KR101943852B1 - A novel peptide and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염과 그 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.The present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof and uses thereof. According to the present invention, one or more selected from Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia can be effectively treated or prevented.
Description
본 발명은 신규 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 펩타이드와 그 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel peptides, and more particularly to novel peptides and uses thereof.
알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD)은 서서히 진행되는 뇌세포의 퇴화로 치매증상을 야기하는 질환으로, 전체 치매의 55~70%를 차지한다.Alzheimer's disease (AD) is a disease caused by gradual progression of brain cell degeneration, which accounts for 55 to 70% of all dementia.
현재 치매 치료제로 시판중인 약물은 주로 신경전달물질인 아세틸콜린의 분해를 억제하는 아세틸콜린분해효소 억제제로, 주로 경도에서 중등도 치매 환자에게 적용되고 있다. 이와 같은 아세틸콜린분해효소억제제는 아세틸콜린의 과도한 증가로 부교감신경을 항진시켜 심한 설사, 구토, 우울증 등의 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.Drugs currently on the market for dementia treatment are acetylcholinesterase inhibitors that mainly inhibit the degradation of acetylcholine, a neurotransmitter, and are mainly applied to patients with mild to moderate dementia. Such an acetylcholinesterase inhibitor is known to exhibit severe side effects such as diarrhea, vomiting and depression due to hyperactivity of the parasympathetic nerve due to excessive increase of acetylcholine.
이와 같은 부작용으로 인해, 상대적으로 증상이 심하지 않은 경도인지장애, 최경도 및 경도 치매 환자에게는 아세틸콜린분해효소억제제를 적용하는 것이 바람직하지 않으나, 마땅한 대안이 없는 실정이다.Because of these side effects, it is not desirable to apply acetylcholinesterase inhibitors to patients with mild cognitive impairment, minimal and mild dementia with relatively low symptoms, but there is no suitable alternative.
한편, 알츠하이머병은 뇌조직의 베타아밀로이드 단백질 침착과 관련성이 크며, 알츠하이머병 초기 단계인 최경도 및 경도 환자의 뇌조직에서도 뚜렷이 증가되는 것으로 알려져 있다(Neurology 2004 Jun 8;62(11):1984-1989 등 참조).On the other hand, Alzheimer's disease is associated with the deposition of beta-amyloid protein in brain tissue, and it is known to be significantly increased in the brain tissue of patients with the lowest stage of Alzheimer ' s disease and in patients with hardness (Neurology 2004 Jun 8; 62 (11): 1984-1989 Etc.).
베타아밀로이드 단백질을 뇌로 수송하는 역할을 하는 단백질 중 하나가 혈액뇌장벽 내피세포 막에 발현되어 있는 RAGE(Receptor for Advanced Glycation End products)이다. RAGE는 수용체로써 역할뿐만 아니라, 접합분자(adhesion molecule)로써의 역할도 수행한다.RAGE (Receptor for Advanced Glycation End Products), in which one of the proteins that serve to transport beta amyloid protein to the brain is expressed in the blood brain barrier endothelial cell membrane. RAGE plays a role not only as a receptor, but also as an adhesion molecule.
이와 같은 RAGE를 억제함으로써, 뇌로의 베타아밀로이드 단백질 수송을 억제하여 알츠하이머병을 치료하기 위한 연구가 이루어지고 있다. 그러나, RAGE의 억제는 RAGE의 정상적인 기능까지 억제하여 부작용을 발생시킬 염려가 있다.By inhibiting such RAGE, studies have been made to treat Alzheimer's disease by inhibiting beta amyloid protein transport to the brain. However, inhibition of RAGE may inhibit the normal function of RAGE and cause side effects.
