KR101922515B1

KR101922515B1 - 알코올 유발성 간 질환의 치료, 예방 및 역행

Info

Publication number: KR101922515B1
Application number: KR1020097007164A
Authority: KR
Inventors: 라 몬트 수잔 마리 드; 잭 레이먼드 완즈
Original assignee: 로드아일랜드하스피틀
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-10
Publication date: 2019-02-20
Also published as: WO2008030595A3; CA2663115C; WO2008030595A2; AU2007292874A1; US20100021386A1; US9717719B2; CA2663115A1; AU2007292874B2; JP5864077B2; EP2061484A2; JP2010502718A; EP2061484A4; KR20090086941A; ES2399147T3; EP2061484B1

Abstract

본 발명은 1종 이상의 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 효현제를 투여함으로써 만성 알코올 섭취에 의한 간 질환 또는 손상을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법에 관한 것이다.

Description

알코올 유발성 간 질환의 치료, 예방 및 역행{TREATMENT, PREVENTION, AND REVERSAL OF ALCOHOL-INDUCED LIVER DISEASE}

본 발명은 의학적 치료 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(peroxisome proliferator activated receptor; PPAR) 효현제를 투여함으로써 만성적인 알코올 섭취 또는 태아의 알코올 노출에 의해 발생된 간 질환 또는 손상을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법에 관한 것이다.

에탄올이 성장 인자 및 시토카인 네트워크의 영양 작용에 대한 간세포의 민감성을 감소시키는 증거가 증가하고 있다. 실제로, 배양 시 에탄올에 노출된 래트 간세포는 인슐린 및 상피 성장 인자(EGF) 자극 DNA 합성에 대한 반응이 확연하게 감소한다. 따라서, 단기간 및 장기간 에탄올 노출은 시험관 내에서 간 세포 DNA 합성(Carter et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 128:767 (1985); Carter et al, Alchol Clin. Exp. Res. 12:555 (1988)) 및 부분적인 간 절제술 후 간의 재생 능력(Diehl et al, Gastroenterology 99: 1105 (1990); Diehl et al, Hepatology 16:1212 (1992); Wands et al, Gastroenterology 77:528 (1979))을 손상시킨다. 에탄올이 간 세포 증식을 억제하는 정확한 분자성 메카니즘(들)은 불완전하게 이해된다. 간 재생은 종양 괴사 인자(TNF)-α, EGF, 변형 성장 인자 알파(TGF-α), 인터 루킨(IL)-6, 간 세포 성장 인자(HGF) 및 인슐린이 가장 중요하다고 생각되는 몇몇 성장 인자 및 시토카인에 의해 조절된다(Michalopoulos et al, Science 276:60 (1997); Pistoi et al, FASEB J. 10:819 (1996); Fausto, J. Hepatol 32:19 (2000). 이와 관련하여, 앞선 연구들은 에탄올이 HGF(Saso et al, Alcohol Clin. Exp. Res. 20:330A (1996)), EGF(Zhang et al, J. Clin. Invest. 98:1237 (1996); Higashi et al, J. Biol. Chem. 266:2178 (1991); Saso et al, Gastroenterology 112:2073 (1997)), 또는 TNF-α(Akerman et al, Hepatology 17:1066 (1993))에 의한 신호 전달 캐스캐이드 활성화 및 간세포에서의 Ca²⁺매개 신호(Sun et al, MoI. Endocrinol. 11:251 (1997))를 방해함을 제시하였다. 또한, 만성 에탄올 소비는 래트 간을 재생시키는 데 있어서 G-단백질 발현을 방해하고 환상 AMP 의존적 신호화를 억제한다(Diehl et al, FASEB J. 10:215 (1996); Hoek et al, FASEB J. 6:2386 (1992)). 다른 신호 전달 경로는 또한, 몇몇 조사자가 나타낸 바와 같이, 에탄올로의 생체 내 노출에 의해 반대로 영향을 받는다. 예를 들어, EGF 수용체에 대한 G 단백질 결합이 손상되고(Zhang et al, Biochem. Pharmacol 61:1021 (2001)); 부분적인 간 절제술에 의한 NFkβ 및 JNK의 TNF-α 유도된 발현이 변경되며(Diehl, Clin. Biochem. 32:571 (1999)); p42/44, MAPK, p38 MAPK 및 JNK의 활성화가 급성 또는 만성 에탄올 노출에 의해 감소된다(Chen et al, Biochem. J. 334:669 (1998)).

EGF, TGF-α, HGF 및 인슐린과 같은 간 세포 성장 인자가 수용체 티로신 키 나제를 활성화시키기 때문에, 그들의 세포내 기질의 티로신 인산화를 통해 매개된 신호 전달에 대한 에탄올의 효과를 조사하였다. 이전 연구는 에탄올이 DNA 합성의 강력한 억제제이기 때문에 이 경로의 생물학적 연관성(Carter et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 128:767 (1985); Diehl et al, Gastroenterology 99:1105 (1990); Wands et al, Gastroenterology 77:528 (1979); Duguay et al, Gut 23:8 (1982)), 및 인슐린 매개 신호 전달(Sasaki et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:403 (1994))과 환상 AMP 매개 신호 전달(Diehl et al, Hepatology 16:1212 (1992))을 수립하였다. 이러한 에탄올의 효과는 유사분열생식에 관련된 인슐린 신호 전달 경로의 풀림에 의해 매개될 수 있다(Sasaki et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:403 (1994)). 실제로, IRS-1 매개 신호화는 성체 간의 간 세포 성장을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 한다(Ito et al, Mol. Cell. Biol. 16:943 (1996); Nishiyama et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:280 (1992); Sasaki et al, J. Biol Chem. 268:3805 (1993); Tanaka et al, J. Biol. Chem. 271:14610 (1996); Tanaka et al Hepatology 26:598 (1997); Tanaka et al, Cancer Res. 56:3391 (1996); Tanaka et al, J. Clin. Invest. 98:2100 (1996)). 알부민 프로모터의 조절 하에 IRS-1이 과다발현된 유전자 도입(Tg) 마우스 모델에 있어서서, 비Tg 대조군 마우스에 비해 Tg 마우스에서 간 질량이 20∼30% 더 크고 이 차이는 성체기 내내 유지됨이 증명되었다(Tanaka et al Hepatology 26:598 (1997)). IRS-1 과다발현의 이 효과는 증가된 간 세포 DNA 합성, 및 PI3K 및 Ras/Erk MAPK 캐스캐이드의 구조적 활성화와 관련이 있다. 다른 모델에 있어서, 안 티센스 IRS-1 RNA의 발현 또는 IRS-1 항체의 미량 주사는 인슐린 자극 DNA 합성 및 성장을 억제하였다(Rose et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 91:797 (1994); Waters et al, J. Biol. Chem. 268:22231 (1993)). 유사하게, 결정자/음성의 ERS-I 돌연변이는 인슐린 및 IGF-I 자극 세포 증식을 차단하는 것으로 밝혀졌다(Tanaka et al, J. Clin. Invest. 98:2100 (1996)). 또한, 최근의 조사는 IRS-1을 통한 신호화의 활성이 DNA 합성 및 세포 주기 이행에 필수적이고, IRS-1이 세포 변형에서 직접적인 역할을 하는 것을 입증하였다(Ito et al, Mol. Cell. Biol. 16:943 (1996); Tanaka et al, J. Biol. Chem. 271:14610 (1996); Tanaka et al, Cancer Res. 56:3391 (1996); Tanaka et al, J. Clin. Invest. 95:2100 (1996)). 세포 성장에 대한 IRS-1 과다발현의 효과는 세포분열성 신호 전달 캐스캐이드의 구조적 활성화에 의존하는 것으로 보인다(Ito et al, Mol Cell. Biol. 16:943 (1996); Nishiyama et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:280 (1992); Sasaki et al, J. Biol Chem. 268:3805 (1993); Tanaka et al, J. Biol. Chem. 271:14610 (1996); Tanaka et al Hepatology 26:598 (1997); Tanaka et al, Cancer Res. 56:3391 (1996); Tanaka et al, J. Clin. Invest. 98:2100 (1996)). 함께 이러한 연구들은 간 성장에 있어서 인슐린/IGF-I 신호화의 중요성 및 간 치유 과정에 대한 인슐린 내성의 잠재적 반대 효과를 강조한다.

