KR101941427B1 - Diagnostic method for toxicity of bisphenol A - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비스페놀 A의 독성 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 비스페놀 A의 농도 및 노출 시간의 증가는 혈청 저밀도 지단백질의 구조 및 전기적 성질을 변화시켜 단백질 응집현상으로 인한 아가로즈 겔 상에서의 이동성 변화를 나타내며, 피부섬유세포에서 노화를 증가시킨다. 또한, 비스페놀 A는 제브라피쉬 배아의 생존율 및 부화율을 감소시키고, 기형 발생률을 증가시키며, 제브라피쉬 성체의 생존율을 감소시키고, 난소 및 간 손상을 유발한다.
따라서, 본 발명은 비스페놀 A에 의해 유발되는 지표들을 분석함으로써 미지의 시료로부터 비스페놀 A의 존재 여부를 확인할 수 있으며, 비스페놀 A에 의한 인체 내 손상 정도를 진단할 수 있고, 비스페놀 A와 관련된 각종 질병 및 건강에 미치는 영향을 진단 및 평가할 수 있다.The present invention relates to a method for diagnosing the toxicity of bisphenol A, wherein an increase in the concentration and exposure time of bisphenol A changes the structure and electrical properties of serum low density lipoproteins, and thus the mobility on the agarose gel Changes, and increases aging in skin fibroblasts. In addition, bisphenol A reduces the survival and hatching rates of zebrafish embryos, increases malformation incidence, decreases the survival rate of zebrafish adults, and causes ovarian and liver damage.
Accordingly, the present invention can confirm the presence of bisphenol A from an unknown sample by analyzing indicators induced by bisphenol A, diagnose the degree of damage to the body by bisphenol A, Health effects can be diagnosed and evaluated.
Description
본 발명은 비스페놀 A에 의한 혈액 독성, 생식 독성 및 배아 독성 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for diagnosing blood toxicity, reproductive toxicity and embryotoxicity by bisphenol A.
비스페놀 A(Bisphenol A; BPA)는 대표적인 환경 호르몬으로서 인체 내에서 세포외 극성 독성 뿐만 아니라 내분비계 교란활성을 가진 내분비계 장애물질로 알려져 있다. 내분비계 장애물질(Endocrine disrupting chemicals; EDC(= 환경 호르몬, 내분비 교란물질, 식물성 에스트로겐 등으로 혼용되고 있음))이란 체내 유입 시, 스테로이드 호르몬과 유사 작용을 하는 외인성 호르몬 유사 물질로, 체내에 유입되어 내분비계의 정상적인 기능을 방해하거나 영향을 미침으로써 심각한 장애를 유발하는 물질이다. 미국 환경보호청(Environmental Protection Agency USA)에 의하면 지금까지 보고된 잠재적 내분비계 장애물질은 87,000가지 이상이며, 이들은 각종 산업용 화학물질, 살충제 및 제초제 등의 농약류, 유기중금속류, 소각장에서 배출되는 다이옥신류, 식물에 존재하는 피토에스트로겐(phytoestrogen) 등의 호르몬 유사 물질, 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol; DES), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol) 등의 의약품으로 사용되는 합성 에스트로겐류, 기타 식품, 식품 첨가물, 세정제 등 일상생활에서 흔히 접할 수 있는 물질일 가능성이 크다는 데에 문제점이 있다.Bisphenol A (BPA) is a representative environmental hormone and is known to be an endocrine disrupter with endocrine disrupting activity as well as extracellular toxicity in the human body. Endocrine disrupting chemicals (EDC) are a kind of extrinsic hormone-like substance that acts like a steroid hormone when it enters the body and enters the body. It is a substance that causes serious disturbances by interfering with or affecting the normal function of the endocrine system. According to the Environmental Protection Agency USA, there are more than 87,000 potential endocrine disruptors reported so far, including industrial chemicals, insecticides and herbicides, pesticides, organic heavy metals, dioxins from incinerators, plants Hormone-like substances such as phytoestrogens present in the body, synthetic estrogens used as medicines such as diethylstilbestrol (DES) and ethinyl estradiol, other foods, food additives, detergents There is a problem in that there is a high possibility that it is a substance that is frequently encountered in everyday life.
