KR101925079B1 - Integrated microdevice for dna purification and amplification and method using the same - Google Patents

Integrated microdevice for dna purification and amplification and method using the same Download PDF

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이내윤
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가천대학교 산학협력단
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Abstract

Disclosed are an integrated microdevice for DNA purification and amplification, and a DNA purification and amplification method using the same. According to an embodiment of the present invention, the integrated microdevice comprises: a substrate unit which is formed by a thermoplastic plastic upper substrate and a lower substrate, and includes a single microchannel in which a microfluid can flow; an inlet tube which is connected to an inlet of the microchannel to introduce the microfluid therein; and an outlet tube which is connected to an outlet of the single microchannel to discharge the microfluid to the outside of the microchannel. While a cell extract is introduced into the microchannel through the inlet tube and retains therein for a predetermined time, the surface of the microchannel is converted to show a positive charge with respect to a positive ion inside the cell extract, the DNA inside the cell extract adsorbs to the surface of the microchannel, thereby carrying out the DNA purification.

Description

DNA 정제-증폭을 위한 통합형 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 DNA 정제-증폭 방법{INTEGRATED MICRODEVICE FOR DNA PURIFICATION AND AMPLIFICATION AND METHOD USING THE SAME}INTEGRATED MICRODEVICE FOR DNA PURIFICATION AND AMPLIFICATION AND METHOD USING THE SAME <br> <br> <br> Patents - stay tuned to the technology Integrated microdevice for DNA purification-

본 발명은 통합형 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 DNA 정제-증폭 방법에 관한 것으로,보다 상세하게는 DNA 정제 및 증폭이 동일 채널 내에서 수행될 수 있는 통합형 마이크로 디바이스와 이를 이용하여 DNA 정제 및 증폭을 연속적으로 수행할 수 있는 DNA 정제-증폭 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an integrated microdevice and a DNA purification and amplification method using the integrated microdevice, and more particularly, to an integrated microdevice in which DNA purification and amplification can be performed in the same channel, and DNA purification and amplification are continuously performed DNA purification and amplification methods that can be used to amplify DNA.

미소 체적을 갖는 샘플 액체를 이용하여 복잡한 생물화학적 반응을 달성하기 위한 목적으로 제조되는 마이크로 디바이스는 세포, 단백질, DNA 연구 등과 관련된 연구 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 특히 DNA 정제, 증폭 및 탐지에 활용된다. 많은 연구자들이 보다 간단하고 적은 비용으로 DNA를 정제, 증폭 및 탐지하기 위해 마이크로 디바이스를 개선해 나가고 있다. Microdevices manufactured for the purpose of achieving complicated biochemical reactions using a sample liquid having a small volume are widely used in research fields related to cells, proteins, DNA studies, and the like. Especially for DNA purification, amplification and detection. Many researchers are improving microdevices to purify, amplify and detect DNA in a simpler and less costly way.

이러한 마이크로 디바이스의 소재로는 실리콘, 유리, 석영, 폴리디메틸실록산, 열가소성 플라스틱 등이 있다. 이 중, 열가소성 플라스틱은 저비용, 높은 투명도, 생체 적합성, 높은 가공성 등의 장점으로 인해 최근 마이크로 디바이스의 소재로 많이 활용되고 있다. 특히 유전자 분석에 있어 가장 노동 집약적이고 많은 시간이 걸리는 공정인 샘플의 정제 및 증폭 단계를 소형화 및 집적화 하기 위하여, 열가소성 플라스틱 소재를 이용한 마이크로 디바이스의 설계에 대한 연구가 활발히 보고되고 있다.Materials for these microdevices include silicon, glass, quartz, polydimethylsiloxane, and thermoplastic plastics. Of these, thermoplastic plastics are widely used as materials for microdevices in recent years because of their advantages such as low cost, high transparency, biocompatibility and high processability. Particularly, in order to miniaturize and integrate the purification and amplification steps of a sample, which is the most labor-intensive and time-consuming process in gene analysis, studies on the design of microdevices using thermoplastic plastic materials have been actively reported.

특허문헌 1: 한국공개특허 제10-2013-0130936호 (2013.12.03 공개)Patent Document 1: Korean Patent Laid-Open No. 10-2013-0130936 (published Dec. 03, 2013)

본 발명은 유전자 분석을 위한 DNA 정제 및 증폭이 하나의 단일 채널에서 이루어질 수 있는통합형 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 DNA 정제-증폭 방법을 제공하고자 한다.The present invention provides an integrated microdevice in which DNA purification and amplification for gene analysis can be performed in a single channel, and a DNA purification-amplification method using the integrated microdevice.

본 발명의 일 측면에 따르면, 열가소성 플라스틱인 상부 기판 및 하부 기판이 본딩되어 형성되고 내부에는 미세 유체가 흐를 수 있는 단일 마이크로채널이 형성되는 기판부와, 단일 마이크로채널의 입구단에 연결되어 미세 유체를 단일 마이크로채널 내부로 도입시키는 입구도관과, 단일 마이크로채널의 출구단에 연결되어 미세 유체를 단일 마이크로채널 외부로 배출시키는 출구도관을 포함하고, 세포 파쇄물(cell extract)이 입구도관을 통해 단일 마이크로채널 내부로 도입되고 소정 시간 머무르는 동안 상기 세포 파쇄물 내의 양이온이 단일 마이크로 채널 표면의 작용기와 반응하여 단일 마이크로채널 표면이 양전하를 띠도록 전환되고 양전하를 띠는 단일 마이크로채널 표면과 음전하를 띠는 세포 파쇄물 내의 DNA 사이의 정전기적 인력에 의해 상기 세포 파쇄물 내의 DNA가 단일 마이크로채널 표면에 흡착되어 DNA 정제가 수행되는 통합형 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다. According to an aspect of the present invention, there is provided a microfluidic device, comprising: a substrate part formed by bonding an upper substrate and a lower substrate, which are thermoplastic plastic, and having a single microchannel through which a microfluid can flow; And an outlet conduit connected to the outlet end of the single microchannel for discharging the microfluid to the outside of the single microchannel, wherein the cell extract is connected to a single microchannel through the inlet conduit, The cations in the cell lysate react with the functional groups on the surface of the single microchannel so that the surface of the single microchannel is converted to be positively charged while the positively charged microchannel surface and the positively charged cell lobes Lt; RTI ID = 0.0 &gt; Four DNA in the lysate are adsorbed onto the surface of a single micro-channel may be provided with an integrated micro device that DNA purification is performed.

이 때, 상기 열가소성 플라스틱은 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌) 및 PP(폴리프로필렌) 중에서 선택될 수 있다. At this time, the thermoplastic resin may be selected from among PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene) and PP (polypropylene).

또한, DNA가 단일 마이크로채널 표면에 흡착된 상태에서 PCR 시약이 단일 마이크로채널 내부로 도입되고 소정시간 머무르는 동안 상기 PCR 시약에 의해 흡착된 DNA가 용리되고, 상기 PCR 시약은 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함할 수 있다. Also, while the DNA is adsorbed on the surface of a single microchannel, the PCR reagent is introduced into a single microchannel, and the DNA adsorbed by the PCR reagent is eluted during a predetermined time, and the PCR reagent is reacted with the reaction buffer, dNTPs, Enzymes and primers.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 마이크로 디바이스를 이용한 DNA 정제-증폭 방법에 있어서, a) 세포 파쇄물을 열가소성 플라스틱으로 형성되는 마이크로 디바이스의 단일 마이크로채널 내부로 도입하고 소정 시간 유지하여 세포 파쇄물 내의 양이온이 단일 마이크로채널 표면의 작용기와 반응하여 단일 마이크로채널 표면과 음전하를 띠는 세포 파쇄물 내의 DNA 사이의 정전기적 인력에 의해 세포 파쇄물 내의 DNA를 단일 마이크로채널 표면에 흡착시키는 단계; b) 상기 세포 파쇄물을 단일 마이크로채널 외부로 배출하는 단계; c) 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함하는 PCR 시약을 상기 단일 마이크로채널 내부로 도입하고 소정 시간 유지하여 상기 DNA를 용리시키는 단계; 및 d) PCR 시약을 유체 흐름 방향으로 전진시키고 히터를 통해 상기 단일 마이크로채널의 온도를 제어함으로써 상기 단일 마이크로채널에서 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행하는 단계를 포함하는 DNA 정제-증폭 방법이 제공될 수 있다. According to another aspect of the present invention, there is provided a DNA purification-amplification method using a microdevice, comprising the steps of: a) introducing a cell lysate into a single microchannel of a microdevice formed of a thermoplastic plastic, holding the lysate for a predetermined time, Adsorbing the DNA in the cell lysate to a single microchannel surface by electrostatic attraction between the DNA in the cell lysate reacting with the functional group on the surface of the microchannel and the DNA in the cell lysate which is negatively charged; b) discharging the cell lysate out of a single microchannel; c) introducing a PCR reagent containing reaction buffer, dNTPs, Taq polymerase and primer into the single microchannel and holding the DNA for a predetermined time to elute the DNA; And d) performing PCR (polymerase chain reaction) in the single microchannel by advancing the PCR reagent in a fluid flow direction and controlling the temperature of the single microchannel through a heater to provide a DNA purification-amplification method .