공지된 간영양 인자인 인슐린은 인슐린 수용체(IR)를 통해 작용하여 간 성장 및 대사에 있어서 중요한 역할을 한다(Khamzina et al, Mol Biol. Cell 9:1093 (1998); White, Recent Prog. Horm. Res. 53:119 (1998)). IRα-아단위에 대한 결 합에 따라, IRβ-아단위는 티로실 잔기에서 자가인산화되어, 수용체 티로실 키나제 활성을 개선시킨다(White, Recent Prog. Horm. Res. 53:119 (1998)). IRS-1은 IR 티로신 키나제에 대한 주요한 세포내 기질이다(Sun et al, Nature 352:73 (1991)). IRS-1 단백질의 C-말단 영역 내에 위치되는 티로실 인산화 모티프(Myers et al, Trends Biochem. Sci. 19:289 (1994))는 포스파티딜이노시톨 3'-키나제(PI3K)의 p85 조절 아단위(Backer et al, EMBO J. 11:3469 (1992); Myers et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10350 (1992)), 성장 인자 수용체 결합 단백질 2(Grb2)(Skolnik et al, Sdence 260:1953 (1993)), 포스포리파제 Cγ(PLCγ)(White, Recent Prog. Horm. Res. 53:119 (1998)), 및 티로실 포스파타제 SHP2/Syp(Sun et al, Mol. Cell. Biol. 13:7418 (1993))를 비롯한 SH2 함유 분자와의 상호작용을 통해 아래로 향하는 신호를 전달한다. 이러한 결합 사건들은 Ras/Raf/MAPKK/MAPK 캐스캐이드와 같은 특이적 신호화 경로의 활성화에 중요하다. 중요한 다른 주요 경로는 Akt/단백질 키나제 B(PKB)를 활성화시킴으로써 세포 생존을 촉진하는(Dudek et al, Science 275:661 (1997); Eves et al, Mol. Cell. Biol. 18:2143 (1998)) IRS-1의 613YMPM 및 942YMKM 모티프에 대한 PI3K의 p85 아단위의 결합(Backer et al, EMBO J. 11:3469 (1992); Myers et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10350 (1992))을 포함한다. 막 인지질에 대해 작용하는 PLCγ는 세포내 Ca 농도 및 단백질 키나제 C 활성의 조절에 관여하는 2차 전달자, 이노시톨 포스페이트 및 디아실 글리세롤을 생성한다(Carpenter et al, Exp. Cell Res. 253:15 (1999); Sekiya et al, Chem. Phys. Lipids 98:3 (1999)). IRS-1의 N-말단 서열은 신호화를 매개하는 3가지 중요한 기능적 도메인을 함유한다: 하나는 플렉스트린(pleckstrin) 상동(PH) 영역으로서 확인되고(Musacchio et al, Trends Biochem. Sci. 18:343 (1993)), 2가지 다른 것은 포스포티로신 결합(PTB) 도메인으로서 확인된다(Sun et al, Nature 377:173 (1995); Gustafson et al, Mol. Cell Biol. 15:2500 (1995)). PH 도메인은 Tyk-2 야누스 티로신 키나제와의 IRS-1 상호작용을 매개하고(Platanias et al, J. Biol. Chem. 271:278 (1996)), IRS-1과 G 단백질 사이의 혼선(Touhara et al, J. Biol Chem. 269:10217 (1994)) 또는 인지질(Harlan et al, Nature 371:168 (1994)) 신호화를 매개할 수 있다.

IRS 단백질에 의해 사용되는 가장 중요한 아래로 향하는 신호화 분자 중 하나는 D-3 위치에서 포스포이노시타이드를 인산화하는 PDK이다(Carpenter et al, Mol. Cell Biol. 13:1657 (1993); Dhand et al, EMBO J. 13:511 (1994)). 이러한 인지질은 세린 키나제인 Akt(또한 PKB라고도 함)를 인산화하고(Kandel et al, Exp. Cell Res. 253:210 (1999); Franke et al, Cell 81:727 (1995); Burgering et al, Nature 376:599 (1995)) Akt 키나제를 활성화하는 포스포이노시타이드 의존적 키나제 1(PDK-1)을 활성화한다. 인슐린을 비롯한 많은 영양 인자들은 PDK->PDK1 경로를 이용하여 Akt 활성을 증가시킨다. PBK의 지질 산물은 또한 포스포이노시타이드 의존적 키나제, 작은 G-단백질 및 단백질 키나제 C(Avruch et al, Mol. Cell. Biochem. 182:31 (1998); Le Good et al, Science 281:2042 (1998); Zheng et al, J. Biol. Chem. 269:18727 (1994)) 신호 전달 분자를 활성화한다. 또한, 최근의 근거는 PDK가 Ras/Raf/MAPK 경로의 개별적인 성분들의 활성을 직접적으로 작용할 수 있음을 제시한다(Chaudhary et al, Curr. Biol. 10:551 (2000)).

Akt와 같은 PDK의 몇몇 아래로 향하는 표적은 전사 및 세포 운명을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 효과는 생존 및 세포 예정사(아폽토시스)에 필요한 섬세하고 정확한 균형화 신호를 요구한다(Burgering et al, Nature 376:599 (1995); Franke et al, Cell 88:435 (1997)). 인슐린은 2개의 부위(Thr308 및 Ser473)에서 Akt 인산화를 유도하고, 그로써 PDK 의존적 방식으로 Akt 키나제를 활성화한다(Carpenter et al, Mol Cell Biol. 13:1657 (1993)). 편재하여 발현된 세린/트레오닌 단백질 키나제인 GSK3β는 PDK/Akt 경로의 또 하나의 주요한 요소이다(Kandel et al, Exp. Cell Res. 253:210 (1999); Avruch et al, Mol Cell Biochem. 182:31 (1998)). 고 농도의 GSK3β 활성은 아폽토시스를 촉진한다. Akt 키나제는 Ser 9/21에서 GSK3을 부분적으로 인산화시킴으로써 생존을 촉진하고 아폽토시스를 억제하고(Pap et al, J. Biol. Chem. 273:19929 (1998)), 이는 상기 키나제를 비활성화하고 GSK3β 활성을 억제한다(Srivastava et al, Mol Cell Biochem. 182:135 (1998); Cross et al, Nature 378:785 (1995)). GSK3β의 생물학적 활성은이 키나제가, IRS-1 신호화의 아래로 향하는 표적이고 세포 이동의 중요한 매개자인 인슐린 조절된 에탄올 민감성 유전자인 아스파틸(아스파라기닐) β-히드록실라제(AAH)의 농도와 기능을 조절할 수 있기 때문에 특히 중요하다.

Bcl-2 군의 구성원인 사멸전(pro-apoptotic) 단백질 BAD의 Akt 의존적 인산화는 세포 생존 과정에서 다른 하나의 주요한 사건이다. BAD 및 포스포-BAD 농도는 아폽토시스 및 인슐린 유발성 세포 생존 사이에서 균형을 조절하는 데 참여한다. BAD Ser112 부위 특이적 키나제는, 외부의 미토콘드리아 막 단백질인 A-키나제 부착 단백질은 PKA 홀로 효소를 BAD가 활성인 세포기관에 매어둠으로써 세포 이하의 키나제-기질 상호작용을 촉진하는 미토콘드리아 막 국부적 cAMP 의존적 단백질 키나제(PKA)(Harada et al, Mol Cell 3:413 (1999))이다. 인슐린과 같은 생존 인자에 노출 시, PKA의 국부화된 촉매적 아단위는 Ser112에서 미토콘드리아계 BAD를 인산화한다. Ser112 및 Ser136에서 BAD의 인산화는 비활성화하고 결합으로부터 BAD를 Bcl-2로 바꾸어, BAD를 시토졸로 전위시킨다. 이 과정은 아폽토시스를 억제하고 세포 생존을 촉진한다(Zha et al, Cell 87:619 (1996)).