예를 들어, 최근 임상 2상 시험을 마친 TTP488(PF-04494700)은 베타아밀로이드 단백질과 RAGE의 결합을 차단하는 RAGE 길항제이다. TTP488의 경우, 고용량 투여받은 환자군에서는 부작용으로 인한 탈락자 증가와 인지기능이 더 악화되는 결과를 초래한 반면, 저용량 투여받은 환자군에서는 인지기능이 향상되는 결과를 나타내었다(Neurology 2014 Apr 29;82(17):1536-42 등 참조). 최근 초기 알츠하이머병 환자를 대상으로 저용량을 사용하여 임상 3상 시험을 시작할 것으로 알려지고 있다.For example, TTP488 (PF-04494700), which has recently undergone Phase 2 clinical trials, is a RAGE antagonist that blocks the binding of beta amyloid protein to RAGE. In the case of TTP488, patients with higher doses resulted in more deterioration of cognitive function due to adverse effects, whereas patients with lower doses showed improved cognitive function (Neurology 2014 Apr 29; 82 (17 ): 1536-42). It is now known that patients with early onset Alzheimer's disease will begin clinical trials using low doses.
따라서, 부작용이 적으며, 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 등을 치료할 수 있는 약물의 개발이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for development of a drug that can reduce the side effects and treat Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia.
본 발명이 해결하고자 하는 하나의 과제는 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 등에 효과적인 신규한 펩타이드를 제공하고자 하는 것이다.One of the problems to be solved by the present invention is to provide a novel peptide effective for Alzheimer's disease, cognitive disorder, dementia and the like.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 하나의 과제는 본 발명 펩타이드의 신규 용도를 제공하고자 하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a novel use of the peptide of the present invention.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열(DDFFF)로 이루어진 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.The present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence (DDFFF) of SEQ ID NO: 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
상기 아미노산 서열의 D는 아스파르트산(Aspartate; Asp)을 나타내고, F는 페닐알라닌(Phenylalanine;, Phe)을 나타낸다.D in the amino acid sequence represents aspartate (Asp), and F represents phenylalanine (Phe).
상기 펩타이드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하며, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산은 이들을 모두 포함한다.The amino acids constituting the peptide include L-form, D-form, and DL-form, and the amino acids constituting the peptide of the present invention include all of them.
상기 펩타이드는 변이체를 포함하는 것으로, 자연적 변이 또는 인공적 변이에 의하여 주요 활성에 변화를 주지 않으면서 본 발명 펩타이드 구조의 일부가 변이된 것을 포함한다.Such peptides include mutants and include those in which a part of the peptide structure of the present invention is mutated without causing a change in the main activity by natural mutation or artificial mutation.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있다.The pharmaceutically acceptable salts include, for example, hydrochloride, sulfate, phosphate, lactate, maleate, fumarate, oxalate, methanesulfonate and paratoluenesulfonate.
본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 의약 용도, 바람직하게는 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방 용도를 제공한다. 치료는 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상과 관련된 증상의 개선, 경감 등을 포괄하는 의미이고, 예방은 질병 이전 단계에서 질병으로 발전되는 것의 억제를 포괄하는 의미이다.The present invention also provides for one or more therapeutic or prophylactic uses selected from the pharmaceutical use of the peptides of the invention or their pharmaceutically acceptable salts, preferably Alzheimer's disease, cognitive impairment or dementia. Treatment is meant to include improvement, relief, etc. of symptoms associated with one or more selected from Alzheimer's disease, cognitive impairment, or dementia, and prevention is meant to encompass inhibition of developing into a disease at a pre-disease stage.
상기 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상은 뇌조직에 베타아밀로이드 단밸질 침착에 의한 것일 수 있다.The at least one selected from Alzheimer's disease, cognitive disorders, or dementia may be caused by beta amyloid protein deposition in brain tissue.
상기 치료 또는 예방은 알에이지이(RAGE; Receptor for Advanced Glycation End products)와 베타아밀로이드 단백질 결합 억제에 의할 수 있다.Such treatment or prevention may be due to inhibition of RAGE (Receptor for Advanced Glycation End products) and beta amyloid protein binding.
