KR101952946B1 - 세포를 포함하는 신경도관 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포를 포함하는 신경도관 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미세채널에 미세기공이 형성된, 세포를 포함하는 다공성 신경도관 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 세포를 포함하는 신경도관은 신경에 대한 in vitro 및 in vivo 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포를 포함하는 신경도관 제조방법{Preparing method of nerve conduits including cells}

본 발명은 세포를 포함하는 신경도관 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미세채널에 미세기공이 형성된, 세포를 포함하는 다공성 신경도관 제조방법에 관한 것이다.

말초 신경이 외상에 의해 손상을 입은 경우, 절단된 신경의 절단면을 서로 직접 문합하는 방법이 시행된다. 그러나 대부분의 신경을 정확하게 직접 문합하는 것은 거의 불가능하다. 직접 문합이 불가능한 경우 그 기능의 회복을 위해서 자가 신경 이식술을 시행하고 있다. 그러나 자가 신경 이식술의 경우 손상 부위의 신경 조직과 이식되어지는 신경 조직의 굵기와 형태를 일치시키기 어렵다는 단점이 있고, 채취 가능한 신경에도 제한이 있다. 또한 이식 신경을 채취한 부위에서도 기능의 저하가 일어날 수 있다. 따라서 신경 결손 부위가 생길 경우, 그것의 기능을 회복하기 위한 방법으로 신경도관(nerve conduit)이 사용되고 있다.

신경도관은 결손된 신경의 양끝을 연결하여 신경이 재생되도록 가이드 역할을 하는 연결관으로, 절단된 신경의 양쪽 끝을 신경도관 안에 고정하고 도관의 안으로 신경의 연결을 유도한다. 신경도관을 이용하게 되면 신경재생에 방해되는 반흔 조직의 침투를 막을 수 있고, 신경재생의 방향을 올바른 방향으로 유도할 수 있다. 또한 신경도관은 신경 자체에서 분비되는 신경재생 촉진 물질들을 도관 내에 유지시키고 재생에 방해되는 물질들이 도관 내부로 들어오는 것을 막아주는 이점을 제공한다.

신경도관은 조직 거부 반응이 나타나지 않는 생체적합성을 가져야 한다. 신경도관은 신경재생 후 별도의 신경도관 제거 시술이 필요하지 않도록, 신경의 재생 시기에 맞추어 생분해되어야 한다. 그리고 신경도관 분해 산물이 체내에서 독성을 가지지 않아야 한다.

또한 신경도관은 신경재생이 일어나는 동안 도관 내부 공간을 유지시킬 수 있는 기계적 물성을 가져야 한다. 신경도관은 신경도관의 삽입 후 시술 부위의 움직임에도 신경도관의 말단 부위가 안정적으로 유지될 수 있도록 적절한 신축성과 인장강도를 가져야 한다. 신경도관은 시술 부위 주변 정상 조직이 손상되지 않는 재료이어야 하고 시술 용이성을 가져야 한다.

이러한 신경도관의 재료로는 크게 콜라겐, 키토산 등의 천연고분자와; 실리콘, 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(polylactic acid-co-glycolic acid, PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone) 등의 합성 고분자가 있다.

이 중 가장 많이 사용되는 천연 고분자 재료는 콜라겐이다. 콜라겐은 뛰어난 생체적합성과 약한 항원성을 가지고 있어서 신경재생을 위한 신경도관의 재료로 많이 사용된다. 그러나 콜라겐은 동물로부터 추출해야 하고 보관 방법이 까다로우며 대량 생산에 적합하지 않다는 문제점이 있다. 또한, 콜라겐을 이용한 신경도관 제작 비용이 비싸다. 콜라겐으로 만든 신경도관은 인장력이 약해서 임상에서 많이 사용되지 못하고 있다.

PLA, PLGA 등의 합성 고분자는 생체에 적합하다는 것이 검증되었다. 이러한 합성 고분자 기반 신경도관은 공극(작은 구멍)이 없는 튜브 형태로 이루어져 있어 구조 안정성 및 인장강도가 우수하다. 그러나 합성 고분자 기반 신경도관은 물성 제어가 어렵다. 또한 지금까지 알려진 합성 고분자 기반 신경도관은 체액의 교환의 쉽게 이루어지지 않는 단점이 있다.

대한민국 특허출원 제2014-0027854호는 유리섬유를 이용한 합성 고분자 기반 신경도관 제조 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 신경도관은 공극이 없는 고분자 튜브 형태이어서, 여전히 체액의 교환이 쉽지 않다는 문제점이 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 신경도관은 생분해성 물질로 만든다. 생분해성 물질은 체내에서 분해되는 시간을 측정해야 할 필요가 있다. 이에, 생체 재료로 제작되는 생분해성 신경도관을 사용한 기존의 연구들 대부분은, 생분해 정도의 측정을 무게에 의존하고 있다.

그러나, 생체 재료의 무게는 재료에 남아 있는 수분의 정도에 따라 차이가 많다. 내부 구조가 있는 신경도관의 경우, 신경도관이 분해되면서 처음 형성된 내부 구조가 어떻게 변하는지, 분해가 진행될수록 내부 구조가 어떻게 변하는지에 대한 자료가 추가로 필요하나, 이에 대한 정보가 부족한 실정이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 미세채널과 미세기공 구조를 동시에 가지는 다공성 신경도관에 대한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다. 또한 본 발명자들은 세포가 포함된 신경도관에 대한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허출원 제2014-0027854호

본 발명의 목적은 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 세포를 포함하는 다공성 신경도관을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신경재생 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법을 제공한다:

a) 소수성 생체적합성 고분자를 수혼화성 유기용매에 용해시켜 신경도관용 고분자 재료를 준비하는 단계;

b) 상기 신경도관용 고분자 재료를 친수성 용액에 침지시켜서 상기 고분자 재료로부터 상기 유기용매를 분리시킴으로써, 상기 소수성 고분자에 미세기공이 형성된, 미세채널 구조를 가지는 다공성 고분자로 이루어진 신경도관을 얻는 단계;

c) 상기 신경도관을 챔버(chamber)에 삽입하여, 신경도관이 삽입되어 있는 장치를 제작하는 단계;

d) 상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치의 상부에 펌프를 튜브로 연결하고, 하부에 배양배지를 포함하는 배지 공급용기를 튜브로 연결하는 단계;

e) 상기 배지 공급용기 내 배양배지에 세포를 투입하는 단계;

f) 상기 d)의 펌프를 이용하여 e)의 배지 공급용기 내 배양배지를 신경도관이 삽입되어 있는 장치로 공급함으로써 c)의 신경도관에 세포를 시딩(seeding)하는 단계; 그리고

g) 상기 d)의 펌프를 이용하여 e)의 배지 공급용기 내 배양배지를 f)의 세포가 시딩된 신경도관으로 공급하여 세포를 배양하는 단계.

상기 미세채널 구조를 가지는 신경도관은 수직으로 배치되어 배양배지가 중력에 의해 신경도관의 상단에서 하단으로 흐르는 것일 수 있다.

상기 다공성 신경도관은 중추신경 또는 말초신경의 재생을 위한 것일 수 있다.

