KR101941893B1 - 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용 - Google Patents

돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 조성물, 상기 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 육질 형질 판단용 조성물 및 한국 토종돼지 판별용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 돼지의 육질 형질을 판단하는 방법 및 한국 토종돼지를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 마커는 돼지의 육질 형질을 판단하는 특이적인 마커로서, 육안으로 구별되지 않는 돼지 육질 형질의 객관적인 평가뿐만 아니라, 외래돼지와 한국 토종돼지를 판별할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있을 것이다.

Description

돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용{Genetic marker for discriminating level of meat quality of pig and use thereof}
본 발명은 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 조성물, 상기 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 육질 형질 판단용 조성물 및 한국 토종돼지 판별용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 돼지의 육질 형질을 판단하는 방법 및 한국 토종돼지를 판별하는 방법에 관한 것이다.
돼지는 약 200여 종의 품종이 존재하며, 그 중 유럽품종이 약 33%, 아시아 품종이 약 30% 존재한다고 일반적으로 알려져 있다. 이러한 돼지 품종들은 모색, 크기, 체형 등의 표현형 차이를 통해 간편히 식별되나, 살코기의 경우에는 시간의 경과에 따라 색도, 보수력, 전단력 등이 달라지므로, 일반인뿐만 아니라 전문가의 수준에서도 돼지육을 통해 육안으로 품종을 구별하기는 어려운 점이 있었다.
최근, 돼지육의 품질을 제고하기 위한 노력이 많이 이루어지고 있다. 돼지를 일정한 규격에서 사육하거나 과학적인 시스템을 통해 관리하고, 이로부터 얻어진 토종돼지의 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다.
이러한 연구의 일환으로서, 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법을 개발 및 발전시키려는 방향으로 활발한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 한국 공개특허공보 제10-2004-0039059호에는 돼지의 일당증체량, 등지방두께, 육질 형질에 관련된 특이 DNA marker를 이용하여 돼지의 형질이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 유전자 검정방법이 개시되어 있고, 한국 공개특허공보 제10-2007-0113336호에는 돼지의 근세포 분화에 관여하는 것으로 알려진 Myogenin 유전자의 5' promoter 부위의 단일 염기서열 차이에 의한 변이(SNP)를 이용한 돼지 근세포수 증가 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있다. 그러나, 여전히 돼지의 육질 형질 수준을 정확하게 판단하기 위한 방법은 개발되지 않은 상태이며, 또한, MYH3 유전자를 이용하여 돼지의 육질 형질 수준을 판단하는 방법은 개발된 바 없었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 유전 형질을 통해 돼지육의 품질을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자임을 규명하였으며, 이를 이용하면 유전적으로 결정되는 돼지의 육질 형질을 간편히 판단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 유전자 마커를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 DNA 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항 또는 제2항의 유전자 마커를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 육질 형질을 판단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 토종돼지 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항 또는 제2항의 유전자 마커를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 토종돼지의 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, MYH3 유전자에 의해 돼지의 근내지방함량 및 적색도의 육질 형질이 결정됨을 확인하였으며, 육질 형질이 우수한 재래종과 우수하지 않은 외래종 간에는 상기 유전자에 변이가 존재하므로, 상기 변이를 포함하는 유전자 마커를 검출함으로써 돼지 육질 형질을 판단할 수 있을 뿐만 아니라, 외래돼지와 한국 토종돼지를 구별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 용어, "유전자 마커"는 유전자 좌위에 있는 돌연변이 또는 변형에 의해 일어난 다양성을 식별하기 위해 이용되는 짧은 DNA 서열을 의미한다.
본 발명의 목적상, 상기 유전자 마커는 돼지의 품종 간에 염기 변이가 나타나는 유전자를 의미할 수 있다.
본 발명의 용어, "서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드"는 MYH3 유전자를 의미한다. 상기 용어, 'MYH3 유전자'는 동물의 근육을 구성하는 마이오신에 포함된 중쇄단백질의 하나인 myosin heavy chain 3을 코딩하는 유전자를 의미하며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(GenBank Accession No. KX549312). 구체적인 예로, 상기 유전자는 돼지로부터 유래한 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자 마커는, 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는, ACGT의 연속된 염기일 수 있다.
또한, 상기 유전자 마커는, 이에 제한되지 않지만, 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개, 구체적으로 5 내지 280개, 더더욱 구체적으로 5 내지 260개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "육질 형질"은 돼지로부터 얻어진 뼈를 제외한 도축물의 상태를 나타내는 다양한 표현 형질을 의미하는데, 상기 표현 형질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 근내지방함량, 육색, 보수력, 전단력 등이 될 수 있으며, 더욱 구체적으로 근내지방함량 또는 육색이 될 수 있다. 근내지방함량은 근육 내 포함된 지방의 함량, 육색은 육안으로 판단되는 고기의 색, 보수력은 축육이 수분을 유지하는 능력, 전단력은 고기의 찢었을 때 질긴 정도로서, 근내지방함량은 높을수록, 육색은 적색을 나타낼수록, 보수력 및 전단력은 낮을수록 육질의 품질이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서, 상기 마커가 검출될 경우, 검출되지 않은 경우와 대비할 때, 근내지방함량은 높고, 육색은 적색도가 증가한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 제주재래돼지와 랜드레이스 또는 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손을 대상으로 돼지의 육질 형질에 대해 QTL 분석 및 LALD(Linkage and linkage disequilibrium) mapping을 수행한 결과, 돼지의 육질 형질에 관여하는 유전자는 12번 염색체에 존재하는 MYH3 유전자임을 확인하였다(도 2 내지 4).
또한, MYH3 유전자의 유전형을 분석한 결과, 육질이 좋지 않은 외래종인 랜드레이스와 육질이 좋은 재래종인 제주재래돼지 사이에 염기 변이(QTN: i.e., MYH3-1805_-1810delGGACTG)가 존재함을 확인하였으며(도 11), HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 상기 원인 염기 변이를 절단한 결과, 두 돼지의 유전자 절단 양상이 다름을 확인하였다(도 12).