이 때, 상기 열가소성 플라스틱은 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌) 및 PP(폴리프로필렌) 중에서 선택되고, 상기 단계 a)에서 상기 세포 파쇄물 내의 양이온에 의해 단일 마이크로채널 표면이 양전하를 띠도록 전환됨으로써 세포 파쇄물 내의 DNA가 단일 마이크로채널 표면에 흡착되고, 상기 단계 c)에서 상기 PCR 시약에 의해 흡착된 DNA가 용리되어 상기 PCR 시약에 혼합될 수 있다.At this time, the thermoplastic resin is selected from among PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene) and PP (polypropylene) DNA in the cell lysate is adsorbed on a single microchannel surface by converting the channel surface to be positively charged, and the DNA adsorbed by the PCR reagent in step c) can be eluted and mixed with the PCR reagent.

본 발명의 구체예들에 따른 통합형 마이크로 디바이스는 세포 파쇄물(cell extract) 내에 들어있는 양이온을 이용하여 열가소성 플라스틱으로 형성되는 마이크로채널 표면이 양전하를 띠도록 전환시킴으로써 세포 파쇄물 내의 DNA를 마이크로채널에 흡착시키고, PCR 시약을 이용하여 흡착된 DNA를 용리시켜 동일 마이크로채널 내에서 PCR 증폭할 수 있다. 따라서 하나의 단일 채널에서 DNA 정제 및 증폭이 이루어질 수 있는 바, 별도의 DNA 정제 유닛 또는 채널이 요구되지 않는다. 즉, 유전자 분석에 있어 가장 노동 집약적이고 많은 시간이 걸리는 공정인 DNA 정제 및 분석 단계를 매우 단순화 시킬 수 있는 바, 분석 비용의 절감, 샘플 오염 리스크 감소 등의 효과를 구현 가능하다.The integrated microdevice according to embodiments of the present invention uses a cation contained in a cell extract to convert a microchannel surface formed of a thermoplastic plastic into a positive charge so that DNA in the cell lysate is adsorbed to a microchannel , PCR can be amplified in the same microchannel by eluting the adsorbed DNA using PCR reagent. Therefore, DNA purification and amplification can be performed in one single channel, and no separate DNA purification unit or channel is required. In other words, it is possible to greatly simplify DNA purification and analysis steps, which are labor-intensive and time-consuming processes in gene analysis, and can reduce the analysis cost and reduce sample pollution risk.

도 1은 본 발명의 구체예들에 따른 통합형 마이크로 디바이스의 DNA 정제-증폭 원리를 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 통합형 마이크로 디바이스의 이미지 및 마이크로채널의 개략도이다.
도 3은 6개의 평행한 직선 마이크로채널이 각 열가소성 플라스틱 기판 상에 형성된 이미지와 접합 조건을 나타낸다.
도 4는 천연 기판 및 DNA가 흡착된 기판의 물 접촉각 측정 결과(상온에서 측정됨)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 형광 측정 결과를 나타내는 이미지다.
도 6은 PMMA, PC, PS 및 PP 소재를 이용하여 제조된 마이크로채널에서 DNA를 정제한 후, 오프-칩 PCR을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 7은 세정 단계의 추가 도입 여부에 따른 오프-칩 PCR을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 8은 적외선 카메라를 이용한 통합형 마이크로 디바이스의 온도 측정 결과(좌측도)와, PMMA 마이크로 디바이스를 이용하여 PCR을 수행한 결과(우측도)를 나타낸다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a schematic diagram illustrating the DNA purification-amplification principle of an integrated microdevice according to embodiments of the present invention.
2 is a schematic diagram of an image and microchannel of an integrated microdevice according to one embodiment of the present invention.
Fig. 3 shows the image and joining conditions in which six parallel straight microchannels are formed on each thermoplastic plastic substrate.
4 is a graph showing the water contact angle measurement (measured at room temperature) of a natural substrate and a substrate on which DNA is adsorbed.
Fig. 5 is an image showing the fluorescence measurement result.
FIG. 6 is an image showing the result of performing an off-chip PCR after purifying DNA in microchannels manufactured using PMMA, PC, PS, and PP materials.
FIG. 7 is an image showing the result of performing off-chip PCR according to whether a cleaning step is additionally introduced or not.
Fig. 8 shows the temperature measurement result (left side) of the integrated micro device using the infrared camera and the PCR result (right side view) using the PMMA micro device.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. It is to be understood that the following description is illustrative of the present invention, and the technical spirit of the present invention is not limited to the following description. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The accompanying drawings, which are included to provide a further understanding of the invention and are incorporated in and constitute a part of this application, illustrate embodiments of the invention and, together with the description, serve to explain the principles of the invention.

본 발명의 구체예들에 따른 통합형 마이크로 디바이스(이하, 마이크로 디바이스)는 하나의 단일 마이크로채널을 통해 DNA 정제 및 증폭을 수행하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 명세서에서 "통합형"이라는 용어는 DNA 정제와 DNA 증폭이 동일한 마이크로채널 내에서 이루어지는 것을 나타내기 위해 기재되었다. An integrated microdevice (hereinafter referred to as a microdevice) according to embodiments of the present invention aims at performing DNA purification and amplification through one single microchannel. That is, the term "integrated" is used herein to denote that DNA purification and DNA amplification occur in the same microchannel.

마이크로 디바이스는 열가소성 플라스틱 소재로 형성된다. 즉, 마이크로 디바이스 내의 미세 유체가 흐를 수 있도록 형성되는 단일 마이크로채널은 열가소성 플라스틱 소재다. 마이크로 디바이스의 형태 등에 대해서는 다른 도면을 참조하여 후술하기로 한다. The microdevice is formed of a thermoplastic plastic material. That is, a single microchannel formed to allow the flow of microfluids in the microdevice is a thermoplastic plastic material. The shape of the micro device will be described later with reference to other drawings.

상기 열가소성 플라스틱 소재의 예로는 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌) 또는 PP(폴리프로필렌)가 있으며, 마이크로 디바이스는 상기 소재들 중 선택될 수 있다. 특히 본 발명의 발명자들이 다수의 실험을 통해 확인한 결과, 마이크로 디바이스를 제작하기 위한 소재로 PMMA가 가장 바람직하다. PMMA가 상대적으로 높은 DNA 정제 효율을 가질뿐더러, 낮은 기체투과성 특성이 있어 PCR이 수행되는 동안의 열적 조건 하에서 기포 발생이 덜 일어나기 때문이다. Examples of the thermoplastic plastic material include PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene) or PP (polypropylene), and microdevices can be selected among the above materials. In particular, the inventors of the present invention have confirmed through a number of experiments that PMMA is the most preferable material for manufacturing micro devices. PMMA has a relatively high DNA purification efficiency and low gas permeability properties, which leads to less bubbling under thermal conditions during PCR.

상기에서 나열한 PMMA, PC, PS, PP와 같은 열가소성 플라스틱들은 고분자 내에 CH3, -COO, 벤젠 등과 같은 작용기를 갖는다. 이들 작용기들은 염 용액의 양이온들과 쉽게 반응하는 특성이 있다. 즉 PMMA, PC, PS, PP와 같은 열가소성 플라스틱 소재가 양이온을 포함하는 염 용액과 소정 시간동안 접촉할 때에, 열가소성 플라스틱 표면은 양전하를 띠도록 전환될 수 있다. 상기 양이온들과 반응하여 고분자 내의 분극이 양전하를 띠는 중심을 형성하기 때문이다. 이렇게 양전하를 띠도록 전환된 열가소성 플라스틱 소재의 표면에는 음전하를 띠는 DNA가 흡착될 수 있다. Thermoplastic plastics such as PMMA, PC, PS, and PP listed above have functional groups such as CH 3 , -COO, and benzene in the polymer. These functional groups have the property of easily reacting with the cations of the salt solution. That is, when a thermoplastic plastic material such as PMMA, PC, PS, or PP is contacted with a salt solution containing a cation for a predetermined time, the thermoplastic plastic surface can be converted to be positively charged. And reacts with the cations to form a positive center of polarization in the polymer. Negatively charged DNA can be adsorbed on the surface of the thermoplastic plastic material thus converted to positively charged.

본 발명은 이러한 기술적 원리를 이용하는 것으로, 특히 세포 파쇄물이 양이온을 갖는 염 용액에 해당한다는 점에 착안하여 마이크로채널 표면에 대해 별도의 표면처리 단계를 거치지 않고도 DNA 정제 및 증폭을 동일 채널에서 수행할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다. The present invention takes advantage of this technical principle, and it is possible to perform DNA purification and amplification on the same channel without special surface treatment steps on the microchannel surface, in particular, considering that the cell lysate corresponds to a salt solution having a cation .

도 1은 본 발명의 구체예들에 따른 통합형 마이크로 디바이스의 DNA 정제-증폭 원리를 설명하기 위한 개략도이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a schematic diagram illustrating the DNA purification-amplification principle of an integrated microdevice according to embodiments of the present invention.

