KR101945139B1 - 선택적 bace1 억제제 - Google Patents

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레오나르드 래리 주니어 위너로스키
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Abstract

본 발명은 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 II>

Description

선택적 BACE1 억제제
본 발명은 특정 신규 선택적 BACE1 억제제, 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물, 이러한 화합물을 생리학적 장애를 치료하는 데 사용하는 방법, 및 이러한 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 알츠하이머병, 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 신경독성 및 고도의 응집성 펩티드 절편인 아밀로이드 β (A베타) 펩티드를 수반하는 다른 질환 및 장애의 치료 분야에 있다. 알츠하이머병은 전세계적으로 수백만명의 환자에게 영향을 미치는 파괴적인 신경변성 장애이다. 질환을 중단, 둔화, 또는 역전시키기보다는 환자에게 단지 일시적, 징후적 이익을 제공하는 시판되는 현재 승인된 작용제의 관점에서, 알츠하이머병의 치료에 있어서 상당한 미충족 필요가 있다.
알츠하이머병은 뇌에서의 A베타의 생성, 응집, 및 침착을 특징으로 한다. β-세크레타제 (β-부위 아밀로이드 전구체 단백질-절단 효소; BACE)의 완전 또는 부분 억제는 마우스 모델에서 플라크-관련 및 플라크-의존성 병리상태에 대해 유의한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 A베타 펩티드 수준에서의 작은 감소도 플라크 부담 및 시냅스 결손에서 장기간 유의한 감소를 생성할 수 있으며, 따라서 유의한 치료 이익을 특히 알츠하이머병의 치료에서 제공한다는 것을 시사한다. 또한, BACE1 및 BACE2로 지칭되는 2개의 BACE 상동체가 확인되었고, BACE1이 알츠하이머병의 발생에 있어 임상적으로 가장 중요하다고 여겨진다. BACE1은 주로 뉴런에서 발현되는 한편 BACE2는 주로 주변부에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. (문헌 [D. Oehlrich, Bioorg. Med . Chem . Lett ., 24, 2033-2045 (2014)] 참조) 또한, BACE2는 색소 세포-특이적 멜라닌세포 단백질의 프로세싱에서 역할을 하는 것으로 확인되었기 때문에 색소침착에 중요할 수도 있다 (문헌 [L. Rochin, et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 110(26), 10658-10663 (2013)] 참조). 중추 신경계 (CNS) 침투를 갖는 BACE 억제제, 특히 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적인 억제제가 A베타 펩티드-매개 장애, 예컨대 알츠하이머병에 대한 치료를 제공하는 것이 요망된다.
미국 특허 번호 8,158,620은 융합된 아미노디히드로티아진 유도체를 개시하고, 이는 BACE1 억제 활성을 보유하며 추가로 Aβ 펩티드에 의해 유발된 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머 유형 치매에 대한 유용한 치료제로서 개시된다. 또한, 미국 특허 번호 8,338,407은 특정 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머-유형 치매를 치료하는 데 유용한 BACE1 억제 효과를 갖는 특정 융합된 아미노디히드로티아진 유도체를 개시한다.
본 발명은 BACE의 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적인 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 CNS에 침투하는 특정 신규 화합물을 제공한다. 본 발명은, 예를 들어 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적인 억제를 통해, 개선된 부작용 프로파일에 대한 잠재력을 갖는 특정 신규 화합물을 또한 제공한다.
따라서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 I>
Figure 112017079619048-pct00001
또한, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 Ia>
Figure 112017079619048-pct00002
본 발명은 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 추가로 제공한다:
<화학식 II>
Figure 112017079619048-pct00003
여기서 R은 메틸, 에틸 또는 시클로프로필이다.
또한, 본 발명은 화학식 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 IIa>
Figure 112017079619048-pct00004
본 발명은 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료를 필요로 하는 환자에게 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 BACE를 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 BACE를 억제하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질의 BACE-매개 절단을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 아밀로이드 전구체 단백질의 BACE-매개 절단을 억제하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 A베타 펩티드의 생산을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, A베타 펩티드의 생산을 억제하는 방법을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 요법, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행의 치료에 사용하기 위한 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한 게다가, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물의 합성을 위한 신규 중간체 및 방법을 또한 포괄한다.
경도 인지 장애는 임상 제시 및 경도 인지 장애를 나타내는 환자의 시간에 따른 알츠하이머 치매로의 진행에 기초하여 알츠하이머병과 연관된 치매의 잠재적인 전구기로서 정의된 바 있다. (Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). 용어 "경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하는"은 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 억제, 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료하는 것"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 인간을 지칭한다.
용어 "A베타 펩티드의 생산의 억제"는 환자에서 A베타 펩티드의 생체내 수준을 감소시키는 것을 의미하는 것으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은, 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시에, 진단 또는 치료 하에 있는 환자에서 목적하는 효과를 제공하는, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다.
유효량은 공지된 기술을 사용함으로써 및 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자로서의 담당 진단자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자를 위한 유효량을 결정하는 데 있어서, 환자의 종; 그의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 침범된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 침범 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정한 화합물; 투여 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특징; 선택되는 용량 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 담당 진단자에 의해 고려된다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상적으로 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중의 범위 내에 속한다. 일부 경우에 상기 언급된 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 보다 적절할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 보다 큰 용량이 허용되는 부작용을 가지며 사용될 수 있으며, 따라서 상기 투여량 범위는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 경구 및 경피 경로를 포함하는, 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)] 참조).
화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 특히 본 발명의 치료 방법에 유용하지만, 특정 기, 치환기 및 배위가 바람직하다. 하기 단락은 이러한 바람직한 기, 치환기, 및 배위를 기재한다. 이들 바람직한 것은 본 발명의 치료 방법 및 신규 화합물 둘 다에 적용가능한 것으로 이해될 것이다.
따라서, 화학식 I 및 II의 화합물 (여기서 융합된 비시클릭 고리는 시스 배위에 있음) 또는 그의 제약상 허용되는 염이 바람직하다. 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 Ia의 화합물이 아래 반응식 A에 제시된 바와 같이 1 및 2로 표지된 중심에 대해 시스 상대 배위에 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 화학식 Ia의 화합물은 1, 2, 및 3으로 표지된 탄소 원자에 3개의 키랄 중심을 함유하는 코어로 구성된다. 반응식 A에 사용된 넘버링 시스템이 본원에서 화합물을 명명하는 데 사용된 넘버링 시스템과 상응하지 않을 수도 있는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고, 이에 따라, 반응식 A에 사용된 넘버링 시스템은 예시적 목적을 위한 것이다. 화학식 Ia의 3개의 키랄 중심에 대해 바람직한 상대 배위는 반응식 A에 제시된다:
반응식 A
Figure 112017079619048-pct00005
화학식 Ia
본 발명의 추가의 화합물은:
Figure 112017079619048-pct00006
;
N-[3-[(4aS,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드;
N-[3-[(4aSR,5SR,7aSR)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드, 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
본 발명은 모든 개별 거울상이성질체 및 부분입체이성질체뿐만 아니라, 라세미체를 포함하는, 상기 화합물의 거울상이성질체의 혼합물을 고려하지만, 아래에 제시된 바와 같은 절대 배위를 갖는 화합물이 특히 바람직하다:
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 및 그의 제약상 허용되는 염; 및
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 수화물.
또한, N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드가 특히 바람직하다.
또한, N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 말로네이트; 및
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트가 특히 바람직하다.
아래 반응식 B에 도시된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 화합물이 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원에서 본 발명의 화합물의 특정 호변이성질체 중 하나에 대한 임의의 언급이 주어지는 경우에, 이는 두 호변이성질체 형태 및 그의 모든 혼합물을 포괄하는 것으로 이해된다.
반응식 B
Figure 112017079619048-pct00007
추가적으로, 하기 제조예에 기재된 특정 중간체는 1종 이상의 질소 또는 산소 보호기를 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이 보호기는 특정한 반응 조건 및 수행되는 특정한 변환에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).
개별 이성질체, 거울상이성질체, 또는 부분입체이성질체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본 발명의 화합물의 합성에서의 임의의 편리한 지점에서, 방법 예컨대 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피에 의해 분리되거나 분할될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen,"Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조).
본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 염, 예컨대 히드로클로라이드 염은 예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 조건 하에 적합한 용매 예컨대 디에틸 에테르 중에서 본 발명의 화합물의 적절한 유리 염기, 적절한 제약상 허용되는 산 예컨대 염산의 반응에 의해 형성될 수 있다. 추가적으로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호와 동시에 일어날 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); 및 Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)]을 참조한다.
특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "APP"는 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "CDI"는 1,1'-카르보닐디이미다졸을 지칭하고; "cDNA"는 상보적 데옥시리보핵산을 지칭하고; "DCC"는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드를 지칭하고; "데옥소-플루오르(Deoxo-Fluor)®"는 비스(2-메톡시에틸)아미노황 트리플루오라이드를 지칭하고; "DIC"는 1,3-디이소프로필카르보디이미드를 지칭하고; "DMAP"는 4-디메틸아미노피리딘을 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "EBSS"는 얼 평형 염 용액을 지칭하고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "ELISA"는 효소-연결된 면역흡착 검정을 지칭하고; "F12"는 햄 F12 배지를 지칭하고; "FBS"는 태아 소 혈청을 지칭하고; "Fc"는 결정화가능 단편을 지칭하고; "플루오리드(FLUOLEAD)™"는 4-tert-부틸-2,6-디메틸페닐황 트리플루오라이드를 지칭하고; "FRET"는 형광 공명 에너지 전달을 지칭하고; "HATU"는 (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HBTU"는 (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)(디메틸아미노)-N,N-디메틸메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "HF-피리딘"은 히드로겐 플루오라이드 피리딘 또는 올라 시약 또는 폴리(피리딘 플루오라이드)를 지칭하고; "HOAt"는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸을 지칭하고; "HOBT"는 1-히드록실벤조트리아졸 수화물을 지칭하고; "IC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 작용제의 농도를 지칭하고; "IgG1"은 이뮤노글로불린-유사 도메인 Fc-감마 수용체를 지칭하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하고; "PDAPP"는 혈소판 유래의 아밀로이드 전구체 단백질을 지칭하고; "Ph"는 페닐 기를 지칭하고; "PyBOP"는 (벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)를 지칭하고; "PyBrOP"는 브로모-트리스-피롤리디노 포스포늄헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "RFU"는 상대 형광 단위를 지칭하고; "RT-PCR"은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "SDS-PAGE"는 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 지칭하고; "SCX"는 강한 양이온 교환을 지칭하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "T3P®"는 프로필포스폰산 무수물을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "TEMPO"는 (2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-일)옥실을 지칭하고; "TMEM"은 막횡단 단백질을 지칭하고; "트리틸"은 화학식 (Ph)3C- 기를 지칭하고; "엑스탈플루오르-E(XtalFluor-E)® 또는 DAST 디플루오로술피늄 염"은 (디에틸아미노)디플루오로술포늄 테트라플루오로보레이트 또는 N,N-디에틸-S,S-디플루오로술필이미늄 테트라플루오로보레이트를 지칭하고; 및 "엑스탈플루오르-M(XtalFluor-M)® 또는 모르포-DAST 디플루오로술피늄 염"은 디플루오로(모르폴리노)술포늄 테트라플루오로보레이트 또는 디플루오로-4-모르폴리닐술포늄 테트라플루오로보레이트를 지칭한다.
용어 "토실레이트", "톨루엔술폰산", "p-톨루엔술폰산", 및 "4-메틸벤젠 술폰산"은 하기 구조의 화합물을 지칭하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다:
Figure 112017079619048-pct00008
.
본 발명의 화합물 또는 그의 염은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 그 중 일부는 아래 반응식, 제조예, 및 실시예에 예시되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기재된 각 경로에 대한 특정한 합성 단계가 상이한 방식으로 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다는 것을 인지한다. 아래 반응식에서의 각 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 포함하는, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 아래 반응식에서, 달리 나타내지 않는 한 모든 치환기는, 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다. 하기 반응식, 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.