고등동물의 신경계는 중추신경계, 말초신경계 및 자율신경계로 나뉜다. 중추신경계는 뇌와 척수를 포함하는 신경계이다. 말초신경계는 뇌나 척수의 중추신경계에서 나와 온몸에 나뭇가지 모양으로 분포하는 신경계를 말한다.

일반적으로 말초신경계를 구성하는 신경세포들은 액손(axon)에 물리적 손상을 입게 되면 일정 시간 후에 정상적으로 재생되어 기능을 회복하게 된다. 그러나 사고나 수술 등으로 말초신경이 손상되면 사회생활을 하는데 심각한 장애를 일으킨다. 특히 손발 신경이 전달된 경우, 그 절단 부위를 치밀하게 봉합하지 않으면 신경을 연결하기 어렵다. 중추신경계의 경우, 신경세포가 손상을 입게 되면 회복하지 못하고 영구적 기능 상실 상태에 빠지게 된다.

말초신경이 절단된 경우, 절단된 신경은 말초 부위에서 매일 1 mm 정도의 속도로 자라나는 성질을 가지고 있으므로, 이런 특성을 이용하여 절단 부위에 튜브형태의 신경도관을 도입하여 절단된 신경을 재생시킬 수 있다.

신경도관은 결손된 신경 조직을 연결하고 신경 섬유를 재생하는 통로 역할을 한다. 따라서 절단된 신경의 양쪽 끝을 신경도관에 연결하면 신경도관 내에서 신경의 한쪽에서 신경 섬유가 자라나 신경이 재생될 수 있다. 또한 신경도관은 제어된 미세환경을 제공하며, 손상된 신경으로부터 분비되는 영양인자들은 도관 내에서 농축되어 축삭의 성장을 촉진시킬 수 있다.

척수 등의 중추신경이 교통사고로 인한 상해 또는 뇌혈관 장애로 손상을 받으면, 신경 기능이 상실되어 재생 불가능한 것으로 알려져 있다. 이는 말초신경이 재생되는 것과는 대조적이다. 중추신경은 일단 손상되면 재생될 수 없기 때문에, 중추신경이 손상될 경우 종종 부분적 또는 완전한 마비가 일어난다.

신경도관을 이용하여 손상된 중추신경을 재생시킬 수 있다. 예를 들면 다음과 같다. 슈반세포(Schwann cell)는 신경 재생을 돕는 역할을 한다. 이 슈반세포를 신경도관에 부착시키고, 슈반세포가 부착된 신경도관을 손상된 중추신경이나 말초 신경에 연결하면 축삭 재생을 촉진할 수 있을 것이다.

따라서 본 발명의 다공성 신경도관은, 별도의 재생인자 또는 신경재생을 도와주는 약물을 추가로 투여하지 않고, 세포를 포함하는 신경도관만을 이용하여 신경재생이 가능하다. 본 발명의 세포를 포함하는 신경도관을 이용하여 말초신경 또는 중추신경의 재생이 가능하다.

본 발명에서 용어 “소수성 생체적합성 고분자란”, 생체에 적합하고 생분해성인 고분자 중에서 물에 녹지 않는 고분자를 말한다.

상기 a) 단계의 소수성 생체적합성 고분자는, 이 기술분야에 사용되는 소수성 생체적합성 고분자라면 제한 없이 사용가능하다. 구체적으로, 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리-L/D-락타이드(poly-L/D-lactide, PLDA), 폴리-L-락트산(poly-L-Lactic Acid, PLLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리디옥산온(polydioxanone), 폴리하이드록시부틸레이트(polyhydroxybutyrate, PHB), 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA) 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “수혼화성 유기용매(water miscible solvent)”란, 물과 적어도 일부 혼화가능하거나 물과 완전히 혼화 가능할 수 있는 유기용매를 말한다.

상기 a) 단계의 수혼화성 유기용매(water miscible solvent)는, 이 기술분야에서 사용되는 수혼화성 유기용매라면 제한 없이 사용가능하다. 구체적으로, 에탄올(ethanol), 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol), N-메틸-2-피롤리돈(N-Methyl-2-pyrrolidone), 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 테트라글리콜(tetraglycol), 글리세롤 포르말(glycerol formal), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 에틸 락테이트(ethyl lactate), 디에틸 카보네이트(diethyl carbonate), 프로필렌 카보네이트(proplyene carbonate), 아세톤(acetone), 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 디메틸 설폰(dimethylsulfone), 테트라하이드로푸란(tetrahydrofurane), 테트라하이드로퍼푸릴 알코올(tetrahydrofurfuryl alcohol), 석시닉 애씨드 디에틸 에스테르(succinic acid diethyl ester), 트리에틸 시트레이드(triethyl citrate), 디부틸 세바케이트(dibutyl sebacate), 디메틸 아세트아미드(dimethyl acetamide), 락틱 애씨드 부틸 에스테르(lactic acid butyl ester), 프로필렌 글리콜 디아세테이트(propylene glycol diacetate), 디에틸렌 글리콜 모노 에틸 에테르(diethylene glycol mono ethyl ether) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, N-메틸-2-피롤리돈(N-Methyl-2-pyrrolidone), 테트라글리콜(tetraglycol), 또는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)이 바람직하나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 "고분자 재료"란, 소수성 생체적합성 고분자를 수혼화성 용매에 용해시켜 제조한 것을 말한다.

본 발명의 일 실시예에서는 소수성 생체적합성 고분자로 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 또는 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 수혼화성 용매로 테트라글라이콜(TG)을 사용하여 제조한 PLGA-TG 또는 PCL-TG 용액을 고분자 재료로 이용하였다. 특히, PLGA와 TG를 혼합하여 고분자 재료를 제조시, PLGA를 TG로 한 번 녹인 이후에는 상온에서 용액 상태를 유지하므로 고분자 재료를 다시 녹이는 과정 없이 사용할 수 있는 장점이 있다.

상기 신경도관용 고분자 재료를 친수성 용액에 침지시켜서 상기 고분자 재료로부터 상기 유기용매를 분리시킴으로써, 상기 소수성 고분자에 미세기공이 형성된 다공성 고분자로 이루어진 신경도관을 얻을 수 있다.

구체적으로 설명하면 다음과 같다. 소수성 생체적합성 고분자와 수혼화성 유기용매로 구성된 신경도관용 고분자 재료를 친수성 용액에 침지시키면 상기 유기용매가 상기 고분자 밖으로 빠져 나가면서, 즉 유기용매가 상분리되면서 고분자에 미세기공을 만든다.

본 발명에서 상기 친수성 용액은 물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 “미세기공”이란, 나노 크기의 매우 작은 구멍을 말한다. 본 발명의 미세기공은 1 μm 이하의 나노 크기 매우 작은 구멍을 의미한다.

상기 a) 단계의 신경도관용 고분자 재료는 상기 수혼화성 유기용매에 상기 소수성 생체적합성 고분자가 10 내지 40 중량/부피%(w/v%) 농도로 용해된 것일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 25 w/v%, 보다 바람직하게는 15 내지 25 w/v% , 가장 최적으로는 20 w/v%일 수 있다.