내분비계 장애물질은 인체의 내분비계에 작용하여 여성 호르몬과 같은 작용을 일으켜 호르몬의 분비를 차단, 과잉, 과소 분비하게 하고, 불임, 성기능 장애, 정자수 감소 등의 생식기능 이상을 초래할 가능성이 있다. 이외에도 내분비계 장애물질에 노출되면 과체중, 성장억제, 간독성, 고환암, 유방암, 당뇨병, 면역기능 저하, 고지혈증, 요도하열, 잠복고환 및 기형아 출산 등을 초래하며, 야생동물에서도 성기 기형, 암수 성비의 불균형, 짝짓기 감소, 동성 간의 교배 행위, 새끼 수의 감소, 수컷의 암컷화 등의 현상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 특히, 비스페놀 A는 외인성 에스트로겐으로 에스트로겐 수용체에 결합하여 유사 작용을 일으키는바, 즉, 유사 호르몬을 만들어 고환을 축소시키고 수컷을 암컷화하는 것은 물론 암컷에서는 자궁 상피조직 이상 증식을 유발하고, 임신부의 독성이 태아로까지 이어져 잠재 위험이 큰 것으로 보고되어 있다. 이러한 환경 호르몬은 생체 호르몬과는 달리 쉽게 분해되지 않고 환경 및 체내에 수년간 잔류하며, 인체 등 생체 내 지방 및 조직에 농축되는 성질이 있다고 보고되고 있다.Endocrine disruptors act on the endocrine system of the human body and cause them to function like female hormones, which can block, over and under secretion of hormones, and cause reproductive abnormalities such as infertility, sexual dysfunction, . In addition, exposure to endocrine disruptors can lead to overweight, growth retardation, hepatotoxicity, testicular cancer, breast cancer, diabetes, impaired immune function, hyperlipidemia, urethral hypothermia, latent testis and birth defects, It is known that there are phenomena such as decrease of mating, breeding of same sex, decrease of the number of the litter, and males of the male. In particular, bisphenol A binds to the estrogen receptor with exogenous estrogens, resulting in a similar action, that is, it produces hypothalamus to reduce testicles and males, as well as females, causing uterine epithelium abnormal proliferation, This leads to the fetus and is reported to have a high potential risk. Unlike biohormones, these environmental hormones are not easily decomposed and remain in the environment and the body for years, and have been reported to be enriched in the body fat and tissues such as the human body.
이러한 유해성과 독성에도 불구하고, 비스페놀 A는 에폭시 수지 및 플라스틱류 생산의 기초물질로 가장 많이 사용되는 물질이며, 사용되는 산업 분야로는 자동차 부품, 젖병, 포장재, 치과용 수지, 병마개, 각종 플라스틱 등의 원료로 다양하다. 더욱이, pH 7의 수용액에서 300 mg/L의 고농도로 용해 가능하여 생활하수, 산업용 하수, 오염된 토양 등에서 빈번하게 검출되고 있을 뿐만 아니라, 난분해성과 지방 친화성 특성으로 인해 그 위험 정도가 더욱 심각하다. 비스페놀 A에 의한 피해 정도는 개인적인 민감도에 따라 차이가 날 수 있기 때문에 비스페놀 A의 독성 및 피해 정도를 판별하는 방법의 개발이 시급한 실정이다.Despite these hazards and toxicity, bisphenol A is the most widely used base material for the production of epoxy resins and plastics. Automotive parts, bottles, packaging materials, dental resins, bottle caps, various plastics . Furthermore, it can be dissolved at a high concentration of 300 mg / L in an aqueous solution of pH 7, and is frequently detected in domestic sewage, industrial sewage, contaminated soil, etc., Do. Since the degree of damage caused by bisphenol A may vary depending on individual sensitivities, it is urgent to develop a method for determining the degree of toxicity and damage of bisphenol A.