상기 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 상기 RAGE와 상기 베타아밀로이드의 결합을 가역성으로, 예를 들어, 가역성 비경쟁적으로 억제할 수 있다.The peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof may reversibly, for example, reversibly and noncompetitively inhibit the binding of RAGE to the beta amyloid.
따라서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학조성물일 수 있다.Accordingly, the present invention provides a composition for treating or preventing at least one selected from Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia comprising the peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The composition may be a pharmaceutical composition.
상기 약학 조성물은 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.The pharmaceutical composition may be characterized by comprising the peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
또한, 상기 약학조성물은, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 및 상기 첨가제로 이루어질 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable additive, and may be composed of the peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof and the above additives.
본 발명의 펩타이드는 펩타이드 화학에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조한 수 있다. 예를 들어, 펩타이드를 Schroder and Lubke 저, 「The Peptides」제 1 권, Acadmeic Press, New York (1965) 등에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있고, 용액상 합성 또는 고체상 합성 등의 방법에 의해 제조할 수 있다.The peptide of the present invention can be prepared by a method commonly used in peptide chemistry. For example, peptides can be produced by the method described in Schroder and Lubke, Volume 1 of The Peptides, Acadmeic Press, New York (1965), etc., and can be prepared by solution phase synthesis or solid phase synthesis .
펩타이드 결합을 형성하기 위한 방법의 예는 아지드법 , 산클로라이드법, 대칭적 무수물법, 혼합 무수물법, 카르보디이미드법, 카르보디이미도-부가물법, 활성에스테르법, 카르보디이미다졸법, 산화-환원법, 및 Woodward 시약 K 를 사용하는 방법 등이 있다.Examples of a method for forming a peptide bond include an azide method, an acid chloride method, a symmetric anhydride method, a mixed anhydride method, a carbodiimide method, a carbodiimide-adduct method, an active ester method, a carbodiimidazole method, Oxidation-reduction method, and a method using Woodward reagent K, and the like.
축합 반응을 수행하기 전에, 반응에 관여하지 않은 카르복실기, 아미노기 등을 보호시킬 수 있고, 축합 반응에 관여하는 카르복실기 및 아미노기를 당 분야에 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있다.Before carrying out the condensation reaction, the carboxyl group and amino group not involved in the reaction can be protected, and the carboxyl group and amino group involved in the condensation reaction can be activated by a method known in the art.
카르복실기를 보호하는 기의 예는 메틸, 에틸, 벤질, p-니트로벤질, t-부틸 및 시클로헥실과 같은 에스테르-형성기를 들 수 있다.Examples of the group protecting the carboxyl group include ester-forming groups such as methyl, ethyl, benzyl, p-nitrobenzyl, t-butyl and cyclohexyl.
아미노기를 보호하는 기의 예는 벤질옥시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 및/또는 9-플루포로에닐메틸옥시카르보닐 등을 들 수 있다.Examples of the group protecting the amino group include benzyloxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, and / or 9-fluoroenylmethyloxycarbonyl.
카르복실기의 활성 형태의 예는 대칭적인 무수물, 아지드 및 활성 에스테르[알코올 (예를 들어,펜타클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알코올, p-니트로페놀, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드로옥시프탈아미드 및 1-히드록시벤조트리아졸)과의 에스테르] 등을 들 수 있다. 또한, 활성화 아미노기의 예는 아미드 포스페이트이다.Examples of active forms of carboxyl groups include symmetrical anhydrides, azides and active esters [alcohols (e.g., pentachlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, p-nitrophenol, N- Ester with 5-norbornene-2,3-dicarboxylimide, N-hydroxysuccinimide, N-hydrooxiphthalamide and 1-hydroxybenzotriazole], and the like. An example of an activated amino group is amide phosphate.
반응을 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸슬폭시드, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란, 물, 메탄올 및 이들의 혼합물과 같은 용매에서 수행할 수 있다.The reaction may be carried out in a solvent such as chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, water, methanol and mixtures thereof.
반응 온도는 반응에 일반적으로 사용되는 약 -30℃～50℃의 범위일 수 있다.The reaction temperature may range from about -30 캜 to 50 캜, which is generally used in the reaction.