이는, 본 발명의 유전자 마커는 외래돼지와 재래돼지의 판별뿐만 아니라, 종의 구별에 따른 육질 형질도 판단할 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명의 유전자 마커를 이용하면, 육질 형질의 수준을 정확하게 판단할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유전자 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.
다른 하나의 양태는 상기 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "유전자 마커를 검출할 수 있는 제제"는 본 발명의 유전자 마커에 특이적으로 결합하여 인식하거나, 상기 유전자 마커를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적인 예로, 상기 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 용어, "프로브"(probe)는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 라벨링(labeling) 되어 있는 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에서, 유전자 마커에 결합 및 인식하는 프로브는 유전자 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5' 또는 3' 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 유전자 마커 증폭에 사용되는 프라이머, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.
또한, 프라이머는 변형시킬 수 있는데, 구체적인 예로, 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 65 및 66으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 65 및 66의 프라이머를 이용하여 외래돼지와 재래돼지 간에 존재하는 염기 변이 부분을 증폭한 뒤, HpyCH4IV 제한효소로 상기 염기 변이의 염기서열 중에서 'ACGT' 부분을 절단하여 절단 양상을 확인한 결과, 육질이 좋지 않은 외래종인 랜드레이스와 육질이 좋은 재래종인 제주재래돼지의 제한효소 절단 양상이 확연히 구분됨을 확인하였다(도 12).
이는, 본 발명의 돼지의 육질 형질 판단용 조성물은 외래돼지와 재래돼지의 판단뿐만 아니라, 종의 구별에 따른 육질 형질을 판단하는데 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 본 발명의 유전자 마커를 증폭을 통해 확인하거나, 상기 유전자 마커의 mRNA 발현 수준을 확인함으로써 돼지의 육질 형질 수준을 판단할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 유전자 마커에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 예로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩 키트일 수 있다.
본 발명의 용어, "DNA 칩"은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 유전자 마커를 포함하는, 돼지의 육질 형질 판단용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 돼지의 육질 형질 판단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 구별 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1 M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 돼지의 육질 형질 수준 판단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 유전자 마커를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 육질 형질을 판단하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계의 증폭 산물에 ACGT의 연속된 염기가 포함된 경우, 돼지의 육질 형질은 외래돼지의 것보다 우수한 것으로 판단하는 (c) 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"는 육질 형질 수준을 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 유전자 마커에 포함된 유전자형을 분석함으로써 상기 돼지의 육질 형질을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 상기 유전자를 검출할 수 있는 한, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어, "외래돼지"는 한국 토종돼지에 반대되는 개념으로, 한국이 아닌 다른 나라에서 들여온 돼지 품종을 의미한다. 일반적으로, 외래돼지는 한국 재래돼지에 비하여 질병에 약하고, 근내지방, 다즙성, 연도 등의 육질 특성이 좋지 못한 것으로 알려져 있다. 구체적인 예로, 버크셔종, 요크셔종, 두록저지종, 햄프셔종, 랜드레이스종 등이 있으며, 본 발명의 목적상, 상기 외래돼지는 외래돼지와 교잡된 모든 품종을 의미할 수 있다.
본 발명에서, 상기 (a) 단계의 DNA로부터 본 발명의 유전자 마커를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (b) 단계의 증폭 산물에 포함된 유전자 마커의 염기를 결정하는 단계도 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specifichybridization; DASH), PCR 연장 분석(예로, 단일 염기 연장(single base extension; SBE), PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예로, Sequenom의 MassARRAY 시스템), Bio-Plex 시스템(BioRad), 제한효소 절단법 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 상기 증폭 산물에 포함된 ACGT의 연속된 염기를 검출할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 65 및 66의 프라이머를 이용하여 왜래 돼지와 재래돼지 간에 존재하는 염기 변이 부분을 증폭한 뒤, HpyCH4IV 제한효소로 상기 증폭된 염기서열 중에서 'ACGT' 부분을 절단하여 절단 양상을 확인한 결과, 육질이 좋지 않은 외래 종인 랜드레이스와 육질이 좋은 재래종인 제주재래돼지의 절단 양상이 확연히 구분됨을 확인하였다(도 12).
이는, 본 발명의 돼지의 육질 형질을 판단하는 방법은 외래돼지와 재래돼지의 종을 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 종의 구별에 따른 육질 형질도 판단할 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 토종돼지 판별용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "유전자 마커를 검출할 수 있는 제제"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "한국 토종돼지"는 외래돼지에 반대되는 개념으로, 전통적으로 한국에서 사육된 돼지 품종을 의미한다. 일반적으로, 한국 토종돼지는 외래돼지에 비하여 질병에 강하고, 근내지방, 다즙성, 연도 등의 육질 특성이 우수한 것으로 알려져 있다. 구체적인 예로, 축진참돈, 강원도 산우리재래돼지, 제주 재래흑돼지, 제주 똥돼지 등의 여러 이름으로 불리는 제주 재래돼지 등이 있으며, 더욱 구체적으로 제주 재래돼지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서, 상기 한국 토종돼지는 '토종돼지', '한국 재래돼지' 또는 '재래돼지'와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명에서, 상기 마커가 검출될 경우, 검출되지 않은 경우와 대비할 때, 한국 토종돼지인 것으로 판별할 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항 또는 제2항의 유전자 마커를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 토종돼지의 판별 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계의 증폭 산물에 ACGT의 연속된 염기가 포함된 경우, 한국 토종돼지인 것으로 판단하는 (c) 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이때, 상기 "개체" 및 "한국 토종돼지"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 (a) 단계의 DNA로부터 본 발명의 유전자 마커를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (b) 단계의 증폭 산물에 포함된 유전자 마커의 염기를 결정하는 단계도 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specifichybridization; DASH), PCR 연장 분석(예로, 단일 염기 연장(single base extension; SBE), PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예로, Sequenom의 MassARRAY 시스템), Bio-Plex 시스템(BioRad), 제한효소 절단법 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 상기 증폭 산물에 포함된 ACGT의 연속된 염기를 검출할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 65 및 66의 프라이머를 이용하여 왜래돼지와 재래돼지 간에 존재하는 염기 변이 부분을 증폭한 뒤, HpyCH4IV 제한효소로 상기 증폭된 염기서열 중에서 'ACGT' 부분을 절단하여 절단 양상을 확인한 결과, 육질이 좋지 않은 외래 종인 랜드레이스와 육질이 좋은 재래종인 제주재래돼지의 절단 양상이 확연히 구분됨을 확인하였다(도 12).