본 발명의 목적은 비스페놀 A에 의해 유도되는 지표를 이용하여 비스페놀 A의 독성을 진단하는 방법을 제공하는 데에 있다.It is an object of the present invention to provide a method for diagnosing the toxicity of bisphenol A using an indicator induced by bisphenol A.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비스페놀 A에 노출된 포유동물의 시료를 수집하는 제 1단계, 상기 시료에서 저밀도 지단백질(LDL)의 응집 증가 여부, 저밀도 지단백질의 산화 증가 여부 및 피부섬유세포의 노화 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 2단계 및 상기 지표를 대조군과 비교하는 제 3단계를 포함하는 비스페놀 A의 독성 진단방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing bisphenol A, comprising: a first step of collecting a sample of a mammal exposed to bisphenol A; a step of increasing the concentration of low density lipoprotein (LDL) A second step of examining one or more indicators selected from the group consisting of an increase in aging, and a third step of comparing the indicator with a control group. The present invention also provides a method for diagnosing toxicity of bisphenol A.
또한, 본 발명은 비스페놀 A를 용매에 용해시켜 비스페놀 A 용해물을 준비하는 제 1단계, 상기 비스페놀 A 용해물에 제브라피쉬 배아를 배양하는 제 2단계, 상기 제브라피쉬 배아의 생존율 감소 여부, 부화율 감소 여부, 기형 발행률 증가 여부 및 활성산소종 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 3단계 및 상기 지표를 대조군과 비교하는 제 4단계를 포함하는 비스페놀 A의 독성 진단방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing bisphenol A, comprising the following steps: a first step of dissolving bisphenol A in a solvent to prepare a bisphenol A lysate, a second step of culturing the zebrafish embryo in the bisphenol A lysate, a reduction in the survival rate of the zebrafish embryo, A third step of examining one or more indicators selected from the group consisting of an increase in malformed release rate and an increase in reactive oxygen species and a fourth step of comparing the indicator with a control group to provide a diagnosis method of toxicity of bisphenol A do.
또한, 본 발명은 비스페놀 A와 혼합된 사료를 준비하는 제 1단계, 상기 비스페놀 A와 혼합된 사료를 제브라피쉬 성체에 공급하는 제 2단계, 상기 제브라피쉬 성체의 생존율 감소 여부, 알의 생산능력 감소 여부, 난소 손상 여부 및 간 손상 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 3단계 및 상기 지표를 대조군과 비교하는 제 4단계를 포함하는 비스페놀 A의 독성 진단방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing zebrafish comprising the steps of: preparing a feed mixed with bisphenol A; feeding a feed mixed with bisphenol A to a zebrafish adult; reducing the survival rate of the zebrafish adult; A third step of examining at least one indicator selected from the group consisting of ovarian injury, ovarian injury and liver damage, and a fourth step of comparing the indicator with a control group.
본 발명에 따르면, 비스페놀 A의 농도 및 노출 시간의 증가는 혈청 저밀도 지단백질의 구조 및 전기적 성질을 변화시켜 단백질 응집현상으로 인한 아가로즈 겔 상에서의 이동성 변화를 나타내며, 피부섬유세포에서 노화를 증가시킨다. 또한, 비스페놀 A는 제브라피쉬 배아의 생존율 및 부화율을 감소시키고, 기형 발생률을 증가시키며, 제브라피쉬 성체의 생존율을 감소시키고, 난소 및 간 손상을 유발한다. According to the present invention, the increase in the concentration of bisphenol A and the exposure time changes the structure and electrical properties of serum low density lipoprotein, which indicates mobility on agarose gel due to protein aggregation and increases aging in skin fibroblasts. In addition, bisphenol A reduces the survival and hatching rates of zebrafish embryos, increases malformation incidence, decreases the survival rate of zebrafish adults, and causes ovarian and liver damage.
따라서, 본 발명은 비스페놀 A에 의해 유발되는 지표들을 분석함으로써 미지의 시료로부터 비스페놀 A의 존재 여부를 확인할 수 있으며, 비스페놀 A에 의한 인체 내 손상 정도를 진단할 수 있고, 비스페놀 A와 관련된 각종 질병 및 건강에 미치는 영향을 진단 및 평가할 수 있다.Accordingly, the present invention can confirm the presence of bisphenol A from an unknown sample by analyzing indicators induced by bisphenol A, diagnose the degree of damage to the body by bisphenol A, Health effects can be diagnosed and evaluated.
