 발명의 복합 단백질 나노입자는 나노입자 상에 항원과 면역증강제를 표면 표출시킴으로써 백신의 면역원성 증대 및 면역 유도 활성화 효과를 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 복합 단백질 나노입자 상에 항원과 면역증강제가 동시에 존재할 경우 면역증강제에 의한 항원의 B 세포 타겟팅을 가능하게 함으로써 B 세포가 항원 표출 세포(APC)로 활성화시키고 이는 결과적으로 Th1 세포의 활성을 촉진시켜 면역 유도 향상 효과를 가져올 수 있다. 결과적으로 항원과 면역증강제를 동시 표출하는 복합 단백질 나노입자는 가장 높은 항체 형성율을 보이며, 특이 체액성 면역 반응뿐 아니라 세포성 면역 반응 또한 촉진시킬 수 있다. The complex protein nanoparticles of the present invention may have an effect of enhancing the immunogenicity of the vaccine and activating the immune induction by surface-expressing the antigen and the immunostimulant on the nanoparticles. That is, when an antigen and an immunostimulant are present on the complex protein nanoparticles of the present invention, B cells are activated by an antigen-expressing cell (APC) by enabling the B cell targeting of the antigen by an immune enhancer, Thereby promoting the activity and improving the immunity induction. As a result, complex protein nanoparticles coexpressing antigen and immune enhancer exhibit the highest antibody formation rate and can promote not only specific humoral immune response but also cellular immune response.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 복합 단백질 나노입자는 스파이크 팁 부위에 면역증강제를 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체; 및 스파이크 팁 부위에 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 것일 수 있다.According to one embodiment, the complex protein nanoparticle of the present invention is a subunit of a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus capsid expressing an immunostimulant at a spike tip portion; And a subunit of a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus capsid that expresses an antigen at a site of a spike tip.

다른 구체예에 따르면, 본 발명의 복합 단백질 나노입자는 N-말단 또는 C-말단 부위에 면역증강제를 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체; 및 스파이크 팁 부위에 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 것일 수 있다.According to another embodiment, the complex protein nanoparticle of the present invention is a subunit of a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus capsid that expresses an immunostimulant at the N-terminal or C-terminal region; And a subunit of a protein nanoparticle derived from a hepatitis B virus capsid that expresses an antigen at a site of a spike tip.

또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 복합 단백질 나노입자는 스파이크 팁 부위에 면역증강제를, N-말단 또는 C-말단 부위에 항원을 동시 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체; 및 스파이크 팁과 N-말단 또는 C-말단 부위에 종류가 같거나 상이한 1종 이상의 복합 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 것일 수 있다. 이 경우 면역증강제와 항원을 동시 표출하는 소단위체와 복합 항원을 표출하는 소단위체에서 각 항원은 종류가 같거나 상이할 수 있다. According to another embodiment, the complex protein nanoparticle of the present invention is a subunit of protein nanoparticle derived from hepatitis B virus capsid, which simultaneously expresses an immunostimulant at the spike tip portion and an antigen at the N-terminal or C-terminal portion ; And a subunit of protein nanoparticles derived from a hepatitis B virus capsid expressing one or more kinds of complex antigens having the same or different kinds of N-terminal or C-terminal regions at the spike tip. In this case, the subunit expressing both the immunopotentiator and the antigen and the subunit expressing the complexant may be the same or different.

본 발명의 복합 단백질 나노입자는 3차 구조로 자가조립하기 때문에 면역증강제와 항원의 표출 부위에 따라 면역 증강 효과가 다를 수 있다.Since the complex protein nanoparticles of the present invention self-assemble into a tertiary structure, the immune enhancing effect may vary depending on the expression site of the immunopotentiator and the antigen.

일 구체예에 따르면, HBcAg의 아미노 말단에 면역증강제인 SpaB가 존재할 경우 단백질 나노입자의 표면에 효과적으로 표출되지 않아 B 세포의 BCR에 결합하는 효율이 저하되며, 상기 SpaB를 중복되게 연장하여 HBcAg의 아미노 말단에 융합한 경우 SpaB의 표면 표출이 증가하고 BCR이 결합 능력이 향상됨에 따라 항체 양전률 및 항체 형성 농도가 증가된다. 결과적으로, 상기 면역증강제가 단백질 나노입자 표면의 가장 바깥 부분인 스파이크 팁에 융합 발현되었을 때 B 세포와의 결합 효율이 증가되고 이로 인해 가장 높은 면역 증강 효과를 나타낼 수 있다. According to one embodiment, the presence of SpaB, which is an immunostimulating agent at the amino terminus of HBcAg, is not efficiently expressed on the surface of protein nanoparticles, and the efficiency of binding to BCR of B cells is decreased. When fused to the end, the surface expression of SpaB is increased and the binding ability of BCR is improved, so that antibody positivity and antibody formation concentration are increased. As a result, when the immunostimulant is fused to the spike tip, which is the outermost portion of the surface of the protein nanoparticles, the binding efficiency with B cells increases, thereby exhibiting the highest immunostimulating effect.

상기 면역증강제는 스태필로코컬 단백질 에이(Staphylococcal protein A), 열충격단백질(heat shock protein), Flt-3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 과립구큰포식 세포집락자극인자 (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 또는 플라젤린(Flagellin) 등을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로는, 스태필로코컬 단백질 에이(Staphylococcal protein A)의 B 도메인을 사용할 수 있다.The immunostimulant may be selected from the group consisting of Staphylococcal protein A, heat shock protein, Flt-3L (fms-like tyrosine kinase 3 ligand), granulocyte macrophage colony stimulating factor GM-CSF, interleukin-2, IL-2 or flagellin. More specifically, the B domain of staphylococcal protein A can be used. have.

B형 간염 바이러스 캡시드 단백질은 구조상 스파이크에 해당하는 79-80번째 아미노산 서열 사이, N-말단 또는 C-말단에 외래 단백질을 융합 발현할 경우, 발현된 외래 단백질이 단백질 나노입자의 바깥 표면에 표출될 수 있다. 다만, 이러한 외래 단백질의 표면 표출은 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 3차 구조를 형성하는데 영향을 줄 수 있으므로 상기 3차 구조를 형성할 수 있는 범위에서 외래 단백질을 채택할 수 있다.The hepatitis B virus capsid protein is expressed on the outer surface of the protein nanoparticles when the exogenous protein is fused to the N-terminal or C-terminal between the 79-80th amino acid sequence corresponding to the structural spike . However, since the surface expression of such foreign proteins may affect the formation of the tertiary structure of the hepatitis B virus capsid protein, it is possible to adopt an exogenous protein within a range capable of forming the tertiary structure.

따라서, 면역증강제를 표출하는 나노입자의 소단위체는 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 79-80번째 아미노산 서열 사이, 상기 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 스태필로코컬 단백질 에이(Staphylococcal protein A)의 B 도메인의 아미노산 서열 부분이 연결된 키메릭 단백질로부터 제조될 수 있다. 상기 B 도메인이 스파이크 팁에 표출되는 경우 단백질 나노입자의 3차 구조 형성을 위해 B 도메인은 탠덤 리피트로 키메릭 단백질에 연결될 수 있고, 상기 B 도메인이 N-말단 또는 C-말단에 표출되는 경우에는 1개 이상의 도메인이 제한 없이 연결될 수 있다.Thus, the subunit of the nanoparticle expressing the immune enhancer is a polypeptide having the amino acid sequence of Staphylococcal protein A at the N-terminal or C-terminal region of the protein between the 79-80th amino acid sequence of the hepatitis B virus capsid protein, Lt; RTI ID = 0.0 > B < / RTI > When the B domain is expressed on the spike tip, the B domain can be linked to the chimeric protein by a tandem repeat for the tertiary structure formation of the protein nanoparticles, and when the B domain is expressed at the N-terminal or C-terminal One or more domains can be connected without limitation.

또한, 면역증강제와 항원을 동시 표출하는 나노입자의 소단위체는 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 79-80번째 아미노산 서열 사이에 면역증강제를, 상기 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 항원이 연결된 키메릭 단백질로부터 제조될 수 있다. 또는 항원이 스파이크 팁에, 면역증강제가 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 연결된 키메릭 단백질로부터 제조될 수 있다. The subunit of the nanoparticle coexpressing the immune enhancer and the antigen is an immunogen enhancer between the 79-80th amino acid sequence of the hepatitis B virus capsid protein and an antigen is linked to the N-terminal or C- Chimeric < / RTI > proteins. Or a chimeric protein in which an antigen is attached to a spike tip and an immunostimulant is linked to the N-terminal or C-terminal portion of the protein.

상기 항원은 B형 간염 표면 항원, A형 간염 표면 항원, 또는 C형 간염 표면 항원 등을 사용할 수 있다.The antigen may be a hepatitis B surface antigen, a hepatitis A surface antigen, or a hepatitis C surface antigen.

보다 구체적으로, 상기 항원은 PreS1, PreS2 또는 MHR(Major hydrophilic region) 등의 B형 간염 표면 항원일 수 있다.More specifically, the antigen may be a hepatitis B surface antigen such as PreS1, PreS2, or MHR (Major Hydrophilic Region).

상기 항원을 표면에 표출시킬 때, 같거나 다른 종류의 항원을 1종 이상 사용할 수도 있다.When the antigen is expressed on the surface, one or more of the same or different kinds of antigens may be used.

상기 항원을 표출하는 나노입자의 소단위체는 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 79-80번째 아미노산 서열 사이, 상기 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 PreS1, PreS2 및 MHR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원의 아미노산 서열 부분이 연결된 키메릭 단백질로부터 제조될 수 있다. The subunit of the nanoparticle expressing the antigen is selected from the group consisting of the 79-80th amino acid sequence of the hepatitis B virus capsid protein and the one or more selected from the group consisting of PreS1, PreS2 and MHR at the N-terminal or C- The amino acid sequence portion of the above antigens can be made from a linked chimeric protein.