상기 용어 “중량/부피%(w/v%)”는 유기용매 100mL에 녹는 소수성 고분자의 무게(g)를 의미한다.

만약 상기 농도 범위가 10 w/v% 미만일 경우, 수혼화성 유기용매를 많이 사용하게 되어 기공률(porosity)이 증가하는 문제가 발생할 수 있고, 상기 농도 범위가 40 w/v% 를 초과하는 경우에는 미세기공 형성이 충분하게 이루어지지 않는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 b) 단계의 미세기공이 형성된, 미세채널 구조를 가지는 다공성 고분자로 이루어진 신경도관은 하기 단계를 포함하여 제조되는 것일 수 있다:

상부 및 하부 채널을 갖는 용기 내에 복수 개의 유리섬유를 삽입하고;

상기 복수 개의 유리섬유가 삽입된 용기 내로, 소수성 생체적합성 고분자와 수혼화성 유기용매로 구성된 신경도관용 고분자 재료를 주입하고;

상기 상부 채널에 진공을 인가하여 상기 유리섬유 사이로 상기 고분자 재료를 침투시키고;

상기 용기로부터 상기 고분자 재료가 침투된 유리섬유를 분리시키고; 그리고

상기 분리된 유리섬유를 친수성 용액에 침지시켜 상기 유리섬유를 용해하는; 단계.

상기 신경도관용 고분자 재료는 상기 수혼화성 유기용매에 상기 소수성 생체적합성 고분자가 10 내지 40 중량/부피%(w/v%) 농도로 용해된 것이고,

상기 유리섬유를 용해하는 단계에서, 상기 소수성 생체적합성 고분자가 경화되면서 미세채널을 형성하고; 그리고 상기 수혼화성 유기용매가 상기 친수성 용액과 섞이면서 상기 소수성 고분자로부터 빠져나와 상기 소수성 고분자로 이루어진 미세채널에 미세기공이 형성되는 것일 수 있다.

상기 용어 "미세채널"이란, 유리섬유가 녹은 공간에 형성되는 5~ 20μm 크기의 빈 공간을 말하며, 신경도관 내부에 형성된 미세구조의 채널을 의미한다. 상기 미세채널은 축삭을 올바른 방향으로 자라게 하고 신경재생을 방해하는 반흔조직의 침투를 막는다.

본 발명의 신경도관은 약 1000 내지 10,000개의 채널을 가질 수 있으나, 그 이상의 채널도 포함할 수 있다.

본 발명은 미세채널에 미세기공이 형성된 다공성 신경도관의 제조방법을 제공한다. 미세채널과 미세기공의 형성 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

소수성 생체적합성 고분자와 수혼화성 유기용매로 구성된 신경도관용 고분자 재료는, 용기(예: 유리관) 내에 가득 채워진 유리섬유들 사이의 공간에 채워지면서 상기 유리섬유 사이로 상기 고분자 재료가 침투한다. 참고로, 상기 유리섬유들 사이의 공간이 좁기 때문에 음압 또는 양압을 사용하여 고분자 재료를 침투시킬 수 있다. 유리섬유들 사이에 고분자 재료가 가득 채워지면 상기 용기로부터 유리섬유와 고분자 재료를 빼 내어 친수성 용액에 담근다. 그러면 유리섬유가 녹으면서 유리섬유가 차지하고 있던 공간에 미세채널이 형성되고, 고분자 재료에서 수혼화성 유기용매가 빠져나오면서 미세기공이 형성된다. 구체적으로 유리섬유가 친수성 용액(예를 들면, 물)에 녹고 물이 소수성 고분자와 접촉하면, 이 고분자는 소수성 성질을 가지므로 물과 접촉하면서 경화가 일어나서 미세채널을 형성한다. 또한 새로 형성된 미세채널로 물이 유입되면 상기 수혼화성 유기용매가 물과 섞이면서 소수성 고분자 밖으로 빠져나가면서, 즉 상분리되면서, 미세기공을 만든다.

본 발명에 따라 제조된 신경도관은 생체 내 적용 시 미세기공이 형성된 미세채널에 의해 체액 교환이 쉽게 이루어질 수 있다.

상기 하부 채널은 상부 채널보다 작은 직경을 가지며, 상기 용기는 불연속적인 각도로 경사지는 것일 수 있다.

상기 하부 채널은 상부 채널보다 작은 직경을 가지기 때문에, 상기 용기에 주입되는 유리섬유가 용개 내에서 흘러나가지 않고 채워진 상태를 유지할 수 있다.

상기 용기는 불연속적인 각도로 경사진 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 용기는 불연속적인 각도로 경사진 상부 및 하부 채널을 형성한 것일 수 있다.

상기 불연속적인 각도로 경사진 용기 및 이의 상하부 채널에 의하여, 용기 내에 삽입되는 유리섬유의 간격이 일정하므로 유리섬유가 녹은 공간에 형성되는 미세채널의 간격 또한 일정하다. 즉, 본 발명에 따라 제조되는 다공성 신경도관은 일정한 간격의 미세채널을 형성하여, 동일한 방향으로의 신경재생을 유도할 수 있다.

상기 용기는 유리관의 중앙 부위를 가열하여 병목 지점을 만들어서 상부 채널 및 하부 채널을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 신경도관용 고분자 재료는 상온에서 용액 상태인 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 “상온”이란, 15~25℃를 의미한다.

상기 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법은, 상기 유리섬유를 용해하는 단계 이후에 다음 단계를 더 포함할 수 있다:

상기 유리섬유를 용해한 후 형성된 신경도관을 액체질소로 냉각시키고; 그리고

상기 냉각된 신경도관을 절단하여 성형하는 단계.

상기 용기는 상기 신경도관용 고분자 재료의 침투가 육안으로 확인될 수 있는 투명 재질로 이루어진 것일 수 있다. 상기 투명 재질로 이루어진 용기로 바람직한 것은 유리이나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 진공의 인가는 복수 회 반복하여 진행되는 것일 수 있으며, 이에 따라 균일한 밀도의 신경도관을 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 진공은 주사기를 이용하여 용기(예: 유리관) 내부에 반복적인 것으로 인가하는 것일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 c) 단계의 챔버(chamber)를 이루는 고분자는 이 기술분야에 사용되는, 거푸집 등을 이용하여 성형하거나 3D 프린터 등을 통해 형상을 구현할 수 있는 고분자라면 제한 없이 사용가능하며, 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 챔버를 제작한 후 신경도관을 삽입하고 아가로스를 이용하여 PDMS 챔버와 신경도관 사이의 공간을 메운 뒤 커버글라스로 덮어 밀폐함으로써 신경도관이 삽입되어 있는 장치를 제작하였다. 본 발명에 따른 신경도관의 길이는 다양한 크기로 제작이 가능하므로 이에 따른 다양한 길이의 PDMS 장치를 준비할 수 있다.

상기 e) 단계의 세포는 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 신경세포일 수 있다.

상기 신경세포는 슈반세포(schwann cell), 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 슈반세포일 수 있다.