반응식 1
Figure 112017079619048-pct00009
반응식 1, 단계 A에서, 트리메틸술포늄 아이오다이드를 유기 염기, 예컨대 n-부틸리튬으로 약 -50℃의 온도에서 용매, 예컨대 THF 중에서 처리한다. 적합한 보호기, 예컨대 트리틸 기로 보호되는 보호된 옥시메틸 옥시란을 이어서 염기성 용액에 -10℃에서 첨가하고 약 2시간 동안 교반되도록 하여 반응식 1, 단계 A의 보호된 생성물을 수득한다. "PG"는 아미노 기 또는 산소 기를 위해 개발된 보호기 예컨대 카르바메이트, 아미드 또는 에테르이다. 이러한 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지 및 인지되어 있다. 단계 A의 보호된 생성물을 용매 예컨대 톨루엔 및 수성 무기 염기 예컨대 수산화나트륨 중에서 테트라-N-부틸암모늄 술페이트 또는 다른 4급 암모늄 염 상 이동 촉매를 사용하여 α-할로에스테르 예컨대 tert-부톡시 브로모아세테이트와 대략 실온에서 반응시켜 반응식 1, 단계 B의 화합물을 수득한다. 이러한 알킬화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적으로 염기 예컨대 오일 중 60% 수소화나트륨을 용매 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 또는 THF와 0 내지 100℃ 범위의 온도에서 사용하여 단계 B의 보호된 생성물을 수득할 수 있다. tert-부톡시 카르보닐 아세테이트를 2-단계 절차를 걸쳐 옥심으로 전환시킨다. 환원제 예컨대 헥산 중 이소부틸알루미늄 히드라이드를 약 -70℃의 온도에서 적가하고 이어서 수성 산 예컨대 염산을 약 -60℃의 온도에서 적가한다. 후처리를 유기 추출로 달성하여 중간체 물질을 수득한다. 이 물질을 유기 용매 예컨대 디클로로메탄 중에 용해시키고 아세트산나트륨에 이어 히드록실아민 히드로클로라이드로 처리하여 단계 C의 옥심 생성물을 수득한다. 반응식 1, 단계 C의 옥심 생성물을 차아염소산나트륨 또는 대안적 산화제 예컨대 N-클로로숙신이미드의 수용액을 사용하는 것과 같은 여러 방법에 의해 용매 예컨대 tert-부틸 메틸 에테르, 톨루엔, 디클로로메탄 또는 크실렌 중에서 약 10-15℃의 온도에서 또는 가열하면서 3+2 고리화시켜 단계 D의 비시클릭 4,5-디히드로이속사졸 생성물로 전환시킬 수 있다. 2-플루오로, 5-브로모 페닐 기를 디히드로이속사졸에 유기금속 시약을 생성함으로써 첨가할 수 있다. 유기금속 시약은 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도-벤젠으로부터 시약 예컨대 n-부틸리튬 또는 이소프로필마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 착물과의 할로겐-금속 교환 및 약 -78℃ 내지 15℃ 범위의 온도에서 용매 예컨대 THF 중에서의 적가를 사용하여 생성할 수 있다. 루이스 산 예컨대 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트를 이어서 첨가하여 반응식 1, 단계 E의 생성물을 수득한다. 생성된 비시클릭 테트라히드로이속사졸을 아세트산 중에서 아연으로 처리하여 반응식 1, 단계 F의 개환 생성물을 형성시킬 수 있다. 이속사졸 고리를 개방하는 대안적 방법은 극성 용매 예컨대 에탄올 중에서 라니 니켈을 수소화 조건을 갖는 압력 하에 사용한다. 단계 F의 생성물을 이어서 용매 예컨대 디클로로메탄 또는 THF 중에서 벤조일 이소티오시아네이트와 약 5℃ 내지 실온의 온도에서 반응시켜 단계 G의 티오우레아 화합물을 수득할 수 있다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 및 유기 염기 예컨대 피리딘을 용매 예컨대 디클로로메탄 중에서 약 -20℃의 온도에서 사용하여 티아진 고리를 형성시켜 단계 H의 생성물을 수득할 수 있다. 반응식 1, 단계 I에서 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 예컨대 실온에서 포름산을 사용하거나 또는 용매 예컨대 디클로로메탄 및 메탄올 중에서 p-톨루엔술폰산 1수화물을 사용하여 히드록시메틸 보호기 예컨대 트리틸 기를 제거하여 단계 I의 화합물을 수득할 수 있다. 산화제 예컨대 2-아이오독시벤조산 (IBX)을 0-22℃의 온도에서 용매 예컨대 DMSO 중에서 사용하거나 또는 약 5-25℃의 온도에서 교반하면서 용매 예컨대 아세토니트릴 또는 아세토니트릴 및 물 중에서 (디아세톡시아이오도)벤젠을 조금씩 또는 모두 한번에 첨가하여 히드록시 메틸을 카르복실산으로 산화시켜 반응식 1, 단계 J의 화합물을 수득할 수 있다. TEMPO를 또한 산화에서 촉매로서 사용할 수 있다. 웨인렙 아미드를 반응식 1, 단계 K에서 단계 J의 산 생성물로부터 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드, 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민, 및 커플링 시약 예컨대 HATU의 첨가에 의해 제조한다. 혼합물을 실온에서 교반하여 단계 K의 생성물을 수득한다. 사용할 수 있는 다른 커플링제는 CDI, 카르보디이미드 예컨대 DCC, DIC, 또는 EDCI 또는 비-친핵성 음이온의 다른 우로늄 또는 포스포늄 염, 예컨대 HBTU, PyBOP, 및 PyBrOP를 포함한다. 이어서 단계 L에서 용매 예컨대 THF 중에서 유기금속 시약 예컨대 그리냐르 시약 또는 유기리튬 시약을 사용하여 케톤으로 웨인렙 아미드를 전환시킨다. 적절한 그리냐르 시약을 용매 예컨대 에테르 또는 2-메틸테트라히드로푸란 중 용액으로서 웨인렙 아미드에 약 -78℃ 내지 0℃의 온도에서 첨가하여 단계 L의 케톤을 수득할 수 있다. 반응식 1, 단계 M에서, 용매 예컨대 디클로로메탄 중에서 데옥소-플루오르®를 약 -78℃ 내지 실온에서 사용하여 단계 L의 화합물의 R 및 케톤 기를 디플루오로-R 기로 전환시킬 수 있다. 또 다른 대안적 절차는 플루오린화 시약 예컨대 데옥소-플루오르®를 보론 트리플루오라이드-디에틸 에테레이트와 예비-혼합하고 이어서 반응식 1, 단계 L의 생성물 및 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 첨가하여 반응식 1, 단계 M의 생성물을 수득하는 것을 수반한다. 대안적으로, 관련 기술분야에 널리 공지된 사용할 수 있는 다른 플루오린화제는, 디에틸아미노황 트리플루오라이드 (또한 "DAST"로 지칭됨), 첨가제 예컨대 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 사용하는 엑스탈플루오르-E® 또는 엑스탈플루오르-M® 또는 첨가제 예컨대 HF-피리딘을 사용하는 플루오리드™이다. 용매 예컨대 에탄올 중에서 (1R,2R)-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 또는 트랜스-N,N'디메틸시클로헥산-1,2-디아민을 사용하고 아지드화나트륨에 이어 L-아스코르브산나트륨 및 황산제2구리를 첨가하여 페닐의 5-브로모를 아민으로 전환시킨다. 반응물을 약 80-100℃로 수시간 동안 가열하고 이어서 용매 예컨대 에틸 아세테이트를 사용하여 추출함으로써 후처리한다. 이어서 용매 예컨대 메탄올 또는 에탄올 및 THF 중에서 탄소 상 팔라듐 예컨대 5-10% 팔라듐을 약 40-50 psi의 수소의 압력에서 사용하여 수소화 조건 하에 중간체를 환원시켜 반응식 1, 단계 N의 아닐린 생성물을 수득한다.
반응식 2
Figure 112017079619048-pct00010
대안적으로 반응식 2에서, 반응식 1, 단계 A의 보호된 생성물을 용매 예컨대 톨루엔 중에서 4-(2-클로로아세틸)모르폴리노 및 염기 예컨대 테트라부틸 암모늄 히드로겐 술페이트로 약 5℃의 온도에서 처리하여 반응식 2, 단계 A의 생성물을 수득할 수 있다. 모르폴리노 기는 이어서 반응식 2, 단계 B에서 이탈기로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 반응식 2, 단계 A의 생성물을 이소프로필 마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 착물 및 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도벤젠으로부터 계내에서 제조할 수 있는 적절한 그리냐르 시약으로 처리하거나 또는 적절한 그리냐르 시약이 이용가능하다면, 시약을 직접적으로 반응식 2, 단계 A의 생성물에 약 5℃의 온도에서 첨가하여 반응식 2, 단계 B의 생성물을 수득할 수 있다. 카르보닐 아세테이트를 히드록실아민 히드로클로라이드 및 아세트산나트륨을 사용하여 약 50℃로 가열하면서 옥심으로 전환시켜 반응식 2, 단계 C의 생성물을 수득할 수 있다. 반응식 2, 단계 C의 옥심 생성물은 이어서 용매 예컨대 톨루엔 중에서 히드로퀴논을 사용하고 환류 하에 가열하여 반응식 2, 단계 D의 생성물 (반응식 1, 단계 E와 동일한 생성물)로 전환시킬 수 있다. 반응식 2, 단계 D의 아민 생성물은 유기 염기 예컨대 DMAP 및 피리딘을 용매 예컨대 디클로로메탄 중에서 약 0-5℃의 온도에서 사용하여 아세틸 클로라이드로 아실화시켜 반응식 2, 단계 E의 생성물을 수득할 수 있다. 반응식 2, 단계 E의 생성물은 이어서 아래에 논의되는 바와 같이 반응식 3, 단계 A의 생성물로 전환시킬 수 있다.
반응식 3
Figure 112017079619048-pct00011
대안적 경로에서, 반응식 3에 기재된 바와 같이, 반응식 1, 단계 E의 화합물의 이속사졸 질소를 아세틸 기로 보호하고 히드록시 메틸의 보호기를 2-단계 절차에서 제거한다. 예를 들어, 테트라히드로이속사졸을 유기 염기 예컨대 DMAP 및 피리딘으로 용매 예컨대 디클로로메탄 중에서 처리하고 아세틸 클로라이드를 첨가한다. 온도를 약 10℃ 아래로 유지하고 이어서 대략 실온에서 교반되도록 한다. 반응물을 물로 희석하고 용매 예컨대 디클로로메탄으로 추출한다. 유기 추출물을 수성 산 예컨대 1 N 염산으로 세척하고 수성부를 용매 예컨대 디클로로메탄에 이어 수성 세척으로 다시 추출한다. 유기 용매를 부분적으로 제거할 수 있고 산 예컨대 포름산 또는 p-톨루엔술폰산 1수화물을 용매 예컨대 디클로로메탄 및 메탄올 중에서 첨가하여 히드록시 메틸을 탈보호시킬 수 있다. 혼합물을 히드록시의 탈보호가 완료될 때까지 실온에서 교반하거나 약 40℃의 온도로 가열하여 반응식 3, 단계 A의 화합물을 수득할 수 있다. 반응식 3, 단계 A의 히드록시 메틸 생성물을 반응식 1, 단계 J에 기재된 절차와 유사한 방식으로 반응식 3, 단계 B의 카르복실산 생성물로 산화시킬 수 있고, 웨인렙 아미드를 반응식 1, 단계 K에 기재된 절차와 유사한 방식으로 커플링제 예컨대 CDI를 조금씩 첨가하여 사용하거나 또는 용매 예컨대 디클로로메탄과 한 번에 첨가하고, -20℃로 냉각시키고, 약 1시간 동안 교반하고 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드를 조금씩 또는 모두 한 번에 첨가하여 추가로 제조할 수 있다. 유기 염기 예컨대 트리에틸아민을 또한 사용하여 반응을 촉진시킬 수 있다. CDI 및 N,O-디메틸히드록실아민의 추가의 첨가를 완전한 반응이 관찰될 때까지 첨가하여 반응식 3, 단계 C의 웨인렙 아미드 생성물을 수득할 수 있다. 반응식 3, 단계 D의 케톤을 웨인렙 아미드로부터 반응식 1, 단계 L에 기재된 절차와 유사한 방식으로 형성시킬 수 있다. 단계 D의 케톤을 반응식 1, 단계 M에 기재된 절차와 유사한 방식으로 디플루오로-R 기로 전환시켜 반응식 3, 단계 E의 생성물을 수득할 수 있다. 아세틸 테트라히드로이속사졸을 관련 기술분야에 널리 공지된 산성 조건 하에 예컨대 염산을 사용하고 약 100℃로 가열하여 탈보호시킴으로써 반응식 3, 단계 F의 생성물을 수득할 수 있다. 비시클릭 테트라히드로이속사졸을 반응식 1, 단계 F에 기재된 절차와 유사한 방식으로 아세트산 중에서 아연으로 처리하여 반응식 3, 단계 G의 개환 생성물을 형성시킬 수 있다. 반응식 3, 단계 H의 티아진 생성물을 반응식 1, 단계 G에 기재된 절차와 유사한 방식으로 벤조일 이소티오시아네이트를 사용하여 원 포트 2 단계 반응에서 제조할 수 있다. 혼합물을 잔류물로 증발시키고 시클로헥산을 첨가한다. 혼합물을 약 60℃로 가열하고 메틸 tert-부틸 에테르를 첨가하여 잔류물을 용해시킨다. 용액을 여과하고 농축 건조시킨다. 이어서 반응식 1, 단계 H에 기재된 절차와 유사한 방식으로 티아진 고리를 형성시켜 반응식 3, 단계 H의 생성물을 수득할 수 있다.