도 1을 참조하면, 본 명세서에서 세포 파쇄물(Cell extract)은 세포 배양액을 원심분리하여 세포막이 파괴된 것을 의미한다. 세포 파쇄물 내에는 gDNA, 파쇄된 세포막(cytomembrane), 단백질(protein), 나트륨, 칼륨, 마그네슘 등의 양이온을 비롯한 기타 물질들이 포함된다. 그리고 이러한 세포 파쇄물이 열가소성 플라스틱으로 형성된 마이크로채널(120) 내로 도입 되고 소정 시간(예컨대 5분~10분) 머무르면, 열가소성 플라스틱 표면과 세포 파쇄물 내의 양이온(예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘 등의 양이온)들이 반응하게 됨으로써 마이크로채널(120)의 표면이 양전하를 띠게 된다. 이 때, 양전하를 띠는 마이크로채널(120) 표면과 음전하를 띠는 DNA 사이의 정전기적 인력에 의해 DNA가 마이크로채널(120)의 표면에 흡착된다. 이어서 세포 파쇄물을 마이크로채널(120) 외부로 배출시키면 마이크로채널(120) 표면에는 DNA만 남게 된다. Referring to FIG. 1, in this specification, a cell extract means that a cell membrane is destroyed by centrifuging a cell culture solution. Cell lysates include gDNA, broken cell membranes (cytomembranes), proteins, and other substances including cations such as sodium, potassium, and magnesium. When such a cell lysate is introduced into the microchannel 120 formed of thermoplastic plastic and stays for a predetermined time (for example, 5 minutes to 10 minutes), the thermoplastic plastic surface and the cations in the cell lysate (for example, cations such as sodium, potassium and magnesium) So that the surface of the microchannel 120 is positively charged. At this time, the DNA is adsorbed on the surface of the microchannel 120 by the electrostatic attraction between the surface of the microchannel 120 having a positive charge and the DNA having a negative charge. Subsequently, when the cell lysate is discharged outside the microchannel 120, only DNA remains on the surface of the microchannel 120.

다음으로 PCR 시약이 마이크로채널(120) 내로 도입 되고 소정 시간(예컨대 5분~10분) 머무르면, 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함하는 PCR 시약이 마이크로채널(120) 표면과 DNA 사이의 정전기적 인력을 감소시키게 되는 바, DNA가 마이크로채널(120) 표면으로부터 용리될 수 있다. 물론 흡착된 모든 DNA가 용리되는 것은 아니지만 PCR 증폭을 성공적으로 수행하기에 충분한 DNA가 용리됨은 실험을 통해 확인하였으며, 이는 후술될 것이다. Next, when a PCR reagent is introduced into the microchannel 120 and stays for a predetermined time (for example, 5 minutes to 10 minutes), a PCR reagent including reaction buffer, dNTPs, Taq polymerase and primer is transferred between the surface of the microchannel 120 and DNA The DNA can be eluted from the microchannel 120 surface. Of course, not all of the adsorbed DNA is eluted, but it has been confirmed through experiments that sufficient DNA is eluted to successfully carry out the PCR amplification, which will be described later.

즉 PCR 시약에 의해 마이크로채널(120) 표면에 흡착된 DNA가 용리되고, PCR 시약과 혼합된 DNA는 마이크로채널(120)을 따라 흐름 방향으로 흐르면서 PCR을 통해 증폭될 수 있다. 여기에서 PCR은 중합효소연쇄반응으로, 핵산(DNA 등)을 증폭시키는 공지의 방법을 의미한다. PCR 증폭방법의 기술 원리 및 세부 기술적 사항은 당업계에 알려져 있다. That is, the DNA adsorbed on the surface of the microchannel 120 is eluted by the PCR reagent, and the DNA mixed with the PCR reagent can be amplified by PCR while flowing along the microchannel 120 in the flow direction. Here, PCR refers to a known method of amplifying a nucleic acid (DNA or the like) by a polymerase chain reaction. The technical principles and details of the PCR amplification method are known in the art.

도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 통합형 마이크로 디바이스의 이미지 및 마이크로채널의 개략도이다. 도 2a는 단일 마이크로채널의 일 구체예를 도시하고 있으며, 도 2b는 일 구체예에 따른 통합형 마이크로 디바이스의 이미지이다(실제 시험을 위해 제작됨).2 is a schematic diagram of an image and microchannel of an integrated microdevice according to one embodiment of the present invention. Figure 2a shows one embodiment of a single microchannel, and Figure 2b is an image of an integrated microdevice according to one embodiment (fabricated for actual testing).

도 2를 참조하면, 본 발명의 일 구체예에 따른 통합형 마이크로 디바이스(이하, 마이크로 디바이스)는 단일 마이크로채널(120)이 형성되는 기판부(111,112)와, 미세 유체를 단일 마이크로채널(120) 내부로 도입시키는 입구도관(131)과, 미세 유체를 단일 마이크로 채널(120) 외부로 배출시키는 출구도관(132)을 포함할 수 있다. Referring to FIG. 2, an integrated micro device (hereinafter, referred to as a micro device) according to an embodiment of the present invention includes substrate parts 111 and 112 on which a single microchannel 120 is formed, And an outlet conduit 132 for discharging the microfluid to the outside of the single microchannel 120. [

기판부(111,112)는 마이크로 디바이스의 외형을 이루며, 상부기판(111) 및 하부기판(112)이 상호 접합(본딩)되어 형성된다. 기판부(111,112)는 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌) 또는 PP(폴리프로필렌) 중에서 선택되는 소재로 형성될 수 있다. 상부기판(111) 및 하부기판(112)의 접합은 핫 엠보싱 공정 등의 통상적 방법을 통해 이루어질 수 있다. 일 구체예에 있어서, 기판부(111,112)가 PMMA 소재로 형성되는 경우 상부기판(111) 및 하부기판(112)의 본딩은 105℃, 0.1MPa의 조건 하에서 30분 가량 핫 엠보싱 공정을 통해 이루어질 수 있다. The substrate portions 111 and 112 form an outer shape of the micro device, and the upper substrate 111 and the lower substrate 112 are formed by bonding. The substrate portions 111 and 112 may be formed of a material selected from PMMA (polymethylmethacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene) or PP (polypropylene). The bonding of the upper substrate 111 and the lower substrate 112 may be performed by a conventional method such as a hot embossing process. In one embodiment, when the substrate portions 111 and 112 are formed of a PMMA material, the bonding of the upper substrate 111 and the lower substrate 112 may be performed through a hot embossing process at 105 ° C. and 0.1 MPa for about 30 minutes have.

상부기판(111) 또는 하부기판(112) 중 어느 하나에는 단일 마이크로채널(120)이 형성된다. 단일 마이크로채널(120)은 미세 유체의 흐름 공간(유로)을 형성한다. 예컨대 하부기판(112)에 단일 마이크로채널(120)이 형성된 경우, 하부기판(112)의 두께가 실질적으로 미세 유체의 흐름 공간(유로)의 높이를 형성하게 된다. 그리고 상부기판(111)이 상부를 덮음으로써 폐쇄 유로가 형성될 수 있다. A single microchannel 120 is formed on either the upper substrate 111 or the lower substrate 112. The single microchannel 120 forms the flow space (flow path) of the microfluid. For example, when a single microchannel 120 is formed on the lower substrate 112, the thickness of the lower substrate 112 substantially forms the height of the microchannel flow space (flow path). And the upper substrate 111 covers the upper portion, so that the closed channel can be formed.

일 구체예에 있어서, 단일 마이크로채널(120)은 서펜틴(serpentine) 형태를 가질 수 있다. 예를 들면 도 2a에 도시된 것처럼 인렛(inlet)으로부터 연장 형성된 유로가 가로방향으로 평행 배치되고, 다시 세로방향으로 방향을 전환하여 평행 배치된 후에 아웃렛(outlet)까지 연장 형성되는 형태다. 이와 같은 단일 마이크로채널(120)의 형성은 통상적인 방법, 예컨대 레이저 컷팅, 컷팅 플로팅 가공법, 컷팅 프린팅법, 선반 가공법 등을 이용하여 이루어질 수 있으며 이들 각각의 기술 원리 및 세부 기술적 사항은 당업계에 알려져 있다. In one embodiment, the single microchannel 120 may have a serpentine morphology. For example, as shown in FIG. 2A, a flow path extending from an inlet is arranged in parallel in the lateral direction, and is further extended to an outlet after the direction is switched in the vertical direction and arranged in parallel. The single microchannel 120 may be formed by a conventional method such as a laser cutting method, a cutting floating processing method, a cutting printing method, a lathe processing method, and the like. The respective technical principles and technical specifications are known in the art have.