도 1은 비스페놀 A에 의한 혈청 저밀도 지단백질(LDL)의 구조 및 전기적 성질의 변형을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 2는 비스페놀 A에 의한 피부섬유세포의 손상 및 노화 정도를 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-β-gal) 염색으로 확인한 결과이다.
도 3은 비스페놀 A에 의한 제브라피쉬 배아 독성을 확인한 결과로, (A) 생존율, (B) 부화율, (C) 기형 발생률 및 (D) 활성산소종(디하이드로에티디움(dihydroethidium; DHE) 염색)을 나타낸 것이다.
도 4는 비스페놀 A에 의한 제브라피쉬 배아의 부화율 및 기형 발생률을 확인한 결과이다.
도 5는 비스페놀 A 및 고지혈증 유발 식이에 의한 제브라피쉬 성체 독성을 확인한 결과로, (A) 생존율, (B) 알의 생산 능력, (C) 난소 모양 및 (D) 난소 무게를 나타낸 것이다.
도 6은 비스페놀 A에 의한 제브라피쉬 성체의 난소 손상을 헤마톡실린 & 에오신 염색으로 확인한 결과이다.
도 7은 비스페놀 A에 의한 제브라피쉬 성체의 간 손상을 헤마톡실린 & 에오신 및 오일 레드 O 염색으로 확인한 결과이다.FIG. 1 shows the results of electrophoretic analysis of the structural and electrical properties of serum low density lipoprotein (LDL) by bisphenol A.
FIG. 2 shows the results of confirming the degree of damage and aging of skin fibroblasts by bisphenol A by aging-related beta-galactosidase (SA-beta-gal) staining.
FIG. 3 shows the results of confirming zebrafish embryotoxicity by bisphenol A, and it was found that (A) survival rate, (B) hatching rate, (C) malformation incidence rate and (D) active oxygen species (dihydroethidium ).
Fig. 4 shows the results of confirming the hatching rate and malformation rate of zebrafish embryos by bisphenol A;
FIG. 5 shows (A) survival rate, (B) egg production ability, (C) ovarian shape and (D) ovarian weight as a result of confirming zebrafish adult toxicity by bisphenol A and hyperlipidemia-inducing diets.
Fig. 6 shows the results of confirming ovarian damage of zebrafish adults by bisphenol A by hematoxylin & eosin staining.
FIG. 7 shows the results of confirming liver damage of zebrafish adults by bisphenol A by hematoxylin & eosin and oil red O staining.
본 발명의 발명자들은 전기영동을 이용하여 비스페놀 A에 의한 혈청 저밀도 지단백질의 손상 정도를 시각화하고, 피부섬유세포에서 노화 유발을 확인하였으며, 제브라피쉬 배아 및 성체를 이용하여 비스페놀 A에 의한 배아 독성 및 생식 독성을 확인하며 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention visualized the degree of damage of serum low-density lipoprotein by bisphenol A using electrophoresis and confirmed aging induction in skin fibroblast cells. Using the zebrafish embryo and adult, embryotoxicity and reproduction by bisphenol A And the present invention has been completed.
본 발명은 비스페놀 A에 노출된 포유동물의 시료를 수집하는 제 1단계, 상기 시료에서 저밀도 지단백질(LDL)의 응집 증가 여부, 저밀도 지단백질의 산화 증가 여부 및 피부섬유세포의 노화 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 2단계 및 상기 지표를 대조군과 비교하는 제 3단계를 포함하는 비스페놀 A의 독성 진단방법을 제공한다.The present invention relates to a method for producing bisphenol A comprising the first step of collecting a sample of a mammal exposed to bisphenol A, a step of collecting low density lipoprotein (LDL), increasing oxidation of low density lipoprotein and increasing aging of skin fibroblasts A second step of examining one or more selected indicators and a third step of comparing the indicator with a control group.
바람직하게는, 상기 시료는 혈청, 조직 또는 세포 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.Preferably, the sample may be selected from, but is not limited to, serum, tissue or cells.