상기 면역증강제와 항원을 표출하는 나노입자의 소단위체와 항원만을 표출하는 나노입자의 소단위체에서 각 항원의 종류는 같거나 상이할 수 있다. The subunit of the nanoparticle expressing the immunostimulant and the antigen and the subunit of the nanoparticle expressing only the antigen may be the same or different.

본 발명의 복합 단백질 나노입자에 있어서, 상기 면역증강제를 표출하는 나노입자의 소단위체 및 항원을 표출하는 나노입자의 소단위체는 1 : 1 내지 4 의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기 범위 내일 경우, 우수한 항체 양전율과 GMT를 나타낼 수 있다.
In the complex protein nanoparticles of the present invention, the subunit of the nanoparticle expressing the immunopotentiator and the subunit of the nanoparticle expressing the antigen may be mixed at a weight ratio of 1: 1 to 4. Within this range, excellent antibody positivity and GMT can be indicated.

또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위에 1종 이상의 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터를 숙주세포에 도입하여 상기 두 개의 벡터를 모두 포함하는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 상기 복합 단백질 나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a vector expressing a chimeric protein in which an immunostimulant or an immunostimulant and an antigen are inserted in at least one site selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C-terminal of hepatitis B virus capsid protein, and B A vector expressing a chimeric protein into which at least one antigen has been inserted at one or more sites selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C-terminal of a hepatitis virus capsid protein is introduced into a host cell, The method comprising the steps of: (1) selecting a transformant containing the protein nanoparticles;

본 발명의 복합 단백질 나노입자는 도 1에 도시된 바와 같이, 항원 또는 면역증강제를 단백질 나노입자의 표면에 표출되도록 발현 벡터를 구축하여 제조할 수 있다. The complex protein nanoparticles of the present invention can be prepared by constructing an expression vector so that an antigen or an immunostimulating agent is expressed on the surface of protein nanoparticles as shown in FIG.

상기 면역증강제를 표출하는 단백질 나노입자 발현용 벡터 즉, B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 또는 C-말단 등을 나타내는 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터는 카나마이신 저항성 벡터인 pET28a 벡터를, 1종 이상의 항원 표출 단백질 나노입자 발현용 벡터 즉, B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 또는 C-말단 등을 나타내는 부위에 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터는 암피실린 저항성 벡터인 pT7-7 벡터를 뼈대벡터로 하여 제조할 수 있다. 각기 다른 항생제 마커를 가지고 있으므로 대장균에 형질전환 하였을 때 암피실린과 카나마이신 혼합 배지에 도말함으로써 두 개의 발현 벡터를 동시에 포함하는 형질전환체를 선별할 수 있다. A protein nano-particle expression vector for expressing the immunostimulant, that is, a chimeric protein in which an immunostimulant or an immunostimulant and an antigen are inserted at a site showing a spike tip, N-terminal or C-terminal of the hepatitis B virus capsid protein The expression vector is constructed by inserting the pET28a vector, which is a kanamycin resistance vector, into a vector for expressing one or more antigenic expression protein nanoparticles, that is, a spike tip, N-terminal or C-terminal of the hepatitis B virus capsid protein The chimeric protein-expressing vector can be prepared by using a pT7-7 vector, which is an ampicillin resistance vector, as a skeletal vector. Because they have different antibiotic markers, when transformed into Escherichia coli, transformants containing both expression vectors can be screened by smearing on a mixed medium of ampicillin and kanamycin.

상기 면역증강제 또는 면역증강제와 항원을 표출하는 단백질 나노입자 발현용 벡터에는 HBVcAg의 79-80번째 아미노산 서열 사이, 상기 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 면역증강제가 삽입되거나, HBVcAg의 79-80번째 아미노산 서열 사이에 면역증강제가, N-말단 또는 C-말단 부위에 항원이 삽입되거나, HBVcAg의 79-80번째 아미노산 서열 사이에 항원이, N-말단 또는 C-말단 부위에 면역증강제가 삽입되는 등 단백질 나노입자의 3차 구조를 형성할 수 있는 범위 내에서 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로, N-HBVcAg(1-78)-(SpaB)2-HBVcAg(81-149)-C, N-SpaB-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-C, N-(SpaB)2-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-C 또는 N-(PreS2)-HBVcAg(1-78)-(SpaB)2-HBVcAg(81-149)-C 의 합성을 코딩하는 플라즈미드 발현 벡터일 수 있다.An immunopotentiator may be inserted into the N-terminal or C-terminal region of the protein between the 79-80 amino acid sequence of HBVcAg, or the 79-80 amino acid sequence of the protein nanoparticle expressing the immunostimulant or immunostimulant and the antigen, An immune enhancer is inserted between the 80th amino acid sequence, an antigen is inserted at the N-terminal or C-terminal region, an antigen is inserted between the 79-80th amino acid sequence of HBVcAg, and an immune enhancer is inserted at the N-terminal or C- And can be used without limitation within a range capable of forming a tertiary structure of protein nanoparticles. Specifically, N-HBVcAg (1-78) - (SpaB) 2-HBVcAg (81-149) -C-N-SpaB- HBVcAg (1-78) -MHR- HBVcAg (SpaB) 2-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) -C or N- (PreS2) -HBVcAg Lt; / RTI > expression vector.

상기 항원을 표출하는 단백질 나노입자 발현용 벡터에는 HBVcAg의 79-80번째 아미노산 서열 사이, 상기 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 1종 이상의 항원이 삽입되어 있을 수 있다. 바람직하게는, N-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-C, 또는 N-PreS1-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-C의 합성을 코딩하는 플라즈미드 발현 벡터일 수 있다.In the vector for expressing the protein nanoparticle expressing the antigen, one or more antigens may be inserted between the 79-80th amino acid sequence of HBVcAg and at the N-terminal or C-terminal region of the protein. Preferably, the coding of the synthesis of N-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) -C or N-PreS1-HBVcAg (1-78) -MHR- HBVcAg Lt; / RTI > expression vector.

상기 발현 벡터에서, 면역증강제 또는 항원은 서열번호 12 또는 13의 링커 서열에 의해 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질 (HBVcAg)에 연결될 수 있다.In such an expression vector, the immunostimulant or antigen may be linked to the hepatitis B virus capsid protein (HBVcAg) by a linker sequence of SEQ ID NO: 12 or 13.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁을 나타내는 부위에 면역증강제가 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터는 N-NdeI-HBVcAg(1-78)-G4SG4T-XhoI-SpaB-SpaB-BamHI-G4SG4-HBVcAg(81-149)-HindIII-C를 코딩하는, HBV 캡시드 단백질의 스파이크(78-81 a.a) 사이에 SpaB 유전자가 두 번 중복된 유전자가 삽입된 유전자 클론을 얻고 유전자를 수득하고, 이를 플라스미드 pT7-7에 삽입하여 N-HBVcAg(1-78)-SpaB-SpaB-HBVcAg(81-149)-C의 합성을 코딩하는 플라스미드 발현벡터 pT7 SpaB2 in CORE를 구축한다. 상기 주형으로 한 유전자는 크게 캡시드 단백질의 1-78번째 아미노산 서열 부분, 스태필로코컬 단백질 에이의 B 도메인이 연속적으로 2개 포함되어 있는 부분, 그리고 캡시드 단백질의 81-149번째 아미노산 서열부분으로 나눌 수 있다(캡시드 단백질의 1-78번째 서열: NCBI Nucleotide accession number AF286594의 염기서열 1901-2134(서열번호 4), 캡시드 단백질의 81-149번째 염기서열: AF286594의 염기서열 2141-2347(서열번호 5), 그리고 단백질 에이의 B 도메인 서열: NCBI nucleotide accession No. M18264, nucleotide sequence 625-813(서열번호 6)).In one embodiment of the present invention, the vector expressing the chimeric protein in which the immunostimulant is inserted at the site showing the spike tip of the hepatitis B virus capsid protein is N- Nde I-HBVcAg (1-78) -G4SG4T- Xho I-SpaB-SpaB- Bam HI -G4SG4-HBVcAg (81-149) - the SpaB gene is duplicated gene inserted between the double spike (78-81 aa) of encoding the Hin dIII-C, HBV capsid protein The plasmid expression vector pT7 SpaB2 in (1-78) -SpaB-SpaB-HBVcAg (81-149) -C, which encodes the synthesis of N-HBVcAg Build CORE. The gene coding for the template may be divided into the 1-78th amino acid sequence part of the capsid protein, the consecutive two B domains of the staphylococcal protein a, and the 81-149th amino acid sequence part of the capsid protein. (Nucleotide sequence 1901-2134 (SEQ ID NO: 4) of NCBI nucleotide accession number AF286594, nucleotide sequence 81-149 of capsid protein: nucleotide sequence 2141-2347 (SEQ ID NO: 5) of AF286594) , And the B domain sequence of the protein A: NCBI nucleotide accession No. M18264, nucleotide sequence 625-813 (SEQ ID NO: 6)).

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁을 나타내는 부위에 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터는 프라이머쌍(서열번호7, 8)을 사용하여 N-XhoI-MHR-BamHI-C를 암호화하는 유전자 서열을 수득하고, XhoI, BamHI을 이용하여 제한효소 처리한 후 상기 pT7 SpaB2 in CORE의 SpaB가 삽입되었던 부위에 삽입하여 SpaB 대신 MHR이 삽입되도록 라이게이션을 진행하며, N-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-C의 합성을 코딩하는 플라스미드 pT7 MHR in CORE를 구축한다. N-NdeI-HBVcAg(1-78)-G4SG4T-XhoI-MHR-BamHI-G4SG4-HBVcAg(81-149)-HindIII-C 구조로 구성된 플라스미드 pT7 MHR in CORE을 다시 NdeI 과 HindIII 제한효소로 절단하여 이를 pET28a 발현 벡터의 NdeI과 HindIII 위치에 삽입하여 최종적으로 pET28a MHR in CORE 발현 벡터를 구축한다.In one embodiment of the present invention, a vector expressing a chimeric protein into which an antigen is inserted at a site showing a spike tip of the hepatitis B virus capsid protein is constructed by using a primer pair (SEQ ID NOS: 7 and 8) -MHR-BamHI-C was obtained, restriction enzyme treatment was performed using XhoI and BamHI, and then inserted into the site where SpaB of pT7 SpaB2 in CORE was inserted, and ligation was performed so that MHR was inserted instead of SpaB And constructs a plasmid pT7 MHR in CORE encoding the synthesis of N-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) -C. N- Nde I-HBVcAg (1-78) -G4SG4T- Xho I-MHR- Bam HI-G4SG4-HBVcAg (81-149) - Hin dIII-C structure plasmid pT7 MHR Nde I and Hin dIII to in CORE again consisting of Digested with restriction enzymes and inserted into the NdeI and HindIII sites of pET28a expression vector to finally construct a pET28a MHR in CORE expression vector.