입구도관(131)은 단일 마이크로채널(120)의 인렛에 연결되어 단일 마이크로채널(120)의 내부로 미세 유체를 도입하는 기능을 하며, 출구도관(132)은 단일 마이크로채널(120)의 아웃렛에 연결되어 단일 마이크로채널(120)의 외부로 미세 유체를 배출하는 기능을 한다. 일 구체예에 있어서 입구도관(131) 및 출구도관(132)은 실리콘 튜브(silicon tube)일 수 있다. 한편 입구도관(131) 및 출구도관(132)의 연결을 위하여 기판부(111,112)의 해당 지점에는 삽입구가 마련될 수 있다. 상기 삽입구를 통해 입구도관(131) 및 출구도관(132)이 기판부(111,112)에 삽입됨으로써 각각 인렛 및 아웃렛에 연결될 수 있다. 또한 입구도관(131) 및 출구도관(132)에는 펌프 시스템(pump system)이 연결될 수 있다. 펌프 시스템은 단일 마이크로채널(120) 내에서 미세 유체를 구동시키는 구동력을 제공하는 것으로, 구체적으로는 미세 유체를 흐름 방향으로 전진시키거나 후진시키거나 또는 단일 마이크로채널(120) 내에 머무르게 할 수 있다. 이러한 펌프 시스템은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 시린지 펌프(syringe pump)가 있다. The inlet conduit 131 is connected to the inlet of a single microchannel 120 to introduce microfluid into a single microchannel 120 and the outlet conduit 132 is connected to the outlet of a single microchannel 120 And discharges the microfluid to the outside of the single microchannel 120. In one embodiment, the inlet conduit 131 and the outlet conduit 132 may be silicon tubes. On the other hand, for the connection of the inlet conduit 131 and the outlet conduit 132, an insertion port may be provided at a corresponding point of the substrate units 111 and 112. The inlet conduit 131 and the outlet conduit 132 can be inserted into the base portions 111 and 112 through the insertion port to be connected to the inlet and outlet, respectively. A pump system may also be connected to the inlet conduit 131 and the outlet conduit 132. The pump system provides a driving force to drive the microfluid in a single microchannel 120, in particular, it can advance or retract the microfluid in the flow direction or stay within a single microchannel 120. Such pump systems are known in the art and include, for example, syringe pumps.

상술한 바와 같이 구성되는 마이크로 디바이스에서 기판부(111,112)의 하부에는 히터(140)가 배치될 수 있다. 히터(140)는 PCR 증폭을 위한 열원을 제공할 수 있다. 이러한 히터(140)의 종류를 예시하면, 구리 가열 블록, 박막 히터, 적외선 장치, 할로겐 램프, 마이크로웨이브, 백금 레지스터 또는 유도 가열장치 등이 있다. In the micro device constructed as described above, the heater 140 may be disposed below the substrate units 111 and 112. The heater 140 may provide a heat source for PCR amplification. Examples of the heater 140 include a copper heating block, a thin film heater, an infrared device, a halogen lamp, a microwave, a platinum resistor, or an induction heating device.

히터(140)는 서로 별개의 온도로 구동될 수 있도록 2 이상이 구비될 수 있다. PCR을 이용한 DNA 증폭에서는 일반적으로 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 신장(extension) 단계에 맞는 온도가 각각 요구된다(총 3개의 온도 구역). 표적 앰플리콘(amplicon)의 크기가 300bp 미만인 경우에는 결합/신장 단계가 동일 온도에서 수행될 수도 있다. 따라서 마이크로 디바이스에서 PCR을 이용한 DNA 증폭을 하기 위해서는 단일 마이크로채널(120)이 최소 2개의 온도 구역을 가질 수 있도록 히터(140)가 2 이상 구비될 수 있다. 관련하여 도 2b를 참조하면, 두 개의 히터(140)가 각각 단일 마이크로채널(120)의 상부분과 하부분을 지지하고 있음을 알 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상부분은 열변성 단계를 수행하기 위한 열변성 영역(denaturation zone)이고 하부분은 결합/신장 단계를 수행하기 위한 결합/신장 영역(annealing/extension zone)일 수 있다. 물론 이는 임의적인 것이며 히터(140)의 위치나 온도 조정 등에 따라 상기 영역은 달라질 수 있다. At least two heaters 140 may be provided so that they can be driven at different temperatures. DNA amplification using PCR generally requires temperatures that are appropriate for the denaturation, annealing and extension stages, respectively (total of three temperature zones). If the size of the target amplicon is less than 300 bp, the binding / extension step may be performed at the same temperature. Accordingly, in order to perform DNA amplification using PCR in a microdevice, two or more heaters 140 may be provided so that a single microchannel 120 has at least two temperature zones. Referring to FIG. 2B, it can be seen that the two heaters 140 support the upper and lower portions of the single microchannel 120, respectively. In one embodiment, the upper portion may be a denaturation zone for performing the thermal denaturation step and the lower portion may be an annealing / extension zone for performing the binding / stretching step. Of course, this is arbitrary, and the area may vary depending on the position of the heater 140, temperature adjustment, and the like.

상술한 마이크로 디바이스에서의 DNA 정제 및 증폭 수행은 다음과 같이 이루어질 수 있다. DNA purification and amplification in the above-described microdevice can be performed as follows.

(1) 세포 파쇄물을 입구도관(131)을 통해 단일 마이크로채널(120) 내부로 도입시키고 소정 시간 유지한다(단계 a). 세포 파쇄물이 단일 마이크로채널(120)에 머무르는 동안 상기 세포 파쇄물 내의 양이온에 의해 단일 마이크로채널(120) 표면이 양전하를 띠게 되며, 이어서 세포 파쇄물 내의 DNA가 단일 마이크로채널(120) 표면에 흡착된다. (1) The cell lysate is introduced into the single microchannel 120 through the inlet conduit 131 and maintained for a predetermined time (step a). The surface of the single microchannel 120 is positively charged by the cation in the cell lysate while the cell lysate stays in the single microchannel 120 and then the DNA in the cell lysate is adsorbed on the surface of the single microchannel 120.

(2) 세포 파쇄물을 출구도관(132)을 통해 단일 마이크로채널(120)의 외부로 배출한다(단계 b). 그 외 별도의 세정 단계는 요구되지 않는다. 본 발명의 발명자들은 실험을 통해 세정 단계 없이도 성공적으로 PCR 증폭이 수행됨을 확인할 수 있었으며, 이에 대해서는 후술될 것이다. (2) The cell lysate is discharged to the outside of the single microchannel 120 through the outlet conduit 132 (step b). No other cleaning steps are required. The inventors of the present invention have confirmed through experiments that PCR amplification is successfully performed without a washing step, which will be described later.

(3) PCR 시약을 입구도관(131)을 통해 단일 마이크로채널(120) 내부로 도입시키고 소정 시간 유지한다(단계 c). 여기에서 PCR 시약은 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 반응 버퍼는 DNA 주형이 없는 15mmol L-1 MgCl2 버퍼액일 수 있다. PCR 시약이 단일 마이크로채널(120)에 머무르는 동안 PCR 시약이 일종의 용리액으로 작용하여 단일 마이크로채널(120)에 흡착되어 있는 DNA를 용리시킨다. 용리된 DNA는 PCR 시약과 혼합된다. (3) The PCR reagent is introduced into the single microchannel 120 through the inlet conduit 131 and held for a predetermined time (step c). Wherein the PCR reagent may comprise a reaction buffer, dNTPs, a Taq polymerase and a primer. At this time, the reaction buffer may be a 15 mmol L -1 MgCl 2 buffer solution without a DNA template. While the PCR reagent stays in the single microchannel 120, the PCR reagent acts as a kind of eluent to elute the DNA adsorbed on the single microchannel 120. The eluted DNA is mixed with the PCR reagent.

(4) PCR 시약을 유체 흐름 방향으로 전진시키면서 히터(140)를 통해 단일 마이크로채널(120)의 온도를 제어함으로써 PCR을 수행하여 DNA를 증폭한다(단계 d). 예컨대 도 2b의 마이크로 디바이스를 중심으로 설명할 때, 단일 마이크로채널(120)의 상부분에서는 열변성 단계가 일어나도록 하부에 배치된 히터(140)의 온도를 제어하고, 하부분에서는 결합/신장 단계가 일어나도록 하부에 배치된 다른 히터(140)의 온도를 제어할 수 있다. (4) PCR is performed by controlling the temperature of the single microchannel 120 through the heater 140 while advancing the PCR reagent in the fluid flow direction (step d). For example, referring to the microdevice of FIG. 2B, the upper portion of the single microchannel 120 controls the temperature of the heater 140 disposed below to cause a thermal denaturation step, and at the lower portion, It is possible to control the temperature of the other heater 140 disposed below.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로 디바이스는 세포 파쇄물(cell extract) 내에 들어있는 양이온을 이용하여 열가소성 플라스틱으로 형성되는 마이크로채널 표면이 양전하를 띠도록 전환시킴으로써 세포 파쇄물 내의 DNA를 마이크로채널에 흡착시키고, PCR 시약을 이용하여 흡착된 DNA를 용리시켜 동일 마이크로채널 내에서 PCR 증폭할 수 있다. 따라서 하나의 단일 채널에서 DNA 정제 및 증폭이 이루어질 수 있는 바, 별도의 DNA 정제 유닛 또는 채널이 요구되지 않는다. 즉, 유전자 분석에 있어 가장 노동 집약적이고 많은 시간이 걸리는 공정인 DNA 정제 및 분석 단계를 매우 단순화 시킬 수 있는 바, 분석 비용의 절감, 샘플 오염 리스크 감소 등의 효과를 구현 가능하다. 나아가 PCR 시약을 DNA 용리에 사용하게 되는 바, DNA 정제 및 증폭이 연속적으로 이루어질 수 있도록 한다. As described above, the microdevice according to the present invention uses a cation contained in a cell extract to convert a microchannel surface formed of a thermoplastic plastic into a positive charge, thereby adsorbing DNA in the cell lysate to microchannels , PCR can be amplified in the same microchannel by eluting the adsorbed DNA using PCR reagent. Therefore, DNA purification and amplification can be performed in one single channel, and no separate DNA purification unit or channel is required. In other words, it is possible to greatly simplify DNA purification and analysis steps, which are labor-intensive and time-consuming processes in gene analysis, and can reduce the analysis cost and reduce sample pollution risk. Furthermore, the PCR reagent is used for DNA elution, so that DNA purification and amplification can be performed continuously.