바람직하게는, 상기 저밀도 지단백질의 응집 증가 여부는 혈청에서 분리된 저밀도 지단백질의 전기영동 이동성 분석을 통하여 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.Preferably, the increase in aggregation of the low density lipoprotein can be confirmed through electrophoretic mobility analysis of the low density lipoprotein separated from the serum, but not limited thereto.
또한, 본 발명은 비스페놀 A를 용매에 용해시켜 비스페놀 A 용해물을 준비하는 제 1단계, 상기 비스페놀 A 용해물에 제브라피쉬 배아를 배양하는 제 2단계, 상기 제브라피쉬 배아의 생존율 감소 여부, 부화율 감소 여부, 기형 발행률 증가 여부 및 활성산소종 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 3단계 및 상기 지표를 대조군과 비교하는 제 4단계를 포함하는 비스페놀 A의 독성 진단방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing bisphenol A, comprising the following steps: a first step of dissolving bisphenol A in a solvent to prepare a bisphenol A lysate, a second step of culturing the zebrafish embryo in the bisphenol A lysate, a reduction in the survival rate of the zebrafish embryo, A third step of examining one or more indicators selected from the group consisting of an increase in malformed release rate and an increase in reactive oxygen species and a fourth step of comparing the indicator with a control group to provide a diagnosis method of toxicity of bisphenol A do.
바람직하게는, 상기 용매는 물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.Preferably, the solvent may, but is not limited to, water.
또한, 본 발명은 비스페놀 A와 혼합된 사료를 준비하는 제 1단계, 상기 비스페놀 A와 혼합된 사료를 제브라피쉬 성체에 공급하는 제 2단계, 상기 제브라피쉬 성체의 생존율 감소 여부, 알의 생산능력 감소 여부, 난소 손상 여부 및 간 손상 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 3단계 및 상기 지표를 대조군과 비교하는 제 4단계를 포함하는 비스페놀 A의 독성 진단방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing zebrafish comprising the steps of: preparing a feed mixed with bisphenol A; feeding a feed mixed with bisphenol A to a zebrafish adult; reducing the survival rate of the zebrafish adult; A third step of examining at least one indicator selected from the group consisting of ovarian injury, ovarian injury and liver damage, and a fourth step of comparing the indicator with a control group.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example 1: 비스페놀 A에 의한 저밀도 1: Low density by bisphenol A 지단백질의Lipoprotein 영향 확인 Verify impact
1. 저밀도 1. Low density 지단백질Lipoprotein (low-density lipoprotein; LDL)의 정제(low-density lipoprotein (LDL)) purification
전날 하룻밤 금식한 젊은 남성(평균 22±2세) 18명으로부터 제공받은 혈청에서 LDL(1.019<d<1.063)은 표준 방법(Havel et al., 1955)을 참고하여 염화 나트륨(NaCl) 첨가에 의해 적절히 조정된 밀도를 지니게 한 후, 초원심분리기를 이용하여 분리하였다. 지단백질의 분획은 영남대학교 분석센터의 원심분리기(Himac CP-90α, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 10℃에서 100,000 g로 24시간 동안 원심분리하여 획득하였다.LDL (1.019 <d <1.063) was determined by the addition of sodium chloride (NaCl) according to the standard method (Havel et al., 1955) in 18 sera from young men (mean age 22 ± 2 years) After having a properly adjusted density, it was separated using an ultracentrifuge. The lipoprotein fractions were obtained by centrifugation at 100,000 g for 24 hours at 10 ° C using a centrifuge (Himac CP-90α, Hitachi, Tokyo, Japan) at Yeungnam University Research Center.
2. 비스페놀 A에 의한 저밀도 지단백질의 영향 확인2. Identification of the effects of low density lipoprotein by bisphenol A
비스페놀 A, 저밀도 지단백질 및 구리 이온(Cu2 +)을 농도 별로 처리하여 72시간 동안 반응시킨 후, 0.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동하여 각 시료의 이동성을 분석하였다.Bisphenol A, low density lipoprotein, and copper ions (Cu 2 + ) were treated at different concentrations for 72 hours, and then analyzed for mobility of each sample by electrophoresis on a 0.5% agarose gel.