상기에서 구축된 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁을 나타내는 부위에 면역증강제가 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁을 나타내는 부위에 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터를 1 : 1 내지 4의 중량비로 숙주세포에 도입하여 형질전환 시킨다.A vector expressing a chimeric protein in which an immunostimulant is inserted at a site showing a spike tip of the hepatitis B virus capsid protein constructed above and a chimeric protein having an antigen inserted at a site showing a spike tip of the hepatitis B virus capsid protein Is introduced into a host cell at a weight ratio of 1: 1 to 4 and transformed.

상기 발현 벡터들은 각기 다른 항생제 마커를 가지고 있으므로 형질전환체를 종류가 상이한 항생제, 예컨대, 암피실린과 카나마이신 혼합 배지에서 도말함으로써 두 개의 발현 벡터를 동시에 포함하는 형질전환체를 선별할 수 있다. Since the expression vectors have different antibiotic markers, the transformants can be screened for transformants containing two expression vectors at the same time by laminating the transformants with different antibiotics, such as ampicillin and kanamycin mixed medium.

상기에서 선별된 형질전환체를 통상의 배양방법에 따라 배양하여 정제함으로써 본 발명의 복합 단백질 나노입자를 얻을 수 있다.The complexed protein nanoparticles of the present invention can be obtained by culturing and screening the transformant selected from the above in accordance with a conventional culture method.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.Such transformation includes any method of introducing the nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and can be carried out by selecting a suitable standard technique depending on the host cell, as is known in the art. Such methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO ₄ ) precipitation, calcium chloride (CaCl ₂ ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, Agrobacterium mediated transformation, PEG, dextran sulfate, ≪ / RTI > lipofectamine, and the like.

또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.In addition, since the expression amount of the protein and the expression are different depending on the host cell, the host cell most suitable for the purpose may be selected and used.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.
Examples of host cells include Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus but are not limited to, prokaryotic host cells such as mirabilis or Staphylococcus . In addition, fungi (e.g., Aspergillus ), yeast (e. G., Pichia < pastoris), Mai access to the Yasaka Auxerre Vichy kids (Saccharomyces cerevisiae), investigating car break in Rome Seth (Schizosaccharomyces), Castello La Neuro Chrysler Corporation (Neurospora can be used lower eukaryotic cells, insect cells, plant cells, mammalian cells, such as in higher eukaryotic origin, including such as crassa)) as a host cell.

본 발명은 또한 상기 복합 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to the above composite protein nanoparticles; And a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 복합 단백질 나노입자상에 항원과 면역증강제가 동시에 존재할 경우 면역증강제에 의한 항원의 B 세포 타겟팅을 가능하게 함으로써 B 세포가 항원 표출 세포로 활성화하고 이는 결과적으로 Th1 세포의 활성을 촉진시켜 면역 유도 향상 효과가 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 복합 단백질 나노입자는 백신으로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, B형 간염 바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.When the antigen and the immunostimulant are present simultaneously on the complex protein nano-particle of the present invention, the B cell is activated as an antigen-expressing cell by allowing the B cell targeting of the antigen by the immunopotentiator, thereby promoting the activity of the Th1 cell, There may be an improvement effect. Therefore, the complex protein nanoparticles of the present invention can be used as a vaccine. More specifically, it can be used to induce an immune response against the hepatitis B virus.

본 발명의 백신 조성물은 스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 단백질 나노입자; 또는 The vaccine composition of the present invention comprises a protein consisting of a subunit of protein nanoparticles derived from a hepatitis B virus capsid that expresses an immunostimulant or an immunogen and an antigen at one or more sites selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C- Nanoparticles; or

스파이크 팁, N-말단 및 C-말단으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 부위에 1종 이상의 항원을 표출하는 B형 간염 바이러스 캡시드 유래의 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 단백질 나노입자를 적어도 하나 더 포함할 수 있다.At least one protein nanoparticle composed of a protein nanoparticle derived from hepatitis B virus capsid that expresses at least one antigen at one or more sites selected from the group consisting of a spike tip, N-terminal and C-terminal have.

상기 면역증강제 또는 면역증강제와 항원을 표출하는 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 단백질 나노입자 또는 1종 이상의 항원을 표출하는 단백질 나노입자의 소단위체로 이루어진 단백질 나노입자는 상술한 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 또는 C-말단을 나타내는 부위에 면역증강제 또는 면역증강제와 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터 또는 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 스파이크 팁, N-말단 또는 C-말단을 나타내는 부위에 1종 이상의 항원이 삽입된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터를 각각 숙주세포에 도입하여 형질전환 시켜 제조할 수 있다.Protein nanoparticles composed of protein nanoparticles consisting of subunits of protein nanoparticles expressing the immunostimulants or immunostimulants and antigens or protein nanoparticles composed of subunits of protein nanoparticles expressing one or more antigens can be used as the spikes of the hepatitis B virus capsid protein Terminus or C-terminus of a hepatitis B virus capsid protein, or a vector expressing a chimeric protein in which an immunostimulant and an antigen are inserted, or a spike tip, N-terminal or C-terminal of a hepatitis B virus capsid protein And introducing a vector expressing a chimeric protein into which at least one antigen is inserted into a host cell, respectively, for transformation.

상기 면역증강제 및 항원의 종류는 상술한 바와 같다. The types of the immunostimulant and the antigen are as described above.

본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.The vaccine composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.

상기 담체는 면역원의 보관 및 환자에 대한 면역원의 투여를 용이하게 한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.The carrier facilitates storage of the immunogen and administration of the immunogen to the patient. Pharmaceutically acceptable carriers may contain a variety of ingredients such as buffer, injectable sterile water, normal saline or phosphate buffered saline, sucrose, histidine, salts and polysorbates.

한, 본 발명의 백신 조성물은 주사 형태로 투여할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 상기 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.As such, the vaccine composition of the present invention may be administered in an injection form. The injectable composition is preferably an isotonic aqueous solution or suspension and the composition contains sterilized and / or adjuvant (for example, a preservative, stabilizer, wetting agent or emulsifier solution promoter, salt for controlling osmotic pressure and / or buffer) . They may also contain other therapeutically valuable substances.

상기 백신 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우 비경구로 1일 1회 20∼52mg으로 투여하는 것이 바람직하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에 의하여 적절히 결정될 수도 있다.
The dosage of the vaccine composition varies depending on the patient's age, weight, and degree of disease. In general, when administered to an adult (based on 60 kg body weight), the vaccine composition is preferably parenterally administered at 20 to 52 mg once a day. And may be suitably determined by the experience of one of ordinary skill in the art.

또한, 본 발명은 백신의 면역 반응 유도 기작의 원인을 규명할 수 있다.Further, the present invention can identify the cause of the mechanism of inducing the immune response of the vaccine.

본 발명의 복합 단백질 나노입자에서, 면역증강제로 SpaB를 사용할 경우, 기존 문헌에 의하면 SpaB는 항체의 Fcγ, V_H3B-type B 세포 수용체(B-cell receptor, 또는 BCR) 에 직접적으로 결합할 수 있으므로 B 세포 특이적으로 결합이 가능하다. B 세포는 면역 체계에서 T 세포 활성화시킬 수 있는 항원 표출 세포(professional antigen presenting cell, 또는 APCs) 역할을 한다. 휴지기의 B 세포 표면에 존재하는 BCR에 SpaB가 선택적으로 결합하고 B-세포를 활성화하게 된다. 활성화된 B-세포는 APC이 되어 Native T 세포를 활성화시켜 Native T 세포(CD4+, CD8+)을 메모리 T 세포 또는 작동 T 세포로 분화하도록 돕는다. 특히 작동 T 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포(사이토카인 분비, B 세포 활성화)이나, 세포 사멸 활성(cytotoxic killing activity)을 지닌 CD8+ CTL로 분화된다. 차후 CD4+ 작동 T 세포는 cell mediated function(CTL)을 하는 Th1(IL-2, IFN-r, TNF-beta 분비), 또는 B 세포 활성화를 돕는 Th2(IL-4,5,6,10)로 분화됨. Th1, Th2 cell 모두 항체의 생성을 촉진시키지만 이 중 Th1이 활성화되면 IFN-r가 촉진되고 IgG 클래스 중 IgG2a로 클래스 스위칭(class switching) 시켜 항체 내 IgG2a의 비율이 증가하게 된다. 또한 Th1으로부터 분비된 IL-2와 IFN-r은 CD8+ 전구체가 세포독성 Tc 세포로 분화하는 것을 돕는다. 반면 Th2로부터 분비된 IL-4,5는 IgE 생산을 유도하고 IgG1 생산으로 클래스 스위칭을 유도한다. 따라서 IgG1/IgG2a의 비율을 조사하면 백신의 면역 반응 유도 기작 원인을 규명할 수 있다(immunology 5^th edition, W.H. Freeman and Company).In complex protein nanoparticle of the present invention, when using the SpaB as adjuvant, according to literature SpaB may be directly coupled to the antibody Fcγ, V _H 3B-type B-cell receptor (B-cell receptor, or BCR) B cell specific binding is possible. B cells act as antigen-presenting cells (APCs) that can activate T cells in the immune system. SpaB binds selectively to the BCR present on the surface of the B cell of the resting phase and activates the B-cell. Activated B-cells become APCs and activate Native T cells, helping to differentiate Native T cells (CD4 +, CD8 +) into memory T cells or T cells. In particular, working T cells are differentiated into CD8 + CTL with CD4 + helper T cells (cytokine secretion, B cell activation) or cytotoxic killing activity. Subsequent CD4 + T cells differentiate into Th1 (IL-2, IFN-r, TNF-beta secretion) or Th2 (IL-4,5,6,10) that help cell activation mediate cell mediated function (CTL) being. Both Th1 and Th2 cells promote the production of antibodies, but when Th1 is activated, IFN-r is promoted and class switching is performed to IgG2a in the IgG class, thereby increasing the proportion of IgG2a in the antibody. IL-2 and IFN-r secreted from Th1 also help CD8 + precursors differentiate into cytotoxic Tc cells. On the other hand, IL-4,5 secreted from Th2 induces IgE production and induces class switching by IgG1 production. Therefore, by examining the ratio of IgG1 / IgG2a, we can identify the mechanism by which the vaccine induces the immune response (immunology 5 ^th edition, WH Freeman and Company).