이하에서는 본 발명의 실시예 및 시험예에 대하여 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 시험예에 의해 본 발명이 한정되지 않음은 자명하다.  Hereinafter, embodiments and test examples of the present invention will be described. However, it is apparent that the present invention is not limited by the following examples and test examples.

실시예 및 시험예Examples and Test Examples

1. 마이크로 디바이스의 제조1. Manufacture of microdevices

(가) DNA 정제를 확인하기 위해 동일한 형태의 직선형 마이크로채널(폭 1mm, 깊이 2.5mm, 길이 2cm) 6개를 PMMA 기판, PC 기판, PS 기판 및 PP 기판(두께 2mm, Goodfellow社) 상에 각각 형성하였다. 관련하여 도 3은 6개의 평행한 직선 마이크로채널이 각 열가소성 플라스틱 기판 상에 형성된 이미지와 접합 조건을 나타낸다. (A) 6 linear micro channels (width 1 mm, depth 2.5 mm, length 2 cm) of the same type were placed on a PMMA substrate, a PC substrate, a PS substrate and a PP substrate (thickness 2 mm, Goodfellow) . 3 shows the image and bonding conditions in which six parallel straight microchannels are formed on each thermoplastic plastic substrate.

(나) 한편 온-칩 정제 및 흐름-구동 PCR 수행을 위해 서펜틴(serpentine) 형태의 마이크로채널(폭 300㎛, 깊이 100㎛, 총 길이 2.1m)이 총 30 thermal cycle을 갖도록 PMMA 기판에 형성되었다(도 2 참고). (B) On the other hand, serpentine-type microchannels (width 300 μm, depth 100 μm, total length 2.1 m) were formed on the PMMA substrate to have a total of 30 thermal cycles for on-chip purification and flow- (See FIG. 2).

상기 (가), (나)의 모든 마이크로 디바이스는 CNC 밀링머신을 이용하여 제조되었고, 핫 엠보싱 공정으로 접합되었다. 입구도관 및 출구도관은 실리콘 튜브(내경 1mm, 외경 2mm)로 제조되었고, 각 기판에는 입구도관과 출구도관이 삽입되기 위한 삽입구가 드릴 머신을 통해 형성되었다. 실리콘 튜브는 상기 삽입구에 삽입된 후, 접합경계가 PDMS(폴리디메틸실록산)로 경화됨으로써 기판에 부착되었다. All of the microdevices (a) and (b) above were manufactured using a CNC milling machine and were bonded in a hot embossing process. The inlet conduit and the outlet conduit were made of a silicone tube (inner diameter 1 mm, outer diameter 2 mm), and each board was formed with a drilling machine through which an inlet conduit and an outlet conduit could be inserted. After the silicone tube was inserted into the insertion port, the bonding boundary was attached to the substrate by curing with PDMS (polydimethylsiloxane).

2. 세포 배양2. Cell culture

E.coli O157:H7(대표적 식중독 유발균인 병원성 대장균임)이 액체배지와 고체배지 모두에서 배양되었다. E.coli O157:H7은 200rpm으로 지속적으로 16시간 동안 쉐이킹(shaking) 되는 37℃의 증류수 1L에 트립톤(tryptone) 10g, 효모추출물 5g 및 NaCl 5g을 함유하는 LB 배지 5mL에서 배양되었다. 구체적으로는 쉬가독소 유전자(Shiga toxin gene)로부터 210bp 타겟을 증폭할 수 있는 프라이머를 설계하였다. 고형 아가 배지(agar media; LB 아가)상에 단계적 희석 도포(serial dilution plating)를 수행하는 방식으로 평판 계수법(spread plate counts)을 통해 생장을 측정하였고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 배양된 E.coli O157:H7의 수는 밀리미터당 평균 4.2ⅹ107 CFU(colony forming units)였다. E. coli O157: H7 (a typical pathogenic E. coli) was cultured in both liquid and solid media. E. coli O157: H7 was cultured in 5 mL of LB medium containing 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract and 5 g of NaCl in 1 L of distilled water at 37 DEG C shaking for 16 h continuously at 200 rpm. Specifically, a primer capable of amplifying a 210 bp target from a Shiga toxin gene was designed. Growth was measured by spread plate counts in the manner of performing serial dilution plating on agar media (LB agar) and incubated overnight at 37 ° C. The number of cultured E. coli O157: H7 was an average of 4.2 × 10 7 CFU (colony forming units) per millimeter.

3. DNA 정제 및 증폭 과정3. DNA purification and amplification process

세포막 파괴를 위해 E.coli O157:H7 배양액이 14,000rpm으로 원심분리되었다(세포 파쇄물). 다음으로 세포 파쇄물 5㎕가 마이크로채널 내로 도입되었고, 5분간 정상 상태(stationary)를 유지한 후 제거되었다. 다음으로 PCR 시약 5㎕가 상기 마이크로채널의 표면에 흡착된 DNA를 용리시키기 위한 용리액으로써 마이크로채널 내로 도입되었다. PCR 시약은 dNTPs, 프라이머, DNA 주형이 없는 15mmol L-1 MgCl2 버퍼액을 포함하였다(이상 Promega社). 상기 용리액은 마이크로채널 내에서 5분간 정상 상태를 유지하였다. 이어서 용리액은 출구도관을 통해 배출되었고, 써멀사이클러를 이용한 오프-칩 PCR을 위하여 추가적으로 PCR 시약 15 ㎕와 혼합되었다. 이는 PCR 시약이 후속 PCR을 위한 용리액으로써 기능되는지를 살피기 위함이다. For cell membrane destruction, E. coli O157: H7 culture was centrifuged at 14,000 rpm (cell lysate). Next, 5 μl of the cell lysate was introduced into the microchannel, and it was removed after maintaining stationary state for 5 minutes. Next, 5 mu l of the PCR reagent was introduced into the microchannel as an eluent to elute the DNA adsorbed on the surface of the microchannel. The PCR reagent contained dNTPs, a primer, and a 15 mmol L -1 MgCl 2 buffer solution without DNA template (from Promega). The eluent remained steady for 5 minutes in the microchannel. The eluate was then discharged through an outlet conduit and mixed with 15 μl of PCR reagent for off-chip PCR using a thermal cycler. This is to see if the PCR reagent functions as an eluent for subsequent PCR.

또한, 정제된 DNA 증폭을 위해 온-칩 및 오프-칩 PCR이 모두 수행되었다. PCR 시약(20㎕)은 버퍼액(10x), 0.2mM dNTPs, 0.5 U ㎕-1 Taq 중합효소, 및 1μM 순행/역행 프라이머를 포함하였다. 나아가 E.coli O157:H7 세포 파쇄물 0.25㎕가 상기 20㎕ PCR 시약 내에서 대략 2.5ⅹ103 CFU에 해당하는 최종 세포수를 맞추기 위해 상기 PCR 시약에 첨가되었다. Both on-chip and off-chip PCR were performed for purified DNA amplification. The PCR reagent (20 μl) contained buffer solution (10 ×), 0.2 mM dNTPs, 0.5 U μl- 1 Taq polymerase, and 1 μM forward / retrograde primer. Further, 0.25 [mu] l of E. coli O157: H7 cell lysate was added to the PCR reagent to match the final cell number corresponding to approximately 2.5 x 10 3 CFU in the 20 μl PCR reagent.

쉬가독소로부터 210bp 유전자 단편을 증폭시키기 위한 프라이머 시퀀스는 다음과 같다: 5'-TGT AAC TGG AAA GGT GGA GTA TAC A-3'(순행) 및 5'-GCT ATT CTG AGT CAA CGA AAA ATA AC-3'(역행).The primer sequences for amplifying the 210 bp gene fragment from the shiga toxin are as follows: 5'-TGT AAC TGG AAA GGT GGA GTA TAC A-3 '(transitional) and 5'-GCT ATT CTG AGT CAA CGA AAA ATA AC- 3 '(retrograde).

비교를 위해 써멀사이클러를 이용하여 2단계 온도조절 기반 PCR이 수행되었다. 증폭은 열변성 단계는 30초간 95℃에서, 결합 단계는 30초간 55℃에서 30 사이클 수행되었다. 초기 열변성 단계는 5분간 95℃에서, 최종 신장 단계는 5분간 70℃에서 수행되었다. 증폭 결과는 아가로스겔 전기영동으로 분석되었고, 타겟 앰플리콘들은 EtBr(Ethidium bromide)로 염색되고 Gel Doc EZ system(Bio-Rad)로 탐지되었다.Two-step temperature-controlled PCR was performed using a thermal cycler for comparison. Amplification was carried out at 95 ° C for 30 seconds for the thermal denaturation step and 30 cycles at 55 ° C for 30 seconds. The initial heat denaturation step was carried out at 95 ° C for 5 minutes and the final elongation step at 70 ° C for 5 minutes. Amplification results were analyzed by agarose gel electrophoresis, and the target amplicons were stained with EtBr (Ethidium bromide) and detected with Gel Doc EZ system (Bio-Rad).