그 결과, 도 1을 참조하여 보면, 비스페놀 A의 농도가 증가할수록 혈청 저밀도 지단백질의 구조 및 전기적 성질이 변화하여 아가로즈 겔 상에서 이동성이 느려진 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비스페놀 A의 농도가 증가할수록 밴드가 희미해지면서 다량체 형성에 의한 단백질 응집 현상이 관찰되었다. As a result, referring to FIG. 1, it was confirmed that as the concentration of bisphenol A was increased, the structure and electrical properties of serum low density lipoprotein were changed and the mobility was slowed on the agarose gel. Also, as the concentration of bisphenol A increased, the band became blurred and protein aggregation due to formation of multimer was observed.
또한, 구리 이온이 존재 하에 저밀도 지단백질은 산화되어 이동성이 빨라지고 아래쪽으로 더 이동하는 반면, 비스페놀 A 존재 하에 저밀도 지단백질의 산화 및 단백질 변형에 변화가 생겨 이동성이 느려지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비스페놀 a의 농도가 증가할수록 밴드가 희미해지면서 다량체 형성에 의한 단백질 응집 현상이 관찰되었다.In addition, it was confirmed that low density lipoprotein is oxidized in the presence of copper ion to increase mobility and move further downward, while the oxidation and protein modification of low density lipoprotein are changed in the presence of bisphenol A to slow the mobility. Also, as the concentration of bisphenol - a increased, the band became blurred and protein aggregation was observed due to the formation of oligomers.
상기 결과로부터 비스페놀 A가 일정 농도 이상에서 혈청 저밀도 지단백질을 분해하고, 지단백질의 응집을 유발할 수 있음을 확인함으로써, 미지의 시료로부터 비스페놀 A의 존재 여부 확인 및 단백질 응집에 관련된 질병(당뇨, 동맥경화, 치매, 암) 유발에 직접적인 영향을 줄 수 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that bisphenol A could decompose serum low density lipoprotein at a certain concentration or higher and induce aggregation of lipoprotein, thereby confirming the presence of bisphenol A from an unknown sample and diagnosing diseases (diabetes, arteriosclerosis, Dementia, and cancer).
실시예Example 2 : 비스페놀 A에 의한 2: by bisphenol A 피부섬유세포의Of skin fibroblasts 손상 및 노화 확인 Check for damage and aging
비스페놀 A가 피부 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 인간 피부섬유세포(human dermal fibroblast; HDF)를 이용하여 실험을 수행하였다. HDF 세포는 영남대학교 의과대학 해부학 교실에서 제공받았으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. In order to confirm the effect of bisphenol A on skin cells, experiments were conducted using human dermal fibroblast (HDF). HDF cells were obtained from an anatomical classroom at Yeungnam University Medical School and were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin at 37 ° C and 5% CO 2 incubator.
세포는 계대배양하여 p12(passage 12), p14 및 p16의 세포를 이용하였으며, 각각의 계대배양된 세포에 비스페놀 A를 농도 별로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 노화 마커인 노화 관련 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-beta-gal)로 염색하여 세포의 노화 정도를 분석하였다. Cells were subcultured and p12 (passage 12), p14 and p16 cells were used. Each of the subcultured cells was treated with bisphenol A in a concentration-dependent manner and cultured for 24 hours. Then, aging-related beta-galactose And senescence-associated beta-galactosidase (SA-beta-gal).
그 결과, 도 2를 참조하여 보면, 계대배양이 증가함에 따라 노화 관련 베타-갈락토시다제로 염색된 세포의 수가 증가함으로써 피부섬유세포의 노화가 진행된 것을 확인하였으며, 마찬가지로 비스페놀 A의 농도가 증가함에 따라 노화 관련 베타-갈락토시다제로 염색된 세포의 수가 증가함으로써 피부섬유세포의 노화가 진행된 것을 확인하였다.As a result, referring to FIG. 2, it was confirmed that aging of skin fibroblast cells was progressed by increasing the number of cells stained with age-related beta-galactosidase as the subculture increased, and similarly, the concentration of bisphenol A increased Thus, it was confirmed that aging of skin fibroblast cells was progressed by increasing the number of cells stained with beta-galactosidase related to aging.