반응식 4
Figure 112017079619048-pct00012
반응식 4, 단계 A에서, 반응식 1, 단계 N의 아닐린 생성물을 관련 기술분야에 널리 공지된 커플링 조건을 이용하여 헤테로방향족 카르복실산과 커플링시킬 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 카르복실산 및 아민의 반응으로부터 발생하는 아미드 형성을 위한 다수의 방법 및 시약이 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 커플링 시약 및 아민 염기 예컨대 디이소프로필에틸아민 또는 트리에틸아민의 존재 하에 적절한 산과의 적절한 아닐린의 반응은, 반응식 4, 단계 A의 화합물을 제공할 것이다. 커플링 시약은 카르보디이미드 예컨대 DCC, DIC, EDCI, 및 방향족 옥심 예컨대 HOBt 및 HOAt를 포함한다. 추가적으로, 비-친핵성 음이온의 우로늄 또는 포스포늄 염 예컨대 HBTU, HATU, PyBOP, 및 PyBrOP 또는 시클릭 인산 무수물 예컨대 T3P®를 보다 전통적인 커플링 시약 대신에 사용할 수 있다. 첨가제 예컨대 DMAP를 사용하여 반응을 증진시킬 수 있다. 대안적으로, 치환된 벤조일 클로라이드를 염기 예컨대 트리에틸아민 또는 피리딘의 존재 하에 사용하여 아닐린 아민을 아실화시킬 수 있다. 반응식 4, 단계 B에서, 보호된 티아진 아민을 이어서 유기 염기 예컨대 피리딘 및 O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드로 용매 예컨대 THF 및 에탄올 및 유기 염기 예컨대 피리딘 중에서 탈보호시켜 화학식 II의 화합물을 제공할 수 있다. 대안적으로 무기 염기 예컨대 메탄올 중 수산화리튬을 사용하여 티아진을 탈보호시킴으로써 화학식 II의 화합물을 제공할 수 있다.
반응식 5
Figure 112017079619048-pct00013
대안적으로, 반응식 5에서, 트리플루오로아세트아미드, 아이오딘화구리, 디아민 예컨대 트랜스, 라세미-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산 디아민, 무기 염기 예컨대 탄산칼륨, 및 아이오딘화나트륨을 사용하여 약 100-130℃로 가열하면서 반응식 1, 단계 M의 브로마이드 생성물을 보호된 아닐린으로 전환시켜 반응식 5, 단계 A의 보호된 아닐린 생성물을 수득한다. 보호된 아닐린 및 티아진 아민은 이어서 단계적 탈보호시킬 수 있다. 염기 예컨대 7 N 암모니아를 메탄올 중에서 사용하여 트리플루오로아세트아미드를 가수분해시켜 반응식 1, 단계 N의 동일한 생성물인 보호된 티아진과 아닐린을 수득할 수 있다. 이어서 관련 기술분야에 널리 공지되고 반응식 4, 단계 B에 기재된 조건 하에 용매 예컨대 에탄올 및 THF 중에서 O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드를 유기 염기 예컨대 피리딘과 함께 사용하고 이어서 약 55℃로 가열하거나 실온에서 교반하고 이어서 농축 및 정제하여 티아진을 탈보호시켜 반응식 5, 단계 B의 생성물을 수득할 수 있다. 대안적으로, 탈보호의 순서는 먼저 티아진이 탈보호되고 마지막에 아닐린이 탈보호되도록 역전될 수 있다. 반응식 5, 단계 C에서, 단계 B의 아닐린 생성물을 이어서 반응식 4, 단계 A에 기재된 바와 같이 적절한 카르복실산 또는 산 클로라이드와 반응시켜 화학식 II의 생성물을 수득할 수 있다.
본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 염, 예컨대 히드로클로라이드 염은, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 조건 하에 적합한 용매 예컨대 디에틸 에테르 중에서 화학식 I, Ia, II, 또는 IIa의 적절한 유리 염기와 적절한 제약상 허용되는 산 예컨대 염산, p-톨루엔술폰산, 또는 말론산을 반응시킴으로써, 형성될 수 있다. 추가적으로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호 시에 동시에 일어날 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되고 인지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,"]을 참조한다.
하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.
제조예 1
(2S)-1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올
Figure 112017079619048-pct00014
반응식 1, 단계 A: THF (1264 mL) 중 트리메틸술포늄 아이오다이드 (193.5 g, 948.2 mmol)를 주위 온도에서 75분 동안 교반하였다. 혼합물을 -50℃로 냉각시키고 n-부틸리튬 (헥산 중 2.5 mol/L, 379 mL, 948.2 mmol)을 캐뉼라를 통해, 30분의 기간에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 서서히 -30℃로 가온되도록 하고 60분 동안 교반하였다. 온도를 -10℃ 아래로 유지하면서, (2S)-2-트리틸옥시메틸 옥시란 (100 g, 316.1 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 완전한 첨가 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 염화암모늄에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 메틸 t-부틸 에테르: 헥산 (10-15% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 표제 화합물 (56.22 g, 54%)을 수득하였다. ES/MS m/z 353 (M+Na).
대안적 제조예 1
(2S)-1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올
반응식 2, 단계 A 출발 물질: 트리페닐메틸 클로라이드 (287 g, 947.1 mmol), DMAP (7.71 g, 63.1 mmol) 및 트리에틸아민 (140 g, 1383.5 mmol)을 디클로로메탄 (850 mL) 중 (2S)-부트-2-엔-1,2-디올 (문헌 [JACS, 1999, 121, 8649]에서와 같이 제조됨) (64.5 g, 631 mmol)의 용액에 첨가하였다. 24시간 동안 24℃에서 교반하였다. 1 N 수성 시트르산 (425 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 추출물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 메탄올 (900 mL)을 첨가하고 5℃로 1시간 동안 냉각시켰다. 여과에 의해 고체를 수집하고 5℃ 메탄올 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 폐기하고 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 톨루엔 (800 mL)을 첨가하고 268 g의 질량으로 농축시켜 톨루엔의 48 wt% 용액 중 표제 화합물 (129 g, 67%)을 수득하였다.
제조예 2
1-모르폴리노-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논
Figure 112017079619048-pct00015
반응식 2, 단계 A: 테트라부틸 암모늄 히드로겐 술페이트 (83.2 g, 245.0 mmol) 및 4-(2-클로로아세틸)모르폴린 (638.50 g, 3902.7 mmol)을 0 내지 5℃인 톨루엔 (5800 mL) 중 1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올 (832.4, 2519 mmol)의 용액에 첨가하였다. 물 (1041 mL) 중 수산화나트륨 (1008.0 g, 25202 mmol)을 첨가하였다. 19시간 동안 0 내지 5℃에서 교반하였다. 물 (2500 mL) 및 톨루엔 (2500 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 추출물을 물 (2 × 3500 mL)로 세척하였다. 유기 추출물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 톨루엔 (2500 mL)을 잔류물에 첨가하고 이어서 n-헵탄 (7500 mL)을 천천히 첨가하였다. 16시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고 n-헵탄 (1200 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (1075.7 g, 98%)을 수득하였다.
제조예 3
1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논
Figure 112017079619048-pct00016
반응식 2, 단계 B: THF 중 이소프로필 마그네슘 클로라이드 리튬 클로라이드 착물 (3079 mL, 2000 mmol)의 1.3 M 용액을 톨루엔 (2500 mL) 중 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도벤젠 (673.2 g, 2237.5 mmol)의 용액에 반응 온도를 5℃ 아래로 유지하는 속도로 첨가하였다. 1시간 동안 교반하였다. 생성된 그리냐르 용액 (5150 mL)을 톨루엔 (5000 mL) 중 1-모르폴리노-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 (500 g, 1093 mmol)의 용액에 반응 온도를 5℃ 아래로 유지하는 속도로 첨가하였다. 온도를 5℃ 아래로 유지하면서 3시간 동안 교반하였다. 추가의 제조된 그리냐르 용액 (429 mL)을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 1 N 수성 시트르산 용액 (5000 mL)을 온도를 5℃ 아래로 유지하는 속도로 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 추출물을 물 (5000 mL)로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 메탄올 (2000 mL)을 잔류물에 첨가하고 농축시켜 표제 화합물을 잔류물 (793 g, 73.4% 효력, 83%)로서 수득하였다.
제조예 4
1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 옥심
Figure 112017079619048-pct00017
반응식 2, 단계 C: 히드록실아민 히드로클로라이드 (98.3 g)를 메탄올 (3800 mL) 중 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 (450 g, 707 mmol) 및 아세트산나트륨 (174 g)에 첨가하였다. 용액을 50℃로 2시간 동안 가열하였다. 24℃로 냉각시키고 농축시켰다. 물 (1000 mL) 및 톨루엔 (1500 mL)을 잔류물에 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 상을 톨루엔 (500 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 물 (2 × 400 mL)로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 잔류물 (567 g, 61.4% 효력, 88%)로서 수득하였다.
제조예 5
tert-부틸 2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세테이트
Figure 112017079619048-pct00018
반응식 1, 단계 B: (2S)-1-트리틸옥시부트-3-엔-2-올 (74.67 g, 226.0 mmol)을 톨루엔 (376 mL) 중 테트라-N-부틸암모늄 술페이트 (13.26 g, 22.6 mmol)의 용액에 첨가하였다. 물 (119 mL) 중 수산화나트륨 (50 질량%)에 이어 tert-부틸-2-브로모아세테이트 (110.20 g, 565.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 물에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (77.86 g, 77%)을 수득하였다. ES/MS m/z 467 (M+Na).
제조예 6
(1E)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세트알데히드 옥심
Figure 112017079619048-pct00019
반응식 1, 단계 C: 디클로로메탄 (582.2 mL) 중 tert-부틸 2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세테이트 (77.66 g, 174.7 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 헥산 중 디이소부틸알루미늄 히드라이드의 용액 (1 mol/L, 174.7 mL)을 35분의 기간에 걸쳐 적가하고 온도를 -70℃ 아래로 유지하였다. -78℃에서 5시간 동안 교반하였다. 온도를 -60℃ 아래로 유지하면서, 물 중 염산 (2 mol/L, 192.1 mL)을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응물을 서서히 주위 온도로 가온되도록 하고 60분 동안 교반하였다. 유기 추출물을 분리하고 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 아세트산나트륨 (28.66 g, 349.3 mmol)에 이어 히드록실아민 히드로클로라이드 (18.21 g, 262.0 mmol)를 첨가하였다. 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 물에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (68.38 g, 101%)을 수득하였다. ES/MS m/z 386 (M-H).
제조예 7
(3aR,4S)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸
Figure 112017079619048-pct00020
반응식 1, 단계 D: tert-부틸 메틸 에테르 (717 mL) 중 (1E)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]아세트알데히드 옥심 (55.57 g, 143.4 mmol)의 용액을 5℃로 냉각시켰다. 온도를 10℃ 아래로 유지하면서, 차아염소산나트륨 (물 중 5%, 591 mL, 430.2 mmol)을 적가하였다. 10℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 15℃로 가온되도록 하였다. 15℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 상을 분리하고, 유기 상을 5% 소듐 히드로겐 술파이트 용액 및 염수로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 50% 메틸 tert-부틸 에테르/디클로로메탄: 헥산 (20-27% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (35.84 g, 65%)을 수득하였다. ES/MS m/z 408 (M+Na).
제조예 8
(3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸
Figure 112017079619048-pct00021
반응식 1, 단계 E: THF (144.5 mL) 및 톨루엔 (1445 mL) 중 4-브로모-1-플루오로-2-아이오도-벤젠 (86.94 g, 288.9 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 온도를 -70℃ 아래로 유지하면서, n-부틸리튬 (헥산 중 2.5 M, 120 mL, 288.9 mmol)을 적가하였다. 30분 동안 -78℃에서 교반하였다. 온도를 -70℃ 아래로 유지하면서, 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트 (36.5 mL, 288.9 mmol)를 적가하였다. 용액을 30분 동안 -78℃에서 교반하였다. 온도를 -65℃ 아래로 유지하면서, THF (482 mL) 중 (3aR,4S)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (55.69 g, 144.5 mmol)의 용액을 반응물에, 30분의 기간에 걸쳐 적가하였다. -78℃에서 90분 동안 교반하였다. 온도를 -60℃ 아래로 유지하면서, 포화 염화암모늄을 급속하게 첨가하였다. 염수에 붓고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 10-15% 디에틸 에테르:헥산 (0-70% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (36.52 g, 45%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 560/562 [M+H].
대안적 제조예 8
반응식 2, 단계 D: 톨루엔 (4000 mL) 중 1-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-[(1S)-1-(트리틸옥시메틸)알릴옥시]에타논 옥심 (458 g, 502 mmol) 및 히드로퀴논 (56.3g 511 mmol)의 용액을 환류 하에 질소 하에 27시간 동안 가열하였다. 용액을 24℃로 냉각시키고 수성 탄산나트륨 (800 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 상을 톨루엔 (300 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 물 (2 × 500 mL)로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 이소프로필 알콜 (1500 mL)을 첨가하고 환류 하에 가열하였다. 24℃로 냉각시키고 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (212 g, 75%)을 수득하였다.
제조예 9
1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논
Figure 112017079619048-pct00022
반응식 2, 단계 E: 내부 온도를 5℃ 아래로 유지하면서, 아세틸 클로라이드 (35.56 g, 503.9 mmol)를 디클로로메탄 (720 mL) 중 (3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (235.3 g, 420 mmol), DMAP (5.13 g, 42.0 mmol), 및 피리딘 (66.45 g, 840.1 mmol)의 용액에 질소 하에 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 이어서 물 (300 mL) 및 1 M 황산 (300 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고 층이 분리되도록 하였다. 유기 추출물을 수집하고 포화 탄산나트륨 (500 mL) 및 물 (500 mL)로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (235 g, 93%)을 회색 고체로서 수득하였다.