펩타이드 보호기를 제거하는 반응은 보호기의 종류에 따라 다르지만, 펩타이드 결합에 아무런 영향을 주지 않고 보호기를 이탈시킬 수 있는 것이어야 한다.The reaction to remove the peptide protecting group depends on the kind of protecting group, but should be capable of leaving the protecting group without affecting the peptide bonding.
보호기를 산처리 예를 들어, 염화 수소, 브롬화수소, 플루오르화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 및 이들 산의 혼합물로 처리함으로써 제거시킬 수 있다. 또한, 액체 암모니아에서 나트륨 금속을 사용하는 환원 또는 팔라듐-탄소를 사용하는 촉매성 환원을 사용할 수 있다.The protecting group can be removed by treatment with acid treatment, for example, with hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, and mixtures of these acids. It is also possible to use reduction with sodium metal in liquid ammonia or catalytic reduction using palladium-carbon.
상기 산처리로 보호기를 제거하는 반응을 수행할 때, 아니솔, 페놀 및 티오아니솔 등을 첨가할 수 있다.When the acid treatment removes the protective group, anisole, phenol, thioanisole, or the like may be added.
반응 완결후, 통상적인 펩타이드 정제 방법 예를 들어, 추출, 분배, 재침전, 재결정 또는 컬럼 크로마트그래피에 의해 펩타이드를 정제할 수 있다.After completion of the reaction, the peptide can be purified by conventional peptide purification methods, for example, extraction, distribution, reprecipitation, recrystallization or column chromatography.
또한, 본 발명의 펩타이드를 통상적인 방법에 따라 변이체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염으로 전환시킬 수 있다.In addition, the peptide of the present invention can be converted into a mutant or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to a conventional method.
본 발명에 따른 펩타이드는 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의해서도 생산할 수 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여 융합파트너와 본 발명의 펩타이드로 된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 그것으로 숙주 미생물을 형질전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킨 후 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다.The peptide according to the present invention can be synthesized by an automatic peptide synthesizer and can also be produced by genetic engineering techniques. For example, a fusion gene encoding a fusion protein comprising a fusion partner and a peptide of the present invention is prepared by genetic engineering, and the host microorganism is transformed with the fusion gene, followed by expression in the form of a fusion protein in the host microorganism, The peptide of the present invention can be cleaved and separated from the fusion protein to produce a desired peptide.
상기 펩타이드, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 투여량은 비경구 투여시 50㎍/일 ~ 10mg/일이며, 바람직하게는 0.5mg/일 ~ 5mg/일이다. 경구 투여의 경우, 투여량은 비경구 투여량의 2 ~ 5배이다. 본 발명의 펩타이드를 주로 비경구적인 방법으로, 예를 들면 국소주사, 정맥 또는 피하주사, 대뇌실내 또는 척수강내 투여, 경비투여, 또는 경피투여로 투여한다. 또한, 경우에 따라 경구적으로 투여할 수 있다.The dosage of the peptide, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is 50 μg / day to 10 mg / day, preferably 0.5 mg / day to 5 mg / day, when parenterally administered. For oral administration, the dosage is 2 to 5 times the parenteral dose. The peptides of the present invention are administered in predominantly parenteral ways, for example, by topical injection, intravenous or subcutaneous injection, intravenous or intrathecal administration, intranasal administration, or transdermal administration. In addition, it may be administered orally in some cases.
본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제와 함께 제제화하여 주사제, 패취제, 좌제, 분말, 점비제, 과립, 정제 등의 형태로 만들 수 있다.The peptides or compositions of the present invention may be formulated together with pharmaceutically acceptable additives into the form of injections, patches, suppositories, powders, nasal drops, granules, tablets and the like.