몇몇 환경하에서, Akt 활성이 세포 사멸 유전자의 발현을 조절하는 전자 인자를 제어함으로써 아폽토시스를 억제할 수 있다는 주목하지 않을 수 없는 근거가 존재한다. 최근에, 전사 인자의 Forkhead 군의 구성원인 FKHRL1 유전자를 제어한다는 것이 증명되었다. Akt가 인슐린/IGF-I 자극에 의해 활성화될 때, 아마도 IRS-1 신호 전달 경로를 통해, 그것은 FKHRL1을 인산화하고 14-3-3 샤페론 단백질과의 그것의 연합을 촉진하여, 세포질에서 FKHRL1 전사 인자의 유지를 초래한다. 이와 반대로, Akt에 의해 감소된 FKHRL1의 인산화는 그것의 핵 전좌 및 표적 유전자의 후속 활성화를 유도할 수 있다. 이와 관련하여, FKHRL1의 가장 중요한 표적들 중 하나는 FKHRL1 DNA 결합에 대해 3개의 일치 서열을 함유하는 Fas 리간드(L) 유전자이다. Fas L 프로모터 영역으로의 FKHRL1의 결합은 Fas L 유전자 발현을 증가시키고 세포 사멸을 촉진시킨다(Brunet et al, Curr. Opin. Neurobiol 11:297 (2001)). 따라서, Akt 신호화의 억제는 Fas L 발현을 유발한다(Suhara et al, Mol Cell. Biol. 22:680 (2002)). 이와 관련하여, 메카니즘(들)이 아직 정해지지 않았음에도 불구하고, 이전 실험에서의 발견은 급성 또는 만성 에탄올 소비가 래트 및 마우스에게서 상위 조절된 Fas L 발현을 유도할 수 있음을 제시한다(Deaciuc et al, 알코올 Clin. Exp. Res. 23:349 (1999); Zhou et al, Am. J. Pathol. 159:329 (2001); Deaciuc et al, Hepatol. Res. 19:306 (2001); Castaneda et al., J Cancer Res. Clin. Oncol. 127:418 (2001)). 만성 에탄올 남용의 조건하에 Fas L 유전자 상위 조절은 Forkhead 전사 인자의 감소된 Akt 의존적 인산화를 통해 발생할 수 있고, 이 과정이 간세포에서 세포 예정사 메카니즘을 활성화시킬 수 있음이 제시되었다. 그러므로, 그것들이 간 세포 증식 및 생존에 관여할 때 IRS-1 의존적 및 IRS-1 비의존적 신호화 메카니즘에서 에탄올 유발성 변형의 생물학적 결과를 인식하는 것이 중요하다.

에탄올이 IRS-1 의존적 경로에 의해 간에서 PI3K 활성을 감소시키는 직접적인 실험 근거가 존재한다. 하지만, PI3K가 에탄올에 의해 억제될 수 있다는 다른 잠재적 메카니즘의 고려는 간에서 PTEN 발현의 고찰을 유도한다. 이러한 실험들의 원리는 PI3K 활성의 주요 음성 조절자로서 판명되었다는 것이다(Yamada et al, J. Cell ScL 114:2375 (2001); Seminario et al., Semin. Immunol. 14:27 (2002); Leslie et al, Cell Signal. 14:285 (2002); Maehama et al, Annu. Rev. Biochem. 70:247 (2001); Comer et al, Cell 109:541 (2002)). 상기 PTEN 분자는 C2 인지질 결합 도메인, 2가지 PEST 영역, PDZ 결합 도메인 및 PIP2 결합 모티프와 같은 다수의 보존된 도메인을 가진다. 종양 억제 유전자로서 초기에 기술한 바와 같이, 주요 기질(생체 내)은 PI(3, 4, 5)P3 및 PI(4, 5)P2임이 증명되었다. 단지 PTEN(G-129-E)의 지질 포스파타제 도메인을 폐기하는 점 돌연변이의 존재는 종양 억제의 소실을 포함하는 PTEN -/- 표현형을 생성하기에 충분하다. 반면에, PTEN의 과다발현은 인슐린 수용체의 티로실 인산화를 방해하지 않고 IRS-1 티로실 인산화 및 IRS-1/Grb-2/SOS 복합체 형성을 차단한다. 세포 내에서의 순 효과는 MAPK 활성화, 세포 주기 이행 및 증식을 억제하는 것이다(Weng et al, Hum. Mol. Genet. 10:605 (2001)). 이러한 발견은 PTEN이 간 세포 증식에 관여하는 신호화 경로를 음성적으로 제어함을 제시한다.

따라서, PTEN이 탈인산화하여 PDK 기능을 저해하는 것은 간에 대한 에탄올 효과와 관련하여 매우 중요하다(Dahia et al, Hum. Mol. Genet. 5:185 (1999); Maehama et al, Trends Cell. Biol. 9:125 (1999); Li et al, Cancer Res. 57:2124 (1997)). 반대로, PTEN의 비활성화는 PI3K 기능을 증진시키고 증가된 Akt 인산화 및 Akt 키나제 활성을 유도하는 Akt의 막 채용을 촉진한다(Kandel et al, Exp. Cell Res. 253:210 (1999); Maehama et al, Trends Cell. Biol. 9:125 (1999)). 그러므로, 저 농도의 PTEN은 Akt 키나제 활성을 증가시키고 성장 및 생존을 촉진하는 한편, 고 농도의 PTEN은 PI3K/Akt를 억제하고 사멸 신호의 전달을 증진시킬 뿐 아니라 세포 증식을 억제한다. 대조군 래트에 비해 만성 에탄올 노출된 래트로부터 유래한 간 조직에서 유의적으로 증가한 PTEN 발현 및 포스파타제 활성이 존재한다. 이 현상은 전사, 전사후 또는 양 메카니즘에 기인될 수 있다. 이와 관련하여, PTEN 발현 및 포스파타제 활성은 인산화에 의해 음성적으로 제어되고(Torres et al, J. Biol. Chem. 276:993 (2001)), PTEN 농도가 1차 간 세포 배양에서 인슐린 유발성 인산화에 의해 조절될 수 있고, 에탄올 노출이 상기 분자의 C-말단 영역의 인산화를 변형시킴으로써 단백질의 생물학적 활성 및 농도를 증진시키는 것을 제시한다. 에탄올 노출된 간 조직에 있어서 증가된 PTEN 발현의 규모가 증진된 GSK-3β 활성과 대등하고, PI3K를 통해 아래로 향하는 신호화에 대한 예상된 억제 효과와 일치하는 것은 주목할 만하다. 이 관찰은 PTEN 발현의 변조를 통해 세포 증식 경로뿐 아니라 세포 예정사에 대해 에탄올이 간에서 주요한 효과를 가질 수 있음을 제시한다.

인간 질환에 적용될 때 생물학적 중요성은 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF-I 및 IGF-II)와 IRS-1 의존적 및 IRS-1 비의존적 신호 전달 캐스캐이드에 의해 조절된 간 세포 증식 및 생존과 관련된 특이적 신호화 캐스캐이드에 에탄올이 반대로 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 손상된 PBK/Akt 신호화에 연결된 것처럼 보이는 Fas 시스템에 대한 에탄올 효과가 존재한다. IRS-1 및 PBK를 통한 증식 경로 및 생존 경로는 생체 내에서 만성 에탄올 노출에 의해 현저하게 변형되고, Fas 신호화 경로는 생체 내 및 시험관 내에서 간 세포 아폽토시스에 기여할 수 있다. 실제로, 에탄올이 Fas L 발현을 상위조절하며 간 질환을 동반한 알코올 중독에서 관찰되는 간 세포 손상에서 중요한 역할을 할 수 있다는 축적된 근거가 존재하지만, 에탄올에 의한 Fas 수용체(R)/Fas L 변형의 분자 메카니즘(들)은 여전히 수립되어야 한다(Benedetti et al, J. Hepatol. 6:137 (1988); Natori et al, J. Hepatol. 34:248 (2001); Goldin et al, J. Pathol. 171:73 (1993); Nanji, Semin. Liver Dis. 18:187 (1998); Higuchi et al, Hepatology 34:320 (2001)).

간에 대한 만성 에탄올 소비의 다른 반대의 효과는 지질 과산화 및 DNA 손상에 의해 표명되는 산화적 스트레스에 관한 것이다. 이와 관련하여, 간에 대한 에탄올 노출은 H₂O₂를 포함하는 활성 산소(ROS)의 세포질 생성을 증가시킨다. 이것이 발생할 때, 항산화성 방어는 불충분하고, 간 세포 생존 능력이 감소하며 간 손상이 생성된다(Sohn et al., J. Neurol. ScL 162:133 (1999); Tanaka et al., J. Clin. Invest. 103:341 (1999); Diehl et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. 간 Physiol. 288:1 (2005)). 이 조절에 있어서, 지방 간, 알코올성 간염, 간경변 및 몇몇 경우에 간세포 암종의 성장과 같은 만성 질환을 초래하는 간 염증이 증가한다. 그러므로 만성 에탄올 소비는 간에 대한 2가지 반대의 영향, 즉 산화적 스트레스, 미토콘드리아 손상, 세포 예정사 경로의 상위 조절, DNA 손상을 통한 간 손상의 유발성 및 영구 보존과, 원칙적으로 인슐린/IGF-I 신호 전달 캐스캐이드를 통한 간 치유 과정의 억제(즉, 간 재생)를 가지며, 그것은 전 세계에 걸쳐 인간의 간 질환의 주된 원인 중 하나이다.