실시예Example 3 : 비스페놀 A에 의한 3: by bisphenol A 제브라피쉬Zebra fish 배아 독성 확인 Identification of embryotoxicity
비스페놀 A에 의한 배아 독성을 확인하기 위해, 제브라피쉬 배아를 비스페놀 A가 포함된 사육수에 노출시킨 후, 비스페놀 A의 농도 및 노출 시간에 따른 배아 생존율을 측정하였다.In order to confirm the embryotoxicity of bisphenol A, the embryo survival rate of bisphenol A embryos was measured by exposure to bisphenol A - containing water and exposure time.
그 결과, 도 3A를 참조하여 보면, 비스페놀 A의 농도 및 노출 시간이 증가할수록 배아 생존율이 감소하는 것을 확인하였으며, 특히, 비스페놀 A의 농도가 20 μg/L에서는 배아의 사멸 속도가 빨라져 생존율이 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, referring to FIG. 3A, it was confirmed that as the concentration of bisphenol A and exposure time increased, the embryo survival rate decreased. Especially, when the concentration of bisphenol A was 20 μg / L, As shown in Fig.
또한, 도 3B 및 도 4를 참조하여 보면, 비스페놀 A 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 부화율이 감소하는 것을 확인하였으며, 특히, 비스페놀 A의 농도가 10 μg/L 이상에서 부화율이 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.3B and FIG. 4, it was confirmed that the hatching rate decreased in a concentration-dependent manner as the bisphenol A concentration increased. Especially, when the concentration of bisphenol A was higher than 10 μg / L, the hatching rate was abruptly decreased I could confirm.
또한, 도 3C 및 도 4를 참조하여 보면, 72시간까지 배아 발달을 관찰한 결과, 비스페놀 A 농도가 증가함에 따라 배아의 기형 발생률이 3% 이상 증가하는 것을 확인하였다.3C and FIG. 4, the embryo development was observed up to 72 hours. As a result, it was confirmed that the incidence of embryonic development was increased by 3% or more as the bisphenol A concentration increased.
또한, 도 3D를 참조하여 보면, 비스페놀 A 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 디하이드로에티디움(dihydroethidium; DHE)으로 염색된 영역이 증가함으로써 배아 내에 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. Also, referring to FIG. 3D, as the concentration of bisphenol A increases, reactive oxygen species (ROS) are increased in the embryo by increasing the concentration of dihydroethidium (DHE) .
실시예Example 4 : 비스페놀 A에 의한 4: by bisphenol A 제브라피쉬Zebra fish 성체 독성 확인 Identification of adult toxicity
테트라비트(tetra bits) 사료에 비스페놀 A의 농도가 360 ng/일(day)(low dose, LD) 와 720 ng/일(high dose, HD)이 되도록 비스페놀 A를 혼합하여 16주 동안 제브라피쉬에게 식이 공급하였다. 이때, 정상 식이(normal diet; ND)와 고지혈증 유발 식이(high-cholesterol diet; HCD)를 병행하여 실험을 수행하였다. Bisphenol A was mixed in tetra bits of feed to give bisphenol A concentrations of 360 ng / day (low dose, LD) and 720 ng / day (high dose, HD) Dietary supplementation. At this time, the experiment was performed in parallel with the normal diet (ND) and the high-cholesterol diet (HCD).
그 결과, 도 5A를 참조하여 보면, 정상 식이에 비스페놀 A의 혼합은 제브라피쉬의 생존율을 감소시켰으며, 비스페놀 A가 고농도로 혼합되었을 때 생존율이 더욱 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 고지혈증 유발 식이에 비스페놀 A의 혼합은 제브라피쉬의 생존율을 감소시켰으며, 비스페놀 A가 고농도로 혼합되었을 때 생존율이 더욱 감소되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, referring to FIG. 5A, it was confirmed that the mixing of bisphenol A in the normal diet reduced the survival rate of zebrafish, and the survival rate was further reduced when the bisphenol A was mixed at a high concentration. Likewise, the mixing of bisphenol A in hyperlipidemic diets decreased the survival rate of zebrafish, and the survival rate was further reduced when bisphenol A was added at high concentrations.