이는, 본 발명의 돼지의 육질 형질을 판단하는 방법은 외래돼지와 재래돼지의 종을 식별할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 유전자 마커는 돼지의 육질 형질을 판단하는 특이적인 마커로서, 육안으로 구별되지 않는 돼지 육질 형질의 객관적인 평가뿐만 아니라, 외래돼지와 한국 토종돼지를 판별할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있을 것이다.
도 1은 도입종인 랜드레이스(a)와 재래종인 제주재래돼지(b)의 외모 및 등심사진을 비교한 이미지이다.
도 2는 육질 형질 결정 유전자의 QTL(quantitative trait locus) 영역 확인에 따른 LDLA(linkage-linkage disequilibrium analysis) 결과를 보여주는 그래프이다. a는 제주재래돼지와 랜드레이스 돼지를 교배하여 얻어진 자손(LK축군), b는 제주재래돼지와 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손(DK축군)에 관한 것이다.
도 3은 육질 형질 결정 유전자의 QTL 영역에 존재하는 유전자를 나타내고 있는 LALD mapping 결과이다.
도 4는 QTL 영역에 존재하는 유전자의 mRNA 발현양을 비교한 그래프이다. a는 등심(최장근, longissimus), b는 후지(대퇴사두근, quadriceps)에 관한 것이다.
도 5는 CAGGS-EGFP-Puro 벡터의 개열지도를 보여준다.
도 6은 MYH3 유전자가 재조합된 CAGGS-MYH3-Flag 발현 벡터의 개열지도 및 상기 벡터 내 유전자의 순서를 보여준다.
도 7은 MYH3 유전자가 재조합된 벡터로 형질전환된 마우스의 MYH3 유전자 활성 및 발현 양상을 보여준다. a는 MYH3 유전자의 전사 활성을 보여주는 이미지이다. P/C는 양성대조군(positive control), 붉은색으로 표시된 숫자(21, 24, 26, 27, 28)는 MYH3 유전자 전사활성을 나타내는 형질전환 마우스, 검정색으로 표시된 숫자(19, 20, 22, 23, 25)는 형질전환은 되었으나, MYH3 유전자의 전사활성이 없는 마우스를 의미한다. b는 MYH3 유전자의 단백질 발현양을 분석한 웨스턴블롯 결과를 나타내는 이미지이다.
도 8은 돼지 MYH3 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 모습이다.
도 9는 야생형 마우스(WT) 및 형질전환 마우스(TG)의 뒷다리 근육 외관(a) 및 근육 조직(b, c)의 모습을 보여주는 이미지이다. b는 뒷다리 근육 조직을 미오신 ATPase로 조직화학염색한 이미지로서, 적색 화살표는 적색근의 일종인 Type 1/oxidative/slow fibers, 청색 화살표는 백색근의 일종인 Type 2a 및 청색 삼각형은 백색근의 일종인 Type 2b의 Type 2/glycolytic/fast fibers를 가리킨다. 스케일바(Scale bar)는 50 ㎛을 의미한다. c는 뒷다리 근육 조직을 Oil red O 염색한 이미지이다. 스케일바는 100 ㎛을 의미하고, 직사각형 내에 존재하는 영역을 확대하여 그 아래에 나타내었다.
도 10은 돼지 MYH3 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 근육 내 유전자 발현 패턴을 확인한 결과를 보여준다. a는 근섬유 type과 관련한 유전자의 mRNA 및 단백질 발현을 qRT-PCR 및 웨스턴블롯을 통해 분석한 결과를 보여준다. 4개월령의 야생형 마우스(n=3)와 형질전환 마우스(n=5)를 이용하였다. b는 뒷다리 근육의 slow-type(좌) 및 fast-type(우) 근육과 관련한 유전자의 mRNA 발현양을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 보여준다. 4개월령의 야생형 마우스(n=3)와 형질전환 마우스(n=4)를 이용하였다. 결과값은 독립적인 세 번의 실험을 통해 얻었으며, 이를 평균±SEM으로 나타내었다(*P<0.05, **P<0.01). c는 뒷다리 근육을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 결과를 보여준다. 화살표는 근주막(perimysium), 삼각형은 근내막(endomysium)을 가리킨다. d는 지방분화 유전자의 mRNA 발현양을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 보여준다.
도 11은 돼지 MYH3 유전자의 구조 및 QTN(quantitative trait nucleotide)을 보여주는 이미지이다.
도 12는 육질에 영향을 미치는 원인 염기변이를 HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 절단한 패턴을 보여주는 이미지이다. LANDRACE 품종(q/q)에서 유래한 1/1은 비 절단형, 랜드레이스와 제주재래돼지의 교배 품종(q/Q)에서 유래한 1/2는 절단형, 제주재래돼지 품종(Q/Q)에서 유래한 2/2는 절단형을 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 돼지의 육질 형질 육안 비교
제주재래흑돼지와 랜드레이스 돼지의 육질 형질(근내지방함량 및 적색육)을 비교하기 위하여, 등심의 형태를 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 도입종인 랜드레이스의 등심 고기는 백색이면서 창백하나, 제주재래돼지의 등심 고기는 흑모색이면서 적색육이며, 특히 마블링 침착이 우수함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 재주재래돼지는 랜드레이스에 비하여 육질이 우수함을 알 수 있었다.