한편, 흐름-구동 PCR을 수행하는 열가소성 플라스틱의 표면 온도 측정을 위해 적외선 카메라(FLIR Thermovision A320)를 사용하였다. 열가소성 플라스틱(사이즈는 5ⅹ5cm) 편재를 두 개의 구리 가열 블록 상에 배치하고, 반사 방지를 위해 흑색 절연 테이프를 부착하였다. 하나의 구리 가열 블록의 온도는 DNA의 열변성을 위해 95℃로 제어되었고, 다른 하나의 구리 가열 블록의 온도는 DNA의 결합 및 신장을 위해 55℃로 제어되었다. 온도 측정을 위하여 10개 지점이 임의로 선택되었고, 평균 온도는 이미지 분석프로그램(ThermaCAM Researcher 2.8)로 평가되었다.On the other hand, an infrared camera (FLIR Thermovision A320) was used to measure the surface temperature of the thermoplastic plastic to perform the flow-driven PCR. A thermoplastic plastic (size 5 x 5 cm) ellipse was placed on two copper heating blocks and a black insulation tape was attached to prevent reflection. The temperature of one copper heating block was controlled at 95 ° C for thermal denaturation of DNA and the temperature of the other copper heating block was controlled at 55 ° C for DNA binding and extension. Ten points were randomly selected for temperature measurement, and the average temperature was evaluated by an image analysis program (ThermaCAM Researcher 2.8).

4. DNA 흡착능 분석4. Analysis of DNA adsorption capacity

마이크로채널에 DNA가 흡착되었는지 여부를 확인하기 위해 Phoenix 300 contact angle analyzer를 이용하여 물 접촉각(water contact angle)을 측정하였다(Sufrace Electro Optics, 한국). 측정 대상은 천연 기판(PMMA, PC, PS, PP) 및 DNA가 흡착된 기판(PMMA, PC, PS, PP)이었다. 측정은 6회에 걸쳐 이루어졌고 평균치를 산출하였다. The water contact angle was measured using a Phoenix 300 contact angle analyzer (Sufrace Electro Optics, Korea) to determine whether DNA was adsorbed on the microchannel. The measurement targets were natural substrates (PMMA, PC, PS, PP) and substrates on which DNA was adsorbed (PMMA, PC, PS, PP). The measurements were made six times and the average values were calculated.

도 4는 천연 기판 및 DNA가 흡착된 기판의 물 접촉각 측정 결과(상온에서 측정됨)를 나타내는 그래프이다. 도 4의 흰색 막대는 천연 기판의 물 접촉각을 나타내며, 검정색 막대는 DNA가 흡착된 기판의 물 접촉각을 나타낸다. 앞서 설명한대로 4 종류의 열가소성 플라스틱 기판은 E.coli O157:H7의 DNA 추출물들과 5분간 반응하였다. 4 is a graph showing the water contact angle measurement (measured at room temperature) of a natural substrate and a substrate on which DNA is adsorbed. The white bar in Fig. 4 represents the water contact angle of the natural substrate, and the black bar represents the water contact angle of the substrate on which the DNA is adsorbed. As described above, four types of thermoplastics substrates reacted with DNA extracts of E. coli O157: H7 for 5 minutes.

도 4를 참조하면, 천연 PMMA, PC, PS, PP의 접촉각은 각각 72.6°±1.7°, 84.0°±3.1°, 86.0°±1.6°및 93.0°±3.6°이었다. 한편, DNA가 흡착된 PMMA, PC, PS, PP의 접촉각은 각각 54.0°±3.8°, 46.3°±6.9°, 52.5°±5.3°및 57.0°±3.8°로 측정되어, 기판 종류와 무관하게 유사한 값을 보였다. DNA 흡착 후에 접촉각이 감소하는 것은 DNA와 관련된 친수성 작용(hydrophilic functionality) 때문인 것으로 판단되며, 이러한 결과로부터 DNA가 4 종류의 열가소성 플라스틱 표면에 성공적으로 흡착되었음을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 4, the contact angles of natural PMMA, PC, PS, and PP were 72.6 ± 1.7, 84.0 ± 3.1, 86.0 ± 1.6, and 93.0 ± 3.6, respectively. On the other hand, the contact angles of PMMA, PC, PS and PP adsorbed DNA were measured to be 54.0 ° ± 3.8 °, 46.3 ° ± 6.9 °, 52.5 ° ± 5.3 ° and 57.0 ° ± 3.8 °, Respectively. The reduction of the contact angle after DNA adsorption is considered to be due to the hydrophilic functionality associated with DNA. From these results, it was confirmed that the DNA was successfully adsorbed on the surface of four types of thermoplastics.

또한 DNA 흡착능을 SYBR Green I(Lonza社)을 이용한 형광 측정을 통해 확인하였다. E.coli O157:H7 세포 파쇄물 5 ㎕가 PMMA 마이크로채널 내로 도입되었고, 5분간 정상 상태(stationary)를 유지한 후 제거되었다(PMMA 소재를 사용한 이유는 PMMA가 다른 열가소성 플라스틱 소재들에 비하여 낮은 형광 백그라운드 내지 자발형광(autofluorescence)을 갖기 때문임). 이후 마이크로채널은 압축 공기를 통해 건조되었다. 다음으로 SYBR Green I(10mM Tris-Hcl, 1mM EDTA에서 10000배 희석됨, pH는 7.5)이 염료로써 마이크로채널 내로 도입되었고, 10분간 정상 상태를 유지하였다. 비교예는 세포 파쇄물 도입을 제외하고 같은 방식으로 이루어졌다. 형광 측정은 Nikon Eclipse TE 2000-U 형광현미경을 통해 측정되었고, NIS-Elemnets S/W를 통해 분석되었다. 또한 청색 형광 필터(여기 파장 450-490nm(DM 505nm), 방출 파장 520nm)가 사용되었는데, 이는 염료로 기능하는 SYBR Green I의 최대 여기 파장 및 방출 파장이 490nm, 520nm이기 때문이다. The DNA adsorption capacity was also confirmed by fluorescence measurement using SYBR Green I (Lonza). 5 μl of E. coli O157: H7 cell lysate was introduced into the PMMA microchannel and maintained stationary for 5 min and then removed (PMMA material was used because PMMA had a lower fluorescence background than other thermoplastic plastics materials Since they have autofluorescence. The microchannel was then dried through compressed air. Next, SYBR Green I (10000 dilution in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) was introduced into the microchannel as a dye and maintained in a steady state for 10 minutes. The comparative example was done in the same way except for cell lysate introduction. Fluorescence measurements were taken using a Nikon Eclipse TE 2000-U fluorescence microscope and analyzed using NIS-Elemnets software. A blue fluorescence filter (excitation wavelength 450-490 nm (DM 505 nm), emission wavelength 520 nm) was used because SYBR Green I, which functions as a dye, has a maximum excitation wavelength and emission wavelength of 490 nm and 520 nm.

도 5는 형광 측정 결과를 나타내는 이미지다. 도 5를 참조하면, 우선 도 5a는 DNA가 흡착된 PMMA 마이크로채널의 이미지이며, 보이는 바와 같이 밝은 녹색 형광이 나타남을 확인할 수 있다. 반면 흡착된 DNA를 용리시킨 후의 형광 광도는 도 5b에서처럼 감소되었음을 확인할 수 있다. 즉 도 5a 및 도 5b를 통해 PMMA 마이크로채널 표면에서 DNA가 성공적으로 용리되었음을 확인할 수 있다. 한편, 도 5c는 천연 PMMA 마이크로채널의 형광 이미지, 도 5d는 동일한 SYBR Green I으로 염색된 천연 PMMA 마이크로채널의 형광 이미지인데, 두 경우 모두 유의미한 형광이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. Fig. 5 is an image showing the fluorescence measurement result. Referring to FIG. 5, FIG. 5A is an image of a PMMA microchannel on which DNA is adsorbed, and it can be seen that bright green fluorescence appears as shown in FIG. On the other hand, the fluorescence intensity after eluting the adsorbed DNA is decreased as shown in FIG. 5B. 5a and 5b, DNA can be successfully eluted from the surface of the PMMA microchannel. FIG. 5c is a fluorescence image of a natural PMMA microchannel, and FIG. 5d is a fluorescence image of a natural PMMA microchannel stained with the same SYBR Green I. In both cases, no significant fluorescence appears.