또한, 도 5B를 참조하여 보면, 암수의 메이팅(mating) 테스트 결과, 정상 식이 및 고지혈증 유발 식이 모두에서 비스페놀 A와 혼합 시, 알의 생산 능력이 30 내지 50% 가량 감소하였고, 특히, 고지혈증 유발 식이와 함께 병행한 경우 알의 생산 능력이 더욱 감소하는 것을 확인하였다. 5B, as a result of the mating test of male and female, when the mixture was mixed with bisphenol A in both the normal diet and the hyperlipemia-inducing diet, the egg production capacity was reduced by 30 to 50%, and in particular, The production capacity of eggs was further decreased.
또한, 도 5C 및 5D를 참조하여 보면, 16주 섭취 이후에 난소의 크기 및 무게를 측정한 결과, 비스페놀 A의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 난소의 무게가 감소하였고, 특히, 고지혈증 유발 식이와 함께 병행한 경우 난소의 무게가 더욱 크게 감소하는 것을 확인하였다. 5C and 5D, the ovarian size and weight were measured after 16 weeks of feeding. As the concentration of bisphenol A was increased, the ovarian weight was decreased in a concentration-dependent manner. In particular, In addition, it was confirmed that the weight of the ovaries was significantly decreased.
다음으로 난소의 형태학적 관찰을 위해, 난소의 냉동 박편을 이용하여 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin) 염색을 수행한 결과, 도 6을 참조하여 보면, 비스페놀 A의 농도가 증가할수록 난소의 발달이 느려지고, 난포 형성에 장애가 생기는 것을 확인하였으며, 특히, 고지혈증 유발 식이와 함께 병행한 경우 난소의 손상 정도가 더욱 크게 증가하는 것을 확인하였다. Next, for morphological observation of the ovary, hematoxylin & eosin staining was performed using frozen flakes of ovaries. As a result, as shown in FIG. 6, as the concentration of bisphenol A increased, , And it was confirmed that the degree of damage to the ovary was further increased when the combined treatment with the hyperlipidemic induction diet was performed.
또한, 비스페놀 A가 간에 미치는 영향을 확인하기 위해, 간의 냉동 박편을 이용하여 헤마톡실린 & 에오신 및 오일 레드 O(Oil red O) 염색을 수행한 결과, 도 7을 참조하여 보면, 비스페놀 A가 증가할수록 간세포의 염증 및 지방 축적이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히, 고지혈증 유발 식이와 함께 병행한 경우 간의 손상 정도가 더욱 크게 증가하는 것을 확인하였다.Further, in order to confirm the effect of bisphenol A on the liver, hematoxylin and eosin and oil red O staining was performed using the frozen flakes of the liver. As a result, referring to FIG. 7, And the increase of inflammation and fat accumulation of hepatocytes was increased. Especially, the degree of liver damage was significantly increased in the case of coexisting with hyperlipidemia - inducing diets.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is clearly understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included within the scope of the present invention.
Claims (5)
상기 시료에서 저밀도 지단백질(LDL)의 응집 증가 여부, 저밀도 지단백질의 산화 증가 여부 및 피부섬유세포의 노화 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지표를 조사하는 제 2단계; 및
상기 지표를 대조군과 비교하는 제 3단계;
를 포함하는 시험관 내에서(in vitro) 비스페놀 A의 독성 진단방법.A first step of exposing bisphenol A to a sample separated from a human;
A second step of examining at least one indicator selected from the group consisting of an increase in aggregation of low density lipoprotein (LDL), an increase in oxidation of low density lipoprotein, and an increase in aging of skin fibroblasts in the sample; And
A third step of comparing the indicator with a control group;
A method for diagnosing the toxicity of bisphenol A in vitro.
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| Chinese Journal of Ecology, 2010, Vol. 29, pp 2192-2198.* |
| Nanoscale Research Letters, 2014, Vol. 9, pp 1-9.* |
| Toxicol. Environ. Health. Sci., 2016, Vol. 8, pp 290-295.* |
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