실시예 2. 돼지의 육질 형질 양적특성자리 (quantitative trait locus; QTL ) 분석
실시예 2-1. 육질 유전자의 QTL 영역 확인
돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자를 규명하기 위하여, 제주재래돼지와 랜드레이스 돼지를 교배하여 얻어진 자손(LK축군), 및 제주재래돼지와 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손(DK축군)을 대상으로 돼지의 육질 형질(적색도(a*), 근내지방함량(IMF))에 대해 양적특성자리(quantitative trait locus; QTL) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2의 a에서 볼 수 있듯이, LK축군에서 수직 점선은 12번 염색체의 661 kb 영역 상에 위치함을 확인하였고, 또한, 도 2의 b에서 볼 수 있듯이, KD축군에서도 수직 점선은 12번 염색체의 661 kb 영역 상에 위치함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 적색육(적색도)과 근내지방함량을 결정하는 유전자는 돼지의 품종에 상관없이 동일한 위치에 존재함을 확인하였고, 이는 12번 염색체의 661kb 영역 내에 존재함을 알 수 있었다.
실시예 2-2. 돼지 육질 형질 유전자 규명
상기 실시예 2-1를 통해 돼지 육질 형질을 결정하는 유전자는 12번 염색체의 661kb 영역 내에 존재함을 확인함에 따라, 상기 영역 내에 존재하는 유전자를 LALD mapping을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, MYH3, MYH1, MYH2, MYH13, ADPRM, SCO1, TMEM220, ENSSSCG00000029441, ENSSSCG00000018006의 9개 유전자가 상기 육질 형질 유전자 영역 내에 존재함을 확인하였다.
실시예 2-3. 돼지 육질 형질 관련 유전자 선발
상기 실시예 2-2를 통해 육질 형질을 결정하는 9개 유전자를 확인함에 따라, 상기 유전자 중에서도 육질 형질의 결정에 가장 관련성이 높은 유전자를 선발하고자 하였다.
랜드레이스(LANDRACE)와 재래돼지(KNP)의 등심(최장근, longissimus) 및 후지(대퇴사두근, quadriceps)에서, 상기 9개 유전자의 상대적인 mRNA 발현양을 분석하였다.
구체적으로, 재래돼지(LANDRACE)와 랜드레이스로 등심과 후지를 근육조직을 채취하였고, Trizol 시약(Ambion)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 각 조직별 RNA농도를 5 ㎍으로 동일하게 맞춘 후 TOPscript cDNA 합성 키트(Enzynomics)를 이용하여 cDNA(complement DNA)를 합성하였다. 이후 각 조직별 cDNA를 이용하여 qRT-PCR 실험을 수행하였다. qRT-PCR 실험은 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초를 40회 반복하였으며 qRT-PCR 실험 수행을 위해 QuatiTect SYBR Green PCR 키트(Qiagen)를 사용하였고, Roter-Gene Q thermal cycler(Qiagen) 장비를 이용하여 실시간으로 분석하였다. 총 9개의 유전자 분석을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 1에 나열하였다.
유전자 구분 방향 염기서열(5'→3')
pMYH3 서열번호 3 Forward AAAAGCTCAGCATGAGCTCGA
서열번호 4 Reverse AGGGTCAGGAACCATGAAAAT
pMYH1 서열번호 5 Forward GTTCTGAAGAGGGTGGTAC
서열번호 6 Reverse AGATGCGGATGCCCTCCA
pMYH2 서열번호 7 Forward GGGCTCAAACTGGTGAAGC
서열번호 8 Reverse AGATGCGGATGCCCTCCA
pMYH13 서열번호 9 Forward CACAGGGCTCTGGCCGACAT
서열번호 10 Reverse CGTGCGCACAGGGGTGTAGT
pADPRM 서열번호 11 Forward CATCCTGAGACCGTGCCTTCA
서열번호 12 Reverse TTCCGCATTTGGGTTGTGCT
pSCO1 서열번호 13 Forward TCCTCACGGACTCGGGGTTT
서열번호 14 Reverse GTGGGGTCTCTGCTGCCCTT
pTMEM220 서열번호 15 Forward CCCAGACGCAGAACTGTGGG
서열번호 16 Reverse GTTGTATGCCAAGCCGGCAG
pENSSSCG00000029441 서열번호 17 Forward TCGTGCTGGAGCAGGAGGAG
서열번호 18 Reverse AGGTGTCTGTGGCCTTGGGG
pENSSSCG00000018006 서열번호 19 Forward AGAACCAGCCCTTCGATGCC
서열번호 20 Reverse TGGCATACACATCCTCCGGC
pGAPDH 서열번호 21 Forward GGGCATGAACCATGAGAAGT
서열번호 22 Reverse GGGCATGAACCATGAGAAGT
그 결과, 도 4의 a 및 b에서 볼 수 있듯이, 랜드레이스에 비하여, 재래돼지의 등심 및 후지에서 MYH3 유전자의 mRNA 발현이 월등히 높음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질 중에서도 특히, 적색도와 근내지방함량을 결정하는 주요 유전자임을 알 수 있었다.
실시예 3. 돼지 MYH3 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 제작
상기 실시예 2를 통해 MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질 중에서도 특히, 적색도와 근내지방함량을 결정하는 유전자임이 규명됨에 따라, 상기 유전자의 생체 내(in vivo) 활성을 확인하기 위하여, 하기 3-1 내지 3-2에 따른 방법으로 돼지 MYH3 유전자가 삽입된 형질전환 마우스를 제작하여 이를 이용하였다.