도 6은 PMMA, PC, PS 및 PP 소재를 이용하여 제조된 마이크로채널에서 DNA를 정제한 후, 오프-칩 PCR을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다(상기 마이크로채널의 형태는 도 3 참고). 도 6을 참조하면, Lane 1은 음성대조군에서의 오프-칩 PCR 결과를 나타내며, Lane 2는 양성대조군에서의 오프-칩 PCR 결과를 나타낸다. Lane 3-14는 각각 PMMA 기판(Lane 3-5), PC 기판(Lane 6-8), PS 기판(Lane 9-11) 및 PP 기판(Lane 12-14)에서 DNA 정제가 수행된 후의 오프-칩 PCR 결과를 나타낸다(DNA 정제는 10분간 수행됨). 각 열가소성 플라스틱에서의 본 실험들은 3회 수행되었다. FIG. 6 is an image showing the result of performing an off-chip PCR after purifying DNA in a microchannel manufactured using materials of PMMA, PC, PS, and PP (see FIG. 3 for the form of the microchannel). Referring to FIG. 6, Lane 1 represents the off-chip PCR result in the negative control group, and Lane 2 represents the off-chip PCR result in the positive control group. Lane 3-14 shows the off-state after DNA purification on the PMMA substrate (Lane 3-5), PC substrate (Lane 6-8), PS substrate (Lane 9-11) and PP substrate (Lane 12-14) Chip PCR results (DNA purification is performed for 10 minutes). These experiments on each thermoplastics were performed three times.

실험 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 210bp 유전자 단편이 각 열가소성 플라스틱에서 성공적으로 증폭되었음을 확인할 수 있다. 각 앰플리콘의 강도는 상기 양성대조군(Lane 2)에서의 결과와 비교함으로써 판단할 수 있는데, Lane 3-14를 참조하면 실험이 수행된 열가소성 플라스틱들의 표면에서 DNA의 강한 흡착이 일어났음을 알 수 있다. As a result of the experiment, it can be confirmed that the 210 bp gene fragment was successfully amplified from each thermoplastics as shown in FIG. The intensity of each ampicron can be determined by comparing the results with those in the positive control group (Lane 2). Referring to Lane 3-14, it can be seen that the strong adsorption of DNA on the surface of the thermoplastic plastics have.

한편, DNA 정제-증폭의 전 단계에서 세정 단계가 추가로 필요한지 여부를 판단하기 위해 마이크로채널 내에 DNA를 흡착시킨 후, 상기 마이크로채널 내에 에탄올을 채우고 10분 동안 정상 상태를 유지한 후 제거되었다. 이후, 마이크로채널은 압축공기로 건조되었다. 상기 세정 공정은 불필요하게 흡착되어 있는 세포 파편(cellular debris) 및 단백질을 제거하기 위함이다. 상술한 세정 공정 후, 오프-칩 PCR을 수행하였다. DNA was adsorbed in the microchannel to determine whether a further washing step was required in the previous stage of the DNA purification-amplification, and then the microchannel was filled with ethanol and maintained in a steady state for 10 minutes and then removed. The microchannel was then dried with compressed air. The cleaning process is to remove cellular debris and proteins that are unnecessarily adsorbed. After the above-described cleaning step, off-chip PCR was performed.

도 7은 세정 단계의 추가 도입 여부에 따른 오프-칩 PCR을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다. 도 7을 참조하면, Lane 1, 2는 각각 양성대조군 및 음성대조군에서의 오프-칩 PCR 결과를 나타낸다. Lane 3-10은 각각 PMMA 마이크로채널(Lane 3,4), PC 마이크로채널(Lane 5,6), PS 마이크로채널(Lane 7,8) 및 PP 마이크로채널(Lane 9,10)에서 DNA 정제가 수행된 후, 오프-칩 PCR 결과를 나타낸다. 여기에서 Lane 3,5,7,9는 상술한 세정 단계가 생략된 결과이고, Lane 4,6,8,10은 상술한 세정 단계가 도입된 결과다. FIG. 7 is an image showing the result of performing off-chip PCR according to whether a cleaning step is additionally introduced or not. Referring to FIG. 7, Lane 1 and 2 show off-chip PCR results in positive control and negative control, respectively. Lane 3-10 was subjected to DNA purification in PMMA microchannels (Lane 3,4), PC microchannels (Lane 5,6), PS microchannels (Lane 7,8) and PP microchannels (Lane 9,10) , And shows off-chip PCR results. Here, Lane 3, 5, 7, 9 is the result of omitting the above-described cleaning step, and Lane 4, 6, 8, 10 is the result of introducing the above-described cleaning step.

도 7에서 확인되듯이, 세정 단계가 도입되거나 생략되었을 때의 밴드 강도는 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다. 즉 별도의 세정 단계가 없어도 타겟 앰플리콘들이 충분히 식별 가능하게 나타남을 확인하였다. 나아가 에탄올과 같은 유기 용매가 PCR에 있어 잠재적인 억제제(inhibitor)로 기능할 수 있음을 고려한다면, DNA 정제 단계에서 상술한 것과 같은 세정 단계는 생략될 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스 및 DNA 정제-증폭 방법에서는 별도의 세정 단계가 요구되지 않는 바, 보다 분석 과정을 단순화 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. As can be seen in FIG. 7, there was no significant difference in band strength when the cleaning step was introduced or omitted. In other words, it was confirmed that the target amplicon was identifiable even without a separate cleaning step. Furthermore, considering that an organic solvent such as ethanol can serve as a potential inhibitor in PCR, the washing step as described above in the DNA purification step may be omitted. That is, in the microdevice and the DNA purification-amplification method according to embodiments of the present invention, no separate cleaning step is required, and it is confirmed that the analysis process can be further simplified.

5. 통합형 마이크로 디바이스를 이용한 DNA 정제-증폭5. DNA purification-amplification using integrated microdevice

본 발명의 구체예들에 따른 통합형 마이크로 디바이스의 소재 중에서 PMMA가 가장 바람직하다. 왜냐하면 PMMA는 상대적으로 높은 정제 효율을 가지며, 낮은 기체투과성 특성을 가지는 바 PCR이 수행되는 동안의 열적 조건 하에서 기포 발생이 상대적으로 덜 일어나는 장점이 있다. PMMA는 DNA의 열변성 온도(95℃)와 유사한 유리전이온도를 가지는 바, PCR 동안의 고온에 대해 충분히 견딜 수 있기 때문이다. 이에 따라 본 발명의 일 구체예에 따른 통합형 마이크로 디바이스를 PMMA로 제조하고 DNA 정제 및 증폭을 연속적으로 수행하였다.  PMMA is most preferred among materials of integrated microdevices according to embodiments of the present invention. Because PMMA has a relatively high purification efficiency and low gas permeability, it has the advantage of relatively less bubbling under thermal conditions during PCR. PMMA has a glass transition temperature that is similar to the thermal denaturation temperature of DNA (95 ° C), as it can withstand the high temperatures during PCR. Accordingly, the integrated microdevice according to one embodiment of the present invention was made into PMMA, and DNA purification and amplification were successively performed.

DNA 정제-증폭을 위해 제작된 PMMA 마이크로 디바이스의 총 부피에 해당하는 최종 부피 60㎕의 세포 파쇄물 제조를 위해 순수(pure water)에 원심분리된 E.coli O157:H7 배양액 5㎕를 희석하였다. 다음으로 E.coli O157:H7 DNA를 함유하는 상기 희석액 60㎕를 상기 PMMA 마이크로 디바이스로 도입한 후, 5분간 정상 상태를 유지하였다. 이후 희석액은 제거되었으며 마이크로채널은 건조되었다. PCR 시약의 도입 이전에, PMMA 마이크로 디바이스는 한 쌍의 구리 가열 블록(사이즈는 2.5ⅹ6cm) 상에 놓여졌고, 2단계 온도조절 기반 PCR이 수행되었다. 관련하여, 도 8의 좌측도는 적외선 카메라를 이용한 온도 측정 결과를 나타낸다. 이를 참조하면, E.coli O157:H7의 210bp 단편을 증폭하기 위해 열변성 영역의 온도는 95.0±1.0℃, 결합/신장 영역의 온도는 55.0±1.0℃에 해당한다. DNA Purification - 5 μl of centrifuged E. coli O157: H7 culture in pure water was diluted for the preparation of a cell lysate with a final volume of 60 μl corresponding to the total volume of PMMA microdevices prepared for amplification. Next, 60 μl of the diluted solution containing E. coli O157: H7 DNA was introduced into the PMMA microdevice, and then maintained in a steady state for 5 minutes. The diluent was then removed and the microchannels were dried. Prior to the introduction of the PCR reagents, the PMMA microdevices were placed on a pair of copper heating blocks (size 2.5 x 6 cm) and two-step temperature-controlled PCR was performed. In this regard, the left side of Fig. 8 shows the result of temperature measurement using an infrared camera. Referring to this, in order to amplify the 210 bp fragment of E. coli O157: H7, the temperature of the heat denaturation region is 95.0 ± 1.0 ° C and the temperature of the binding / stretch region is 55.0 ± 1.0 ° C.