본 발명의 일 구체예에 따르면, 동물 실험 결과 생성된 항체의 IgG1, IgG2a의 농도를 ELISA로 분석한 결과, 실제 체액성 면역반응을 유도한다고 알려진 Alum 젤을 면역증강제로 사용한 경우 IgG1의 비율이 현저히 높은 반면 SpaB를 면역증강제로 사용한 복합 백신 단백질 나노입자의 경우 IgG2a의 비율이 증가한 것을 확인하였다. 이는 기존에 발표된 연구 결과와 마찬가지로 단백질 나노입자 상에 SpaB와 항원이 동시에 존재할 경우 SpaB 의한 항원의 B 세포 타겟팅을 가능하게 함으로써 B 세포가 APC로 활성화시키고 이는 결과적으로 Th1 세포의 활성을 촉진시켜 면역 유도를 향상 효과를 가져온 것을 알 수 있다. 따라서, SpaB 동시 표출 복합 백신은 가장 높은 항체 형성율을 보였으며, 특이 체액성 면역 반응뿐 아니라 세포성 면역 반응 또한 촉진시킨 것을 알 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, when the concentration of IgG1 or IgG2a of the antibody produced as a result of the animal experiment was analyzed by ELISA, the ratio of IgG1 was remarkably increased when Alum gel known to induce actual humoral immune response was used as an immunostimulating agent Whereas the ratio of IgG2a was increased in combination vaccine protein nanoparticles using SpaB as an immunity enhancer. This is because, as in the previous research results, when SpaB and the antigen are simultaneously present on the protein nanoparticles, the B cell is activated by APB by the Spa B-targeting of the antigen, thereby promoting the activity of the Th1 cell, It can be seen that the induction is improved. Therefore, the combination vaccine of SpaB showed the highest antibody formation rate and promoted not only specific humoral immune response but also cellular immune response.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples of the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the following Examples.

<실시예 1> HBV 캡시드 유래 키메릭 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현벡터 제조Example 1 Expression Vector Production for Biosynthesis of Chimeric Protein Nanoparticles Derived from HBV Capsid

본 발명은 B 형 간염 예방을 위한 효과적인 재조합 백신을 제조하기 위하여 B형 간염 바이러스의 캡시드 단백질을 운반체로 선정하였으며, 운반체 상에 항원 단백질(MHR)과 면역 증강 단백질(SpaB)를 동시에 표출하는 재조합 복합 백신 생산을 위한 발현 벡터 및 정제 시스템을 확보하였다.In order to produce an effective recombinant vaccine for the prevention of hepatitis B, the present invention selects a capsid protein of hepatitis B virus as a carrier and a recombinant complex which expresses an antigen protein (MHR) and an immune enhancing protein (SpaB) Expression vectors and purification systems for vaccine production were obtained.

B형 간염 바이러스 중 C형 유전자아형에 속하는 adr 혈청형 이 한국 환자에게서 가장 빈번하게 발견된다고 알려져 있으므로 (차충환 외, Korean J Lab Med, 2009) 본 발명은 adr 혈청형의 HBVsAg 중 주요항원 부위라고 알려진 97-169 번째 아미노산 서열인 MHR을 항원 단백질로 선정하였다 (서열번호 1). 또한 추가적으로 면역원성이 있다고 알려진 PreS1(서열번호 14), PreS2 (서열번호 15)을 항원으로 선정하였다.Among the hepatitis B viruses, the adr serotype belonging to the C-type subtype is known to be found most frequently in Korean patients (Cha Chung Hwan et al., Korean J Lab Med , 2009) The present invention selected MHR as the antigen protein (SEQ ID NO: 1), the 97-169th amino acid sequence known as the major antigen site among the HBVsAg of the adr serotype. In addition, PreS1 (SEQ ID NO: 14) and PreS2 (SEQ ID NO: 15), which are known to have additional immunogenicity, were selected as antigens.

HBVcAg는 구조상 스파이크에 해당하는 79-81번째 아미노산 서열 사이에 외래 단백질을 융합 발현할 경우, 융합 발현된 외래 단백질이 단백질 나노입자의 가장 바깥 표면에 표출이 되는 것으로 알려져 있다 (Park, J.S. et al ., Nat . Nanotechnol. 2009, 4(4):259-64). 발명자는 B 형 간염 바이러스의 표면 단백질(Hepatitis B virus surface antigen, 또는 HBVsAg) 중 주요 항원 부위라고 알려진 MHR(HBVsAg의 100-160 a.a)을 HBVcAg의 스파이크 부위에 융합하여 항원 표출 단백질 나노입자를 제조하였다. 또한 외래 단백질을 융합 발현 시 표면 표출이 가능하다고 알려진 N-말단에 PreS1, PreS2를 각각 융합하였다 (도 1, 도 2).It is known that HBVcAg is expressed on the outermost surface of the protein nanoparticle when the fusion protein is fused and expressed between the 79-81th amino acid sequence corresponding to the structural spike (Park, JS et al ., Nat . Nanotechnol . 2009, 4 (4): 259-64). The inventors prepared antigen-expressing protein nanoparticles by fusing MHR (100-160 aa of HBVsAg) known as a major antigen site in the surface protein (hepatitis B virus surface antigen, or HBVsAg) of hepatitis B virus to the spike site of HBVcAg . In addition, PreS1 and PreS2 were fused to the N-terminus, which is known to be capable of surface expression when expressing foreign proteins (FIGS. 1 and 2).

재조합 단백질은 기존 사백신이나 약독화 백신에 비해 면역원성이 낮다고 알려져 있다. 이를 극복하기 위하여 항체 결합능력을 통해 면역 세포인 B 림프구 표적화를 통해 면역 증강 효과가 있다고 알려진 SpaB 단백질을 면역증강제로 선정하여 HBVcAg의 스파이크 부위에 융합 발현하여 면역 증강 효과를 검증하고자 하였다. Recombinant proteins are known to be less immunogenic than conventional vaccines or attenuated vaccines. In order to overcome this problem, SpaB protein, which is known to be immunopotentiating effect through B lymphocyte targeting through immune cells, was selected as an immunopotentiator and tested for immunostimulating effect by fusion expression to the spike region of HBVcAg.

항원 단백질(MHR)과 면역증강 단백질(SpaB)을 동시에 단백질 나노입자(HBVcAg) 표면에 표출되도록 하기 위하여 도 1 과 같이 발현 벡터를 구축하였다. 즉, SpaB 표출 단백질 나노입자 발현용 벡터는 카나마이신 저항성 벡터인 pET28a 벡터 (도 1A), MHR 표출 단백질 나노입자 발현용 벡터는 암피실린 저항성 벡터인 pT7-7 벡터를 뼈대벡터로 하여 제작하였다(도 1B). 또한 세가지 항원 (PreS1, PreS2, MHR)과 면역증강 단백질 (SpaB)를 동시에 표출하는 단백질 나노입자를 제조하기 위하여 도 1과 같이 발현용 벡터를 제작하였다. 즉, PreS1과 MHR을 포함하는 벡터는 카나마이신 저항성 벡터인 pET28a에 (도 1E), PreS2와 SpaB를 포함하는 벡터는 암피실린 저항성 벡터인 pT7-7 벡터를 뼈대벡터로 하여 제작하였다(도 1F).An expression vector was constructed as shown in Fig. 1 in order to simultaneously express antigen protein (MHR) and immunostimulatory protein (SpaB) on the surface of protein nanoparticles (HBVcAg). That is, the SpaB expression protein nanoparticle expression vector was constructed using pET28a vector (Fig. IA), which is a kanamycin resistance vector, and the MHR expression protein nanoparticle expression vector, pT7-7 vector, which is an ampicillin resistance vector, as a skeletal vector (Fig. 1B) . In order to prepare protein nanoparticles simultaneously expressing the three antigens (PreS1, PreS2, MHR) and the immunostimulatory protein (SpaB), an expression vector was prepared as shown in Fig. That is, the vector containing PreS1 and MHR was constructed as pET28a (Fig. 1E), which is a kanamycin resistance vector, and the vector containing PreS2 and SpaB was a pT7-7 vector, which is an ampicillin resistance vector, as a skeletal vector (Fig.

각기 다른 항생제 마커를 가지고 있으므로 대장균에 형질전환 하였을 때 암피실린과 카나마이신 혼합 배지에 도말함으로써 두 개의 발현 벡터를 동시에 포함하는 형질전환체를 선별할 수 있다.Because they have different antibiotic markers, when transformed into Escherichia coli, transformants containing both expression vectors can be screened by smearing on a mixed medium of ampicillin and kanamycin.