약학적으로 허용되는 첨가제는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 적용될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 첨가제에는 D5W(물 중에서 5% 포도당), 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액 등을 포함하며, 병소 내 국소주사의 경우 치료 효과를 증진시키고 지속시간을 증가시키기 위하여 여러 가지 주사가능한 하이드로겔(hydrogel)을 사용할 수 있다. 또한 약학적으로 이용가능한 첨가제는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 해당분야의 적절한 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA(최근판) 등에 개시되어 있는 방법을 참조하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.Pharmaceutically acceptable excipients can be applied according to a variety of factors well known to those skilled in the art including, for example, the particular bioactive material employed, its concentration, stability and intended bioavailability; Diseases and conditions or conditions to be treated; The subject, age, size and general condition to be treated; But are not limited to, the route used to administer the composition, for example, nasal, oral, ocular, topical, transdermal, and muscular factors. In general, pharmaceutically acceptable additives for administration of physiologically active substances other than the oral administration route include aqueous solutions containing D5W (5% glucose in water), dextrose and physiological salt within 5% of the volume, and the like , Various injectable hydrogels may be used to enhance the therapeutic effect and increase the duration of local injection in the lesion. The pharmaceutically acceptable excipients may also contain additional ingredients which may enhance the stability of the active ingredients such as preservatives and antioxidants. The peptides or compositions of the present invention may be prepared by any suitable method in the art and may be prepared according to the methods described in, for example, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA (recent edition) And can be suitably formulated accordingly.
본 발명의 펩타이드를 생리 식염수 용액으로 보관할 수 있고 만니톨 또는 소르비톨의 첨가후 앰플(ample)에 동결 건조시킬 수 있으며, 이것을 투여하기 위해 사용할때는 생리 식염수 등에 용해시킬 수 있다.The peptide of the present invention can be stored in a physiological saline solution and can be lyophilized in an ampoule after the addition of mannitol or sorbitol. When it is used for administration, it can be dissolved in physiological saline or the like.
본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방법을 제공하며, 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 상기 투여되는 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 유효량의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염일 수 있다.The invention also provides one or more treatments or prophylactics selected from Alzheimer's disease, cognitive disorders or dementia comprising the step of administering a peptide of the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a mammal, including a human, in need thereof And provides for the use of the peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of one or more therapeutic or prophylactic agents selected from Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia. The peptide or pharmacologically acceptable salt thereof to be administered may be an effective amount of a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 염, 용도, 조성물, 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일성 범위에서 서로 동일하게 적용된다. Unless otherwise indicated, the terms used in the peptide or pharmacologically acceptable salts, uses, compositions and methods of the present invention apply equally to each other, unless they are mutually contradictory.
본 발명에 의해 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.According to the present invention, one or more selected from Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia can be effectively treated or prevented.
이하, 실시예 및 제조예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로 본 발명의 내용이 하기 실시예나 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Preparation Examples. However, the following examples and preparative examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
이하, 실시예에서 사용한 시약은 시중에서 구할 수 있는 것으로, 최상품을 사용하였으며, 별도의 언급이 없는 한, Sigma-Aldrich사 등에서 구입한 것을 사용하였다.
Hereinafter, the reagents used in the examples were obtained from commercial sources, and the best products were used. Unless otherwise noted, those purchased from Sigma-Aldrich were used.