이 문제의 규모는 다음과 같이 설명된다: 성체 중 대략 67%가 알코올을 소비하고 천사백만 미국인들이 알코올 남용 및/또는 의존도에 대한 기준을 충족시킨다. 문맥에서, 알코올성 간 질환(ALD)은 2백만이 넘는 미국인들, 세계적으로는 더 많이 영향을 미친다. 임상적인 결과, ALD를 앓는 개개인 중 40%가 간의 간경변으로 사망한다. 따라서, 이러한 에탄올 남용의 두려운 합병증을 예방 또는 치료하는 방법을 발견하는 것이 필요하다.

[발명의 개요]

알코올 유발성 간 손상과 인슐린 내성 사이의 유연 관계는, 만성적으로 알코올을 섭취한 동물의 간에서 인슐린/IGF 경로 및 손상된 인슐린 반응의 발견에 의해 설명된다. 이러한 발견은 치료 목적으로 활용될 수 있는 ALD와 인슐린/IGF 신호화 경로 사이의 관계를 정의한다.

본 발명은 알코올 유발성 간 손상 동물 모델을 이용할 때 특정 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 효현제의 투여가 간에서 산화적 스트레스 및 DNA 손상을 현저히 억제한다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 순효과는 에탄올에 의해 유발된 진행중인 간 손상을 완화 또는 예방하는 것이다. 본 발명은 알코올과 관련된 성체 및 태아 간 손상의 치료에 주로 관련된 것이다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 동물에 있어서 알코올 유발성 간 질환을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법으로서, 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 동물에 있어서 만성 알코올 섭취에 의한 간 손상을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법으로서, 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 만성 알코올 섭취에 의한 동물의 간에 있어서의 인슐린 내성을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법으로서, 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 모체(parent)의 만성 알코올 섭취에 의해 동물 태아의 간에 유발된 간 손상을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법으로서, 상기 동물 또는 상기 모체에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

놀랍게도, PPAR 효현제가 만성 에탄올 섭취 동물에 있어서 간 손상을 치료 및 예방하는 데 특히 유효하다는 것이 발견되었다. 따라서, 만성 알코올 섭취자이거나 알코올 유발성 간 손상 또는 간 질환을 앓고 있는 인간 피험체에게 PPAR 효현제를 투여하여 추가적인 간 손상을 예방하거나 늦추고 간 손상 또는 간 질환의 증상을 치료 또는 개선할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 만성 알코올 섭취자인 임신한 여성에게 PPAR 효현제를 투여하여 복중 태아에 대한 추가적인 간 손상을 예방하거나 늦추고 태아에 의해 나타나는 간 손상 또는 간 질환의 증상을 치료 또는 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 또한 롱-에반스(Long-Evans) 래트에게 에탄올을 만성적으로 섭식시켜 제작한 알코올 유발성 간 손상 및 질환의 동물 모델을 제공한다. 놀랍게도, 롱-에반스 래트는 다른 래트 품종에 비해 에탄올 식이에 확실한 반응을 나타내기 때문에 이 래트가 만성 알코올 섭취의 영향을 연구하기에 이상적으로 적합하다는 것을 발견하였다. 일 실시형태에 있어서, 롱-에반스 래트의 일상 식이에 에탄올을 포함시킨다. 예를 들어, 에탄올은 일상 식이의 약 0%, 2%, 4.5%, 6.5%, 9.25%(v/v)(칼로리 함량의 0%, 8%, 18%, 26% 또는 37%에 상당함) 또는 그 이상을 차지할 수 있다.

본 발명은 또한 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 잠재적으로 유용한 제제를 스크리닝하는 방법으로서, 롱-에반스 래트에게 에탄올을 만성적으로 섭식시켜 제작한 동물 모델에게 제제를 투여하는 단계 및 상기 제제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준과 관련하여 간 손상, 인슐린 내성 및/또는 인슐린 내성의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 제제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준에 비해 간 손상, 인슐린 내성 및/또는 간 재생 반응의 수준이 개선된 것은 상기 제제가 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 잠재적으로 유용함을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 대한 잠재적 치료제를 테스트하는 방법으로서, 롱-에반스 래트에게 에탄올을 만성적으로 섭식시켜 제작한 동물 모델에게 잠재적 치료제를 투여하는 단계 및 상기 잠재적 치료제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준과 관련하여 간 손상, 인슐린 내성 및/또는 간 재생 반응의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 잠재적 치료제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준에 비해 간 손상, 인슐린 내성 및/또는 간 재생 반응의 수준이 개선된 것은 상기 치료제가 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 잠재적으로 유용함을 나타내는 것인 방법을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 동일 칼로리 쌍을 섭식시킨 대조군에 비해 만성 에탄올 섭식에 의한 간 손상(상부), 증진된 지질 과산화(중간), 및 DNA 손상(하부)을 도시한다.

도 2A∼2F는 실시간 RT-PCR에 의한 그들의 개별적인 수용체 발현(D, E, 및 F)에 비해 에탄올 및 대조군 동물(A, B, 및 C)에서의 인슐린, IGF-I 및 IGF-II 유전자 발현의 측정을 도시한다.

도 3A∼3C는 만성 에탄올 섭식 래트(A)에서 그것의 수용체에 대한 감소된 인슐린 결합을 도해한다. 대조군(B, C)에 비해 IGF-I 또는 IGF-II 수용체 결합에 있어서 어떠한 변화도 없다.

도 4A∼4C는 에탄올 섭식 동물 및 대조군(A∼C) 사이에 IRS-1, IRS-2 및 IRS-4 유전자 발현의 차이점이 존재하지 않음을 도시한다. 만성 에탄올 섭식 군(D)에서 인슐린 반응성 유전자인 AAH 발현이 감소한다. 이 결과는 간에서 인슐린 내성을 설명한다.

도 5는 부분적인 간 절제술 후 24 시간에 BrdU 통합에 의해 측정한 바와 같이 간 재생을 손상시키는 것을 도시한다.

도 6은 PPAR 효현제가 간 재생의 에탄올 유발 억제를 구조하는 것을 도시한다. PPAR-δ 효현제 치료가 BrdU 통합으로 측정한 바와 같이 정상 농도에 간 재생 반응을 회복한다. PPAR-δ 및 PPAR-α 효현제는 간 손상에 대해 더욱 최근의 이로운 효과를 가진다.

도 7은 PPAR 효현제가 HNE 면역활성에 의해 측정된 바와 같이 지질 과산화에 대한 만성 에탄올 영향을 구조한다는 근거를 도시한다. α, γ 및 δ PPAR 제제는 간에서 세포 손상을 예방하는 데 동등하게 잘 작용한다.

도 8은 만성 에탄올 소비에 의해 유발된 DNA 손상이 PPAR 효현제에 의해 감소되는 것을 도시한다. PPAR-δ는 간 세포 손상을 예방하는 데 있어서 α 및 γ 제제보다 우수하다.

도 9A∼9L은 대조군 동물에서 간 구조에 대한 PPAR 효현제의 영향을 도시한다.

도 10A∼1OL은 에탄올 섭식 동물에서 간 구조에 대한 PPAR 효현제의 영향을 도시한다.

도 11A∼11F는 대조군 및 에탄올 섭식 동물에 있어서 간 세포 프로파일에 대한 PPAR 효현제의 영향을 도시한다.

도 12A∼12I는 인슐린 및 IGF 폴리펩티드의 간 발현, 이들의 수용체, 및 IRS 분자에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제의 영향을 도시한다.

도 13A∼13H는 인슐린 수용체 결합에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 영향을 도시한다.

도 14A∼14H는 IGF-I 수용체 결합에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 영향을 도시한다.