본 발명에 있어서, "슈반세포(Schwann cell)"는 신경 재생을 돕는 역할을 한다. 이 슈반세포를 신경도관에 부착시키고, 슈반세포가 부착된 신경도관을 손상된 말초신경 또는 중추신경에 연결하면 축삭 재생을 촉진할 수 있다.

상기 신경세포는 직경이 미세채널의 직경인 10~20μm과 유사한 것이 바람직하며, 직경이 10 내지 30 μm인 것일 수 있다. 신경세포의 직경이 미세채널의 직경보다 작은 경우, 신경세포가 유입되는 배양배지를 따라 신경도관 외부로 배출될 수 있으며, 신경세포의 직경이 미세채널의 직경보다 큰 경우, 신경세포가 신경도관 내 미세채널의 내부로 들어가지 못할 수 있다.

상기 f) 또는 g) 단계의 배양배지의 유속은 30 내지 60 μl/min일 수 있다.

상기 유속의 수치 범위를 벗어나 높은 경우에는 세포가 빠른 속도로 유입되는 배양배지를 따라 신경도관 외부로 배출될 수 있으며, 낮은 경우에는 세포가 튜브를 따라 신경도관에 도달하기 어려울 수 있다.

상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치는 세포를 시딩하여 배양함으로써 세포가 신경도관 내부의 미세채널 내부에서 성장하는 것일 수 있다.

상기 세포를 시딩하여 배양하기 위한 배양배지는 필요에 따라 신경 관련 재생인자 또는 약물을 추가로 포함할 수 있고, 포함하지 않을 수도 있으며, 포함하지 않는 경우에도 세포 성장 또는 신경재생에 문제가 없다.

용어 "신경 관련 재생인자"란 신경세포의 축삭(axon) 등의 성장에 영향을 미치는 인자를 의미한다.

상기 신경 관련 재생인자는 이로 제한되는 것은 아니나, 신경생장인자(nerve growth factor, NGF), 신경영양인자(neurotrophic factor, NTF)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

용어 "약물"이란 신경세포의 축삭(axon) 등의 성장에 영향을 미칠 가능성이 있다고 판단되는 미지의 물질을 의미한다.

상기 약물은 화학적으로 합성된 물질, 천연물 추출물, 뉴클레오타이드(nucleotide)를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또 따른 측면에서, 본 발명은 상기 언급한 제조방법에 의해 제조된 미세기공이 형성된 미세채널 구조를 가지는, 세포를 포함하는 다공성 신경도관을 제공한다.

상기 신경도관은 유리섬유가 용기의 축방향으로 삽입됨에 따라 신경도관의 축 방향으로 미세채널이 형성된 것일 수 있다.

상기 신경도관은, 수혼화성 유기용매 및 소수성 생체적합성 고분자로 구성된 신경도관용 고분자 재료가 친수성 용액과 반응하여 상기 소수성 생체적합성 고분자가 경화되면서 미세채널을 형성하고; 그리고 상기 수혼화성 유기용매가 상기 친수성 용액과 섞이면서 상기 소수성 생체적합성 고분자로부터 빠져나와 상기 소수성 고분자로 이루어진 미세채널에 미세기공이 형성되는 것일 수 있다.

또 따른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 신경도관을 손상된 신경 부위에 이식하는 것인, 신경재생 방법을 제공한다.

상기 신경은 말초신경 또는 중추신경일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 유리섬유를 용기(유리관)의 상부 채널 내에 축방향으로 삽입한 후, 용기 내로 고분자 재료(PLGA- 또는 PCL-TG 용액)를 주입하고 진공을 인가하여 유리섬유 내로 침투시켰다. 그 다음 상기 용기로부터 유리섬유를 분리한 뒤 물(DW)에 침지시킴으로써 유리섬유를 모두 용해시켰다. 상기 유리섬유가 용해될 때 소수성 고분자가 물과 접촉하면서 경화되어 미세채널을 형성하고 또한 이 미세채널에 미세기공이 만들어진다. 즉, 유리섬유를 용기의 축방향으로 삽입한 후 유리섬유를 녹임으로써, 유리섬유가 녹은 공간에 축 방향으로 미세기공이 있는 미세채널이 형성된 신경도관을 제조하였다.

또한 본 발명의 일 실시예에서는 상기 제조된 신경도관을 이용하여, 별도의 재생인자나 신경재생을 도와주는 약물 등의 추가 없이도, 말초신경을 재생시켰다.

본 발명에 따라 제조된 다공성 신경도관은 다양한 직경과 길이로 제작할 수 있다. 또한 본 발명의 신경도관을 제조할 때, in vitro 및 in vivo 신경 연구에 유용하게 사용될 수 있도록 사용 목적 및 용도에 따라 신경도관의 직경과 길이를 자유롭게 변경할 수 있다.

본 발명에 따른 효과는 다음과 같다.

1. 본 발명의 제조방법에 따라, 소수성 생체적합성 고분자를 수혼화성 용매에 녹인 고분자 재료를 유리섬유 사이로 침투시킨 후, 이를 친수성 용액에 침지시킨다. 그러면 소수성 고분자는 친수성 용액과 접촉하여 경화되면서 미세채널을 형성하고, 반면에 수혼화성 용매가 소수성 생체적합성 고분자로부터 빠져 나오면서 고분자에 미세기공을 만든다. 이 미세기공을 통해 체액 교환이 가능하다.

2. 소수성 생체적합성 고분자와 수혼화성 용매를 혼합하여 고분자 용액의 녹는점이 낮아짐에 따라, 소수성 생체적합성 고분자를 수혼화성 용매에 한번 녹인 이후에는 상온에서 용액 상태를 유지하므로 고분자 재료를 다시 녹이는 과정 없이 사용할 수 있다.

3. 유리섬유 사이의 공간에 일정 점도를 갖는 고분자 용액을 침투시킨 후, 반복적으로 진공을 복수 회 인가함으로써 균일한 밀도의 신경도관 제조가 가능하다.

4. 본 발명에 따른 신경도관을 이용하여, 별도의 재생인자나 신경재생을 도와주는 약물 등의 추가 없이도, 말초신경 및/또는 중추신경의 재생이 가능하다.