<실시예 1> 펩타이드 제조≪ Example 1 > Preparation of peptide
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드(DDFFF: 서열번호 1)를 애니젠㈜ (AnyGen Co., Ltd., 대한민국)에 의뢰하여 제조하였다. 구체적으로 Fmoc (9-fluorenyl-methoxycarbony) 화학적 성질을 이용한 고체상법(solid phase method)에 의해 합성되었다. 보다 구체적으로, 고상수지(Wang resin; Sigma-Aldrich) 0.55 mmol/g을 이용하여, 펩타이드의 C-말단을 고상수지에 결합하여 실시하였다.) Fmoc-Phe-OH 아미노산의 커플링(coupling)은 O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate(HBTU)와 함께 실시되었다. 아미노산 곁가지는 tert-butyl과 tert-butyloxycarbonyl로 보호하였다. 보호기 제거(Deprotection)와 레진(resin)에서의 분리는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)과 물을 95:5 (v/v) 비율로 혼합한 용액을 사용하여 실온에서 3시간 동안 실시하였다. 조(Crude) 펩타이드는 디에틸에테르(diethylether)로 반복하여 세척한 후 진공 건조하여 Shimadzu 5 um Shimpak ODS C18 column (20 x 250 mm)을 사용하여 역상 고속액체 크로마토그래피{reversed-phase HPLC; RP-HPLC} 방법으로 정제하였다. 정제된 펩타이드는 Shimpak 5um ODS C18 column (4.6 x 250 mm)을 사용하여 분석용 역상 고속액체 크로마토그래피(analytical RP-HPLC) 방법으로 확인하였다. 합성된 펩타이드의 분자량은 매트릭스-어시스티드 레이저 탈착 이온화 매스 스펙트로미터{matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)-mass spectrometer; Axima CFR, Kratos Analytical, Manchester, UK}를 사용하여 확인하였다.
A peptide (DDFFF: SEQ ID NO: 1) composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared by asking ANGEN Co., Ltd. (AnyGen Co., Ltd., Korea). Specifically, it was synthesized by solid phase method using Fmoc (9-fluorenyl-methoxycarbonyl) chemistry. More specifically, the coupling of the Fmoc-Phe-OH amino acid was carried out by using the solid phase resin (Wang resin; Sigma-Aldrich) 0.55 mmol / O-Benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU). The amino acid side chain was protected with tert-butyl and tert-butyloxycarbonyl. Deprotection and resin separation were carried out at room temperature for 3 hours using a mixture of trifluoroacetic acid and water in a ratio of 95: 5 (v / v). The crude peptide was washed repeatedly with diethylether, vacuum-dried, and subjected to reversed-phase HPLC using Shimadzu 5 μm Shimpak ODS C18 column (20 × 250 mm). RP-HPLC}. Purified peptides were identified by reversed-phase high-performance liquid chromatography (analytical RP-HPLC) using a Shimpak 5um ODS C18 column (4.6 x 250 mm). Molecular weights of the synthesized peptides were determined using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) -mass spectrometer; Axima CFR, Kratos Analytical, Manchester, UK).
<실시예 2> 펩타이드 효과 확인<Example 2> Confirmation of peptide effect
실시예 1의 펩타이드가 RAGE와 베타아밀로이드 결합 억제를 나타내는 것으로부터, 뇌조직에 베타아밀로이드 단백질 침착과 관련된 질병인 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용도가 있음을 확인하였다. 이는 RAGE와 베타아밀로이드 결합 억제 물질이, 뇌조직에 베타아밀로이드 단백질 침착과 관련된 질병인 알츠하이머병, 인지장애, 또는 치매 등에 대해 치료 또는 예방 효과가 있는 점을 이용한 것이다.(Neurology. 2004 Jun 8;62(11):1984-1989; J Clin Invest. 2012 Apr;122(4):1377-1392 등 참조)Since the peptide of Example 1 shows inhibition of RAGE and beta amyloid binding, it has been confirmed that there is at least one therapeutic or prophylactic use of brain tissue selected from Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia, which is a disease associated with beta amyloid protein deposition. This is based on the fact that RAGE and beta amyloid binding inhibitors have therapeutic or prophylactic effects on Alzheimer's disease, cognitive disorder, or dementia, a disease associated with beta amyloid protein deposition in brain tissue (Neurology 2004 Jun 8; (11): 1984-1989; J Clin Invest. 2012 Apr; 122 (4): 1377-1392)
분리 정제된 RAGE의 C-terminal biotinylated extracellular domain과 Cy3-conjugated streptavidin을 섞은 용액에 FITC-conjugated 베타아밀로이드 1-42를 섞은 후 FITC와 Cy3 사이에서 일어나는 Fluorescence resonance energy transfer (FRET) 현상을 측정하였다.Fluorescence resonance energy transfer (FRET) between FITC and Cy3 was measured by mixing FITC-conjugated beta amyloid 1-42 in a solution of C-terminal biotinylated extracellular domain of purified RAGE and Cy3-conjugated streptavidin.