도 15A∼15H는 IGF-II 수용체 결합에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 영향을 도시한다.

도 16A∼16D는 웨스턴 분석에 의한 AAH 및 GAPDH 발현에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 영향을 도시한다.

도 17A∼17C는 ELISA 분석에 의한 AAH 및 GAPDH 발현에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 영향을 도시한다.

[상세한 설명]

본 발명은 알코올 유발성 간 손상 및 질환과 FAS의 발생에 있어서 증가된 인슐린 내성의 중요한 역할 및 상기 간 손상을 예방 또는 치료할 수 있는 PPAR 효현제의 능력에 관한 것이다. 알코올을 만성적으로 섭취한 동물에게 PPAR 효현제를 투여하는 것은 산화적 스트레스(예를 들어, 지질 과산화) 및 DNA 손상에 기인한 손상을 비롯하여 알코올 섭취에 반응하여 나타나는 간 손상을 경감 또는 예방한다. 따라서, 본 발명은 동물에 있어서 알코올 유발성 간 질환을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법으로서, 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 모체의 만성 알코올 섭취에 의해 동물 태아의 간에 유발된 간 손상을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법으로서, 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 2종 이상의 상이한 PPAR 효현제가 투여된다. 다른 일 실시형태에 있어서, 3개 이상의 상이한 PPAR 효현제가 투여된다. 일 실시형태에 있어서, 투여된 PPAR 효현제는 PPAR 수용체의 2종 이상의 상이한 아형, 예를 들어 α 및 δ, α 및 γ, 또는 δ 및 γ에 결합한다. 추가의 실시형태에 있어서, 투여된 PPAR 효현제는 PPAR 수용체의 모든 3가지 아형에 결합한다. 투여된 PPAR 효현제는 하나의 PPAR 수용체 아형에 선택적으로 결합하는 화합물 및/또는 PPAR 수용체 아형보다 더 많이 결합하는 화합물을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "알코올성 간 질환(ALD)"이라는 용어는 에탄올 섭취에 의해 야기되는 간에서의 임상적 병상 변화의 스펙트럼을 가리킨다. ALD 병상은 지방 간(지방증), 알코올성 간염 및 알코올성 간경변을 포함한다.

본원에서 사용되는 "만성 알코올 섭취"란 용어는 동물이 평균적으로 매일 체중 1 kg당 약 0.1 g 이상, 예를 들어 평균적으로 매일 체중 1 kg당 적어도 약 0.2 g, 0.3 g, 0.4 g, 0.5 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 또는 5 g의 순수 알코올(에탄올)을 소비하는 것을 의미한다. 인간의 경우, 만성 알코올 섭취란 평균적으로 매일 약 10 g 이상, 예를 들어 평균적으로 매일 적어도 약 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g 또는 100 g의 순수 알코올을 소비하는 것으로 간주된다.

본원에서 사용되는 "치료적 유효량"이란 용어는 질환의 증상 중 하나 이상을 개선시키거나, 질환의 진전을 예방하거나, 질환의 회귀를 유발하기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 예를 들어, 간 손상의 치료와 관련하여, 일 실시형태에 있어서, 치료적 유효량이란 손상된 간 세포의 수 또는 손상된 간 세포수의 증가 속도를 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 감소시키거나 늦추는 치료제의 양을 의미한다. 간 기능은 아미노기전이효소(예를 들어, 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 아스파르트산 아미노기전이효소(AST)), γ-글루타밀 펩티드전이효소(GGT), 평균 미립자 부피(MCV), 프로트롬빈 시간, 혈소판 계산, 빌리루빈, 알부민 및/또는 알카리성 포스파타제를 비롯한 임상 의학에서 일상적인 분석법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에 있어서, 치료적 유효량이란 간에서의 인슐린 내성을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 감소시키는 치료제의 양을 의미한다. 인슐린 내성은, 인슐린 수용체에의 인슐린 결합의 측정, 당 부하 검사 및 인슐린 반응성 유전자의 발현을 측정하는 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 당업계에서 통상적으로 이용되고 있고 본원에 기재되어 있는 분석법을 이용하여 측정할 수 있다.

본원에서 사용되는 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"이란 용어들은 동물에 있어서의 병리적 세포(예를 들어, 손상된 간 세포)의 발생이 감소되는 것을 의미한다. 예방은, 예를 들어 피험체에서 병리적 세포가 완전히 사라지는 것과 같이 완벽할 수 있다. 예방은, 피험체에 있어서 병리적 세포의 발생이 본 발명이 적용되지 않았을 때 발생한 것보다 더 적은 것과 같이 부분적인 것일 수도 있다.

본 발명의 일 양태에서는, 동물에 있어서 알코올 유발성 간 질환을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함한다. 상기 PPAR 효현제는 간 질환의 물리적 또는 조직학적 증상이 개시되기 전 또는 후에 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 동물에 있어서 만성 알코올 섭취에 의한 간 손상을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함한다. 상기 PPAR 효현제는 간 손상의 물리적 또는 조직학적 증상이 개시되기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 간 손상은 알코올 섭취와 관련된 임의의 유형의 세포 또는 조직 손상일 수 있다. 예를 들어, 상기 손상은 산화적 스트레스(예를 들어, 지질 과산화) 또는 DNA 손상과 관련된 것일 수 있다. 본원에서 사용된 "∼와 관련된"이란 표현은 알코올 유발성 간 손상이 병태(예를 들어, 산화적 스트레스 또는 DNA 손상)의 물리적(예를 들어, 조직학적, 혈청학적)의 징후에 의해 확인되는 것을 의미한다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 만성 알코올 섭취에 의한 동물의 간에 있어서의 인슐린 내성을 치료, 예방 또는 역행시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상기 동물에게 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 것을 포함한다. 상기 PPAR 효현제는 인슐린 내성이 개시되기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 인슐린 내성은 인슐린/IGF 신호 전달 경로를 따라 어느 곳에서나 발생하는 알코올에 의한 임의의 변화, 예를 들어 인슐린 또는 IGF-I 발현의 감소, IGF-II 발현의 증가, 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II에 대한 수용체 발현의 감소, 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II의 그 각각의 수용체에 대한 결합의 감소, 또는 인슐린 반응성 유전자(예컨대 AAH)의 발현 감소에 의한 것일 수 있다.

인슐린 내성은 상기 인슐린/IGF 신호 전달 경로에서의 하나 이상의 인자의 수준 또는 기능에 있어서의 변화를 검출함으로써 측정할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 변화의 검출은 생체내에서 행해질 수 있다. 예를 들어, 영상 기법(예를 들어, 자기 공명 영상법, 컴퓨터 축 단층 촬영술, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영술, 양전자 방출 단층 촬영술, X선, 초음파)을 검출 가능하게 표지된 항체, 리간드, 효소 기질 등과 함께 사용함으로써, 피험체의 상기 인슐린/IGF 신호 전달 경로에 있어서의 하나 이상의 인자의 수준 또는 기능을 측정할 수 있다. 검출 가능한 표지의 예로는 방사성 표지, 형광 표지, 상자성 표지 및 초상자성 표지를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 생체내 영상 기법이 본 발명에 이용될 수 있다. 영상 기법의 예는 미국 특허 제6,737,247호, 제6,676,926호, 제6,083,486호, 제5,989,520호, 제5,958,371호, 제5,780,010호, 제5,690,907호, 제5,620,675호, 제5,525,338호, 제5,482,698호 및 제5,223,242호에 개시되어 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 변화의 검출은 시험관내에서, 예를 들어 생물학적 샘플을 이용하여 행한다. 생물학적 샘플은 상기 인슐린/IGF 신호 전달 경로에서의 하나 이상의 인자의 수준 또는 기능을 검출하는 데 적합한, 피험체 유래의 임의의 조직 또는 체액일 수 있다. 유용한 샘플의 예로는 생검 조직, 혈액, 혈장, 장액, 간척수액, 간실액, 타액, 뇨 및 림프를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