실시예 3-1. 형질전환 벡터의 제작
먼저, 돼지 MYH3 유전자가 삽입된 형질전환 마우스를 제작하고자, MYH3 유전자가 삽입된 재조합 CAGGS-MYH3-Flag 발현벡터를 제조하였다.
구체적으로, 돼지 MYH3를 과발현하는 벡터를 제작하기 위해, 돼지 MYH3 유전자의 mRNA 전체 염기서열을 확인한 후, 총 4부분으로 나누어 DNA 단편을 각각 인위적으로 합성하였다. 첫 번째 단편은 1,417bp로 양쪽에 XbaI과 BglII 효소 site를 양끝 단면에 추가하여 인위적 합성하였다. 두 번째 단편은 1,745bp로 BglII와 SalI를 합성하였으며, 세 번째 단편은 1,777bp로 SalI와 SacII를 합성하였고, 마지막 네 번째 944bp로 SacII와 EcoRI으로 합성하였다. 완성된 4개의 DNA 단편을 말단에 인위적으로 결합시킨 효소 site를 이용하여 결합(Ligation)시켜 최종적으로 돼지 MYH3 유전자의 전체 mRNA를 포함하는 유전자 단편을 완성할 수 있었다.
이후 과발현 벡터에 도입하기 위해 도 5에 나타낸 바와 같은 CAGGS-EGFP-Puro 벡터를 XbaI과 EcoRI으로 절단한 후, 앞서 제작한 돼지 MYH3 유전자 mRNA의 전체 단편을 삽입시킴으로써 최종적으로 돼지 MYH3 형질전환벡터를 제작을 완료하였다(도 6).
상기 벡터의 구조는 6에 나타내었으며, 벡터의 염기 서열은 서열번호 2로 표시하였다.
실시예 3-2. 형질전환 마우스의 제작
실시예 3-2-1. 형질전환 마우스의 제작 방법
상기 실시예 3-1을 통해 제작한 벡터를 이용하여 형질전환 마우스를 제작하였다.
구체적으로, C57BL/6n 마우스의 수정란을 획득한 후 미세주입기법(microinjection)을 사용하여 상기에 제작된 형질전환 벡터를 수정란의 핵 안으로 도입하였다.
그 결과, 총 47마리의 F0 founder를 확인하였다.
실시예 3-2-2. mRNA 발현 분석을 통한 외래 유전자 도입 여부 확인
상기 실시예 3-2-1을 통해 제작한 형질전환 마우스에 MYH3 유전자가 도입되었는지 확인하기 위해, 상기 유전자의 mRNA 발현 여부를 분석하였다.
구체적으로, PCR 실험 조건은 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 40회 반복하였으며, 사용한 프라이머는 하기 표 2에 나열하였다.
유전자 구분 방향 염기서열(5'→3')
pMYH3 서열번호 23 Forward CCGAGAGCTGGAGTTTGA
서열번호 24 Reverse CTCCCATATGTCCTTCCGAGT
그 결과, 도 7의 a에서 볼 수 있듯이, MYH3 유전자가 삽입되어 mRNA를 발현하는 형질전환 마우스(21, 24, 26, 27, 28번)를 확인할 수 있었다.
실시예 3-2-3. 단백질 발현 분석을 통한 외래 유전자 도입 여부 확인
상기 실시예 3-2-1을 통해 제작한 형질전환 마우스에 MYH3 유전자가 도입되었는지 확인하기 위해, 상기 유전자의 단백질 발현 여부를 분석하였다.
구체적으로, 야생형 마우스(WT)와 형질전환 마우스(TG)의 후지 근육조직을 채취한 후, RIPA 버퍼에 단백질 분해 억제제를 첨가하여 초음파 분쇄함으로써 조직을 분해하였다. 이후, 저온원심분리기를 통해 조직과 단백질을 분리하여 상층액에서 단백질을 회수하였다. 회수한 단백질은 BSA 단백질 어세이 시약(bio-rad)을 이용하여 정량한 후, 4x 단백질 로딩 버퍼(1x)로 100℃에서 약 10분간 가열하였다. 준비된 단백질을 이용하여 웨스턴블롯을 수행하기 위해, SDS-PAGE 겔에 약 2시간 동안 상기 단백질을 영동하였다. 이후, 영동된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 5% skim milk를 이용하여 1시간 동안 블로킹하였고, 실험 목적에 맞는 일차 항체(Anti-Flag M2(F1804, Sigma-Aldrich) 및 b-actin(#4970, Cell signaling))를 첨가하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 TBST 용액으로 세척한 후 이차 항체를 2시간 동안 반응시킨 뒤, ECL 시약을 처리하였고, LAS-300 luminescent image analyzer system(Fujifilm)을 이용하여 단백질에 결합한 항체의 신호를 확인하였다. 실험에 사용된 이차 항체는 일차 항체에 따라 달리 사용하였다.
그 결과, 도 7의 b에서 볼 수 있듯이, 형질전환 마우스 중에서도 24번에서 MYH3 유전자의 단백질 발현량이 가장 높음을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 형질전환 유전자의 단백질의 발현도가 가장 높았던 24번 마우스를 활용하여 교배 후 번식시켰으며, 그 모습은 도 8에 나타내었다.
실시예 3-3. 형질전환 마우스의 근육 형태 확인
육질 형질 결정에 관한 MYH3 유전자의 기능을 확인하기 위해, 상기 실시예 3-2를 통해 제작한 형질전환 마우스의 육질 형질을 조사하였다.
먼저, 도 9의 a에서 볼 수 있듯이, 돼지 MYH3 유전자가 형질전환된 마우스(우; TG)의 뒷다리의 근육은 야생형 마우스(좌; WT)에 비해 더욱 붉은색을 띄는 것을 확인할 수 있었다.