구체적으로 이하의 방법에 의하였다. 50% glycerol(G5516, Sigma) 용액에 1mg/ml 농도가 되도록 Cy3-streptavidin(016-160-084, Jackson ImmunoResearch)을 준비하였다. FITC-conjugated 베타아밀로이드 1-42(M2585, BACHEM)를 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 100uM의 농도가 되도록 준비하였다. 96웰 흑색 플레이트(96-well black plate)에 정제한 RAGE 단백질을 50ug/ml이 되도록 PBS(phosphate buffer saline) buffer(D5652, Sigma)에 희석해서 well 당 50ul씩 넣고, Cy3-streptavidin 용액을 PBS에 희석해서 2ug/ml이 되도록 well 당 50ul씩 첨가 한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 베타아밀로이드-FITC를 0.1uM이 되도록 PBS에 희석을 한 후 well 당 50ul 씩 넣고, 표 1에 기재된 각각의 농도로 PBS에 희석한 실시예 1의 펩타이드를 well 당 50ul씩 첨가했다. 대조군은 실시예 1의 펩타이드를 사용하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1의 펩타이드 처리군과 동일하게 준비하였다. 또한, 실시예 1의 펩타이드 및 RAGE를 사용하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1의 펩타이드 처리군과 동일한 방법으로 공시험 시료를 준비하였다.Specifically, the following method was used. Cy3-streptavidin (016-160-084, Jackson ImmunoResearch) was prepared to a concentration of 1 mg / ml in 50% glycerol (G5516, Sigma) FITC-conjugated beta amyloid 1-42 (M2585, BACHEM) was prepared in DMSO (dimethyl sulfoxide) to a concentration of 100 uM. The purified RAGE protein was diluted in PBS (phosphate buffered saline) (D5652, Sigma) to a concentration of 50 ug / ml in a 96-well black plate, and 50 ul of the purified Cy3-streptavidin solution was added to PBS The cells were diluted to 50 ug / well with 2 ug / ml per well and incubated at room temperature for 30 min. After the reaction, 50 μl of β-amyloid-FITC was diluted with PBS to 0.1 μM, and 50 μl of the peptide of Example 1 diluted with PBS at the concentrations shown in Table 1 were added at 50 μl per well. The control group was prepared in the same manner as the peptide treatment group of Example 1, except that the peptide of Example 1 was not used. In addition, a blank test sample was prepared in the same manner as in the peptide treatment group of Example 1, except that the peptide of Example 1 and RAGE were not used.
Plate를 상온에서 30분동안 shaking incubation 시킨 후, 각각의 군에 대하여 마이크로플레이트 리더(SAFIRE, TECAN)을 이용해 Excitation과 Emission 파장을 각각 490nm와 560nm로 하여 형광 intensity를 측정하였다. 측정값으로부터 결합 저해율을 계산하였다. 복수의 측정값인 경우 평균값을 사용하였고, 아래와 같은 식에 의해, 결합저해율을 계산하였다.Plates were shaking incubated at room temperature for 30 min. Fluorescence intensities were measured at 490 nm and 560 nm for excitation and emission wavelengths, respectively, using a microplate reader (SAFIRE, TECAN). The binding inhibition rate was calculated from the measured values. The average value was used for a plurality of measured values, and the inhibition rate of binding was calculated by the following equation.