검출 및 측정될 수 있는 인슐린/IGF 신호 전달 경로에 있어서의 인자로는 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자-I(IGF-I), IGF-II, 인슐린 수용체, IGF-I 수용체, IGF-II 수용체, 티로신 인산화 인슐린 수용체, 티로신 인산화 IGF-I 수용체, 티로신 인산화 IGF-II 수용체, 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1), IRS-2, IRS-4, 티로신 인산화 IRS-1, 티로신 인산화 IRS-2, 티로신 인산화 IRS-4, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3 키나제), PI3 키나제의 p85 서브유닛, Akt, 포스포-Akt, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β) 및 포스포-GSK-3β를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 측정될 수 있는 기능으로는 인슐린 수용체, IGF-I 수용체 또는 IGF-II 수용체의 리간드 결합 능력, 인슐린 수용체, IGF-I 수용체 또는 IGF-II 수용체의 키나제 활성, PI3 키나제의 p85 서브유닛과 인산화된 IRS-1, IRS-2 또는 IRS-4의 상호작용, 성장 인자 수용체 결합형 단백질 2(Grb2), SHPTP-2 단백질 티로신 포스파타제 또는 PI3 키나제의 p85 서브유닛에 대한 인산화된 IRS-1, IRS-2 또는 IRS-4의 결합, 미토젠 활성화 단백질 키나제 키나제(MAPKK), Erk MAPK, Akt/단백질 키나제 B, GSK-3β의 효소 활성을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 인슐린/IGF 신호 전달 경로에 있어서의 인자들의 수준은 단백질 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 수준에서 측정될 수 있다. 생물학적 샘플 중의 특정 단백질을 정량하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 그 예로는 면역분석법, 웨스턴 블로팅, 면역침전법, 면역조직화학법, 젤 전기영동, 모세관 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 리간드 결합 분석법 및 효소 분석법을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)]; 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd Edition, (1995)]을 참조할 수 있다.

특정 RNA의 수준을 측정하기 위해서는, 당업계에 공지된 임의의 핵산 검출 분석법을 본 발명에 이용할 수 있다. 그 예로는 역전사법 및 증폭 분석법, 하이브리드화 분석법, 노던 블로팅, 도트 블로팅, 인시추 하이브리드화, 젤 전기영동, 모세관 전기영동 및 컬럼 크로마토그래피를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd ed., (1995)]; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989)]을 참조할 수 있다. 이 분석법은 RNA 그 자체 또는 RNA의 역전사에 의해 생성된 cDNA를 검출할 수 있다. 분석은 생물학적 샘플에 대해 바로 또는 그 샘플로부터 단리된 핵산에 대해 실시될 수 있다.

추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은 동물에서 간 재생 반응을 촉진 또는 회복시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 치료적 유효량의 1종 이상의 PPAR 효현제를 동물에게 투여하는 것을 포함한다. PPAR 효현제는 간 재생 반응의 감소 이전 또는 후에 투여될 수 있다. PPAR 효현제에 의해 유발된 재생 반응의 증가는 PPAR 효현제의 부재 시 관찰되는 재생 반응보다 약 10% 이상, 예를 들어 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 더 클 수 있다. 간 재생 반응의 측정은 DNA 합성 속도의 측정과 같은 업계에 공지된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 간 손상 또는 질환에 기인한 병리를 나타내는 동물, 간 손상 또는 질환에 기인한 병리를 나타내는 것으로 의심되는 동물 및 간 손상 또는 질환에 기인한 병리를 나타낼 위험이 있는 동물에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 알코올 중독에 대한 유전적 소인을 보이는 동물, 과음을 하지는 않지만 다른 원인의 간 손상이 이미 발생한 동물, 또는 임신했음을 알게 된 동물이 예방 목적으로 치료될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 PPAR 효현제로는 미국 특허 제6,713,514호, 제6,677,298호, 제6,462,046호, 제5,925,657호 및 제5,326,770호와, 문헌[Combs et al., J. Neurosci. 20:558 (2000)]에 개시된 것과 같은 PPAR-α, PPAR-γ 및 PPAR-δ의 선택적 효현제뿐만 아니라, 다수의 PPAR 아형의 효현제인 화합물을 들 수 있다. "선택적"이란 용어는 다른 PPAR 수용체 아형보다 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상, 가장 바람직하게는 1,000배 이상 더 큰 활성을 나타내는 제제를 설명하는 표현이다. PPAR 수용체 아형에 대한 제제의 수용체 친화성 및 기능적 활성은 WO 2005/049572에 기재된 방법을 이용하여 그 특성을 규명할 수 있다. 간 질환 환자에 있어서의 PPAR-δ의 사용은 I형 근육 섬유의 수를 증가시킨다는 추가적인 장점이 있으며, 이는 운동을 하지 않아도 비만에 대한 내성을 부여하고 대사 프로필을 개선시킬 수 있다[Wang et al., PLoS Biol. 2:3294 (2004)].

유용한 PPAR-α 선택적 효현제로는 클로피브레이트, 베자피브레이트, 시프로피브레이트, 2-브로모헥사데칸산, 에토목시르 소듐 하이드레이트, N-올레오일에탄올아민, GW-9578, GW-7647, WY-14643과, 미국 특허 제7,091,225호, 제7,091,230호, 제7,049,342호, 제6,987,118호, 제6,750,236호, 제6,699,904호, 제6,548,538호, 제6,506,797호, 제6,306,854호, 제6,060,515호 및 제6,028,109호에 개시된 화합물들을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

유용한 PPAR-γ 선택적 효현제로는 시글리타존, 로시글리타존, 피오글리타존, 트로글리타존, GW-1929, F-L-Leu, JTT-501, GI-262570과, 미국 특허 제7,090,874호, 제7,060,530호, 제6,908,908호, 제6,897,235호, 제6,852,738호, 제6,787,651호, 제6,787,556호, 제6,713,514호, 제6,673,823호, 제6,646,008호, 제6,605,627호, 제6,599,899호, 제6,579,893호, 제6,555,536호, 제6,541,492호, 제6,525,083호, 제6,462,046호, 제6,413,994호, 제6,376,512호, 제6,294,580호, 제6,294,559호, 제6,242,196호, 제6,214,850호, 제6,207,690호, 제6,200,995호, 제6,022,897호, 제5,994,554호, 제5,939,442호 및 제5,902,726호에 개시된 화합물들을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

유용한 PPAR-δ 선택적 효현제로는 이하에 그 구조식이 정의되어 있는 GW-501516, GW-0742, L-165041 및 카바프로스타사이클린을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다:

그 밖의 유용한 PPAR-δ 효현제로는 RWJ-800025, L-160043과, 미국 특허 제7,091,245호, 제7,015,329호, 제6,869,967호, 제6,787,552호, 제6,723,740호, 제6,710,053호 및 제6,300,364호 및 EP 1586573, US 2005/0245589 및 WO 2005/049572에 개시된 화합물들을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

유용한 혼합 PPAR-α/γ 효현제로는 GW-1556, AVE-8042, AVE-8134, AVE-0847, DRF-2519와, 미국 특허 제7,091,230호, 제6,949,259호, 제6,713,508호, 제6,645,997호, 제6,569,879호, 제6,468,996호, 제6,465,497호 및 제6,380,191호에 개시된 화합물들을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

모든 PPAR 수용체에 대해 효현제로서 작용하는 유용한 화합물로는 LY-171883 및 슈도라르산(pseudolaric acid) B를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 실시형태는 알코올 유발성 간 질환 또는 손상의 치료, 예방 또는 역행에 유용하다고 당업계에 알려져 있는 제제와 함께 치료적 유효량의 PPAR 효현제를 투여하는 방법을 제공한다. 추가 제제의 예로는 글루코코르티코이드(예를 들어, 프레드니손, 프레드니솔론), 펜톡시필린, 우루소데옥시콜린산, 콜히친 및 이뇨제를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 실시형태에 있어서, PPAR 효현제와 추가 제제는 개별적으로, 예를 들어 2개의 별개의 조성물로서 동물에게 투여된다. 다른 실시형태에서는, PPAR 효현제와 추가 제제가 단일 조성물의 구성요소로서 투여된다.

본 발명의 일부 실시형태에 있어서, PPAR 효현제와 추가 제제는 하기 조건, 즉, 서로 다른 주기, 서로 다른 투여 기간, 서로 다른 농도, 서로 다른 투여 경로 등 중 하나 이상에 따라 동물에게 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, PPAR 효현제는 추가 제제에 앞서, 예를 들어 추가 제제의 투여보다 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 10 시간, 12 시간 또는 18 시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일, 또는 1주, 2주, 3주 또는 4주 전에 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, PPAR 효현제는 추가 제제 후에, 예를 들어 추가 제제를 투여한 지 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 10 시간, 12 시간 또는 18 시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일, 또는 1주, 2주, 3주 또는 4주 후에 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, PPAR 효현제와 추가 제제는 동시에, 그러나 서로 다른 스케쥴로 투여되는데, 예를 들어 PPAR 효현제는 매일 투여되는 반면, 추가 제제는 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 4주에 1회 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, PPAR 효현제는 주 1회 투여되는 반면, 추가 제제는 매일, 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 4주에 1회 투여된다.