제조예 10
1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(히드록시메틸)테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-1-일]에타논
Figure 112017079619048-pct00023
반응식 3, 단계 A: 20 L 재킷 반응기에서 내부 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 아세틸 클로라이드 (290 mL, 4075 mmol)를 디클로로메탄 (10 L) 중 (3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (1996 g, 3384 mmol), DMAP (56.0 g, 458 mmol), 피리딘 (500 mL, 6180 mmol)의 용액에 질소 하에 첨가하였다. 완전한 첨가 (1시간) 후 20℃로 가온하고 밤새 교반하였다. 반응이 불완전하다면, 아세틸 클로라이드, DMAP, 피리딘, 및 디클로로메탄을 완전한 반응이 관찰될 때까지 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 물 (5 L)을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 10℃에서 30분 동안 교반하고 층이 분리되도록 하였다. 유기 추출물을 수집하고 수성부를 디클로로메탄 (1 L)으로 세척하였다. 합한 유기 추출물을 1 N 수성 염산 (2 × 4 L)으로 세척하고, 수성부를 디클로로메탄 (2 × 1 L)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 (4 L)로 세척하고 용매를 감압 하에 제거하고 대략 5 L의 총 부피를 수득하였다. 90% 포름산 (1800 mL)을 첨가하고 주위 온도에서 3일 동안 정치시켰다. 40℃로 2시간 동안 가온하고 이어서 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올 (4 L)로 희석하고 포화 수성 탄산나트륨 (3 L)을 천천히 첨가하였다. 고체 탄산나트륨 (375 g)을 첨가하여 pH를 8-9로 조정하였다. 45℃에서 1시간 동안 교반하고 이어서 주위 온도로 냉각시켰다. 메탄올 (4 × 500 mL)로 세척하며 고체를 여과에 의해 제거하고, 이어서 2 N 수성 수산화나트륨 (100 mL)으로 처리하고 주위 온도에서 1시간 동안 정치시켰다. 메탄올 (2 × 100 mL)로 세척하며, 고체를 여과에 의해 제거하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 (5 L) 및 물 (2 L) 사이에 분배하였다. 수성부를 에틸 아세테이트 (2 L)로 추출하고 합한 유기 추출물을 염수 (2 × 1 L)로 세척하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 메틸 tert-부틸 에테르 (2.5 L)를 첨가하고 증발 건조시켰다. 메틸 tert-부틸 에테르 (4 L)를 첨가하고 65℃에서 1시간 동안 교반하고 주위 온도로 냉각시키고 메틸 tert-부틸 에테르 (3 × 500 mL)로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 진공 하에 베이지색 고체로 건조시켰다. 톨루엔 (7.5 L) 중 이 고체가 110℃로 완전히 용해될 때까지 가열하고, 18℃로 1시간에 걸쳐 냉각시키고, 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 40℃로 가온하고 침전물이 형성되면, 18℃로 1회 더 냉각시켰다. 45분 동안 교반하고 이어서 톨루엔 (2 × 500 mL)으로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (443.1 g, 36%, LCMS에 의한 95% 순도)을 수득하였다. 여과물을 진공 하에 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 20%-100% 에틸 아세테이트/이소헥산으로 용리하는, 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (2 L) 중 분획을 함유하는 생성물을 60℃에서 30분 동안 슬러리화하고, 주위 온도로 냉각시키고, 메틸 tert-부틸 에테르 (2 × 200 mL)로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 베이지색 결정질 고체 (304 g, 24%, LCMS에 의한 88% 순도)로서 수득하였다. 여과물을 진공 하에 잔류물로 증발시켰다. 잔류물을 20%-100% 에틸 아세테이트/이소헥산으로 용리하는, 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (57.8 g, 5%, LCMS에 의한 88% 순도)을 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 360.0/362.0 [M+H].
대안적 제조예 10
반응식 3, 단계 A: 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (69 g, 114.5 mmol)을 p-톨루엔술포산 1수화물 (2.2 g, 11.45 mmol), 디클로로메탄 (280 mL) 및 메탄올 (700 mL)의 15℃ 용액에 첨가하였다. 18시간 동안 교반하고 이어서 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (350 mL)으로 희석하고 1 M 수성 탄산나트륨 (140 mL) 및 물 (140 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 층을 감압 하에 증발시켰다. 톨루엔 (350 mL)을 잔류물에 첨가하고 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 10-15℃로 10℃/시간의 속도로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 톨루엔 (70 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (30 g, 65%)을 회색 고체로서 수득하였다.
제조예 11
(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-카르복실산
Figure 112017079619048-pct00024
반응식 3, 단계 B: 20 L 재킷 반응기에서 물 (2 L)을 아세토니트릴 (4.5 L) 중 1-[(4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (804.9 g, 2177 mmol), TEMPO (40.0 g, 251 mmol)의 현탁액에 첨가하고 5℃의 내부 온도로 냉각시켰다. (디아세톡시아이오도)벤젠 (1693 g, 4993.43 mmol)을 조금씩 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응기 냉각을 사용하여 발열을 제어하고 이어서 20℃에서 LCMS가 완전한 반응을 나타낼 때까지 유지하였다. 내부 온도를 25℃ 아래로 유지하면서, 물 (300 mL) 중 중아황산나트륨 (70 g, 672.68 mmol)의 현탁액을 주위 온도에서 천천히 첨가하였다. 30분 동안 교반하고 이어서 5℃로 냉각시켰다. 물 (2 L)을 첨가하고, 이어서 내부 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 47 wt% 수성 수산화나트륨 (780 mL)을 1시간의 기간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (2 L) 및 이소헥산 (5 L)을 첨가하고, 격렬히 교반하고 층을 분리하였다. 2상 유기 층을 물 (1 L)로 추출하고 합한 수성부를 메틸 tert-부틸 에테르 (2.5L)로 세척하였다. 수성 추출물을 5℃로 냉각시키고 내부 온도를 약 5℃로 유지하면서 37% 염산 (1.4 L)을 30분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (5 L)를 첨가하고, 층을 분리하고 유기부를 염수 (3 × 1 L)로 세척하였다. 합한 수성 추출물을 에틸 아세테이트 (2.5 L)로 추출하고, 합한 유기부를 염수 (1 L)로 세척하고, 이어서 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 유기부를 헵탄 (2.5 L)으로 희석하고 감압 하에 증발 건조시켰다. 메틸 tert-부틸 에테르 (1.5 L) 및 헵탄 (1.5 L)을 첨가하고 증발 건조시켰다. 헵탄 (2.5 L)을 첨가하고 2회 증발 건조시켰다. 헵탄 (500 mL) 및 메틸 tert-부틸 에테르 (500 mL)를 첨가하고 40℃에서 30분 동안 교반하고 이어서 헵탄/메틸 tert-부틸 에테르 (1:1, 1 L)에 이어 메틸 tert-부틸 에테르 (3 × 300 mL)로 세척하며, 침전물을 여과에 의해 수집하고 공기 건조시켜 표제 화합물을 베이지색 결정질 고체 (779 g, 91%)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 374.0/376.0 [M+H].
[α]D 20 = -19.0 ° (C=1.004, 클로로포름).
대안적 제조예 11
반응식 3, 단계 B: 물 (150 mL) 및 아세토니트릴 (150 mL)을 1-[(4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-1-일]에타논 (30 g, 73.3 mmol), TEMPO (1.14 g, 7.30 mmol) 및 (디아세톡시아이오도)벤젠 (51.9 g, 161 mmol)에 첨가하였다. 15℃로 냉각시키고 2시간 동안 교반하였다. 물 (150 mL) 중 티오황산나트륨 (21 g) 및 탄산칼륨 (22 g)을 주위 온도에서 천천히 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 이어서 메틸 tert-부틸 에테르 (150 mL)를 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층의 pH를 2-3으로 진한 황산을 사용하여 조정하였다. 에틸 아세테이트 (150 mL)를 첨가하고 층을 분리하였다. 유기 층을 감압 하에 증발 건조시켰다. n-헵탄 (90 mL)을 첨가하고 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 15℃로 냉각시키고 이어서 n-헵탄 (90 mL)으로 세척하며, 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (27 g, 98%)로서 수득하였다.
제조예 12
(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-N-메톡시-N-메틸테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-4-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00025
반응식 3, 단계 C: 10 L 재킷 반응기에서, 디클로로메탄 (7.0 L) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-카르복실산 (771 g, 2019 mmol)의 용액을 0℃로 질소 하에 냉각시키고 CDI (400 g, 2421 mmol)를 조금씩 40분에 걸쳐 첨가하였다. 반응기 재킷을 -20℃로 냉각시키고 1시간 동안 교반하고 이어서 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (260.0 g, 2612 mmol)를 조금씩 약 30분에 걸쳐 첨가하였다. -20℃에서 1시간 동안, 0℃에서 2시간 동안, 및 10℃에서 7시간 동안 교반하였다. CDI (175 g, 1058 mmol)를 첨가하고 10℃에서 밤새 교반하였다. 추가의 CDI (180 g, 1088 mmol)를 10℃에서 첨가하고 1시간 동안 교반하고 이어서 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (140 g, 1407 mmol)를 첨가하고 10℃에서 교반을 계속하였다. 반응이 불완전하다면, CDI에 이어 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드를 완전한 반응이 관찰될 때까지 추가로 충전시킬 수 있다. 반응 혼합물을 5℃로 냉각시키고 1 N 수성 염산 (5 L)에 이어 2 N 수성 염산 (5 L)으로 세척하였다. 합한 수용액을 디클로로메탄 (1 L)으로 추출하고, 유기 추출물을 합하고 물 (2.5 L), 1 N 수성 수산화나트륨 (2.5 L), 및 물 (2.5 L)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (3 L)를 첨가하고 감압 하에 증발시켰다. 추가의 메틸 tert-부틸 에테르 (2 L)를 첨가하고 50℃에서 1시간 동안 교반하고, 25℃로 냉각시키고 30분 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 메틸 tert-부틸 에테르 (2 × 500 mL)로 세척하고 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (760 g, 88%)을 백색 고체로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 417.0/419.0 [M+H].
대안적 제조예 12
반응식 3, 단계 C: N,N-디메틸포름아미드 (135 mL) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-카르복실산 (27g, 70.7 mmol)의 용액을 0℃로 질소 하에 냉각시키고 CDI (14.9 g, 91.9 mmol)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 이어서 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (9.0 g, 92 mmol) 및 트리에틸아민 (14.3 g, 141 mmol)을 첨가하였다. 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 0.5 M 수성 황산 (675 mL)을 첨가하였다. 1시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 메틸 tert-부틸 에테르 (90 mL) 중에서 1시간 동안 슬러리화하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 메틸 tert-부틸 에테르 (30 mL)로 세척하였다. 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (23 g, 78%)을 고체로서 수득하였다.
제조예 13
1-[(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-일]에타논
Figure 112017079619048-pct00026
반응식 3, 단계 D: 20 L 재킷 반응기에서, THF (10 L) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-N-메톡시-N-메틸테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-4-카르복스아미드 (654.0 g, 1536 mmol)의 용액을 -60℃로 냉각시키고 내부 온도를 -40℃ 아래로 유지하면서, 2-메틸테트라히드로푸란 (660 mL, 2110 mmol) 중 메틸마그네슘 브로마이드의 3.2 M 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 -40℃에서 30분 동안 교반하고 이어서 -50℃로 냉각시키고 내부 온도를 -38℃ 아래로 유지하면서 THF (2 L) 중 1 N 수성 염산 (2 L)의 용액을 첨가하였다. 온도를 10℃로 증가시키고 에틸 아세테이트 (5 L) 및 물 (1 L)을 첨가하고, 교반하고 내부 온도가 5℃에 도달하도록 하고 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (1 L)로 추출하고 유기 추출물을 합하였다. 유기 추출물을 물 (2 L)로 세척하고 수성 층을 에틸 아세테이트 (1 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 염수 (3 × 2 L)로 세척하고 이어서 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 잔류물로 증발시켰다. 시클로헥산 (2.5 L)을 첨가하고, 60℃에서 1시간 동안 이어서 20℃에서 30분 동안 교반하고, 시클로헥산 (500 mL)으로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (565 g, 99%)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 372.0/374.0 [M+H], [α]D 20 = -58.0 ° (C=1.000, 클로로포름).
대안적 제조예 13
반응식 3, 단계 D: THF (60 mL) 중 (3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-N-메톡시-N-메틸테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-4-카르복스아미드 (4.0 g, 9.59 mmol)의 용액을 -5℃로 냉각시키고 내부 온도를 -5 내지 0℃로 유지하면서, 2-메틸테트라히드로푸란 (5.0 mL, 15 mmol) 중 메틸마그네슘 브로마이드의 3.0 M 용액을 적가하였다. 반응 혼합물 -5 내지 0℃에서 60분 동안 교반하고 이어서 포화 염화암모늄 (20 mL)의 용액을 첨가하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (40 mL)를 첨가하고, 내부 온도가 5℃에 도달하도록 하고 층을 분리하였다. 유기 층을 감압 하에 잔류물로 증발시켰다. n-헵탄 (50 mL)을 첨가하고, 교반하고, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 고체 (3.0 g, 77%)로서 수득하였다.