(1) HBV 캡시드 유래 스태필로코컬 유래의 항체 결합 단백질(SpaB) 융합 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현 벡터 제조(1) Preparation of Expression Vector for Biosynthesis of Antibody Binding Protein (SpaB) Fusion Protein Nanoparticles Derived from Staphylococcal Derived from HBV Capsid

본 발명자들이 기존에 제작한(Park et al ., 2009) 재조합 유전자를 주형으로 프라이머쌍(서열번호 2, 서열번호 3)을 사용하여 PCR을 진행하여 N-NdeI-HBVcAg(1-78)-G4SG4T-XhoI-SpaB-SpaB-BamHI-G4SG4-HBVcAg(81-149)-HindIII-C를 코딩하는 HBcAg의 스파이크(78-81 a.a) 사이에 SpaB 유전자가 두 번 중복된 유전자가 삽입된 유전자 클론을 얻었고, 유전자를 수득하였다. 주형으로 한 유전자는 상세히 다음과 같은 서열로 이루어져 있다. 크게 캡시드 단백질의 1-78번째 아미노산 서열 부분, SpaB가 연속적으로 2개 포함되어 있는 부분, 그리고 캡시드 단백질의 81-149번째 아미노산 서열부분으로 나눌 수 있다(캡시드 단백질의 1-78번째 서열: NCBI Nucleotide accession number AF286594의 염기서열 1901-2134(서열번호 4), 캡시드 단백질의 81-149번째 염기서열: AF286594의 염기서열 2141-2347(서열번호 5), 그리고 단백질 에이의 서열: NCBI nucleotide accession No. M18264, nucleotide sequence 625-813(서열번호 6))(Park et al.). 이를 제한효소 NdeI, HindIII 로 처리 후 플라스미드 pT7-7에 삽입하여 N-HBVcAg(1-78)-SpaB-SpaB-HBVcAg(81-149)-C의 합성을 코딩하는 플라스미드 발현벡터 pT7 SpaB2 in CORE를 구축하였다 (도 1A).
The inventors of the present invention have found that the existing (Park et al., 2009) the recombinant gene as a template a pair of primers (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3), the process proceeds to PCR using N- Nde I-HBVcAg (1-78) -G4SG4T- Xho I-SpaB-SpaB- Bam HI-G4SG4-HBVcAg (81-149) - the SpaB gene between the spikes (78-81 aa) of HBcAg encoding the Hin dIII-C were obtained twice a gene is inserted into a duplicate gene clone, to obtain the gene. The gene as a template consists of the following sequences in detail. It is largely divided into the 1-78 amino acid sequence part of the capsid protein, the two consecutive parts of SpaB, and the 81-149 amino acid sequence part of the capsid protein (1-78 sequence of the capsid protein: NCBI Nucleotide nucleotide sequence 1901-2134 (SEQ ID NO: 4) of accession number AF286594, nucleotide sequence 81-149 of capsid protein: nucleotide sequence 2141-2347 (SEQ ID NO: 5) of AF286594 and sequence of protein A: NCBI nucleotide accession No. M18264 , nucleotide sequence 625-813 (SEQ ID NO: 6)) (Park et al.). This restriction enzyme Nde I, and then inserted into plasmid pT7-7 treated with Hin dIII and N-HBVcAg (1-78) -SpaB- SpaB-HBVcAg (81-149) plasmid expression vector coding for the synthesis of the -C pT7 SpaB2 in CORE was constructed (Fig. 1A).

(2) HBV 캡시드 유래 B 형 간염 바이러스 표면 단백질의 주요항원 (Hepatitis B virus surface antigen major hydrophilic resion, 또는 MHR) 융합 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현 벡터 제조(2) Production of expression vector for biosynthesis of hepatitis B virus surface protein major hydrophilic resion (MHR) fusion protein nanoparticles derived from hepatitis B virus hepatitis virus surface protein derived from HBV capsid

프라이머쌍(서열번호 7, 8)를 사용하여 N-XhoI-MHR-BamHI-C를 암호화하는 유전자 서열을 수득하였다. 이를 XhoI, BamHI을 이용하여 제한효소 처리한 후에 상기 실시예 1(1)에서 제작한 pT7 SpaB2 in CORE 의 SpaB가 삽입되었던 부위에 삽입하여 SpaB 대신 MHR이 삽입되도록 라이게이션을 진행하였으며 그 결과 N-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-C 의 합성을 코딩하는 플라스미드 pT7 MHR in CORE를 구축하였다.A primer pair (SEQ ID NOS: 7 and 8) was used to obtain a gene sequence encoding N- Xho I-MHR- Bam HI-C. After restriction enzyme treatment using Xho I and Bam HI, ligation was performed so that MHB was inserted instead of SpaB by inserting it into the site where SpaB of pT7 SpaB2 in CORE prepared in Example 1 (1) was inserted. Plasmid pT7 MHR in CORE encoding the synthesis of N-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) -C was constructed.

N-NdeI-HBVcAg(1-78)-G4SG4T-XhoI-MHR-BamHI-G4SG4-HBVcAg(81-149)-HindIII-C 구조로 구성된 플라스미드 pT7 MHR in CORE을 다시 NdeI 과 HindIII 제한효소로 절단하여 이를 pET28a 발현 벡터의 NdeI과 HindIII 위치에 삽입하여 최종적으로 pET28a MHR in CORE(도 1B) 발현벡터를 구축하였다. N- Nde I-HBVcAg (1-78) -G4SG4T- Xho I-MHR- Bam HI-G4SG4-HBVcAg (81-149) - Hin dIII-C structure plasmid pT7 MHR Nde I and Hin dIII to in CORE again consisting of And then inserted into NdeI and HindIII sites of pET28a expression vector to finally construct pET28a MHR in CORE (Fig. 1B) expression vector.

제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 젤- 정제 후 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.
All plasmid expression vectors were sequenced by complete DNA sequencing after gel - purification.

(3) HBV 캡시드 유래 SpaB 와 MHR 동시 융합 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현 벡터 제조(3) Production of expression vector for biosynthesis of co-fusion protein nanoparticles of SpaB and MHR derived from HBV capsid

HBV 캡시드 단백질의 아미노 말단에는 SpaB가, 스파이크 부위(78-81 a.a)에는 MHR을 융합하여 SpaB와 MHR을 동시에 표출하는 복합 백신 단백질 나노입자를 제조하기 위하여 두 단계로 라이게이션을 진행하였다.In order to prepare complex vaccine protein nanoparticles that express SpaB and MHR at the amino terminal of HBV capsid protein and MHR at the spike site (78-81 a.a), ligation was performed in two steps.

먼저 프라이머쌍(서열번호 9, 10)를 이용하여 N-NdeI-His6-SpaB-EcoRI-C를 암호화하는 유전자 서열과 N-His6-SpaB-SpaB-EcoRI-C 유전자 서열을 수득하였다. 이를 플라스미드 pT7-7 에 각각 라이게이션 하였으며 이를 각각 pT7 SpaB, pT7 SpaB2 라고 명명하였다. 두 번째로 실시예 1(2)의 pT7 MHR in CORE 을 주형으로 프라이머쌍(서열번호 11, 3)를 이용하여 N-EcoRI-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-HindIII-C의 구조로 된 유전자 서열을 수득하였으며 이를 pT7 SpaB 또는 pT7 SpaB2 의 뒤부분에 라이게이션하여 최종적으로 pT7 SpaB::MHR in CORE 와 pT7 SpaB2::MHR in CORE 발현 벡터를 제조하였다(도 1C 및 1D 참고).
First, the gene sequence encoding N-NdeI-His6-SpaB-EcoRI-C and the N-His6-SpaB-SpaB-EcoRI-C gene sequence were obtained using the primer pair (SEQ ID NOS: 9 and 10). These were ligated to plasmid pT7-7, respectively, and named pT7 SpaB and pT7 SpaB2, respectively. Secondly, N-EcoRI-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) -HindIII (SEQ ID NO: 11) was prepared by using the pT7 MHR in CORE of Example 1 (2) C was obtained and ligated to the rear part of pT7 SpaB or pT7 SpaB2 to finally produce pT7 SpaB :: MHR in CORE and pT7 SpaB2 :: MHR in CORE expression vectors (Fig. 1C and Fig. 1C) 1D).

(4) HBV 캡시드 유래 SpaB 와 PreS1, PreS2, MHR 동시 융합 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현 벡터 제조(4) Construction of Expression Vector for Biosynthesis of SpaB from HBV Capsid and Simultaneous Fusion Protein Nanoparticles of PreS1, PreS2 and MHR

상기 실시예 1(1)에서 제조한 pT7 SpaB2 in CORE와 실시예 1 (2)에서 제조한 pT7 MHR in CORE를 각각 주형으로 프라이머쌍(서열번호 11, 3)를 이용하여 EcoRI-HBVcAg(1-78)-SpaB-SpaB-HBVcAg(81-149)-HindIII-C 와 N-EcoRI-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-HindIII-C의 구조로 된 유전자 서열을 수득하였다. 서열번호 16 (5' NdeI PreS1), 서열번호 17 (3' EcoRI PreS1) 프라이머쌍을 이용하여 NdeI-PreS1-EcoRI, 서열번호 18(5' NdeI PreS2), 서열번호 19(3' EcoRI PreS2) 프라이머 쌍을 이용하여 NdeI-PreS2-EcoRI 을 각각 제조하였다. 순차적인 라이게이션을 통해 N-PreS1-EcoRI-HBVcAg(1-78)-MHR-HBVcAg(81-149)-HindIII-C의 구조를 이루는 pET28a PreS1-MHR in CORE (도 1E) 와 N-PreS2-EcoRI-HBVcAg(1-78)-SpaB-SpaB-HBVcAg(81-149)-HindIII-C를 이루는 pT7 PreS2-SpaB2 in CORE (도 1F)를 제작하였다.
HBccAg (1- (2-hydroxy-2-pyrrolidin-1-yl) -1H-pyrazol-3-yl) is synthesized using pT7 SpaB2 in CORE prepared in Example 1 (1) and pT7 MHR in CORE prepared in Example 1 78 -SpaB-SpaB-HBVcAg (81-149) -HindIII-C and N-EcoRI-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) -HindIII-C . NdeI-PreS1-EcoRI, SEQ ID NO: 18 (5 'NdeI PreS2), SEQ ID NO: 19 (3' EcoRI PreS2) primer pairs using SEQ ID NO: 16 (5'NdeI PreS1) Pairs were used to prepare NdeI-PreS2-EcoRI. Sequential ligation revealed that pET28a PreS1-MHR in CORE (Fig. 1E) and N-PreS2-Cs (Fig. 1E), which constitute the structure of N-PreS1-EcoRI-HBVcAg (1-78) -MHR-HBVcAg (81-149) PT7 PreS2-SpaB2 in CORE (Fig. 1F) constituting EcoRI-HBVcAg (1-78) -SpaB-SpaB-HBVcAg (81-149) -HindIII-C was constructed.