이후, 근육 형태를 더욱 자세히 확인하기 위하여, ATPase 염색을 수행하였다. 야생형 및 형질전환 마우스의 뒷다리 근육을 회수하여 30% 수크로스(sucrose) 용액에 밤새처리 한 후, OCT compound를 이용하여 -25℃에서 10㎛ 크기로 조직절편(tissue-section)한 뒤, 4% PEA으로 1시간 동안 고정하였다. 이후 흐르는 물에서 10분 동안 세척하였고, 60% 이소프로판올(isopropanol)을 이용하여 세척한 후, ATPase 염색 키트(ATPase stain lyopilized powder for histoenzymatic reaction kit, Bio optica사)를 이용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 9의 b에서 볼 수 있듯이, 야생형 마우스(좌; WT)에 비하여, 상기 유전자가 삽입된 형질전환 마우스(우; TG)는 뒷다리 근육에 적색근이 더 많이 분포함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 근육조직 내 지방의 분포를 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 수행하였다. 구체적으로, 상기 조직절편을 0.3% Oil Red O 용액에 1시간 동안 반응시켰다.
그 결과, 도 9의 c에서 볼 수 있듯이, 야생형 마우스(좌; WT)에 비하여, 형질전환 마우스(우; TG)에서 염색 정도가 더 강함을 확인함으로써, 형질전환 마우스의 뒷다리 근육에는 지방의 함량이 더 많음을 확인할 수 있었다.
이를 종합하면, MYH3 유전자는 적색근을 축적시켜 적색도를 향상시키며, 근내지방함량을 축적시키는 원인 유전자임을 알 수 있었다.
실시예 3-4. 형질전환 마우스의 근육 내 유전자 발현 패턴 확인
실시예 3-4-1. 백색근 / 적색근 형성 유전자의 발현 패턴 확인
육질 형질 결정에 관한 MYH3 유전자의 기능을 확인하기 위해, 상기 실시예 3-2를 통해 제작한 형질전환 마우스의 백색근/적색근 형성 유전자의 발현 패턴을 조사하였다.
구체적으로, 야생형 마우스(WT)와 형질전환 마우스(TG)의 후지 근육조직을 채취하였고, 상기 실시예 2-3에 따른 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기 표 3에 나열하였다.
유전자 구분 방향 염기서열(5'→3')
Myh7 서열번호 25 Forward AGTCCCAGGTCAACAAGCTG
서열번호 26 Reverse TTCCACCTAAAGGGCTGTTG
Myh2 서열번호 27 Forward AGTCCCAGGTCAACAAGCTG
서열번호 28 Reverse GCATGACCAAAGGTTTCACA
Myh1 서열번호 29 Forward AGTCCCAGGTCAACAAGCTG
서열번호 30 Reverse CACATTTTGCTCATCTCTTTG
Myh4 서열번호 31 Forward AGTCCCAGGTCAACAAGCTG
서열번호 32 Reverse TTTCTCCTGTCACCTCTCAACA
Myoglobin 서열번호 33 Forward GCAAGGCCCTGGAGCTCTTC
서열번호 34 Reverse GCTTGGTGGGCTGGACAGTG
Tnnt1 서열번호 35 Forward CCCCCGAAGATTCCAGAAGG
서열번호 36 Reverse TGCGGTCTTTTAGTGCAATGAG
Tnni1 서열번호 37 Forward ATGCCGGAAGTTGAGAGGAAA
서열번호 38 Reverse TCCGAGAGGTAACGCACCTT
Tnnc1 서열번호 39 Forward GCGGTAGAACAGTTGACAGAG
서열번호 40 Reverse CCAGCTCCTTGGTGCTGAT
Aldoa 서열번호 41 Forward ACTCTCTGCTGACCGGGCTCT
서열번호 42 Reverse AATGCTTCCGGTGGACTCAT
Pvalb 서열번호 43 Forward ATCAAGAAGGCGATAGGAGCC
서열번호 44 Reverse GGCCAGAAGCGTCTTTGTT
Tnnt3 서열번호 45 Forward GGAACGCCAGAACAGATTGG
서열번호 46 Reverse TGGAGGACAGAGCCTTTTTCTT
Tnni2 서열번호 47 Forward AGAGTGTGATGCTCCAGATAGC
서열번호 48 Reverse AGCAACGTCGATCTTCGCA
Tnnc2 서열번호 49 Forward ATGGCAGCGGTACTATCGACT
서열번호 50 Reverse CCTTCGCATCCTCTTTCATCTG
GAPDH 서열번호 51 Forward GAAGGGCATCTTGGGCTACAC
서열번호 52 Reverse GCAGCGAACTTTATTGATGGTATT
또한, 상기 실시예 3-2-3에 따른 방법으로 웨스턴블롯을 수행하였으며, 이때 사용한 일차항체는 다음과 같다: Anti-Flag M2(F1804, Sigma-Aldrich), MYH7(SC-53089, Santa cruz biotechnology), MYH4(H00004622-B01P, Abnova) 및 b-actin(#4970, Cell signaling).
그 결과, 도 10의 a에서 볼 수 있듯이, 야생형 마우스에 비하여, 형질전환 마우스에서는 적색근의 일종으로 slow type 유전자인 MYH7 유전자의 mRNA 및 단백질의 발현이 급격하게 증가함을 확인하였다.
또한, 도 10의 b에서 볼 수 있듯이, 야생형 마우스에 비하여, 형질전환 마우스에서는 백색근의 일종인 fast type 유전자(Aldoa, Pvalb, Tnnf3, Tnnl2, Tnnc2)는 발현량에서 유의적인 차이가 없으나, 적색근의 일종인 slow type에 영향을 미치는 유전자(Myoglobin, Tnnt1, Tnnl1, Tnnc1)들은 모두 mRNA 발현양이 증가함을 확인하였다.
실시예 3-4-2. 지방 축적 패턴 및 관련 유전자의 발현 패턴 확인
아울러, 육질 형질 결정에 관한 MYH3 유전자의 기능을 확인하기 위해, 상기 실시예 3-2를 통해 제작한 형질전환 마우스의 지방 축적 패턴 및 관련 유전자의 발현 패턴을 조사하였다.