결합저해율(%)=100-100X(농도별 펩타이드 처리군 측정값-공시험 시료의 측정값)÷(대조군 측정값-공시험 시료의 측정값)Binding inhibition rate (%) = 100-100X (measured value of peptide-treated group by concentration-measured value of blank test sample) ÷ (measured value of control group-measured value of blank test sample)
그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. The results are shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 펩타이드는 RAGE와 베타아밀로이드의 결합을 저해하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 1 펩타이드의 농도 0.01~0.3uM에서 RAGE와 베타아밀로이드의 결합을 10~15% 저해하고, 1~20uM에서는 RAGE와 베타아밀로이드의 결합을 30~38% 저해하는 것으로 나타났다. 특히, 실시예 1 펩타이드의 농도를 1uM에서 20uM로 높여도 그 저해률은 크게 증가하지 않음을 알 수 있다. As shown in Table 1, the peptide of Example 1 was found to have the effect of inhibiting the binding of RAGE to beta amyloid. In addition, it was shown that inhibition of RAGE and beta amyloid binding by 10 to 15% at a peptide concentration of 0.01 to 0.3 uM of Example 1, and inhibition of RAGE and beta amyloid binding by 30 to 38% at 1 to 20 uM. In particular, even if the concentration of the peptide of Example 1 was increased from 1 uM to 20 uM, the inhibition rate did not significantly increase.
상기 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는 RAGE와 베타아밀로이드 단백질의 결합을 저해하는 것을 알 수 있다. 이와 같은 저해는 가역성 저해(reversible inhibition)로 보이며, 보다 구체적으로 가역성 비경쟁적 저해(reversible noncompetitive inhibition)로 보인다. 이와 같은 작용에 의해 본 발명의 펩타이드는 부작용 가능성이 낮을 것으로 판단된다. 즉, 넓은 농도범위에서 40% 이하의 RAGE와 베타아밀로이드 단백질의 결합억제율을 나타내는 본 발명의 펩타이드를 적용함으로써, RAGE 관련 질환을 치료함과 동시에 RAGE의 정상 작용은 크게 억제하지 않을 수 있으므로, 부작용 가능성은 낮출 수 있을 것으로 보인다. From the above results, it can be seen that the peptide of the present invention inhibits the binding of RAGE and beta amyloid protein. This inhibition appears to be a reversible inhibition, more specifically a reversible noncompetitive inhibition. By such an action, it is considered that the peptide of the present invention has a low possibility of side effects. That is, by applying the peptide of the present invention showing a binding inhibition ratio of RAGE and beta amyloid protein of 40% or less in a wide concentration range, it is possible to treat RAGE-related diseases and at the same time, Can be lowered.
따라서, RAGE-베타아밀로이드 결합 저해에 의해 치료가 가능한 질환 즉, 알츠하이머병, 인지장애, 및/또는 치매의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 경도 또는 최경도의 알츠하이머병, 경도의 인지장애, 및/또는 경도 또는 최경도의 치매 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, it can be usefully used for the treatment or prevention of a disease treatable by RAGE-beta amyloid binding inhibition, i.e., Alzheimer's disease, cognitive disorder, and / or dementia. In particular, it can be usefully used for the treatment or prevention of Alzheimer's disease of mild or moderate degree, cognitive impairment of hardness, and / or mild or moderate dementia.
<제조예 1> 주사액제 제조≪ Preparation Example 1 > Preparation of injection solution
실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 펩타이드 10mg을 생리식염수에 용해시켜 용액 10ml을 만든다. 만들어진 용액은 주사제용 앰플에 충진하여 주사액제를 제조한다.10 mg of the peptide prepared in the same manner as in Example 1 was dissolved in physiological saline to make 10 ml of the solution. The prepared solution is injected into an ampoule for injection to prepare an injection solution.
<110> Pison Sciences Inc. <120> A novel peptide and use thereof <130> GP15016 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Asp Asp Phe Phe Phe 1 5 <110> Pison Sciences Inc. <120> A novel peptide and use thereof <130> GP15016 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Asp Asp Phe Phe Phe 1 5
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2015
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Non-Patent Citations (2)
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| Adler-Abramovich L. et al, Chem. Soc. Rev.43:pp.6881-6893 (2014. 8. 6.)* |
| Airoldi F. et al, Current Medicinal Chemistry, 17:pp.2990-3006 (2010.)* |
Also Published As
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