PPAR 효현제의 투여와 추가 제제의 투여를 계속 동시에 행할 수도 있다. 또한, 추가 제제 투여 기간이 지난 후에도 PPAR 효현제의 투여를 지속할 수도 있으며 그 반대로 할 수도 있다.

본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 추가 제제와 함께 PPAR 효현제를 투여하는 방법은 1회 이상 반복될 수 있다. 이 방법은 치료 반응을 얻거나 유지하기 위해 필요에 따라 여러 번, 예를 들어 1회∼약 10회 또는 그 이상 반복적으로 행할 수 있다. 상기 방법의 매회 반복 수행시, PPAR 효현제와 추가 제제는 이전 반복 수행에서 사용된 것과 동일해도 되고 상이해도 된다. 또한, PPAR 효현제와 추가 제제의 투여 기간과 투여 방식은 반복 수행시마다 달라질 수 있다.

본 발명의 제제는 화합물의 세포내 섭취를 개선시키기 위해 담체 분자에 결합시킬 수 있다. 그러한 담체 분자의 예로는 문헌[Fulda et al., Nature Med. 8:808 (2002)], 문헌[Arnt et al., J. Biol. Chem. 277:44236 (2002)] 및 문헌[Yang et al., Cancer Res. (63:831 (2003)]에 기재된 것과 같은 담체 펩티드, 용해성(fusogenic) 펩티드[예를 들어, 미국 특허 제5,965,404호 참조]와, 바이러스 및 바이러스의 일부분(예컨대, 중공 캡시드 및 바이러스 헤마글루티닌)[미국 특허 제5,547,932호 참조)을 들 수 있다. 다른 담체 분자로는 아시알로당단백질과 같은 세포 표면 수용체에 대한 리간드(이것은 상기 아시알로당단백질 수용체에 결합함; 미국 특허 제5,166,320호 참조) 및 T 세포에 특이적인 항체와 같은 세포 표면 수용체에 대한 항체, 예를 들어, 항-CD4 항체(미국 특허 제5,693,509호 참조)를 들 수 있다.

본 발명의 범위 내에 있는 조성물은 본 발명의 제제가 그 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유된 모든 조성물을 포함한다. 개별 필요량이 다르더라도, 각 성분의 유효량의 최적 범위를 결정하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 보통의 숙련된 의사라면, 투여 경로, 피험체의 나이, 체중 및 건강 상태뿐만 아니라 간 질환의 단계는 물론이고, 제제에 수반될 수 있는 임의의 부작용, 제제의 효능을 고려하고 통상적인 의학적 절차 및 관행에 따라 실제 투여량 및 치료 계획을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 상기 제제는, 간 손상 또는 질환의 치료를 받고 있는 동물(예를 들어, 인간)에게 이 동물 체중 1 kg당 하루에 0.0025∼50 mg의 용량으로 경구 투여되거나 또는 그 약학적으로 허용되는 염이 등량으로 경구 투여된다. 바람직하게는, 간 손상 또는 질환을 치료, 예방 또는 역행시키기 위해 약 0.01 mg/kg∼약 10 mg/kg이 경구 투여된다. 근육내 주사의 경우, 그 투여량은 일반적으로 경구 투여량의 절반 수준이다. 예를 들어, 적절한 근육내 투여량은 약 0.0025 mg/kg∼약 25 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 mg/kg∼약 5 mg/kg이다.

단위 경구 투여량은 각각의 제제를 약 0.01 mg∼약 50 mg, 바람직하게는 약 0.1 mg∼약 10 mg 포함할 수 있다. 단위 투여량은 약 0.1 mg∼약 10 mg, 편리하게는 약 0.25 mg∼50 mg의 제제를 함유하는 하나 이상의 정제 또는 캡슐로서 1일 1회 이상 투여될 수 있다.

본 발명의 제제는, 제제를 원료 화합물로서 투여하는 것 이외에도, 약학적으로 이용될 수 있는 제제로의 화합물 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 약학적으로 허용되는 적절한 담체를 함유하는 약학 제제의 일부로서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제제, 특히 경구 또는 국소 투여될 수 있고 선호되는 투여 유형에 이용될 수 있는 제제, 예컨대 정제, 당의정, 서방형 로젠지 및 캡슐, 구강 양치액(마우스 린스) 및 구강 세정액(마우스 워시), 젤, 액체 현탁액, 헤어 린스, 헤어 젤, 샴푸와, 직장을 통해 투여될 수 있는 제제(예컨대 좌제), 주사, 국소 또는 경구 투여하기에 적합한 용액제는 부형제와 함께 약 0.01%∼99%, 바람직하게는 약 0.25%∼75%의 활성 화합물(들)을 함유한다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명 화합물의 유익한 효과를 경험할 수 있는 임의의 피험체에게 투여될 수 있다. 그러한 피험체 중 주요 피험체는 포유동물(예를 들어, 인간)이나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 동물로는 가축(소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이 등)을 들 수 있다.

상기 화합물 및 이의 약학 조성물은 그 의도된 목적을 달성하는 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 협측, 경막내, 두개내, 비내 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 대안으로 또는 병행하여, 경구 경로를 통한 투여가 이용될 수 있다. 투여량은 투여 대상의 나이, 건강 상태 및 체중, 이용된다면 병용 치료의 종류, 치료 빈도 및 원하는 효과의 성질에 따라 달라진다.

본 발명의 약학 제제는 그 자체가 공지된 방법으로, 예를 들어, 통상적인 혼합법, 제립법, 당의정 제조법, 용해법 또는 동결건조법으로 제조한다. 따라서, 경구 사용을 위한 약학 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 혼합하고, 경우에 따라, 형성된 혼합물을 분쇄하고, 경우에 따라 또는 필요에 따라 적절한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 형성함으로써 제조할 수 있다.

적절한 부형제로는 특히 충전제, 예를 들어 락토스 또는 수크로스, 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당류, 셀룰로스 제제 및/또는 인산칼슘, 예를 들어 제3인산칼슘 또는 인산수소칼슘과, 결합제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분을 사용한 전분 페이스트, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈이 있다. 필요에 따라, 전술한 전분과 카복시메틸-전분, 가교 결합형 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 그 염(에컨대 알긴산나트륨)과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다. 보조제로는 특히 흐름성 조절제와 윤활제, 예를 들어 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 그 염, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼슘 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있다. 당의정 코어에는, 필요에 따라 위액 내성인 적절한 코팅을 제공한다. 이를 위해서는, 경우에 따라 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 래커액 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당류 용액이 사용될 수 있다. 위액 내성인 코팅을 제조하기 위해서는, 아세틸셀룰로스 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸-셀룰로스 프탈레이트와 같은 적절한 셀룰로스 제제의 용액이 사용된다. 예를 들어, 활성 화합물 투여량의 조합을 식별 또는 확인할 수 있도록, 상기 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료를 첨가할 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 다른 약학 제제로는 젤라틴으로 제조된 푸쉬핏(push-fit) 캡슐과, 젤라틴과 가소제(예컨대, 글리세롤 또는 솔비톨)로 제조된 연질의 밀봉 캡슐을 들 수 있다. 푸쉬핏 캡슐은 충전제(예컨대, 락토스), 결합제(예컨대, 전분) 및/또는 윤활제(예컨대, 탈크 또는 스테아르산마그네슘) 및 경우에 따라 안정화제와 혼합될 수 있는 과립의 형태로 활성 화합물을 함유할 수 있다. 연질 캡슐의 경우, 상기 활성 화합물은 지방 오일 또는 액체 파라핀과 같은 적절한 액체 중에 용해 또는 현탁되어 있는 것이 바람직하다. 그 밖에, 안정화제도 첨가될수 있다.