제조예 14
1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-1-일]에타논
Figure 112017079619048-pct00027
반응식 3, 단계 E: 1-[(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-일]에타논 (5.08 g, 13.6 mmol)을 단일 부분으로 무수 디클로로메탄 (100 mL) 중 엑스탈플루오르-M® (10.02 g, 39.18 mmol)의 교반 현탁액에 0-5℃에서 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (4.5 mL, 27 mmol)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 8시간 동안 교반하고 이어서 주위 온도로 가온하고 밤새 교반하였다. 포화 수성 탄산나트륨 (100 mL)을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 층을 분리하고 수성부를 디클로로메탄 (2 × 50 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 포화 수성 중탄산나트륨 (100 mL), 2 N 수성 염산 (2 × 100 mL), 및 염수 (100 mL)로 세척하였다. 담갈색 고체로 증발 건조시키고 메틸 tert-부틸 에테르 (300 mL) 중에 60℃에서 용해시켰다. 고온 용액을 여과하고 여과물을 증발시켜 갈색 고체 (5.3 g, 81%, LCMS에 의한 82% 순도)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 393.8/395.8 [M+H].
대안적 제조예 14
반응식 3, 단계 E: 엑스탈플루오르-M® (1.21 kg, 4.73 mol)을 여러 부분으로 무수 디클로로메탄 (5 L) 중 1-[(3aR,4S,6aS)-1-아세틸-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸-4-일]에타논 (565 g, 1.51 mol)의 교반 용액에 -14℃에서 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (550 g, 3.34 mol)를 20분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 -10℃에서 대략 10시간 동안 교반하고 이어서 주위 온도로 가온하고 밤새 교반하였다. 내부 온도를 10℃ 아래로 유지하면서, 50% 수성 수산화나트륨 (750 mL)을 천천히 첨가하고, 이어서 물 (1.5 L) 및 포화 수성 탄산수소나트륨 (1 L)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 층을 분리하고 수성부를 디클로로메탄 (1 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 염수 (3 L), 2 N 수성 염산 (5 L), 및 염수 (3 L)로 세척하였다. 증발시켜 잔류물을 수득하고 50-100% 디클로로메탄/이소-헥산에 이어 10% 메틸 tert-부틸 에테르/디클로로메탄으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 분말 (467 g, 73%, LCMS에 의한 94% 순도)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 393.8/395.8 [M+H].
제조예 15
(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-푸로[3,4-c]이속사졸
Figure 112017079619048-pct00028
반응식 3, 단계 F: 10 L 재킷 반응기에서 37 wt% 수성 염산 (1.3 L, 16 mol)을 1,4-디옥산 (5 L) 중 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로-1H,3H-푸로[3,4-c][1,2]옥사졸-1-일]에타논 (570 g, 1.45 mol)의 용액에 첨가하고 100℃에서 대략 3시간 동안 또는 LCMS가 완전한 반응을 나타낼 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고, 물 (1 L)로 희석하고 내부 온도를 20℃ 아래로 유지하면서, 50 wt% 수성 수산화나트륨 용액 (800 mL) 및 물 (1 L)의 혼합물을 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (2.5 L)를 첨가하고 격렬히 교반한 후에, 층을 분리하고 유기 상을 염수 (2 L), 추가의 염수 (1 L), 및 물 (1 L)로 세척하였다. 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축 건조시켜 잔류물을 수득하였다. 시클로헥산 (2.5 L)을 첨가하고 증발 건조시키고 이어서 반복하여 표제 화합물을 갈색 오일 (527 g, 89%, LCMS에 의한 86% 순도)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 351.8/353.8 [M+H].
제조예 16
[(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올
Figure 112017079619048-pct00029
반응식 3, 단계 G: 아연 분말 (6.0 g, 92 mmol)을 아세트산 (100 mL) 중 (3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-푸로[3,4-c]이속사졸 (5.06 g, 13.4 mmol)의 용액에 주위 온도에서 첨가하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL) 및 물 (300 mL)로 희석하고 탄산나트륨 (97 g, 915 mmol)을 첨가하면서 격렬히 교반하였다. 층을 분리하고 유기 층을 염수 (2 × 200 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 0%-100% 메틸 tert-부틸 에테르/이소헥산으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 왁스상 고체 (4.67 g, 89%, LCMS에 의한 90% 순도)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 354.0/356.0 [M+H].
대안적 제조예 16
반응식 3, 단계 G: 아연 분말 (200 g, 3.06 mol)을 조금씩 아세트산 (2 L) 및 물 (2 L) 중 (3aR,4S,6aS)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(1,1-디플루오로에틸)-3,3a,4,6-테트라히드로-1H-푸로[3,4-c]이속사졸 (304 g, 75% 순도, 647 mmol)의 용액에 20℃에서 첨가하고 이어서 40℃로 가온하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 물 (2 L)로 희석하고 탄산나트륨 (4 kg, 43.4 mol)을 첨가하면서 격렬히 교반하고 이어서 pH 8-9로 추가의 탄산나트륨을 사용하여 조정하였다. 에틸 아세테이트 (5 L) 및 물 (2.5 L)을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 2:1 아세토니트릴/물로 세척하며 규조토를 통해 여과하였다. 층을 분리하고, 수성부를 에틸 아세테이트 (2 × 2.5 L)로 추출하고 합한 유기 추출물을 염수 (2 × 2.5 L)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 SFC, 칼럼: 키랄팩 AD-H (5), 50 × 250 mm; 용리액: 12% 에탄올 (0.2% 디에틸메틸아민)/CO2; 유량: UV 220 nm에서 340 g/분에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (197.7 g, 84%)로서 수득하였다. [α]D 20 = -6.93 ° (C=0.678, 클로로포름). ES/MS: m/z (79Br/81Br) 354.0/356.0 [M+H].
제조예 17
[(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-(트리틸옥시메틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올
Figure 112017079619048-pct00030
반응식 1, 단계 F: (3aR,4S,6aR)-6a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(트리틸옥시메틸)-3,3a,4,6-테트라히드로푸로[3,4-c]이속사졸 (31.30 g, 55.9 mmol)을 아세트산 (186 mL)에 첨가하여 현탁액을 수득하였다. 아연 (25.6 g, 391 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 18시간 동안 격렬히 교반하였다. 혼합물을 톨루엔으로 희석하고 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 가용화시키고, 염수, 및 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 상을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (31.35 g, 99%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 562/564 [M+H].
제조예 18
N-[[(3S,4R,5S)-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)-5-(트리틸옥시메틸)테트라히드로푸란-3-일]카르바모티오일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00031
반응식 1, 단계 G: [(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-2-(트리틸옥시메틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올 (31.35 g, 55.73 mmol)을 디클로로메탄 (557 mL) 중에 용해시키고 5℃로 냉각시켰다. 벤조일 이소티오시아네이트 (9.74 mL, 72.45 mmol)를 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고 2시간 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (42.95 g, 106%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 747/749 [M+Na].
제조예 19
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00032
반응식 3, 단계 H: LCMS가 반응이 완료되었음을 나타날 때까지 벤조일 이소티오시아네이트 (1.80 mL, 13.3 mmol)를 디클로로메탄 (20 mL) 중 [(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올 (4.67 g, 11.9 mmol)의 용액에 주위 온도에서 1시간 동안 첨가하였다. 반응 혼합물을 잔류물로 진공 하에 증발시켰다. 시클로헥산 (50 mL)을 첨가하고, 60℃로 가온하고 침전물이 완전히 용해될 때까지 메틸 tert-부틸 에테르를 첨가하였다 (100 mL). 고온 용액을 여과하고, 실온으로 냉각시키고 감압 하에 백색 침전물이 형성될 때까지 천천히 증발시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고 잔류물을 무수 디클로로메탄 (30 mL) 중에 용해시키고, 피리딘 (2.4 mL, 30 mmol)을 첨가하고, 용액을 -25℃로 냉각시켰다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (2.2 mL 13 mmol)을 30분에 걸쳐 적가하고 0℃로 1시간에 걸쳐 가온되도록 하였다. 반응 혼합물을 물 (25 mL), 2 N 수성 염산 (25 mL), 물 (25 mL), 수성 포화 중탄산나트륨 (25 mL), 및 물 (25 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 5% 메틸 tert-부틸 에테르/디클로로메탄으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 담황색 발포체 (5.0 g, 76%, LCMS에 의한 90 % 순도)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 499.0/501.0 [M+H].
대안적 제조예 19
반응식 3, 단계 H: 벤조일 이소티오시아네이트 (98 mL, 724.9 mmol)를 디클로로메탄 (1.2 L) 중 [(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2-(1,1-디플루오로에틸)테트라히드로푸란-3-일]메탄올 (197.6 g, 546.7 mmol)의 용액에 30℃에서 1시간 동안 첨가하였다. CDI (101 g, 610.4 mmol)를 첨가하고 주위 온도에서 3시간 동안 교반하였다. CDI를 추가로 충전시켜 티오우레아 중간체의 완전한 소모를 확실하게 할 수 있다. 90℃로 42시간 동안 가열하고 용액을 주위 온도로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 L)로 희석하고 2 N 수성 염산 (2 L)을 첨가하고, 교반하고, 염수 (1 L)를 첨가하고 층을 분리하였다. 유기 층을 2 N 수성 염산 (0.5 L), 염수 (2 × 1 L) 및 수성 포화 중탄산나트륨 (1 L)으로 세척하였다. 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 0-100% 에틸 아세테이트/이소헥산으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 담황색 고체 (234 g, 83%)로서 수득하였다. ES/MS: m/z (79Br/81Br) 499.0/501.0 [M+H].
제조예 20
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(트리틸옥시메틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00033
반응식 1, 단계 H: N-[[(3S,4R,5S)-3-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4-(히드록시메틸)-5-(트리틸옥시메틸)테트라히드로푸란-3-일]카르바모티오일]벤즈아미드 (42.95 g, 59.18 mmol)를 디클로로메탄 (591 mL) 중에 용해시키고 -20℃로 냉각시켰다. 피리딘 (12.0 mL, 148.0 mmol)에 이어, 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (10.97 mL, 65.10 mmol)을 첨가하였다. 온도를 -20℃ 아래로 유지하면서 첨가를 모니터링하였다. 반응 혼합물을 -20℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하였다. 포화 염화암모늄에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (45.24 g, 108%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 707/709 [M+H].
제조예 21
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(히드록시메틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00034
반응식 1, 단계 I: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(트리틸옥시메틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (45.24, 63.93 mmol)를 포름산 (160 mL) 중에 용해시키고 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (29 mL)을 5분의 기간에 걸쳐 첨가하였다. 50분 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 메탄올 (639 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (26.7 mL, 191.8 mmol)을 첨가하고, 밤새 주위 온도에서 교반하였다. 염수에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 클로로포름으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 아세톤: 헥산 (25-38% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (16.04 g, 54%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 465/467 [M+H].
제조예 22
(4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-5-카르복실산
Figure 112017079619048-pct00035
반응식 1, 단계 J: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(히드록시메틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (16.04 g, 34.47 mmol)를 DMSO (172 mL)에 첨가하였다. 2-아이오독시벤조산 (35.56 g, 120.70 mmol)을 첨가하고 주위 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 클로로포름 (300 mL)으로 희석하고 포화 염화암모늄 (400 mL)에 부었다. 유기 상을 분리하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (400 mL) 중에 용해시키고 포화 염화암모늄 (2 × 250 mL)으로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 디클로로메탄: 메탄올 혼합물 중에 용해시키고 디에틸 에테르를 고체가 침전될 때까지 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고 감압 하에 건조시켜 표제 화합물 (5.78 g, 35%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 479/481 [M+H].
제조예 23
(4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-N-메톡시-N-메틸-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-5-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00036
반응식 1, 단계 K: (4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-5-카르복실산 (5.78 g, 12.1 mmol)을 디클로로메탄 (201 mL) 및 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (1.76 g, 18.1 mmol) 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 (5.29 mL, 36.2 mmol)에 이어 HATU (7.02 g, 18.1 mmol)를 첨가하였다. 주위 온도에서 3일 동안 교반하였다. 포화 염화암모늄에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트:디클로로메탄 (0-50% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (4.15 g, 66%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 522/524 [M+H].
제조예 24
N-[(4aS,5S,7aS)-5-아세틸-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00037
반응식 1, 단계 L: 메틸마그네슘 브로마이드 (디에틸 에테르 중 3.0 mol/L, 4.8 mL, 14.5 mmol)를 THF (57.8 mL) 중 (4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-N-메톡시-N-메틸-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-5-카르복스아미드 (1.51 g, 2.89 mmol)의 -78℃ 용액에 적가하였다. 반응물을 -78℃에서 5분 동안 교반하고 서서히 주위 온도로 가온되도록 하였다. 30분 동안 교반하였다. 반응물을 메탄올 (4 mL)로 켄칭하고, 포화 염화암모늄으로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 헥산 (0-100% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.28 g, 93%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 477/479 [M+Na].