<실시예 2> HBV 캡시드 유래 키메릭 단백질 나노입자의 생합성을 위한 형질전환체 제조 및 발현Example 2 Preparation and Expression of Transformants for Biosynthesis of Chimeric Protein Nanoparticles Derived from HBV Capsid

하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 1의 벡터들(도 1)을 대장균에 형질전환하였다.The method described by Hanahan (Hanahan D, DNA Cloning &lt; / RTI &gt; vol.19-135, IRS press 1985) were transformed into E. coli.

구체적으로 CaCl₂로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 실시예 1의 pET MHR in CORE 벡터를 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후, 카나마이신(Kanamycine)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 카나마이신 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 다음으로 항원부위(MHR)와 면역증강 단백질(SpaB)을 동시에 표출하는 단백질 나노입자를 제조하기 위하여 실시예 1을 통해 제조한 pET MHR in CORE(카나마이신 저항 벡터)와 pT7 SpaB2 in CORE(암피실린 저항 벡터)를 혼합하여 CaCl₂로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후 암피실린과 카나마이신이 모두 포함된 배지에서 배양하여 두 개 벡터를 모두 포함하는 콜로니를 선별하였다.Specifically, the pET MHR in CORE vector of Example 1 was transformed with Escherichia coli BL21 (DE3) treated with CaCl ₂ by heat shock method and then cultured in a medium containing kanamycin to transform the expression vector Colonies showing kanamycin resistance were selected. Next, in order to prepare protein nanoparticles simultaneously expressing antigenic region (MHR) and immunostimulatory protein (SpaB), pET MHR in CORE (kanamycin resistance vector) and pT7 SpaB2 in CORE (ampicillin resistance vector ) Were mixed and transformed into E. coli BL21 (DE3) treated with CaCl ₂ , and then cultured in a medium containing both ampicillin and kanamycin to select colonies containing both vectors.

다음으로 항원부위 PreS1, PreS2, MHR과 면역증강 단백질(SpaB)을 동시에 표출하는 단백질 나노입자를 제조하기 위하여 실시예 1(4)을 통해 제조한 pET PreS1-MHR in CORE(카나마이신 저항 벡터)와 pT7 PreS2-SpaB2 in CORE(암피실린 저항 벡터)를 혼합하여 CaCl₂로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후 암피실린과 카나마이신이 모두 포함된 배지에서 배양하여 두 개 벡터를 모두 포함하는 콜로니를 선별하였다.Next, in order to prepare protein nanoparticles expressing antigen sites PreS1, PreS2, MHR and immunopotentiating protein (SpaB) simultaneously, pET PreS1-MHR in CORE (kanamycin resistance vector) and pT7 PreS2-SpaB2 in CORE (ampicillin resistance vector) were mixed to transform the Escherichia coli BL21 (DE3) treated with CaCl ₂ to culturing in ampicillin and the medium with kanamycin contain all were screened for colonies containing both the two vectors .

실시예 1(3)을 통해 제조한 pT7 SpaB:: MHR in CORE, pT7 SpaB2:: MHR in CORE 벡터는 각각 형질전환 시킨후 암피실린 배지에 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 100㎎/mL 암피실린(100㎎/mL 카나마이신 )또는 을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 37℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD₆₀₀이 0.7~0.8에 이르렀을 때 IPTG를 첨가(0.5mM)하여 20℃로 옮겨 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 16~18시간 더 배양하였다.
The pT7 SpaB :: MHR in CORE and pT7 SpaB2 :: MHR in CORE vectors prepared in Example 1 (3) were each transformed and cultured in an ampicillin medium to select transformants. A portion of the culture medium in which the colonies were cultured in LB medium overnight was inoculated into LB medium containing 100 mg / mL ampicillin (100 mg / mL kanamycin) or the like, and then cultured at 37 rpm at 130 rpm. When the OD ₆₀₀ of the culture reached 0.7-0.8, IPTG was added (0.5 mM) and transferred to 20 ° C to induce the expression of the recombinant gene. After addition of IPTG, the cells were further cultured for 16 to 18 hours under the same conditions.

<실시예 3> HBV 캡시드 유래 복합백신 키메릭 단백질 나노입자의 정제Example 3 Purification of HBV Capsid-derived Combined Vaccine Chimeric Protein Nanoparticles

재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 5mL 라이시스 버퍼[pH 8.0, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride: serine proteinase inhibitor), 10% 글리세롤, 0.1% Triton X-100, 2mM MgCl₂, 50mM Tris-Cl, 0.1mg/mL lysozyme] 에 재부유하고 상온에서 15~30 분간 교반 후 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다(세척 버퍼: pH 8.0, 50mM 소듐 포스페이트, 300mM NaCl, 80mM 이미다졸 / 용출 버퍼: pH 8.0, 50mM 소듐 포스페이트, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸). 용출 버퍼의 이미다졸을 제거하기 위하여 멤브레인 필터레이터(Amicon, 10K)을 이용하여 PBS로 버퍼를 교체해 주었다.In order to purify the recombinant protein, E. coli cultured in the same manner as described above was recovered and the cell pellet was resuspended in 5 mL of lysis buffer [pH 8.0, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (serine proteinase inhibitor), 10% glycerol, 0.1% Triton X-100 , 2 mM MgCl ₂ , 50 mM Tris-Cl, 0.1 mg / mL lysozyme] and stirred at room temperature for 15 to 30 minutes. Then, cells were disrupted using an ultrasonic disrupter. The disrupted cell lysate was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes and the supernatant was separated. Each recombinant protein was separated using a Ni2 + -NTA column (Qiagen, Hilden, Germany) (washing buffer: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / elution buffer: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole). To remove imidazole from the elution buffer, the buffer was replaced with PBS using a membrane filter (Amicon, 10K).

도 2에 나타난 바와 같이, MHR 이 삽입된 단백질 나노입자 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 20℃에서 발현한 결과 MHR 이 삽입된 단백질 나노입자가 수용성으로 발현되는 것을 확인하였으며 히스티딘 태그를 매개로 니켈 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. As shown in FIG. 2, when Escherichia coli transformed with the protein nano-particle expression vector inserted with MHR was expressed at 20 ° C, it was confirmed that the protein nanoparticle having the MHR inserted therein was expressed in a water-soluble manner, and a nickel- Purification was carried out using chromatography.

또한, 벡터를 동시에 가지고 있는 형질전환체를 배양한 후 재조합 단백질의 발현을 유도한 결과 MHR 표출 단백질 나노입자와 SpaB 표출 단백질 나노입자가 동시에 발현되는 것을 확인하였다(도 2B). 마찬가지로 PreS1와 MHR 표출 단백질 나노입자와 PreS2, SpaB 표출 단백질 나노입자가 동시에 발현되는 것을 확인하였다(도 2C).In addition, it was confirmed that MHR expressed protein nanoparticles and SpaB expressed protein nanoparticles were expressed simultaneously (FIG. 2B) by culturing the transformant having the vector at the same time and inducing the expression of the recombinant protein. Similarly, PreS1 and MHR expressed protein nanoparticles and PreS2 and SpaB expressed protein nanoparticles were simultaneously expressed (FIG. 2C).

상기 언급한 발현 벡터 제조 시 MHR 융합 단백질 나노입자 (PreS1과 MHR 융합 단백질 나노입자)의 아미노 말단에만 히스티딘을 융합하였고, SpaB 융합 단백질 나노입자(PreS2와 SpaB 융합 단백질 나노입자) 에는 정제 태그(히스티딘 태그)를 융합하지 않았다. In preparing the above-mentioned expression vector, histidine was fused only to the amino terminal of the MHR fusion protein nanoparticles (PreS1 and MHR fusion protein nanoparticles), and the SpaB fusion protein nanoparticles (PreS2 and SpaB fusion protein nanoparticles) ) Were not fused.

도 2B 및 2C에서 보면 히스티딘을 포함하지 않는 SpaB 융합 단백질 나노입자(PreS2와 SpaB 융합 단백질 나노입자) 또한 니켈 크로마토그래피를 통해 같이 정제되는 것으로 나타나는데 이는 SpaB 융합 단백질 나노입자가 히스티딘 태그를 포함하는 MHR 융합 단백질 나노입자와 자가 조립되어 같이 정제되기 때문이다. 이는 HBVcAg를 대장균에서 발현할 경우 240개의 소단위체가 모여서 하나의 나노입자로 자가 조립될 때, 두 개의 다른 재조합 단백질 나노입자가 혼합되어 하나의 단백질 나노입자를 이루는 것을 뜻한다.
2B and 2C, SpaB fusion protein nanoparticles (PreS2 and SpaB fusion protein nanoparticles) that do not contain histidine are also purified through nickel chromatography, indicating that the SpaB fusion protein nanoparticles have MHR fusion It is self-assembled with protein nanoparticles and purified together. This means that when HBVcAg is expressed in E. coli, 240 subunits are assembled into one nanoparticle, two different recombinant protein nanoparticles are mixed to form one protein nanoparticle.