다음으로 PCR 시약 20㎕가 2~3μL min-1의 흐름 속도로 마이크로채널에 도입되었다(사이클 횟수에 맞춤). 마이크로채널 표면에 흡착된 DNA는 상기 PCR 시약에 의해 지속적으로 용리되었으며, 나아가 PCR 시약과 혼합되어 동일한 마이크로채널 내에서 PCR 증폭이 수행되었다. 한편, 샘플의 흐름을 보다 명확히 인지하고, 실제 열적 조건 하에서의 기포 발생 여부를 확인하기 위해 녹색 버퍼가 이용되었다. 본 시험에서 PMMA 마이크로 디바이스를 이용한 DNA 정제-증폭에 걸리는 시간은 대략 DNA 정제 5분, 증폭 30분으로 총 35분 이었다. 이는 오프-칩 PCR에서의 시간(DNA 정제 150분 및 증폭 150분으로 총 300분)의 1/10에 불과하다. 이와 같이 DNA 정제-증폭 시간이 단축되면 샘플의 오염 리스크를 크게 줄일 수 있고, 분석 비용 등을 절감할 수 있는 장점이 있다. Next, 20 μl of the PCR reagent was introduced into the microchannel at a flow rate of 2 to 3 μL min -1 (fit to the number of cycles). The DNA adsorbed on the surface of the microchannel was continuously eluted by the PCR reagent. Further, PCR amplification was performed in the same microchannel by mixing with the PCR reagent. On the other hand, a green buffer was used to more clearly recognize the flow of the sample and confirm whether bubbles were generated under actual thermal conditions. In this test, the time required for purification and amplification of DNA using PMMA microdevice was about 5 minutes for DNA purification and 30 minutes for amplification for a total of 35 minutes. This is only 1/10 of the time in off-chip PCR (150 min DNA purification and 150 min amplification for a total of 300 min). As such, shortening the DNA purification-amplification time can greatly reduce the contamination risk of the sample and reduce the analysis cost.

도 8의 우측도는 PMMA 마이크로 디바이스를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. Lane 1,2는 오프-칩 PCR을 수행한 결과이며, Lane 3,4는 PMMA 마이크로 디바이스를 이용하여 PCR을 수행한 결과다. PMMA 마이크로 디바이스를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 타겟 앰플리콘들의 평균 강도는 오프-칩 PCR을 수행하여 얻은 평균 세기(Lane 1)의 대략 53%에 해당한다. 그럼에도 불구하고 PMMA 마이크로 디바이스로부터 얻은 타겟 앰플리콘의 타겟 밴드는 충분히 식별가능하다는 것을 도 8의 우측도로부터 확인할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 DNA 정제-증폭을 단일 채널로 연속적으로 수행하기에 충분히 신뢰할 만한 성능을 가지고 있음을 보여준다. The right side of FIG. 8 shows the result of performing PCR using PMMA microdevice. Lane 1 and 2 are the results of the off-chip PCR, and Lane 3 and 4 are the PCR results of the PMMA microdevice. The average intensity of the target amplicons obtained by performing the PCR using the PMMA microdevice corresponds to approximately 53% of the average intensity (Lane 1) obtained by performing the off-chip PCR. Nevertheless, the target band of the target amplicon from the PMMA microdevice is well identifiable from the right-hand side of FIG. That is, the microdevice according to the present invention has a sufficiently reliable performance for successively performing DNA purification-amplification in a single channel.

이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.Embodiments of the present invention have been described above. However, it will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the present invention as defined by the appended claims. It will be understood that various modifications may be made in the invention, and that such modifications are also included within the scope of the present invention.

111: 하부기판
112: 상부기판
120: 마이크로채널
131: 입구도관
132: 출구도관
140: 히터111: Lower substrate
112: upper substrate
120: Microchannel
131: inlet conduit
132: outlet conduit
140: heater

Claims (5)

열가소성 플라스틱인 상부 기판 및 하부 기판이 본딩되어 형성되고 내부에는 미세 유체가 흐를 수 있는 단일 마이크로채널이 형성되는 기판부와, 단일 마이크로채널의 입구단에 연결되어 미세 유체를 단일 마이크로채널 내부로 도입시키는 입구도관과, 단일 마이크로채널의 출구단에 연결되어 미세 유체를 단일 마이크로채널 외부로 배출시키는 출구도관을 포함하고,
세포 파쇄물(cell extract)이 입구도관을 통해 단일 마이크로채널 내부로 도입되고 소정 시간 머무르는 동안 상기 세포 파쇄물 내의 양이온이 단일 마이크로 채널 표면의 작용기와 반응하여 단일 마이크로채널 표면이 양전하를 띠도록 전환되고 양전하를 띠는 단일 마이크로채널 표면과 음전하를 띠는 세포 파쇄물 내의 DNA 사이의 정전기적 인력에 의해 상기 세포 파쇄물 내의 DNA가 단일 마이크로채널 표면에 흡착되어 DNA 정제가 수행되는 통합형 마이크로 디바이스.A substrate part formed by bonding an upper substrate and a lower substrate which are thermoplastic plastic and having a single microchannel through which a microfluid can flow, and a microchannel connected to an inlet end of the single microchannel to introduce the microfluid into a single microchannel And an outlet conduit connected to the outlet end of the single microchannel to discharge the microfluid out of the single microchannel,
While the cell extract is introduced into a single microchannel through the inlet conduit and the cations in the cell lysate react with the functional groups on the surface of the single microchannel so that the single microchannel surface is converted to be positively charged, Wherein the DNA in the cell lysate is adsorbed on a single microchannel surface by electrostatic attraction between a single microchannel surface and DNA in a cell lysate that is negatively charged to perform DNA purification. 청구항 1에 있어서,
상기 열가소성 플라스틱은 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌) 및 PP(폴리프로필렌) 중에서 선택되는 통합형 마이크로 디바이스.The method according to claim 1,
The thermoplastic is an integrated micro device selected from PMMA (polymethylmethacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene) and PP (polypropylene). 청구항 1에 있어서,
DNA가 단일 마이크로채널 표면에 흡착된 상태에서 PCR 시약이 단일 마이크로채널 내부로 도입되고 소정시간 머무르는 동안 상기 PCR 시약에 의해 흡착된 DNA가 용리되고, 상기 PCR 시약은 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함하는 통합형 마이크로 디바이스.The method according to claim 1,
While the DNA is adsorbed on the surface of a single microchannel, the PCR reagent is introduced into a single microchannel and the DNA adsorbed by the PCR reagent is eluted for a predetermined time, and the PCR reagent is reacted with the reaction buffer, dNTPs, Taq polymerase and An integrated microdevice that includes a primer. 마이크로 디바이스를 이용한 DNA 정제-증폭 방법에 있어서,
a) 세포 파쇄물을 열가소성 플라스틱으로 형성되는 마이크로 디바이스의 단일 마이크로채널 내부로 도입하고 소정 시간 유지하여 세포 파쇄물 내의 양이온이 단일 마이크로채널 표면의 작용기와 반응하여 단일 마이크로채널 표면과 음전하를 띠는 세포 파쇄물 내의 DNA 사이의 정전기적 인력에 의해 세포 파쇄물 내의 DNA를 단일 마이크로채널 표면에 흡착시키는 단계;
b) 상기 세포 파쇄물을 단일 마이크로채널 외부로 배출하는 단계;
c) 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함하는 PCR 시약을 상기 단일 마이크로채널 내부로 도입하고 소정 시간 유지하여 상기 DNA를 용리시키는 단계; 및
d) PCR 시약을 유체 흐름 방향으로 전진시키고 히터를 통해 상기 단일 마이크로채널의 온도를 제어함으로써 상기 단일 마이크로채널에서 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행하는 단계를 포함하는 DNA 정제-증폭 방법.In a DNA purification-amplification method using a microdevice,
a) introducing the cell lysate into a single microchannel of a microdevice formed of a thermoplastic plastic, holding the cell lysate for a predetermined time, and allowing the cation in the cell lysate to react with the functional group on the surface of a single microchannel, Adsorbing DNA in a cell lysate to a single microchannel surface by an electrostatic attraction between DNAs;
b) discharging the cell lysate out of a single microchannel;
c) introducing a PCR reagent containing reaction buffer, dNTPs, Taq polymerase and primer into the single microchannel and holding the DNA for a predetermined time to elute the DNA; And
d) conducting PCR (polymerase chain reaction) in said single microchannel by advancing the PCR reagent in the fluid flow direction and controlling the temperature of said single microchannel through a heater. 청구항 4에 있어서,
상기 열가소성 플라스틱은 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌) 및 PP(폴리프로필렌) 중에서 선택되고,
상기 단계 a)에서 상기 세포 파쇄물 내의 양이온에 의해 단일 마이크로채널 표면이 양전하를 띠도록 전환됨으로써 세포 파쇄물 내의 DNA가 단일 마이크로채널 표면에 흡착되고, 상기 단계 c)에서 상기 PCR 시약에 의해 흡착된 DNA가 용리되어 상기 PCR 시약에 혼합되는 DNA 정제-증폭 방법.The method of claim 4,
The thermoplastic is selected from among PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PS (polystyrene) and PP (polypropylene)
The DNA in the cell lysate is adsorbed on a single microchannel surface by converting the single microchannel surface to be positively charged by the cation in the cell lysate in step a), and the DNA adsorbed by the PCR reagent in step c) Eluting and mixing with the PCR reagent.
KR1020170064406A 2017-05-24 2017-05-24 Integrated microdevice for dna purification and amplification and method using the same KR101925079B1 (en)

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