먼저, 지방 축적 패턴을 확인하기 위해 조직상의 형태를 확인하고자 하였고, 이를 위해 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색을 수행하였다. 야생형 마우스(WT) 및 형질전환 마우스(TG)의 근육 조직을 이용하여 파라핀 엠베딩(Paraffin embedding)한 후, 4㎛의 두께로 조직을 절편하였다. 이후 자일렌(xylene)을 이용하여 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 75%, 50% 알코올을 순서대로 이용하여 탈수한 후, 흐르는 물에 5분간 세척하였다. 이후, Myyer's 헤마톡실린(hematoxylin) 용액에 1분간 처리한 후 흐르는 물에 20분간 세척하고, 에오신(esoin)에 1분간 처리한 후 탈수 및 클리어링(clearing) 과정을 수행하였고, 이후 현미경 상에서 조직의 염색 상태를 확인하였다.
또한, 형질전환 마우스의 근육조직에서 지방 축적 유전자의 발현 패턴을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-3에 따른 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기 표 4에 나열하였다.
유전자 구분 방향 염기서열(5'→3')
CD36 서열번호 53 Forward AATGGCACAGACGCAGCCT
서열번호 54 Reverse GGTTGTCTGGATTCTGGA
LPL 서열번호 55 Forward GTACCTGAAGACTCGCTCTC
서열번호 56 Reverse AGGGTGAAGGGAATGTTCTC
Fabp4 서열번호 57 Forward GATGCCTTTGTGGGAACCTG
서열번호 58 Reverse TCCTGTCGTCTGCGGTGATT
Fto 서열번호 59 Forward GTCAGAGAGAAGGCCAATGA
서열번호 60 Reverse TAGCAGTCTCCCTGGTGAAG
Pgc1α 서열번호 61 Forward CCCTGCCATTGTTAAGACC
서열번호 62 Reverse TGCTGCTGTTCCTGTTTTC
Adiponectin 서열번호 63 Forward AATGGCACACCAGGCCGTGAT
서열번호 64 Reverse TCTCCAGGCTCTCCTTTCCTG
그 결과, 도 10의 c 및 d에서 볼 수 있듯이, 야생형 마우스에 비하여, 형질전환 마우스에서는 근세포 사이 간격이 크며, 그 사이로 지방이 침착되는데, 지방분화 유전자의 발현 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MYH3 유전자는 적색근 관련 유전자의 발현 증가에 영향을 미칠 뿐만 아니라 근육 내 지방 형성을 향상시키는 원인 유전자임을 알 수 있었다.
실시예 4. MYH3 유전자의 유전형 분석
MYH3 유전자의 유전형을 분석하기 위하여, 돼지 MYH3 유전자의 전사시작지점(transcription start site; TSS)으로부터 5'-UTR 3kb, 및 종결코돈(stop codon)으로부터 3'-UTR 1kb 까지의 염기서열을 해독하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 육질에 영향을 미치는 MYH3 유전자에서 QTN(i.e., MYH3-1805_-1810delGGACTG)을 확인하였다(적색점으로 표시). 또한, 랜드레이스(LANDLACE)와 제주재래돼지(KNP) 사이에 염기 변이가 존재하며, 이는 엑손(exon) 3에 있는 개시코돈(ATG)으로부터 5'-UTR에 위치함을 확인하였다. 제주재래돼지의 경우 -1805 bp 내지 -1810 bp의 부위가 결손되었음을 확인하였으며, 이는 근육형성 조절 인자(myogenesis regulatory factor; MRF)의 결합 부위임을 확인하였다.
실시예 5. MYH3 유전자의 유전형 확인을 통한 돼지의 품종 판단
상기 실시예 3을 통해 랜드레이스 및 제주재래돼지의 MYH3 유전자 간에 염기 변이가 존재함을 확인함에 따라, 상기 염기 변이를 이용하여 돼지의 육질을 판단하고자 하였다.
구체적으로, 프라이머(forward: 5'-TGG TCT TTC CTA ATT GGT GAC AT-3' (서열번호 65), reverse: 5'-AGT TTT GAG CAA GGC TTT TGT T-3' (서열번호 66))를 이용하여 상기 염기 변이를 포함한 부분을 증폭하였다. 각 돼지의 혈액으로부터 분리한 100 ng/㎕의 DNA를 주형으로 하였으며, 10×반응 완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM의 정방향 및 역방향 프라이머, 1.5 units Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이온수를 첨가하여 25 ㎕ 용량으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭은 PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 총 30 cycle을 수행하였고, 프라이머의 어닐링 온도는 60℃에서 진행하였다. 증폭 산물은 EtBr(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
이후, HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 상기 원인 염기 변이의 염기서열 중에서 'A▼CGT' 부분을 절단하였다. 상기 증폭한 PCR 산물을 제한효소(HpyCH4Ⅳ)를 이용하여 절단하였고, 제한효소반응 조건은 공급자의 지시에 따라 PCR 증폭 산물 3㎕와 10X buffer 1㎕, 제한효소 0.3㎕, DW 5.7㎕를 혼합하여 37℃에서 밤새 반응하였다. EtBr(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여, 제한효소에 의한 랜드레이스 및 제주재래돼지 MYH3 유전자의 절단 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 육질이 좋지 않은 랜드레이스(LANDLACE) 돼지는 유전자가 절단되지 않아 250 bp에서 한 개의 밴드로 나타남을 확인하였고(1/1; 비 절단형), 육질이 우수한 제주재래돼지(KNP)는 유전자가 절단되어 167 및 77 bp에서 두 개의 밴드로 나타냄을 확인하였다(2/2; 절단형). 또한, 랜드레이스와 제주재래돼지의 교배 품종은 250 및 167 bp에서 두 개의 밴드로 나타냄을 확인하였다(1/2; 절단형).