제조예 24b
N-[(5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-프로파노일-4a,5,7,7A-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00038
반응식 1, 단계 L: (4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-N-메톡시-N-메틸-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-5-카르복스아미드 (3.00 g, 5.74 mmol)를 THF (115 mL)에 질소 하에 첨가하고 -78℃로 냉각시켰다. 온도를 -78℃에서 유지하면서, THF (28.7 mL, 28.7 mmol) 중 에틸마그네슘 브로마이드 (1.0 mol/L)의 용액을 반응물에 적가하였다. 1시간 후에, 메탄올 (10 mL)을 1 부분으로 첨가하고 이어서 포화 염화암모늄 용액에 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트 (100-40% 구배)로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (2.844 g, 5.788 mmol, 100%)을 수득하였다. ES/MS m/z (79Br/81Br) 491/493/513/515 (M+H/Na).
제조예 24c
N-[(5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(시클로프로필카르보닐)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00039
반응식 1, 단계 L: 시클로프로필마그네슘 브로마이드 (2-메틸테트라히드로푸란 중 1.0 mol/L, 14 mL, 14.4 mmol)를 THF (51.2 mL) 중 (4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-N-메톡시-N-메틸-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-5-카르복스아미드 (1.51 g, 2.89 mmol)의 -78℃ 용액에 적가하였다. 반응물을 -78℃에서 5분 동안 교반하고 서서히 주위 온도로 가온되도록 하였다. 30분 동안 교반하였다. 반응물을 메탄올 (4 mL)로 켄칭하고, 포화 염화암모늄으로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 헥산 (0-100% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.299 g, 89%)을 수득하였다. ES/MS m/z (79Br/81Br) 503/505 [M+H].
제조예 25
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00040
반응식 1, 단계 M: 디클로로메탄 (34 mL), 데옥소-플루오르® (1.52 mL, 6.88 mmol), 및 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트 (0.89 mL, 6.88 mmol)를 함께 첨가하였다. 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. N-[(4aS,5S,7aS)-5-아세틸-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.821 g, 1.72 mmol)를 1 부분으로, 이어서 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (1.13 mL, 6.88 mmol)를 첨가하였다. 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 포화 염화암모늄에 붓고, 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 디클로로메탄: 헥산 (80-100% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (0.552 g, 64%)을 수득하였다. ES/MS m/e (79Br/81Br) 499/501 [M+H].
제조예 25b
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로프로필)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00041
반응식 1, 단계 M: N-[(5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-프로파노일-4a,5,7,7A-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.486 g, 0.989 mmol)를 디클로로메탄 (19.8 mL)에 질소 하에 -78℃에서, 이어서 데옥소-플루오르® (1.75 g, 1.75 mL, 3.96 mmol)를 첨가하였다. 30분 동안 -78℃에서 교반하고 이어서 실온으로 밤새 가온하였다. 반응물을 포화 중탄산나트륨 용액에 붓고 디클로로메탄으로 추출하였다. 소수성 프릿을 사용하여 유기부를 분리하고 진공 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트 (100-50% 구배)로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 조 표제 화합물을 불순물 (0.230 g, 0.448 mmol, 45%)과 함께 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS m/z 513/515 (M+H).
제조예 25c
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00042
반응식 1, 단계 M: 데옥소-플루오르® (1.9 mL, 6.68 mmol)를 디클로로메탄 (24 mL) 중 N-[(5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(시클로프로필카르보닐)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.812 g, 1.61 mmol)의 주위 용액에 첨가하였다. 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨에 붓고 수성 상을 에틸 아세테이트 (3×)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 헥산 (5-100% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (41 mg, 5%)을 수득하였다. ES/MS m/z (79Br/81Br) 525/527 [M+H].
제조예 26
N-[(5S,7aS)-5-(1,1-디플루오로에틸)-7a-{2-플루오로-5-[(트리플루오로아세틸)아미노]페닐}-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00043
반응식 4, 단계 A: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (234 g, 454.6 mmol)를 1,4-디옥산 (2 L) 중에 용해시키고 4 Å 분자체 (37 g), 2,2,2-트리플루오로아세트아미드 (91 g, 780.9 mmol), 미분 탄산칼륨 (114 g, 824.9 mmol), 아이오딘화나트륨 (117 g, 780.6 mmol), 아이오딘화구리 (I) (17.5 g, 91.9 mmol) 및 라세미 트랜스-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산 디아민 (20 g, 140.6 mmol)을 질소의 스트림 하에 첨가하였다. 용기를 3 진공 질소 스위치로 퍼징하고 123℃로 18시간 동안 가열하였다. 주위 온도로 냉각시키고 용액을 규조토를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 포화 수성 염화암모늄 (2 L)을 첨가하고 격렬히 45분 동안 교반하였다. 층을 분리하고 유기 층을 포화 수성 염화암모늄 (3 × 1 L), 염수 (300 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 0-100% 에틸 아세테이트/이소-헥산으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 담황색 고체 (297.9 g, 95%, 81% 순도)로서 수득하였다. ES/MS: m/z 532.0 [M+H].
제조예 27
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00044
반응식 1, 단계 N: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.372 g, 0.74 mmol) 및 (1R,2R)-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 (0.037 mL, 0.22 mmol)을 에탄올 (30 ml) 중에서 합하였다. 아지드화나트륨 (0.194 g, 2.98 mmol)에 이어, L-아스코르브산나트륨 (0.66 M 용액, 0.50 ml, 0.33 mmol)을 첨가하였다. 플라스크의 상부를 질소로 퍼징하고 황산제2구리 (0.33 M 용액, 0.68 ml, 0.22 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하고 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 냉각시키고 냉수를 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에탄올 (50 ml) 및 THF (10 ml) 중에서 팔라듐 (탄소 상 10 질량%, 0.35 g, 0.16 mmol)과 합하였다. 혼합물을 질소 및 수소로 퍼징하였다. 주위 온도에서 50 psi의 수소 하에 1시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 디클로로메탄 (0-20% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (0.2184 g, 67%)을 수득하였다. ES/MS m/z 436 (M+H).
대안적 제조예 27
반응식 4, 단계 B: 메탄올 (600 mL, 4.2 mol) 중 7 N 암모니아를 메탄올 (200 mL) 중 N-[(5S,7aS)-5-(1,1-디플루오로에틸)-7a-{2-플루오로-5-[(트리플루오로아세틸)아미노]페닐}-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (250 g, 80% 순도, 376.3 mmol)의 교반 현탁액에 실온에서 첨가하고 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 건조 증발시켜 표제 화합물을 갈색 검 (190 g, 375.2 mmol, 86% 순도)으로서 수득하였다. ES/MS: m/z 436.0 [M+H].
제조예 27b
(4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로프로필)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민
Figure 112017079619048-pct00045
반응식 1, 단계 N: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로프로필)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.567 g, 1.104 mmol), 1,4-디옥산 (4.802 mL) 및 에탄올 (11.04 mL)에 이어, 아지드화나트륨 (0.2154 g, 3.313 mmol), 트랜스-N,N'-디메틸시클로헥산-1,2-디아민 (0.04760 g, 0.0528 mL, 0.3313 mmol), L-아스코르브산나트륨 0.66 M (0.74 g, 0.74 mL, 0.4859 mmol) 및 물 (0.1699 mL)을 함께 첨가하였다. 최종적으로 황산제2구리 0.33 M (0.74 g, 0.74 mL, 0.2430 mmol)을 첨가하고 100℃로 가열하였다. 밤새 90℃에서 교반하였다. 추가의 황산제2구리 0.33 M (0.74 g, 0.74 mL, 0.2430 mmol), L-아스코르브산나트륨 0.66 M (0.74 g, 0.74 mL, 0.4859 mmol), 아지드화나트륨 (0.2154 g, 3.313 mmol) 및 트랜스-N,N'-디메틸시클로헥산-1,2-디아민 (0.04760 g, 0.0528 mL, 0.3313 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 100℃에서 1시간 동안 가열하고, 이어서 실온으로 냉각시켰다. 반응물을 염수에 붓고 생성물을 클로로포름으로 추출하였다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고 유기부를 분리하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 물질을 린들라 촉매 (0.113 g, 0.0533 mmol) 중 팔라듐 (5 질량%)을 갖는 파르 플라스크로 옮기고, 메탄올 (55.22 mL)을 질소 하에 첨가하였다. 276 kPa 수소 압력 하에 격렬히 진탕시키면서 3시간 동안 수소화시켰다. 추가의 린들라 촉매 (0.113 g, 0.0533 mmol) 중 팔라듐 (5 질량%)을 첨가하고 345 kPa 수소 압력 하에 추가의 4시간 동안 수소화시켰다. 반응물을 규조토를 통해 여과하고 클로로포름으로 세척하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고 이어서 메탄올 (55.22 mL)에 이어 수산화리튬 수화물 (0.4634 g, 0.182 mL, 11.04 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃로 3시간 동안 가열하고 이어서 실온으로 냉각시켰다. 반응물을 염수에 붓고 클로로포름으로 추출하였다. 유기부를 메탄올로 희석하고, SCX-2 카트리지에 부었다. 카트리지를 1 칼럼 부피의 메탄올로 플러싱하고 폐기하였다. 이어서 SCX-2 카트리지를 1 칼럼 부피의 7 M 메탄올성 암모니아로 플러싱하고 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (0.290 g, 0.840 mmol, 76%)을 수득하였다. ES/MS m/z 346 (M+H).
제조예 27c
N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드
Figure 112017079619048-pct00046
반응식 1, 단계 N: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-브로모-2-플루오로-페닐)-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (31 mg, 0.059 mmol) 및 (1R,2R)-N,N'-디메틸-1,2-시클로헥산디아민 (0.0049 mL, 0.030 mmol)을 에탄올 (3 ml) 중에서 합하였다. 아지드화나트륨 (31 mg, 0.47 mmol)에 이어 L-아스코르브산나트륨 (0.66 M 용액, 0.089 ml, 0.059 mmol)을 첨가하였다. 플라스크의 상부를 질소로 퍼징하고 황산제2구리 (0.33 M 용액, 0.18 ml, 0.059 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하고 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 냉각시키고 냉수를 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에탄올 (20 ml) 및 THF (5 ml) 중에서 팔라듐 (탄소 상 10 질량%, 30 mg, 0.014 mmol)과 합하였다. 혼합물을 질소 및 수소로 퍼징하였다. 주위 온도에서 40 psi에서의 수소 하에 4시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 헥산 (0-100% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (21 mg, 77%)을 수득하였다. ES/MS m/z 462 (M+H).
제조예 28
(4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민
Figure 112017079619048-pct00047
반응식 4, 단계 B: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (216.4 g, 88% 순도, 435.9 mmol)를 피리딘 (400 mL), 에탄올 (100 mL) 및 THF (300 mL) 중에 용해시켰다. O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (190 g, 2275.0 mmol)를 첨가하고 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 2-메틸테트라히드로푸란 (1 L)으로 희석하고 물 (2 × 300 mL)로 세척하였다. 유기 층을 단리하고 35% 수성 수산화암모늄 (100 mL)을 수성부에 첨가하였다. 2-메틸테트라히드로푸란 (300 mL)으로 추출하고 이어서 염화나트륨으로 포화시키고 2-메틸테트라히드로푸란 (2 × 300 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수 (300 mL)로 세척하고 잔류물로 증발시켰다. 메탄올 (200 mL) 중에 용해시키고, 메탄올 중 7 N 암모니아 (100 mL, 700 mmol)를 첨가하고 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 임의의 트리플루오르아세트아미드 불순물이 남아있다면 추가의 암모니아를 첨가할 수 있다. 용매를 감압 하에 제거하고 잔류물을 수성 2 N 수성 염산 (1.5 L) 중에 용해시켰다. 디클로로메탄 (6 × 500 mL)으로 추출하고, 유기 층을 합하고 용매를 감압 하에 약 1 L의 총 부피로 제거하였다. 2 N 수성 염산 (300 mL)으로 세척하고 모든 수성 세척물을 합하였다. 2-메틸테트라히드로푸란 (1 L)을 첨가하고 중탄산나트륨을 사용하여 pH를 염기성으로 조정하면서 기체 발생이 관찰되지 않을 때까지 격렬히 교반하였다. 층을 분리하고 수성부를 2-메틸테트라히드로푸란 (2 × 500 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 갈색 고체를 수득하였다. 잔류물을 0-100% 디클로로메탄/THF로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 에틸 아세테이트/헵탄으로 증발시켜 표제 화합물을 미세 베이지색 분말 (106 g, 70%, 95% 순도)로서 수득하였다. ES/MS: m/z 332.0 [M+H], [α]D 20 = +42.11 ° (C= 0.532, 클로로포름).
제조예 29
5-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복실산
Figure 112017079619048-pct00048
N,N-디메틸포름아미드 (1 L) 중 메틸 5-클로로피라진-2-카르복실레이트 (124 g, 718.55 mmol), 1H-1,2,4-트리아졸 (198.5 g, 2874.2 mmol) 및 탄산칼륨 (297.92 g, 2155.6 mmol)의 혼합물을 100℃에서 15시간 동안 교반하였다. 주위 온도로 냉각시키고 물 (2 L)에 부었다. 용액의 pH를 2-3으로 진한 수성 염산 (약 500 mL)을 사용하여 조정하고 30분 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고 물로 세척하였다. 물 (500 mL) 및 에탄올 (500 mL)을 첨가하고, 50-60℃로 4시간 동안 가열하고, 주위 온도로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 진공 하에 40℃에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다. ES/MS: m/z 190.0 (M-H).