도 1은 다공성 신경도관의 제조방법을 나타낸 사진이다; A는 유리섬유, 모세 유리관 및 유리섬유가 삽입된 모세 유리관, B는 2-방향 밸브가 연결된 실리콘 튜브 및 루어락(Luer lock) 주사기, C는 2-방향 밸브가 연결된 실리콘 튜브가 결합된 루어락(Luer lock) 주사기, D는 주사기를 이용하여 유리관 내부에 진공을 가하는 모습.
도 2는 다공성 신경도관의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 불연속(A) 또는 연속(B)적인 용기 경사에 따른 채널 형성 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 PLGA 다공성 신경도관의 횡단면 SEM 이미지이다; 스케일 바 : (왼쪽) 100 μm, (오른쪽) 10 μm.
도 5는 다공성 신경도관의 횡단면에서 미세구조를 확대한 SEM 이미지이다; 스케일 바 : (A, C) 10 μm, (B, D) 1 μm, ▶ : 미세채널 내부의 미세기공.
도 6은 다공성 신경도관의 종단면 SEM 이미지이다; 스케일 바 = (A) 100 μm, (B) 10 μm, (C) 10 μm, (D) 1 μm, ▶ : 미세채널 내부의 미세기공.
도 7은 다공성 신경도관에서 빠져 나온 TG가 증류수(distilled water, DW) 아래쪽에 가라앉은 것을 나타낸 사진이다; 화살표: TG.
도 8은 용도에 따라 다양한 직경과 길이로 제작된 본 발명의 다공성 신경도관을 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신경도관의 3D 마이크로-CT 이미지이다(시상절단면).
도 10은 PCL 다공성 신경도관의 횡단면 SEM 이미지이다; 스케일 바 : (왼쪽) 500 μm, (중간) 10 μm (오른쪽) 10 μm. A는 횡단면 이미지, B는 횡단면 미세구조를 확대한 이미지, 그리고 C는 종단면 이미지이다.
도 11은 PDMS 챔버의 규격(A, B) 및 커버글라스로 덮어 밀폐한 PDMS 장치(C)를 나타낸 도이다.
도 12는 다양한 길이의 신경도관 및 이에 따라 제작된 다양한 길이의 PDMS 버를 나타낸 도이다.
도 13은 신경세포 in vitro 배양장치의 모식도(A) 및 배지 공급용기(B)의 사진을 나타낸 도이다.
도 14는 배지 공급용기의 구성을 나타낸 도이다.
도 15는 랫트의 좌골신경(sciatic nerve) 유래 슈반세포를 일차배양한 도이다.
도 16은 펌프를 이용한 슈반세포의 시딩 과정을 나타낸 사진 및 모식도이다.
도 17은 슈반세포를 신경도관에 시딩하기 위한 장치의 실제 사용예를 나타낸 도이다.
도 18은 슈반세포를 신경도관에 시딩하기 위한 장치의 실제 사용예를 나타낸 도이다.
도 19는 직경 1.6~1.7mm, 길이 16mm의 신경도관에서 3일간 EGFP 형광 단백질을 발현하는 슈반세포를 배양한 후 공초점현미경으로 촬영하여 나타낸 도이다.
도 20은 직경 1.7mm, 길이 50mm의 신경도관에서 3일간 EGFP 형광 단백질을 발현하는 슈반세포를 배양한 후 공초점현미경으로 촬영하여 나타낸 도이다.
도 21은 EGFP를 시딩한 슈반세포(EGFP Schwann cell), S100는 rabbit S100 다클론 항체로 염색한 슈반세포, Merge는 EGFP로 인해 형광을 나타내는 슈반세포와 rabbit S100 다클론 항체로 염색한 슈반세포를 병합하여 나타낸 도이다.
도 22는 단순 주입(Direct injection)(A) 또는 세포 시딩 장치(B)를 이용하여 각각 시딩한 후 3일 배양한 슈반세포를 공초점현미경으로 촬영하여 나타낸 도이다.
도 23은 신경도관에 수득한 DRG 외식편을 3-5개 시딩하여 1일간 배양한 것(A)과, 신경도관에 슈반세포를 먼저 시딩하고 1일간 배양한 다음 DRG 외식편을 3-5개 시딩하여 1일간 배양한 것(B)을 공초점현미경으로 촬영하여 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명에 따른 신경도관의 신경재생효과 확인을 위한 생체 내(in vivo) 실험과정을 나타낸 것으로, 렛트의 좌골신경을 절단 후, 16mm 신경도관을 삽입한 사진이다.
도 25는 본 발명에 따른 신경도관의 신경재생효과 확인을 위한 생체 내(in vivo) 실험결과를 나타낸 것으로, 신경도관 삽입 일주일 후 신경도관만을 이식한 개체(scaffold only)보다 슈반세포를 시딩한 신경도관을 이식한 개체(scaffold + SCs)에서 원위부까지의 축삭(Tuj1 단클론 항체로 염색)과 슈반세포(S100 다클론 항체로 염색)가 관찰되었다. EGFP는 SD-Tg(CAG-EGFP) 랫트로부터 일차 배양한 슈반세포이다. Merge는 EGFP로 인해 형광을 나타내는 슈반세포, Tuj1 단클론 항체로 염색한 축삭과 S100 다클론 항체로 염색한 슈반세포를 병합한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 이 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 다공성 신경도관

1-1: PLGA 다공성 신경도관의 제조

소수성 고분자인 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(PLGA)(락틱산 대 글리콜산의 mol %, 85:15)와 수혼화성 용매인 테트라글리콜(TG)(밀도: 1.09g/ml, Sigma-Aldrich, 미국)을 중량 대 용량(w/v) 비율이 20%(w/v)가 되도록 혼합한 후 60℃에서 18시간 동안 녹여 20%(w/v) PLGA-TG 용액(고분자 재료)을 준비하였다.

내경 1.6mm, 길이 13cm인 모세 유리관의 중앙 부위를 가열하여 병목 지점을 만들어, 불연속적인 각도로 경사진 상부 및 하부 채널을 형성하였다. 이때, 하부 채널은 상부 채널보다 작은 직경을 형성하도록 제작하였다. 이후, 직경이 10 ~ 20 μm인 수용성 유리섬유(50P₂O₅-20CaO-30Na₂O in mol % (1100℃, 800rpm)) 7000 ~ 8500 가닥을 5 ~ 6cm 단위로 잘라 유리관의 상부 채널 내에 축방향으로 빽빽하게 삽입하였다(도 1A 및 도 2A).

유리섬유가 삽입된 유리관의 상부 채널에, 내경 0.8mm, 길이 15cm인 실리콘 튜브에 2-방향 밸브가 부착된 루어락(Luer lock) 주사기를 연결하여 제조한 압력 장치를 끼워 준비하였다(도 1B 및 도 1C).

상온에서 유리관의 하부 채널이 20%(w/v) PLGA-TG 용액에 잠기도록 한 후, 주사기를 이용하여 유리관 내부에 반복적으로 진공을 가해 20%(w/v) PLGA-TG 용액이 유리섬유 사이의 빈틈에 완전히 침투하도록 빨아들였다(도 1D 및 도 2C).

유리관(용기)의 구체적인 형태는 도 3A에 나타내었다. 도 3A를 보면 불연속적인 각도로 유리관의 상부채널 대비 하부채널의 너비를 좁혔다. 유리관의 상부채널과 하부채널로 이어지는 각도가 연속적일 경우(도 3B), 유리관에 채워지는 유리섬유 사이의 간격이 점차 좁아지게 되어 유리섬유 간에 일정한 간격을 유지하기 어려워지는 문제가 있다.

유리섬유의 간격이 일정하지 않은 상태에서 신경도관이 제조되면, 신경도관의 미세채널 간격도 일정하지 않을 것이다. 그리고 이 신경도관으로 신경을 재생할 때 신경재생 방향이 미세채널에 따라 달라지므로, 동일한 방향으로의 신경재생이 어려워지는 문제점이 발생할 수 있다.

PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 직경 1.5mm 길이 15cm의 와이어(wire)를 이용하여 유리관으로부터 분리한 즉시 10~20℃의 증류수(DW)에 24시간 이상 완전히 침지시켜(도 2D), 유리섬유를 모두 용해하고 유리섬유가 녹은 공간에 PLGA로 이루어지는 10 ~ 20 μm 크기의 미세채널(미세채널의 직경: 16.54 ㅁ 3.6 μm)이 약 7,000 ~ 8,500 개(미세채널의 수: 7,777 ㅁ 716.2 개) 형성되도록 하였다(도 2E 및 도 4). 10~20℃의 DW 내에서 유리섬유가 용해되는 동시에, 소수성 고분자인 PLGA가 물과 접촉하면서 경화되어 미세채널을 형성하였다. 또한, PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 DW에 침지하는 과정에서 수혼화성 용매인 TG가 물과 섞이면서 소수성 고분자, 즉 미세채널로부터 빠져나오면서 미세채널 내부에 미세기공을 형성하였다(도 4, 도 5 및 도 6). 신경도관으로부터 빠져나온 상분리된 TG는 DW보다 밀도가 높아 DW 아래쪽에 아지랑이 모양으로 가라앉았다(도 7).

DW 처리를 통해 유리섬유와 TG가 제거되고, PLGA로 이루어지는 미세기공을 가지는 다공성 미세채널이 제조되었다. 제조된 신경도관을 액체 질소에 약 30초간 얼린 후 사용 목적에 맞는 크기로 절단하고 성형하였다(도 8).

1-2: PLGA 다공성 신경도관의 내부 미세구조 확인

실시예 1-1을 통해 제조된 신경도관 내부의 미세채널에 형성된 미세구조는 SEM(scanning electron microscopy)를 이용하여 확인하였다(도 4, 도 5 및 도 6).

도 4는 신경도관의 횡단면이고, 도 5는 신경도관의 횡단면에서 미세채널 구조를 확대한 사진이며, 도 6은 신경도관의 종단면으로 신경도관 내부의 미세채널이 연속되어 있는 것을 나타내며, 미세채널 구조에 미세기공이 형성된 것을 확인하였다.

1-3: 다공성 신경도관의 3D 마이크로-CT 이미지

실시예 1-1의 신경도관을 3차원 CT로 촬영한 이미지를 도 9에 나타내었다. 도 9를 통해 손상되지 않은 형태의 신경도관 내부 미세채널을 관찰할 수 있다.

1-4: PCL 다공성 신경도관의 제조

소수성 생체적합성 고분자 재료로 PLGA 대신 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)을 사용하여 고분자 재료를 준비한 것을 제외하고는, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 다공성 신경도관을 제조하였다. 상기 고분자 재료는 PCL과 TG의 중량 대 용량 (w/v) 비율이 18%(w/v)가 되도록 혼합한 후 90℃에서 18~24시간 동안 녹여 18%(w/v) PCL-TG 용액(고분자 재료)을 준비하였다. 그리고 실시예 1-1과 같은 방법으로 신경도관을 제조하였다(도 10).

실시예 2: 세포를 포함하는 다공성 신경도관

2-1: 세포 시딩 장치(cell seedign system) 제작

먼저 도 11A 및 도 11B의 규격으로 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 챔버(chamber)를 제작하였다. PDMS 챔버를 제작하는 방법은 이 기술분야에 통상적으로 알려져 있다. 구체적으로, 필요한 형태의 몰드를 3D 프린터 등을 이용해 만들고 PDMS 용액을 부어 가열하여 경화시켜서 제작하였다.

제작한 PDMS 챔버에 직경 1.6~1.7mm, 길이 16mm로 성형한 실시예 1의 신경도관을 삽입하고, 물에 완전히 녹인 4% 아가로스(agarose)를 40~50℃로 냉각시킨 후 PDMS 챔버와 신경도관 사이의 공간에 침투시켰다. 아가로스가 완전히 경화되도록 상온에서 5 분간 방치 후에 아가로스와 PDMS 챔버 표면의 높이가 균일하도록 다듬고 커버글라스로 덮어 밀폐함으로써, PDMS 장치를 제조하였다(도 11C). 이때, 아가로스가 신경도관의 상하부 말단에 침투하여 미세채널을 막지 않도록 주의하였다. 신경도관의 길이는 다양한 크기로 제작이 가능하므로 이에 따라 다양한 길이의 PDMS 장치를 준비할 수 있다(도 12).

이후, 실리콘 튜브를 이용하여 신경도관이 삽입되어 있는 PDMS 장치의 상부 쪽으로 멀티채널 연동펌프(multichannel peristaltic pump)(Gilson's MINIPULS　3)(도 13A)를 연결하고 하부 쪽에는 25ml T-플라스크(T-flask)를 변형하여 만든 배지 공급용기(media reservoir)(도 13B 및 도 14)를 연결하여, 세포 시딩 장치를 제작하였다. 25ml T-플라스크는 윗부분을 천공하여 주입(inlet)과 배출(outlet)을 위한 바늘(needle) 및 튜브를 삽입하였으며, 필터 캡(Filter cap)이 있는 T-플라스크를 사용하여 공기의 흐름은 유지하되 오염을 방지할 수 있도록 하였다. 제작된 세포 시딩 장치는 펌프를 이용하여 배지 공급용기 내 배양배지가 신경도관이 삽입되어 있는 PDMS 장치로 공급하였다.

2-2: 슈반세포(schwann cell) 시딩

슈반세포는 야생형(wild type) 또는 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 6주령 SD 랫트(SD rat, Sprague rat)(SD-Tg(CAG-EGFP) rat)(Japan SLC, Hamamatsu-shi, Shizuoka, Japan)의 좌골신경(sciatic nerve)으로부터 분리하였다.

신경도관 내부에 슈반세포를 시딩하기 위해, 도 15와 같이 일차배양한 슈반세포 2ㅧ10⁵ 개를 5~10ml의 배양배지에 희석하여 배지 공급용기에 넣어 준 후 연동펌프를 이용하여 분당 50μl(μl/min)의 속도로 신경도관에 슈반세포를 시딩하였다(도 16). 신경도관 내부의 미세채널의 직경은 10~20μm 로, 직경이 약 15μm인 슈반세포가 혼합되어 있는 배양배지를 계속 흘려주어 신경도관 내부의 미세채널에 슈반세포가 파고들어 자리잡도록 하였다.

2-3: 슈반세포 배양

슈반세포를 시딩한 후, 신경 관련 재생인자 또는 약물을 혼합한 배양배지를 배지 공급용기에 투입하고 배양배지가 신경도관 상부에서 하부로 흐르도록 연동펌프를 작동시켰다. 배양배지의 유입 속도는 분당 50μl(μl/min) 이하로 유지하고, CO₂ 인큐베이터에서 배양배지를 계속 흘려주며 1일에서 3일간 배양하였다(도 17 및 도 18). 배양 시 신경도관을 바닥면과 수직하도록 세워서 배양함으로써, 미처 부착되지 않은 슈반세포가 신경도관이 아닌 다른 공간으로 떨어지지 않도록 방지하였다.