<실시예 4> HBV 캡시드 유래 복합백신의 면역원성 검증을 위한 동물 실험<Example 4> Animal experiment for immunogenicity test of a combined vaccine derived from an HBV capsid

(1) 1차 동물실험: SpaB의 면역 증강효과 검증(1) Primary animal test: Verification of immune enhancement effect of SpaB

SpaB의 면역 증강 효과를 검증하기 위하여 MFR 표출 단백질 나노입자, MHR 표출 단백질 나노입자를 알루미늄 젤에 흡착 시킨 제재, MHR 과 SpaB 동시 표출 단백질 나노입자를 준비하여, 각 백신 군을 5주령인 쥐(outbred ICR SPF mouse) 20 수에 접종하였다. 복강내에 아래 표와 같이 각 백신군을 접종 후 28일 후에 심장에서 전채혈을 하였다. In order to verify the immune enhancement effect of SpaB, MHR and SpaB co-expressed protein nanoparticles were prepared by adsorbing MFR expressed protein nanoparticles and MHR expressed protein nanoparticles on an aluminum gel, and each vaccine group was administered to 5-week old mice (outbred ICR SPF mouse). Within the abdominal cavity, whole blood was collected from the heart 28 days after inoculation of each vaccine group as shown in the table below.

(2) 2차 동물실험: SpaB의 융합 위치에 따른 면역 효과 검증
(2) Secondary Animal Experiment: Verification of immune effect according to fusion position of SpaB

1차 동물 실험과 마찬가지로 각 백신군을 위의 표와 같이 준비하여 5주령 쥐(outbred ICR SPF mouse) 20 수에 접종하였다. 복강내에 아래 표와 같이 각 백신군을 접종 후 28일 후에 심장에서 전채혈을 하였다. As in the first animal study, each vaccine group was prepared as in the table above and inoculated into 20 waters of 5-week-old mice (outbred ICR SPF mice). Within the abdominal cavity, whole blood was collected from the heart 28 days after inoculation of each vaccine group as shown in the table below.

채혈 후 혈청 분리하여 ELISA kit (Monolisa Anti-HBs PLUS, Bio-Rad)를 이용하여 polyclonal anti-MHR antibody 농도 (항체가, mIU/ml)를 분석하였다. 이를 2회 반복하였고 각각의 혈청에 대한 결과치는 산술평균치로 하였다. ELISA를 이용하여 항체가를 분석할 때 도 3의 표준곡선을 이용하였다.Serum samples were collected and analyzed for polyclonal anti-MHR antibody concentration (antibody, mIU / ml) using an ELISA kit (Monolisa Anti-HBs PLUS, Bio-Rad). This was repeated twice and the results for each serum were taken as the arithmetic average. The standard curve of FIG. 3 was used to analyze antibody titers using ELISA.

SpaB 단백질은 기존 연구에 의하면 항원 표출 세포(APC) 중 하나인 B 세포의 표면에 표출된 B 세포 수용체와 결합하여 B 세포가 APC로 분화하도록 촉진한다고 알려져 있으며 이를 통해 수지상세포, Th 세포 등에서 인터루킨-2 생성을 촉진시키므로 세포성 면역 반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. SpaB 단백질의 면역 증강 효과를 검증하기 위하여, MHR 표출 단백질 나노입자, 동시 발현을 통해 제조한 MHR과 SpaB를 동시 표출하는 복합 단백질 나노입자, 그리고 기존에 면역증강제로 사용되고 있는 알루미늄 젤을 흡착시킨 MHR 표출 단백질 나노입자를 준비하였으며, 추가적으로 항원 3가지(PreS1, PreS2, MHR)와 면역증강 단백질(SpaB)을 동시에 표출하는 단백질 나노입자를 준비하였다. 이를 각각 쥐에 주사하여 항체 양전율을 확인하였다(도 4). B형 간염백신의 항체 양전율에 대해서는 기준 항체가가 다양할 수 있지만 본 실시예에서는 보수적으로 4mIU/mL을 기준치로 사용하여 항체가 4mIU/mL 이상 시 항체 양전되었다고 평가하였다. It is known that SpaB protein binds to B cell receptor expressed on the surface of B cell, one of antigen-expressing cells (APC), and promotes B cell differentiation into APC. 2 production, thereby promoting a cellular immune response. In order to examine the immunopotentiating effect of SpaB protein, MHR expression protein nanoparticles, MHR and SpaB produced by simultaneous expression of complex protein nanoparticles, and MHR expression adsorbing aluminum gel which is used as an immunopotentiating agent Protein nanoparticles were prepared, and protein nanoparticles simultaneously expressing three antigens (PreS1, PreS2, MHR) and immunopotentiating protein (SpaB) were prepared. Each of them was injected into rats to confirm antibody positivity (Fig. 4). Although the reference antibody titer may vary for the hepatitis B vaccine, in this example, it was conservatively estimated that 4 mIU / mL was used as the reference value and the antibody was positive when the antibody was 4 mIU / mL or higher.

그 결과 면역증강제로 선정한 SpaB와 면역 주요항원 물질인 MHR을 동시에 표출하는 단백질 나노입자에서 가장 높은 항체 양전율을 나타내는 것을 확인하였다(도 4B). 면역증강제를 포함하지 않는 대조군은 20%, 체액성 면역증강제 알루미늄 젤을 사용한 경우는 30% 항체 양전율을 보인 반면 SpaB와 동시 발현한 경우 2배 높은 60%의 항체 양전율을 나타냈다. 반면 3가지 항원과 면역증강 단백질을 포함하는 단백질 나노입자의 경우 15%의 항체 양전율을 보이는 것을 확인하였다. 이는 PreS1과 PreS2에 의해 SpaB의 표출이 저해되어 면역 증강 효과가 제대로 발휘되지 못한 것으로 사료된다. 이를 통해 SpaB의 표면 표출 문제가 높은 항체 양전율 이끌어 내는 데 가장 큰 영향을 주는 것으로 판단된다. 기존 문헌에서 spaB가 세포성 면역 반응을 주로 증가시킨다는 점을 고려해 볼 때 SpaB 이용 시 체액성 면역 반응을 유도하는 알루미늄 젤을 사용했을 때보다 체액성 면역 반응을 2배 이상 증진 시켜 높은 항체 양전율을 나타낸 것은 굉장히 고무적인 결과이다. As a result, it was confirmed that protein nanoparticles simultaneously expressing SpaB selected as an immunopotentiator and MHR as an immunological major antigen material exhibited the highest antibody positivity (FIG. 4B). Antibody positivity was 20% in the control group without the immunopotentiating agent, 30% in the case of using the humoral immunostimulant aluminum gel, and 60% in the case of simultaneous expression with SpaB. On the other hand, protein nanoparticles containing three antigens and immunopotentiating proteins showed 15% antibody positivity. This suggests that the expression of SpaB was inhibited by PreS1 and PreS2 and the immune enhancing effect could not be exhibited properly. Therefore, it is considered that the surface expression problem of SpaB has the greatest effect on inducing high antibody positivity. Considering the fact that spaB mainly increases the cellular immune response in the existing literature, when SpaB is used, high antibody positivity is shown by enhancing humoral immune response more than 2 times when using aluminum gel which induces humoral immune response It is a very encouraging result.

또한 95%의 신뢰구간에서 SpaB를 사용한 경우의 항체가(3.57~6.26mIU/mL)는 alum 젤을 사용한 경우의 항체가(2.62~7.11mIU/mL)와 유사하지만 항체가 산술에 있어 중요한 기하평균 항체가(GMT; geometric mean titration, 백신 접종 후 모든 개체의 평균 항체가 증가 비율)는 알루미늄 젤을 사용 때(3.0mUI/mL) 보다 SpaB 사용 시 4.3mUI/mL로 유의미하게 상승한 것을 확인하였음. 결론적으로 SpaB를 면역증강제로 사용한 경우에 가장 높은 항체 양전율과 GMT를 나타낸 것을 확인하였다(도 4B). Antibodies (3.57 ~ 6.26mIU / mL) in the case of SpaB in the 95% confidence interval were similar to those in the alum gel (2.62 ~ 7.11mIU / mL) The mean antibody titre (GMT: geometric mean titration, the percentage increase in the mean antibody of all individuals after vaccination) was significantly increased to 4.3 mUI / mL when using SpaB compared to when using aluminum gel (3.0 mUI / mL). In conclusion, when SpaB was used as an immunostimulating agent, the highest antibody positivity and GMT were shown (FIG. 4B).

SpaB의 면역증강제로서의 효용성을 검증하였으므로 단백질 나노입자 상의 SpaB의 표출 위치 및 항원과의 조합 비율에 따른 영향을 분석하기 위하여(도 1C 및 1D) 와 같은 백신군을 제조하였다.To confirm the efficacy of SpaB as an immunostimulating agent, a vaccine group as shown in FIGS. 1C and 1D was prepared for analyzing the effect of SpaB on the protein nanoparticles on the expression position and combination ratio with antigen.

도 5와 같이 구축한 발현 벡터를 이용하여 면역증강제와 항원 동시 표출 복합 단백질 나노입자를 발현 정제 하였으며 준비된 각 단백질 샘플을 이용하여 동물 실험을 진행하였다. 2차 동물 실험과 마찬가지로 각 시료당 20수의 마우스에 접종하였으며 접종 시 동일한 양의 MHR이 적용되도록 표 2와 같이 주사하였다. The expression vector constructed as shown in FIG. 5 was used to express and purify the immunopotentiator and the antigen-co-expressed complex protein nanoparticles. The prepared animal protein samples were used for animal experiments. As in the second animal experiment, 20 mice were inoculated into each sample and injected as shown in Table 2 so that the same amount of MHR was applied at the time of inoculation.