제조예 30
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00049
반응식 3, 단계 A: N-[(4as,5s,7as)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (0.139 g, 0.32 mmol), 5-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복실산 (0.0852 g, 0.45 mmol), 및 HOAt (0.0575 g, 0.41 mmol)를 디클로로메탄 (4 ml): 디메틸포름아미드 (1 mL) 중에서 함께 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (0.11 mL, 0.63 mmol)을 용액에 첨가하고 이어서 EDCI (0.079 g, 0.41 mmol)를 1 부분으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 및 염수로 세척하고, 상을 분리하였다. 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 디클로로메탄 (0-30% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (0.1140 g, 59%)을 수득하였다. ES/MS m/z 609 (M+H).
제조예 30a
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00050
반응식 3, 단계 A: N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로-페닐)-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-일]벤즈아미드 (21 mg, 0.045 mmol), 5-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복실산 (10 mg, 0.054 mmol), 및 HOBT (10 mg, 0.059 mmol)를 디클로로메탄 (2.5 ml): 디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중에서 함께 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (0.016 mL, 0.091 mmol)을 용액에 첨가하고 이어서 EDCI (11 mg, 0.059 mmol)를 1 부분으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 용액을 에틸 아세테이트, 물, 및 1 N NaOH (0.5 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트 (3×)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트: 디클로로메탄 (0-100% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (20 mg, 69%)을 수득하였다. ES/MS m/z 635 (M+H).
실시예 1
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00051
반응식 3, 단계 B: THF (2 mL) 및 에탄올 (2 mL) 중 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 (0.1148 g, 0.189 mmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (0.1575 g, 1.886 mmol), 및 피리딘 (0.15 ml, 1.886 mmol)의 혼합물을 45℃에서 5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 2일 동안 교반하였다. 용액을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 7 N NH3/메탄올: 디클로로메탄 (0-3% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (0.086 g, 90%)을 수득하였다. ES/MS m/z 505 (M+H).
대안적 제조 실시예 1
반응식 4 단계 D: 에틸 아세테이트 (1 L) 중 (4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로에틸)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (96.5 g, 291 mmol)을 질소 분위기 하에 50°C에서 교반하고 5-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복실산 (84 g, 439.45 mmol)을 따뜻한 용액에 천천히 첨가하였다. 10분 동안 교반하고 T3P® (에틸 아세테이트 중 1.67 M, 350 mL, 585 mmol)를 첨가하고 50℃에서 17시간 동안 교반하였다. 주위 온도로 냉각시키고, 디클로로메탄 (1 L)으로 희석하고 물 중 탄산나트륨 (128 g, 1 L 중 1.21 mol)의 용액으로 켄칭하면서 교반하였다. 디클로로메탄 (1 L) 및 물 (2 L)로 희석하고 격렬히 1시간 동안 교반하였다. 규조토를 통해 여과하고 디클로로메탄 (3 × 500 mL), 메탄올 (500 mL), 물 (500 mL), 수성 포화 중탄산나트륨 (500 mL), 및 1:1의 메탄올:디클로로메탄 (6 × 500 mL)으로 세척하였다. 층을 분리하고 수성부를 디클로로메탄 (3 × 1 L)으로 추출하였다. 모든 유기 상을 합하고 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 디클로로메탄 (1 L) 중 잔류물을 15분 동안 초음파처리하고 디클로로메탄 (5 × 200 mL)으로 세척하며 고체를 여과에 의해 수집하였다. pH 8을 수득할 때까지 포화 수성 탄산수소나트륨을 첨가하고 디클로로메탄 (1 L) 및 메탄올 (500 mL)과 격렬히 교반하였다. 고체를 여과에 의해 제거하고 여과물을 디클로로메탄 (2 × 500 mL)으로 추출하였다. 고체를 디클로로메탄:메탄올 (1:1, 500 mL)로 용해시키고 이 용액을 다른 유기 상과 합하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 디클로로메탄을 첨가하여 용액을 유지하고 이어서 약 300 mL의 최종 부피가 수득되면, 용액을 5%의 0.3 M 암모니아/메탄올 / 디클로로메탄으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 담갈색 고체를 수득하였다. 고체를 고온 에탄올 (2.5 L) 중에 용해시키고, 고온 중에서 여과하고, 주위 온도로 1시간에 걸쳐 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 에탄올 (2 × 250 mL)로 세척하고 진공 하에 건조시켰다. 여과물을 증발 건조시키고 먼저 65% 에틸 아세테이트/50:1 이소-헥산 / 7 N 암모니아/메탄올 이어서 50:1 에틸 아세테이트 / 7 N 암모니아/메탄올로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 필요하다면, 추가 정제를 SFC, 칼럼: 키랄팩 AD-H (5 μ), 50 × 250 mm; 용리액: 35% 이소프로판올 (0.2% 디에틸메틸아민)/CO2; 유량: UV 220 nm에서 300 g/분에 의해 완료할 수 있다. 증발 및 진공 건조 후, 물질을 에탄올 (1.5 L) 중에서 슬러리화하고 완만하게 가온 (36 에서 45℃)시키면서 20분 동안 교반하였다. 에탄올 (100 mL)로 세척하며 고체를 여과에 의해 수집하였다. 추가 물질은 여과물로부터 회수할 수 있고; 증발 건조시키고, 에탄올 중에서 환류시키고, 고체를 고온 여과에 의해 제거하고 이어서 여과물을 주위 온도로 냉각시켰다. 에탄올로 세척하며, 고체를 여과에 의해 수집하고 상기 여과로부터 수득한 물질과 합하였다. 합한 고체를 진공 하에 40℃에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (103.3 g, 68%, 2.5 wt% 에탄올 함유)로서 수득하였다. ES/MS m/z 505.0 (M+H), [α]D 20 = +149.4 ° (C= 1, 클로로포름).
실시예 1A
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트
Figure 112017079619048-pct00052
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 (600 mg, 1.189 mmol)를 아세톤 (9 mL) 및 물 (1 mL) 중에 용해시켰다. 생성된 현탁액을 60℃로 가열하였다. 아세톤 (1 mL) 중에 용해시킨 p-톨루엔술폰산 1수화물 (420 mg, 2.208 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 60℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 진공에 의해 여과하고 아세톤 (1 mL)으로 세척하고 밤새 공기 건조시켜 표제 화합물 (743 mg, 73%)을 수득하였다.
X-선 분말 회절 (XRD)
결정질 고체의 XRD 패턴을 CuKa 공급원 λ = 1.54060 Å 및 반텍(Vantec) 검출기가 구비되어 있으며, 35 kV 및 50 mA에서 작동하는 브루커 D4 엔데버(Bruker D4 Endeavor) X-선 분말 회절계 상에서 수득한다. 샘플을 0.009°(2θ)의 스텝 크기, 0.5초/스텝의 스캔 속도로, 0.6 mm 발산, 5.28 고정된 산란방지, 및 9.5 mm 검출기 슬릿으로 4 내지 40°(2θ)를 스캔한다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고, 평활면을 유리 슬라이드를 사용하여 수득한다. 결정 형태 회절 패턴을 주위 온도 및 상대 습도에서 수집한다. 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 회절 피크의 상대 강도가 요인 예컨대 결정 형태 및 습성으로부터 생성된 바람직한 배향으로 인해 달라질 수 있다는 것은 결정학 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 또한, 임의의 주어진 결정 형태의 경우에 각도 피크 위치는 약간 달라질 수 있다는 것이 결정학 기술분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도에서의 변동, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동할 수 있다. 본 경우에, ± 0.2 (2θ)의 피크 위치 변동성은 나타낸 결정 형태의 명백한 확인을 방해하지 않으면서 이러한 잠재적 변동을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 구별되는 피크 (° 2θ의 단위), 전형적으로 보다 우세한 피크의 임의의 고유한 조합에 기초하여 수행될 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집한 결정 형태 회절 패턴을 8.853 및 26.774 도 2-세타에서의 NIST 675 표준 피크에 기초하여 조정하였다.
결정질 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트의 제조된 샘플은 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 아래 표에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 패턴은 17.3°에서의 피크를 14.8, 12.7, 및 4.9로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 함께 함유하며; 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차를 갖는다.
<표 1> 실시예 1A의 X-선 분말 회절 피크.
Figure 112017079619048-pct00053
실시예 1B
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 말로네이트
Figure 112017079619048-pct00054
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 (201 mg, 0.398 mmol) 및 말론산 (104 mg, 0.999 mmol)을 95% 에탄올-물 (15 mL) 중에서 함께 첨가하였다. 투명한 용액이 수득될 때까지 혼합물을 65℃에서 교반하였다. 몇 분 후에 농후한 백색 고체가 침전되었다. 현탁액을 1시간 동안 55℃에서 교반하고 이어서 교반하면서 실온으로 냉각시켰다. 고체를 진공 하에 여과하고 2일 동안 공기 건조시켜 표제 화합물 (477 mg, 80%)을 수득하였다.
결정질 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 말로네이트의 제조된 샘플은 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 아래 표 2에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 패턴은 22.7에서의 피크를 16.8, 17.2, 및 24.0으로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 함께 함유하며; 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차를 갖는다.
<표 2> 실시예 1B의 X-선 분말 회절 피크.
Figure 112017079619048-pct00055
실시예 1C
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 수화물
Figure 112017079619048-pct00056
1:1 THF:물 (2 mL) 중 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 (116 mg, 0.23mmol)를 70℃에서 현탁시켰다. 용액을 적어도 2일 동안 교반하고, 고체를 여과하고, 질소 스트림 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 수화물의 제조된 샘플은 CuKa 방사선을 사용하는 XRD 패턴에 의해 아래 표 3에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 패턴은 13.0에서의 피크를 7.8, 10.5, 11.0, 14.9, 19.7, 21.3, 및 26.9로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 함께 함유하며; 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차를 갖는다.
<표 3> 실시예 1C의 X-선 분말 회절 피크.
Figure 112017079619048-pct00057
실시예 2
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로프로필)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00058
반응식 3, 단계 A 및 B: 5-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복실산 (0.116 g, 0.608 mmol), 아세토니트릴 (4.05 mL), 디메틸포름아미드 (0.00314 mL), 및 이어서 옥살릴 클로라이드 (0.154 g, 0.105 mL, 1.22 mmol)를 질소 하에 함께 적가하였다. 반응물을 30분 동안 교반하고 이어서 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 (4.05 mL) 중에 용해시키고 에탄올 (4.05 mL) 및 물 (1.35 mL) 중 (4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(1,1-디플루오로프로필)-4a,5,7,7a-테트라히드로-4H-푸로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (0.140 g, 0.405 mmol)의 혼합물에 교반하면서 적가하였다. 완전한 첨가 시, 반응물을 클로로포름으로 희석하고 포화 중탄산나트륨 용액으로 세척하였다. 유기부를 메탄올로 희석하고 SCX-2 카트리지에 첨가하였다. SCX-2 카트리지를 1 칼럼 부피의 메탄올로 플러싱하고 폐기하고, 이어서 SCX-2 카트리지를 1 칼럼 부피의 7 M 메탄올성 암모니아로 플러싱하였다. 메탄올성 암모니아 플러시를 진공 하에 농축시키고 디클로로메탄/메탄올 (100-85% 구배)로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 잔류물을 수득하였다. 비키랄 SFC (초임계 유체 크로마토그래피) (칼럼: 벤젠술폰아미드 (BzS) (5 μ), 프린스턴 크로마토그래피, 21.2 × 250 mm; 용리액: 22% 메탄올 (1% 2 M 암모니아/메탄올)/CO2; 유량: UV 250 nm에서 70 mL/분; 배압: 100 bar; 온도: 40℃)에 의해 추가로 정제하였다. 잔류물을 클로로포름 중에 가용화시키고 염수로 세척하였다. 유기부를 소수성 프릿을 통해 통과시키고 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (0.0658 g, 0.127 mmol, 31%)을 수득하였다. ES/MS m/z 519 (M+H).
실시예 3
N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드
Figure 112017079619048-pct00059
반응식 3, 단계 B: 에탄올 (3 mL) 중 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-벤즈아미도-5-[시클로프로필(디플루오로)메틸]-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 (20 mg, 0.0315 mmol), O-메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (26 mg, 0.315 mmol), 및 피리딘 (0.026 ml, 0.315 mmol)의 혼합물을 55℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 용액을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 7 N NH3/메탄올: 디클로로메탄 (0.5-10% 구배)으로 용리하는, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (15 mg, 90%)을 수득하였다. ES/MS m/z 531 (M+H).
시험관내 검정 절차:
BACE2보다 BACE1에 대한 선택성을 평가하기 위해, 시험 화합물을 아래에 기재된 바와 같이 BACE1 및 BACE2에 대한 특이적 기질을 사용하여 FRET-기반 효소적 검정에서 평가한다. 시험관내 효소 및 세포 검정을 위해, 시험 화합물을 DMSO 중에서 제조하여 10 mM 원액을 제조한다. 원액을 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 10 μM 내지 0.05 nM 범위의 최종 화합물 농도로 DMSO 중에서 연속적으로 희석하여 10-포인트 희석 곡선을 수득한 후에, 시험관내 효소 및 전세포 검정을 수행한다.