2-4: 시딩된 슈반세포 확인

슈반세포를 신경도관 내부의 미세채널에 시딩하고 3일 동안 배양 후 공초점현미경으로 확인한 결과, 미세채널을 따라 슈반세포가 배양되고 있는 것을 확인하였다(도 19).

또한, 실시예 1의 방법에 따라 대동물 신경 이식용으로 제작한 직경 1.7mm, 길이 50mm의 신경도관에 슈반세포 4ㅧ10⁵ 개를 시딩하고 3일 동안 배양 후 공초점현미경으로 확인한 결과, 50mm 길이 전체에 걸쳐 슈반세포가 배양되고 있는 것을 확인하였다(도 20).

2-5: 단순 주입(Direct injection) 또는 세포 시딩 장치로 시딩된 슈반세포 확인

슈반세포를 신경도관에 단순 주입 또는 세포 시딩 장치로 시딩한 후 배양하여 두 방법에 따른 슈반세포 배양 양상을 확인하였다. 구체적으로, PLGA 다공성 신경도관(길이 = 16mm, O.D. = 2.2 mm)에 헤밀턴 주사기로 5ㅧ10⁵ cells/10μl의 농도로 준비한 슈반세포를 신경도관 앞쪽에 직접 주사기의 바늘로 주입하거나, 세포 시딩 장치를 이용하여 배양배지의 유입 속도를 분당 20μl(μl/min)로 하여 시딩한 후 각각 3일 동안 배양하였다.

공초점현미경으로 확인한 결과, 세포 시딩 장치를 이용하여 시딩된 슈반세포는 신경도관 길이 전반에 걸쳐 배양되나(도 22B), 단순 주입하여 시딩된 슈반세포는 주입된 부분에서만 배양되고 있는 것을 확인하였다(도 22A).

실시예 3: 인비트로(In vitro)에서의 신경재생 효과 확인

생후 3일차 되는 SD 랫트의 흉부(thoracic)와 요추(lumbar) 부위로부터 DRG(dorsal root ganglion)을 분리하고 이를 배양하여 DRG 외식편(explant)을 수득하였다.

실시예 2의 세포 시딩 장치를 이용하여 PCL 다공성 신경도관(길이 = 16mm, O.D. = 2.2 mm)에 슈반세포 및 DRG 외식편을 시딩하여 배양하였다. 구체적으로, 슈반세포는 5ㅧ10⁵ cells/scaffold를 배양배지의 유입 속도를 분당 20μl(μl/min)로 하여 시딩한 후 1일 동안 배양하였다. DRG 외식편은 3-5 DRGs/scaffold를 배양배지의 유입 속도를 분당 20μl(μl/min)로 하여 시딩한 후 1일 동안 배양하였다.

상기 방법과 같이 신경도관에 수득한 DRG 외식편을 3-5개 시딩하여 1일간 배양한 것과, 신경도관에 슈반세포를 먼저 시딩하고 1일간 배양한 다음 DRG 외식편을 3-5개 시딩하여 1일간 배양한 것을 면역염색하여 비교하였다. 신경세포의 축삭 염색을 위해 mouse Tuj1 단클론 항체를 사용하였고 슈반세포 염색을 위해 rabbit S100 다클론 항체를 사용하였다.

공초점 현미경으로 관찰한 결과, DRG 외식편만을 시딩한 후 1일간 배양한 신경도관(도 23A)에서 보다 슈반세포를 시딩한 후 DRG 외식편을 시딩한 신경도관(도 23B)에서 원위부까지의 축삭(Tuj1)과 슈반세포(S100)가 관찰되었다. EGFP는 SD-Tg(CAG-EGFP) 랫트로부터 일차 배양한 슈반세포이다.

상기 결과는 슈반세포를 포함하는 신경도관이 신경재생에 효율적임을 증명하였다.

실시예 4: 인비보(In vivo)에서의 신경재생 효과 확인

12주령 SD 랫트(암컷, 230-250g)의 좌골신경을 16mm 길이로 잘라 제거한 후, 손상 부위에 도 24와 같이 슈반세포 5ㅧ10⁵ cells/scaffold를 배양배지의 유입 속도를 분당 20μl(μl/min)로 하여 시딩하고 1일간 배양한 PCL 신경도관(길이 = 16mm, O.D. = 2.2 mm) 또는 슈반세포를 시딩하지 않은 PCL 신경도관(대조군)을 이식하였다. 신경도관과 신경이 서로 분리되는 것을 방지하기 위해 미세봉합사(10-0: 0.02 내지 0.029mm 굵기의 나일론 봉합사)를 이용하여 신경관의 양끝을 잘린 신경말단과 180도 간격으로 2 부분을 봉합하였다.

이식 후 일주일 뒤 이후 좌골신경의 성장을 확인하기 위해 면역염색을 진행하였다. 18mm 길이의 이식체를 포함한 좌골신경을 적출하고, 4% 파라포름알데하이드에 고정하였다. 이후 다시 30% 스쿠로즈에 3일간 처리 후 16μm의 두께로 동결절편 하였다. 자른 조직은 신경세포의 축삭 염색을 위해 mouse Tuj1 단클론 항체를 사용하였고 슈반세포 염색을 위해 rabbit S100 다클론 항체를 사용하였다. 공초점 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 25에 나타내었다. 신경도관만을 이식한 개체(scaffold only)보다 슈반세포를 시딩한 신경도관을 이식한 개체(scaffold + SCs)에서 원위부까지의 축삭(Tuj1 단클론 항체로 염색)과 슈반세포(S100 다클론 항체로 염색)가 관찰되었다. 축삭은 파란색으로 나타났다. 시딩한 슈반세포는 EGFP를 발현하면서 동시에 S100으로도 염색되어 초록색과 빨간색이 합쳐진 노란색으로 나타나며, 실험동물에서 유래된 슈반세포, 즉 기존 슈반세포는 S100으로만 염색되어 빨간색으로 나타났다. EGFP는 SD-Tg(CAG-EGFP) 랫트로부터 일차 배양한 슈반세포로, 초록색으로 나타났다. Merge는 EGFP로 인해 형광을 나타내는 슈반세포, Tuj1 단클론 항체로 염색한 축삭과 S100 다클론 항체로 염색한 슈반세포를 병합한 것이다.

실험동물에서 유래된 기존 슈반세포가 실험동물의 축삭을 수초화(myelination)하였을 경우에는 분홍색을 나타낸다. 그러나, 도 25에서는 슈반세포를 시딩한 신경도관을 이식한 개체의 Merge에서, 초록색(EGFP: EGFP Schwann cell)과 파랑색(Tuj1: 축삭) 그리고 빨강색(S100: 시딩한 슈반세포 + 기존 슈반세포)이 겹쳐져 흰색 부분이 나타났다. 이 흰색 부분은 시딩한 슈반세포 의해 실험동물의 축삭을 수초화하였음을 보여준다.

즉, 상기 결과는 슈반세포를 포함하는 신경도관이 신경재생에 효율적임을 증명하였다.