그 결과 HBcAg의 아미노 말단에 SpaB를 융합 발현한 경우 동시발현을 통해 SpaB를 HBcAg의 스파이크 부위에 표출시켰을 때 보다 SpaB의 비율이 높음에도 불구하고 항체 양전율 및 항체 형성농도가 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 6B). 이는 HBcAg의 아미노 말단에 SpaB가 존재할 경우 단백질 나노입자의 표면에 효과적으로 표출되지 않아 B 세포의 BCR에 결합하는 효율이 저하되었기 때문이라고 생각된다.As a result, when SpaB was fused and expressed at the amino terminal of HBcAg, it was confirmed that the antibody positivity and the antibody formation concentration were significantly lower than that when SpaB was expressed at the spike region of HBcAg through simultaneous expression 6B). This suggests that the presence of SpaB at the amino terminus of HBcAg is not effectively expressed on the surface of the protein nanoparticles, resulting in a decrease in the efficiency of B cell binding to B cells.

또한 SpaB를 중복되게 연장하여 HBcAg의 아미노 말단에 융합한 경우 SpaB의 표면 표출이 증가하고 BCR이 결합 능력이 향상됨에 따라 항체 양전률 및 항체 형성 농도가 증가된 것을 확인하였다. 이는 면역증강제가 단백질 나노입자 표면의 가장 바깥 부분인 스파이크 부위에 융합 발현되었을 때 B 세포와의 결합 효율이 증가되고 이로 인해 가장 높은 면역 증강 효과를 나타내는 것으로 보인다. In addition, when SpaB was fused to the amino terminal of HBcAg, the antibody expression level and antibody formation level were increased as the surface expression of SpaB increased and the binding ability of BCR increased. This suggests that when the immunostimulant is fused to the spike region, the outermost portion of the protein nanoparticle surface, the binding efficiency with B cells increases and thus the immunostimulating effect is the highest.

결과적으로 3차 동물 실험을 통해 단백질 나노입자 기반의 복합백신 개발에 있어서 면역증강제의 단백질 나노입자상의 표면 표출이 백신의 면역원성 증대 및 면역 유도 활성화에 결정적인 역할을 함을 보여주었다. As a result, in the third animal experiment, it was shown that the surface expression of the protein nanoparticle of the immunopotentiator in the complex vaccine development based on the protein nanoparticle plays a crucial role in increasing the immunogenicity of the vaccine and activation of the immunity induction.

또한 1차 동물 실험을 진행 후 각 복합 백신의 면역 반응 유도 기작을 연구하기 위해 IgG1/IgG2a의 비율을 비교했던 것과 마찬가지로 2차 동물 실험을 통해 얻은 마우스 혈청 내 B형 간염에 대한 항체 비율을 조사하였다. In addition, the ratio of IgG1 / IgG2a was compared in order to investigate the mechanism of induction of the immunoreactivity of each compound vaccine after the first animal experiment, and the antibody ratio to the hepatitis B virus in the mouse serum obtained from the second animal experiment .

2차 동물 실험에서 보여진 바와 같이 면역증강제 SpaB가 융합 발현된 복합 단백질 나노입자의 경우 IgG2a의 비율이 증가한 것을 알 수 있었다. 즉, 동일한 양의 항원을 주입했을 때 면역증강제가 표면으로 표출이 잘 된 복합 단백질 나노입자 일수록 Th1 세포의 활성화를 촉진하여 높은 면역 유도 효과를 보이는 것을 알 수 있다(도 6B). As shown in the second animal experiment, the ratio of IgG2a was increased in the complex protein nanoparticles fused with the immune enhancer SpaB. That is, when the same amount of antigen is injected, the complex protein nanoparticles expressed on the surface of the immunostimulating agent promote the activation of Th1 cells and exhibit a high immunity inducing effect (FIG. 6B).

결론적으로 본 발명을 통해 항원 단백질과 면역 증강 단백질을 동시 표출 할 수 있는 복합 백신 단백질 나노입자를 설계 제조하였으며, 복합 백신의 면역원성을 검증하였고, 동시에 SpaB 단백질의 면역증강제로서의 효용성 및 면역 유도 기작을 검증하였다.
In conclusion, the present invention has designed and manufactured a complex vaccine protein nanoparticle capable of simultaneously expressing an antigen protein and an immunopotentiating protein, and confirmed the immunogenicity of the combined vaccine. At the same time, the efficacy of SpaB protein as an immunity enhancer and the mechanism Respectively.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Protein nanoparticle based multivalent vaccines <130> P120636 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Major hydrophilic region <400> 1 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Phe Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Ala Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 35 40 45 Gln Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 50 55 60 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 65 70 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-NdeI CORE: primer <400> 2 catatggaca ttgacccgta taaaga 26 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3- HindIII CORE: primer <400> 3 aagcttttaa acaacagttg tttcc 25 <210> 4 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-78 aa of capsid protein from HBV <400> 4 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu 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Sequence <220> <223> PreS2 <400> 15 Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val   1 5 10 15 Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn              20 25 30 Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr          35 40 45 Gly Asp Pro Ala Pro Asn      50 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > 5 'NdeI PreS1: primer <400> 16 catatgggag gttggtcttc caaacct 27 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > 3 ' EcoRI PreS1: primer <400> 17 gaattcggcc tgaggatgac tgtctc 26 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > 5 'NdeI PreS2: primer <400> 18 catatgcagt ggaactccac cacattc 27 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'EcoRI PreS2: primer <400> 19 gaattcgttc ggtgcagggt ccccag 26

Claims (15)

B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 4에 기재된 1-78번째 아미노산 서열, 면역증강제의 아미노산 서열 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 5에 기재된 81-149번째 아미노산 서열이 순차적으로 연결된 키메릭 단백질로부터 제조된 단백질 나노입자로 이루어진 복수의 제1소단위체(subunit); 및
B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 4에 기재된 1-78번째 아미노산 서열, 항원의 아미노산 서열 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 5에 기재된 81-149번째 아미노산 서열이 순차적으로 연결된 키메릭 단백질로부터 제조된 단백질 나노입자로 이루어진 복수의 제2소단위체를 포함하고,
상기 제1소단위체 및 제2소단위체는 1 : 1 내지 4의 중량비로 혼합되어 있고, 상기 복수의 제1소단위체 및 복수의 제2소단위체의 자가조립에 의해 단일 단백질 나노입자로 제조되는, 복합 단백질 나노입자.
The 1-78th amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 of the hepatitis B virus capsid protein, the amino acid sequence of the immunostimulant, and the 81-149th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the hepatitis B virus capsid protein are sequentially A plurality of first subunits consisting of protein nanoparticles prepared from linked chimeric proteins; And
The 1-78th amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 of the hepatitis B virus capsid protein, the amino acid sequence of the antigen, and the 81-149th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the hepatitis B virus capsid protein are sequentially connected A plurality of second subunits composed of protein nanoparticles prepared from a chimeric protein,
Wherein the first subunit and the second subunit are mixed at a weight ratio of 1: 1 to 4, and the first subunit and the second subunit are mixed with each other at a weight ratio of 1: 1 to 4, Complex protein nanoparticles.
삭제delete 제1항에 있어서,
면역증강제는 스태필로코컬 단백질 에이(Staphylococcal protein A), 열충격단백질(heat shock protein), Flt-3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 과립구큰포식 세포집락자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 및 플라젤린(Flagellin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 복합 단백질 나노입자.
The method according to claim 1,
The immune enhancer may be selected from the group consisting of Staphylococcal protein A, heat shock protein, Flt-3L (fms-like tyrosine kinase 3 ligand), granulocyte macrophage colony stimulating factor -CSF), interleukin-2 (IL-2), and flagellin (Flagellin).
제3항에 있어서,
면역증강제는 스태필로코컬 단백질 에이(Staphylococcal protein A)의 B 도메인인 복합 단백질 나노입자.
The method of claim 3,
The immunopotentiator is a complex protein nanoparticle that is the B domain of staphylococcal protein A.
삭제delete 제1항에 있어서,
항원은 B형 간염 표면 항원, A형 간염 표면 항원 및 C형 간염 표면 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 복합 단백질 나노입자.
The method according to claim 1,
Wherein the antigen is at least one selected from the group consisting of a hepatitis B surface antigen, a hepatitis A surface antigen, and a hepatitis C surface antigen.
제6항에 있어서,
B형 간염 표면 항원이 PreS1, PreS2 및 MHR(Major hydrophilic region)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 복합 단백질 나노입자.
The method according to claim 6,
Wherein the hepatitis B surface antigen is at least one selected from the group consisting of PreS1, PreS2 and MHR (Major Hydrophilic Region).
삭제delete 삭제delete B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 4에 기재된 1-78번째 아미노산 서열, 면역증강제의 아미노산 서열 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 5에 기재된 81-149번째 아미노산 서열이 순차적으로 연결된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터; 및
B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 4에 기재된 1-78번째 아미노산 서열, 항원의 아미노산 서열 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 SEQ ID NO: 5에 기재된 81-149번째 아미노산 서열이 순차적으로 연결된 키메릭 단백질을 발현하는 벡터를 숙주세포에 동시 형질전환시키는 단계를 포함하는 제1항의 복합 단백질 나노입자의 제조방법.
The 1-78th amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 of the hepatitis B virus capsid protein, the amino acid sequence of the immunostimulant, and the 81-149th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the hepatitis B virus capsid protein are sequentially A vector expressing a linked chimeric protein; And
The 1-78th amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 of the hepatitis B virus capsid protein, the amino acid sequence of the antigen, and the 81-149th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the hepatitis B virus capsid protein are sequentially connected A method for producing a complex protein nanoparticle according to claim 1, which comprises co-transforming a vector expressing a chimeric protein into a host cell.
제1항의 복합 단백질 나노입자; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
A complex protein nanoparticle of claim 1; And
A vaccine composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
삭제delete 제11항에 있어서,
백신 조성물은 B형 간염 바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위해 사용되는 것인 백신 조성물.
12. The method of claim 11,
Wherein the vaccine composition is used to induce an immune response to the hepatitis B virus.
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