시험관내 프로테아제 억제 검정:
huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc의 발현.
인간 BACE1 (수탁 번호: AF190725) 및 인간 BACE2 (수탁 번호: AF204944)를 총 뇌 cDNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝한다. 아미노산 서열 #1 내지 460에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 인간 IgG1 (Fc) 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA에 삽입한다 (Vassar et al., Science, 286, 735-742 (1999)). huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc로 각각 명명되는, BACE1(1-460) 또는 BACE2(1-460) 및 인간 Fc의 이러한 융합 단백질을 pJB02 벡터에 구축한다. 인간 BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc) 및 인간 BACE2(1-460):Fc (huBACE2:Fc)를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시킨다. 각 구축물의 cDNA 250 μg을 퓨젠(Fugene) 6과 혼합하고, 1 리터 HEK293 세포에 첨가한다. 형질감염 4일 후에, 조건화 배지를 정제를 위해 수거한다. huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc를 아래에 기재된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제한다. 효소를 -80℃에서 소량의 분취물로 저장한다. (문헌 [Yang, et al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)] 참조).
huBACE1:Fc 및 huBACE2:Fc의 정제.
huBACE1:Fc 또는 huBACE2:Fc cDNA로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293 세포의 조건화 배지를 수집한다. 세포 파편을 0.22 μm 멸균 필터를 통해 조건화 배지를 여과함으로써 제거한다. 5 ml 단백질 A-아가로스 (베드 부피)를 4 리터 조건화 배지에 첨가한다. 이 혼합물을 완만하게 밤새 4℃에서 교반한다. 단백질 A-아가로스 수지를 수집하고 저압 크로마토그래피 칼럼에 패킹한다. 칼럼을 20× 베드 부피의 PBS로 시간당 20 ml의 유량으로 세척한다. 결합된 huBACE1:Fc 또는 huBACE2:Fc 단백질을 50 mM 아세트산, pH 3.6으로, 시간당 20 ml의 유량으로 용리한다. 용리액의 1 ml 분획을 즉시 0.5 ml 200 mM 아세트산암모늄, pH 6.5로 중화시킨다. 최종 생성물의 순도를 4-20% 트리스-글리신 SDS-PAGE에서 전기영동에 의해 평가한다. 효소를 -80℃에서 소량의 분취물로 저장한다.
BACE1 FRET 검정
시험 화합물의 일련의 희석액을 상기 기재된 바와 같이 제조한다. 화합물을 KH2PO4 완충제 중에서 추가로 20× 희석한다. 10 μL의 각 희석액을 반응 혼합물 (25 μL의 50 mM KH2PO4, pH 4.6, 1 mM 트리톤(TRITON)® X-100, 1 mg/mL BSA, 및 15 μM의 APP의 서열에 기초한 FRET 기질)을 함유하는 상응하는 저 단백질 결합 흑색 플레이트의 A열 내지 H열의 각 웰에 첨가한다 (문헌 [Yang, et al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)] 참조). 내용물을 플레이트 진탕기 상에서 10분 동안 잘 혼합한다. KH2PO4 완충제 중 200 pM 인간 BACE1(1-460):Fc (문헌 [Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조) 15 μL를 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트에 첨가하여 반응을 개시한다. 플레이트 진탕기 상에서 간단히 혼합한 후, 시간 0에서의 혼합물의 RFU를 여기 파장 355 nm 및 방출 파장 460 nm에서 기록한다. 반응 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 습윤 오븐에서 실온에서 16 내지 24시간 동안 유지한다. 인큐베이션의 종료에서의 RFU를 시간 0에서 사용된 동일한 여기 및 방출 설정에서 기록한다. 시간 0 및 인큐베이션의 종료에서의 RFU의 차이는 화합물 처리 하에서의 BACE1의 활성을 나타낸다. RFU 차이를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고 곡선을 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 핏팅하여 IC50 값을 수득한다. (May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).
본원의 실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되며 1.19 nM ± 0.48, n=4 (평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차)의 BACE1에 대한 IC50을 나타낸다. 이러한 데이터는 실시예 1의 화합물이 시험관내 정제된 재조합 BACE1 효소 활성을 억제한다는 것을 입증한다.
BACE2 TMEM27 FRET 검정
또한 콜렉트린으로 공지된, 막횡단 단백질 27 (TMEM27) (수탁 번호 NM_020665)은 BACE1이 아니라 BACE2에 대한 기질로 최근에 기재된다 (Esterhazy, et al., Cell Metabolism, 14, 365-377 (2011)). BACE2 효소적 활성의 억제에 대해 시험 화합물을 평가하기 위해, 인간 TMEM27의 아미노산 서열에 기초한 FRET 펩티드 (답실-QTLEFLKIPS-LucY)를 기질로서 사용한다 (Esterhazy, et al., Cell Metabolism, 14, 365-377 (2011)). 시험 화합물의 일련의 희석액을 상기 기재된 바와 같이 제조한다. 화합물을 KH2PO4 완충제 중에서 추가로 20× 희석한다. 10 μL의 각 희석액을 반응 혼합물 (25 μL의 50 mM KH2PO4, pH 4.6, 1 mM 트리톤® X-100, 1 mg/mL BSA, 및 5 μM의 TMEM FRET 기질)을 함유하는 상응하는 저 단백질 결합 흑색 플레이트의 A열 내지 H열의 각 웰에 첨가한다. KH2PO4 완충제 중 20 μM 인간 BACE2(1-460):Fc (문헌 [Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)] 참조) 15 μL를 이어서 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트에 첨가하여 반응을 개시한다. 내용물을 플레이트 진탕기 상에서 10분 동안 잘 혼합한다. 시간 0에서의 혼합물의 RFU를 여기 파장 430 nm 및 방출 파장 535 nm에서 기록한다. 반응 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 습윤 오븐에서 실온에서 16 내지 24시간 동안 유지한다. 인큐베이션의 종료에서의 RFU를 시간 0에서 사용된 동일한 여기 및 방출 설정에서 기록한다. 시간 0 및 인큐베이션의 종료에서의 RFU의 차이는 화합물 처리 하에서의 BACE2의 활성을 나타낸다. RFU 차이를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고 곡선을 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 핏팅하여 IC50 값을 수득한다. (May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).
본원의 실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되며 479 nM ± 202, n=4 (평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차)의 BACE2 IC50을 나타낸다. BACE2 (TMEM27 FRET IC50 검정)에 대한 BACE1 (FRET IC50 효소 검정)의 비는 약 400배이며, 이는 BACE1 효소를 억제하는 것에 대한 기능적 선택성을 나타낸다. 상기 제시된 데이터는 실시예 1의 화합물이 BACE2보다 BACE1에 대해 선택적임을 입증한다.
SH-SY5YAPP695Wt 전세포 검정
BACE1 활성의 억제의 측정을 위한 통상적인 전세포 검정은 인간 APP695Wt cDNA를 안정하게 발현하는 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y (ATCC 수탁 번호 CRL2266)를 이용한다. 세포는 상용적으로 계대 수 6까지 사용하고 이어서 폐기한다.
SH-SY5YAPP695Wt 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에서 200 μL 배양 배지 (50% MEM/EBSS 및 햄 F12, 1× 각 피루브산나트륨, 비필수 아미노산 및 10% FBS를 함유하는 중탄산나트륨) 중에서 5.0×104개 세포/웰로 플레이팅한다. 다음 날, 배지를 세포로부터 제거하고, 신선한 배지를 첨가하고 이어서 37℃에서 24시간 동안 목적하는 농도 범위의 시험 화합물의 존재/부재 하에 인큐베이션한다.
인큐베이션의 종료에서, 조건화 배지를 특이적 샌드위치 ELISA에 의한 A베타 펩티드 1-40 및 1-42의 분석에 의해 베타-세크레타제 활성의 증명에 대해 분석한다. A베타의 이들 특이적 이소형을 측정하기 위해, 모노클로날 2G3을 A베타 1-40에 대한 포획 항체로서 및 모노클로날 21F12를 A베타 1-42에 대한 포획 항체로서 사용한다. A베타 1-40 및 A베타 1-42 ELISA는 둘 다 비오티닐화 3D6을 리포팅 항체로서 사용한다 (항체의 설명을 위해, 문헌 [Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)] 참조). 화합물 처리 후 조건화 배지 중에서 방출된 A베타의 농도는 이러한 조건 하에서의 BACE1의 활성에 상응한다. 10-포인트 억제 곡선을 플롯팅하고 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 핏팅하여 A베타-저하 효과에 대한 IC50 값을 수득한다. 실시예 1의 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험되며 표 4에 나타난 바와 같이 A베타 저하에 대해 하기 활성을 나타낸다.
<표 4>
Figure 112017079619048-pct00060
(평균 ± SEM; SEM = 평균의 표준 오차)
베타-세크레타제의 생체내 억제
마우스, 기니 피그, 개, 및 원숭이를 포함한 여러 동물 모델을 사용하여 화합물 처리 후의 생체내 베타-세크레타제 활성의 억제에 대해 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 사용된 동물은 야생형, 트랜스제닉, 또는 유전자 녹아웃 동물일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)]에 기재된 바와 같이 제조된, PDAPP 마우스 모델, 및 다른 비-트랜스제닉 또는 유전자 녹아웃 동물이 억제 화합물의 존재 하에서의 생체내 A베타 및 sAPP베타 생산의 억제를 분석하는 데 유용하다. 일반적으로, 2개월령의 PDAPP 마우스, 유전자 녹아웃 마우스 또는 비-트랜스제닉 동물에게 비히클, 예컨대 옥수수 오일, 베타-시클로덱스트란, 포스페이트 완충제, 파마솔브(PHARMASOLVE)®, 또는 다른 적합한 비히클 중에서 제제화된 화합물을 경구, 피하, 정맥내, 복용 또는 다른 투여 경로를 통해 투여한다. 화합물의 투여 후 1 내지 24시간에, 동물을 희생시키고, A베타 1-x의 분석을 위해 뇌를 분리한다. 본원에 사용된 "A베타 1-x"는 잔기 1에서 시작되어 잔기 28 초과의 C-말단에서 종결되는 A베타 종 전부를 지칭한다. 이는 대부분의 A베타 종을 검출하고 종종 "총 A베타"로 불린다. 총 A베타 펩티드 (A베타 1-x) 수준을 모노클로날 266을 포획 항체로서 및 비오티닐화 3D6을 리포팅 항체로서 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 측정한다. (문헌 [May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)] 참조).
급성 연구를 위해, 화합물 또는 적절한 비히클을 투여하고 동물을 투여 후 약 3시간에 희생시킨다. 뇌 조직을 선택된 동물로부터 수득하고, A베타 1-x의 존재에 대해 분석한다. 만성 투여 후 보다 고령의 APP 트랜스제닉 동물의 뇌 조직을 또한 화합물 처리 후 베타-아밀로이드 플라크의 양에 대해 분석할 수 있다.
억제 화합물을 투여한 동물 (PDAPP 또는 다른 APP 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 마우스)은 비히클-처리된 대조군 또는 시간 0 대조군과 비교하여 뇌 조직에서의 A베타의 감소를 입증할 수 있다. 예를 들어, 어린 암컷 PDAPP 마우스에게의 3, 10, 및 30 mg/kg의 실시예 1의 경구 투여는 뇌 해마에서의 A베타 1-x 펩티드 수준을 23% (비-유의함), 43% (p<0.05), 및 58% (p<0.01)만큼 각각 감소시켰다. 뇌 피질 조직에서, 3, 10 및 30 mg/kg의 실시예 1의 투여는 A베타 1-x 수준을 투여 후 3시간에 비히클-처리 마우스와 비교하여 43%, 59%, 및 73% (모든 값 p<0.01)만큼 감소시켰다.
시험관내 BACE1 효소에 대한 실시예 1의 활성을 고려하면, 이들 A베타-저하 효과는 생체내 BACE 억제와 일치하고, 추가로 실시예 1의 CNS 침투를 입증한다.
이들 연구는 본 발명의 화합물이 BACE1을 억제하고, 따라서, A베타 수준을 감소시키는 데 유용하다는 것을 보여준다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure 112017079753575-pct00069

    여기서 R은 메틸, 에틸, 또는 시클로프로필이다.
  2. 제1항에 있어서, R이 메틸인 화합물 또는 그의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이
    Figure 112017079753575-pct00070
    인 화합물 또는 그의 염.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이
    Figure 112017079753575-pct00071
    인 화합물 또는 그의 염.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Figure 112017079753575-pct00072
    인 화합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Figure 112017079753575-pct00073
    인 염.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Figure 112017079753575-pct00074
    인 염.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Figure 112017079753575-pct00075
    인 화합물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화합물이 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드인 화합물 또는 그의 염.
  10. 제5항에 있어서, N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드인 화합물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 수화물인 화합물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 4-메틸벤젠술포네이트인 염.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(1,1-디플루오로에틸)-4,4a,5,7-테트라히드로푸로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4-플루오로-페닐]-5-(1,2,4-트리아졸-1-일)피라진-2-카르복스아미드 말로네이트인 염.
  14. 제1항 또는 제2항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 포함하는, 환자에서 알츠하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 포함하는, 환자에서 경도 인지 장애에서 알츠하이머병으로의 진행을 치료하기 위한 제약 조성물.
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