Claims (18)

1. 하기 단계를 포함하는, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법으로,
   a) 소수성 생체적합성 고분자를 수혼화성 유기용매에 용해시켜 신경도관용 고분자 재료를 준비하는 단계;
   b) 상기 신경도관용 고분자 재료를 친수성 용액에 침지시켜서 상기 고분자 재료로부터 상기 유기용매를 분리시킴으로써, 상기 소수성 고분자에 미세기공이 형성된, 미세채널 구조를 가지는 다공성 고분자로 이루어진 신경도관을 얻는 단계;
   c) 상기 신경도관을 챔버(chamber)에 삽입하여, 신경도관이 삽입되어 있는 장치를 제작하는 단계;
   d) 상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치의 상부에 펌프를 튜브로 연결하고, 하부에 배양배지를 포함하는 배지 공급용기를 튜브로 연결하는 단계;
   e) 상기 배지 공급용기 내 배양배지에 세포를 투입하는 단계;
   f) 상기 d)의 펌프를 이용하여 e)의 배지 공급용기 내 배양배지를 신경도관이 삽입되어 있는 장치로 공급함으로써 c)의 신경도관에 세포를 시딩(seeding)하는 단계; 그리고
   g) 상기 d)의 펌프를 이용하여 e)의 배지 공급용기 내 배양배지를 f)의 세포가 시딩된 신경도관으로 공급하여 세포를 배양하는 단계;를 포함하고,
   상기 미세채널을 구조를 가지는 신경도관은 수직으로 배치되어 배양배지가 중력에 의해 신경도관의 상단에서 하단으로 흐르며,
   상기 b) 단계의 미세기공이 형성된, 미세채널 구조를 가지는 다공성 고분자로 이루어진 신경도관은,
   상부 및 하부 채널을 갖는 용기 내에 복수 개의 유리섬유를 삽입하고;
   상기 복수 개의 유리섬유가 삽입된 용기 내로, 소수성 생체적합성 고분자와 수혼화성 유기용매로 구성된 신경도관용 고분자 재료를 주입하고;
   상기 상부 채널에 진공을 인가하여 상기 유리섬유 사이로 상기 고분자 재료를 침투시키고;
   상기 용기로부터 상기 고분자 재료가 침투된 유리섬유를 분리시키고; 그리고
   상기 분리된 유리섬유를 친수성 용액에 침지시켜 상기 유리섬유를 용해하는; 단계를 포함하고,
   상기 신경도관용 고분자 재료는 상기 수혼화성 유기용매에 상기 소수성 생체 적합성 고분자가 10 내지 40 중량/부피%(w/v%) 농도로 용해된 것이고,
   상기 유리섬유를 용해하는 단계에서, 상기 소수성 생체적합성 고분자가 경화되면서 미세채널을 형성하고; 그리고 상기 수혼화성 유기용매가 상기 친수성 용액과 섞이면서 상기 소수성 고분자로부터 빠져나와 상기 소수성 고분자로 이루어진 미세채널에 미세기공이 형성되는 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 다공성 신경도관은 중추신경 또는 말초신경의 재생을 위한 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 a) 단계의 소수성 생체적합성 고분자는,
   폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리-L/D-락타이드(poly-L/D-lactide, PLDA), 폴리-L-락트산(poly-L-Lactic Acid, PLLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리디옥산온(polydioxanone), 폴리하이드록시부틸레이트(polyhydroxybutyrate, PHB), 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA) 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
   상기 a) 단계의 수혼화성 유기용매(water miscible solvent)는,
   에탄올(ethanol), 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol), N-메틸-2-피롤리돈(N-Methyl-2-pyrrolidone), 2-피롤리돈(2-pyrrolidone), 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 테트라글리콜(tetraglycol), 글리세롤 포르말(glycerol formal), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 에틸 락테이트(ethyl lactate), 디에틸 카보네이트(diethyl carbonate), 프로필렌 카보네이트(proplyene carbonate), 아세톤(acetone), 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 디메틸 설폰(dimethylsulfone), 테트라하이드로푸란(tetrahydrofurane), 테트라하이드로퍼푸릴 알코올(tetrahydrofurfuryl alcohol), 석시닉 애씨드 디에틸 에스테르(succinic acid diethyl ester), 트리에틸 시트레이드(triethyl citrate), 디부틸 세바케이트(dibutyl sebacate), 디메틸 아세트아미드(dimethyl acetamide), 락틱 애씨드 부틸 에스테르(lactic acid butyl ester), 프로필렌 글리콜 디아세테이트(propylene glycol diacetate), 디에틸렌 글리콜 모노 에틸 에테르(diethylene glycol mono ethyl ether) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 a) 단계의 신경도관용 고분자 재료는 상기 수혼화성 유기용매에 상기 소수성 생체적합성 고분자가 10 내지 40 중량/부피%(w/v%) 농도로 용해된 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
   
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서,
   상기 하부 채널은 상부 채널보다 작은 직경을 가지며, 상기 용기는 불연속적인 각도로 경사지는 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 신경도관용 고분자 재료는 상온에서 용액 상태인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
   
8. 제 1항에 있어서,
   상기 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법은,
   상기 유리섬유를 용해하는 단계 이후에 다음 단계를 더 포함함:
   상기 유리섬유를 용해한 후 형성된 신경도관을 액체질소로 냉각시키고; 그리고
   상기 냉각된 신경도관을 절단하여 성형하는 단계.
   
9. 제 1항에 있어서,
   상기 용기는 상기 신경도관용 고분자 재료의 침투가 육안으로 확인될 수 있는 투명 재질로 이루어진 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
   
10. 제 1항에 있어서,
    상기 진공의 인가는 복수 회 반복하여 진행되는 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
    
11. 제 1항에 있어서,
    상기 e) 단계의 세포는 신경세포인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
    
12. 제 11항에 있어서,
    상기 신경세포는 슈반세포(schwann cell), 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
    
13. 제 1항에 있어서,
    상기 f) 또는 g) 단계의 배양배지의 유속은 30 내지 60 μl/min인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
    
14. 제 1항에 있어서,
    상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치에 세포를 시딩하여 배양함으로써 세포가 신경도관 내부의 미세채널 내부에서 성장하는 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관의 제조방법.
    
15. 제 1항에 따른 방법에 의하여 제조된, 미세기공이 형성된 미세채널 구조를 가지는, 세포를 포함하는 다공성 신경도관.
    
16. 제 15항에 있어서,
    상기 신경도관은 유리섬유가 용기의 축방향으로 삽입됨에 따라 신경도관의 축 방향으로 미세채널이 형성된 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관.
    
17. 제 15항에 있어서,
    상기 신경도관은,
    수혼화성 유기용매 및 소수성 생체적합성 고분자로 구성된 신경도관용 고분자 재료가 친수성 용액과 반응하여 상기 소수성 생체적합성 고분자가 경화되면서 미세채널을 형성하고; 그리고
    상기 수혼화성 유기용매가 상기 친수성 용액과 섞이면서 상기 소수성 생체적합성 고분자로부터 빠져나와 상기 소수성 고분자로 이루어진 미세채널에 미세기공이 형성되는 것인, 세포를 포함하는 다공성 신경도관.
    
18. 삭제

Images