상기 결과를 통해, 돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자인 MYH3의 변이를 확인함으로써 외래돼지와 토종돼지를 구별할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 돼지의 육질을 판단할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Genetic marker for discriminating level of meat quality of pig and use thereof <130> KPA161028-KR <160> 66 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3400 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 tggtggttat tgccgctgct tccaccctca gggttctcct ggcgagcgga gctccctgcc 60 tacctcggac cctcgttcca tggcccgggc aggcttcttc ccctcgtgcc ttccagcccc 120 tcatgtgcag aagcaggccg tcaggcagat gacccgagac ctcccagccg agcctctgtg 180 ctcgtggagg acgtgtgacg gagagaagga agacaggccg gctgacgggg gaaaagctgg 240 ggtgggaggc cgtcagcctt gagctcgcct tgggctcagg gatgcgacgt ggcttcacgc 300 ttgacaagaa gctcaaagaa atcctgtgtg gaaaacgtcc tctcggtgtc ccggaggtgg 360 gatggatgtg gttgtgcaga ggtgggtgaa ccggcgccaa ctaaaggtca aaagcaagcc 420 ggccccaacc gcggcccctg gtgtttaaga agggaccgcc agcacccttc ccctgaccac 480 ccagcacacg tcacagcctg agacgtagcc agggcccctg cactgtccct 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atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 480 gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 540 gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 600 tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 660 gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc 720 ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 780 gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 840 ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 900 tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 960 cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1020 ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1080 tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc 1140 cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc 1200 gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1260 ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct 1320 gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1380 gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc 1440 tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt 1500 cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg 1560 acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1620 gctctagagc caccatgagc agcgacactg aaatggaagt gttcggcata gccgctccct 1680 tcctccgcaa gtcggaaaag gagaggatcg aggcgcagaa ccagcccttc gatgccaaaa 1740 cctactgctt cgtggtcgac tcgaaggaag agtacgccaa ggggaaaatt aagagcaccc 1800 aggatgggaa ggtcacggtg gagaccgaag acaacaggac cctggtggtg aagccggagg 1860 atgtgtatgc catgaacccc cccaagtttg accggatcga ggacatggcc atgctgacgc 1920 acctgaacga gccggccgtg ctgtacaacc tcaaggaccg gtacacctcc tggatgatct 1980 atacctactc gggcctcttc tgtgtcaccg tcaaccccta caagtggctg ccggtgtaca 2040 accccgaggt ggtggagggc taccgaggca aaaagcgcca ggaggccccg ccccacatct 2100 tctccatctc 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Sequence <220> <223> Tnnt1 R-primer <400> 36 tgcggtcttt tagtgcaatg ag 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnni1 F-primer <400> 37 atgccggaag ttgagaggaa a 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnni1 R-primer <400> 38 tccgagaggt aacgcacctt 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnnc1 F-primer <400> 39 gcggtagaac agttgacaga g 21 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnnc1 R-primer <400> 40 ccagctcctt ggtgctgat 19 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldoa F-primer <400> 41 actctctgct gaccgggctc t 21 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldoa R-primer <400> 42 aatgcttccg gtggactcat 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pvalb F-primer <400> 43 atcaagaagg cgataggagc c 21 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pvalb R-primer <400> 44 ggccagaagc gtctttgtt 19 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnnt3 F-primer <400> 45 ggaacgccag aacagattgg 20 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnnt3 R-primer <400> 46 tggaggacag agcctttttc tt 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnni2 F-primer <400> 47 agagtgtgat gctccagata gc 22 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnni2 R-primer <400> 48 agcaacgtcg atcttcgca 19 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnnc2 F-primer <400> 49 atggcagcgg tactatcgac t 21 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnnc2 R-primer <400> 50 ccttcgcatc ctctttcatc tg 22 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F-primer <400> 51 gaagggcatc ttgggctaca c 21 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R-primer <400> 52 gcagcgaact ttattgatgg tatt 24 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 F-primer <400> 53 aatggcacag acgcagcct 19 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 R-primer <400> 54 ggttgtctgg attctgga 18 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL F-primer <400> 55 gtacctgaag actcgctctc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL R-primer <400> 56 agggtgaagg gaatgttctc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 F-primer <400> 57 gatgcctttg tgggaacctg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 R-primer <400> 58 tcctgtcgtc tgcggtgatt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fto F-primer <400> 59 gtcagagaga aggccaatga 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fto R-primer <400> 60 tagcagtctc cctggtgaag 20 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgc1 alpha F-primer <400> 61 ccctgccatt gttaagacc 19 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgc1 alpha R-primer <400> 62 tgctgctgtt cctgttttc 19 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin F-primer <400> 63 aatggcacac caggccgtga t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin R-primer <400> 64 tctccaggct ctcctttcct g 21 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH3 variation F-primer <400> 65 tggtctttcc taattggtga cat 23 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH3 variation R-primer <400> 66 agttttgagc aaggcttttg tt 22

Claims (13)

  1. 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지육의 근내지방함량 또는 육색 판단용 유전자 마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지육의 근내지방함량 또는 육색 판단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 65 및 66으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것인, 조성물.
  6. 제3항의 조성물을 포함하는, 돼지육의 근내지방함량 또는 육색 판단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 키트.
  8. 제1항의 유전자 마커를 포함하는, 돼지육의 근내지방함량 또는 육색 판단용 마이크로어레이.
  9. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 유전자 마커를 증폭시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지육의 근내지방함량 또는 육색을 판단하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭 산물에 ACGT의 연속된 염기가 포함된 경우, 돼지의 육질 형질은 외래돼지의 것보다 우수한 것으로 판단하는 (c) 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  11. 제1항의 유전자 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 토종돼지 판별용 조성물.
  12. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 유전자 마커를 증폭시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 토종돼지의 판별 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 증폭 산물에 ACGT의 연속된 염기가 포함된 경우, 한국 토종돼지인 것으로 판단하는 (c) 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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