직장 투여될 수 있는 가능한 약학 제제로는, 예를 들어, 1종 이상의 활성 화합물과 좌제 기재의 조합으로 이루어진 좌제를 들 수 있다. 적절한 좌제 기재로는, 예를 들어 천연 또는 합성 트리글리세라이드 또는 파라핀 탄화수소가 있다. 또한, 활성 화합물과 기재의 조합으로 이루어진 젤라틴 직장 캡슐을 사용하는 것도 가능하다. 사용될 수 있는 기재 재료로는, 예를 들어 액체 트리글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 파라핀 탄화수소를 들 수 있다.

비경구 투여에 적합한 제제는 수용성 형태(예를 들어, 수용성 염)의 활성 화합물의 수용액 또는 알칼리 용액을 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 주사용 유성 현탁액으로서 투여될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비이클은 지방 오일, 예를 들어 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드 또는 폴리에틸렌 글리콜-400을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 상기 현탁액은 안정화제를 함유할 수도 있다.

본 발명은 또한, 롱-에반스 래트에게 에탄올을 만성적으로 섭식시켜 제작한, 알코올 유발성 간 손상 및 질환의 동물 모델을 제공한다. 놀랍게도, 상기 롱-에반스 래트는 다른 래트 품종에 비해 에탄올 섭취에 확실한 반응을 나타내기 때문에, 이 래트가 만성 알코올 섭취의 영향을 연구하기에 이상적으로 적합하다는 것을 발견하였다. 일 실시형태에서는, 롱-에반스 래트의 일상 식이에 에탄올을 포함시킨다. 예를 들어, 에탄올은 일상 식이의 약 0%, 2%, 4.5%, 6.5%, 9.25%(v/v)(칼로리 함량의 0%, 8%, 18%, 26% 또는 37%에 상당함) 또는 그 이상을 차지한다. 일 실시형태에 있어서, 에탄올은 일상 식이의 칼로리 함량의 약 37%를 차지할 수 있다. 에탄올 섭식은 필요한 만큼의 기간 동안, 예를 들어 2일 정도의 단기간부터 6개월 또는 그 이상에 이르는 장기간 동안 지속할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 에탄올 섭식은 간 손상이 유도될 때까지, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 또는 그 이상의 기간 동안 지속하고, 그 후 제제 또는 기타 치료제를 투여하여 이들이 간 손상에 미치는 영향을 확인한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 간 손상이 예방 또는 지연될 수 있는지를 확인하기 위해 에탄올 섭식 전 또는 에탄올 섭식과 동시에 제제 또는 치료제를 투여한다.

본 발명은 또한 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 잠재적으로 유용한 제제를 스크리닝하는 방법으로서, 롱-에반스 래트에게 에탄올을 만성적으로 섭식시켜 제작한 동물 모델에게 제제를 투여하는 단계 및 상기 제제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준과 관련하여 간 손상, 인슐린 내성 및/또는 간 재생 반응의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 제제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준에 비해 간 손상, 인슐린 내성 및/또는 간 재생 반응이 개선된 것은 상기 제제가 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 잠재적으로 유용함을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다.

스크리닝될 수 있는 제제는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 핵산, 유기 분자, 천연물, 화합물 라이브러리 등을 포함한다.

본 발명은 또한, 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 대한 잠재적 치료제를 테스트하는 방법으로서, 롱-에반스 래트에게 에탄올을 만성적으로 섭식시켜 제작한 동물 모델에게 잠재적 치료제를 투여하는 단계 및 상기 잠재적 치료제를 투여받지 않은 대조군 동물에서의 수준과 관련하여 간 손상 및/또는 인슐린 내성의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 잠재적 치료제를 투여받지 않은 대조군 동물에 있어서의 수준에 비해 간 손상 및/또는 인슐린 내성의 수준이 개선된 것은 상기 치료제가 알코올 유발성 간 손상 또는 질환의 치료, 예방 또는 역행에 잠재적으로 유용함을 나타내는 것인 방법을 제공한다.

하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 예시하기 위한 것으로, 한정을 의도한 것은 아니다. 임상 치료에서 일반적으로 접하게 되고 당업자에게 명백한 각종 조건 및 파라미터의 다른 적절한 변경예 및 수정예도 본 발명의 사상 및 범위에 속한다.

실시예 1

일반적 방법

실험 디자인

이 연구에 있어서, 롱-에반스 수컷 래트에게 37% 에탄올 액체 식이를 6 주간 섭식하였다. 동등 칼로리의(에탄올 대신에 수크로스) 식이를 한 쌍의 섭식시킨 대조군 동물에게 투여하였다. 3주 후, 두 군의 래트에게 대조군으로서 PPAR-α, γ 또는 δ 효현제 또는 염수를 주사하였다. PPAR-α(GW7647), PPAR-γ(F-L-Leu) 및 PP AR-δ(L-165041) 활성물은 CalBiochem(Carlsbad, CA)로부터 얻고, 각각 25 ㎍/kg, 20 ㎍/kg 및 2 ㎍/kg의 농도로 복강내(IP) 투여하였다. 일주일에 2번 마우스에게 IP 주사하였다. 6주에, 상기 동물은 2/3 부분적 간 절제술을 받았다. 제거된 간을 하기에서 기술한 조직학, 지질 과산화의 측정, DNA 손상 및 인슐린/IGF 신호화에 있어서 이용하였다. 2/3 간 절제술 후에, 간 잔존물을 18, 24, 30 및 48 시간 후에 채취하여 재생 반응을 평가하였다. 이를 하기 위해, 채취하기 2 시간 전에동물에게 BrdU를 IP 주사하여 DNA 합성의 지표로서 간 세포핵 안으로의 그것의 통합을 측정하였다. 이 동물 모델에서 BrdU 또는 ³H-티미딘 통합에 의해 측정한 간 재생은 부분적인 간 절제술 후 최대 24시간이다(Wands et al, Gastroenterology 77:528 (1979)).

이러한 식이를 한 6주 후에 희생시켜 만성 에탄올 섭식 래트 및 동등 칼로리 한 쌍을 섭식시킨 대조군으로부터 간 조직을 얻었다. 간 영역의 포르말린 고정한 파라핀에 파묻은 부분을 헤마톡실린 및 에오신 염료로 염색하고 광학 현미경으로 검사하였다. 인접한 조직학적 부분을 면역조직화학적 염색을 하였다. 동일한 영역으로부 얻은 조직의 새로운 급냉시킨 블럭을 mRNA 발현 및 수용체 결합을 측정하는 데 사용하였다.

조직학적 연구

파라핀 부분(8 ㎛ 두께)을 8-히드록시-데옥시구아노신(8-OHdG)(Oxis Research) 또는 4-히드록시논에놀(HNE)(Chemicon International, Temecula, CA)에 대한 단일 클론의 항체로 면역염색하여 DNA 손상 및 지질 과산화를 각각 측정하였다. 면역염색 이전에, 탈파라핀화하고 재수화시킨 부분을 실온에서 20분간 인산염 완충 염수(10 mM 인산나트륨, 0.9% NaCl, pH 7.4; PBS) 중 0.1 mg/ml 사포닌으로 처리한 후, 10분간 메탄올 중 3% 과산화수소로 처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭시키고, 그 다음 SuperBlock-TBS(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)에서 30분간 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 그 후, 조직 부분을 4℃에서 0.5∼1 ㎍/ml의 1차 항체와 밤새 인큐베이션하였다. 면역반응성은 비오틴화된 2 차 항체, 아비딘 비오틴 호스래디시 퍼옥시다제 복합체(ABC) 시약, 및 색원체로서 디아미노벤지딘을 사용하여 측정하였다(Vector Laboratories, Burlingame, CA)(Lam et al, J. Biol. Chem. 269:20648 (1994)). 조직 부분을 헤마톡실린으로 대비염색하고, 커버 글라스 아래에 보존하고, 광학 현미경으로 조사하였다.

실시간 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석법

제조업자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 간 조직으로부터 전체 RNA를 단리하였다. 260 nm 및 280 nm에서 측정한 흡광도로부터 RNA 농도 및 순도를 측정하였다. AMV First Strand cDNA 합성 키트(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) 및 랜덤 올리고데옥시뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 RNA(2 ㎍)를 역전사하였다. 실시간 정량적 RT-PCR을 이용하여, 인슐린, IGF-I 및 IGF-II 성장 인자, 이들의 해당 수용체, 뉴런(Hu) 세포, 성상 세포(아교 섬유 산성 단백질; GFAP), 희돌기교세포(미엘린 관련 당단백질-1; MAG-1), 미세아교세포(AIF1) 및 내피세포(엔도텔린-1; ET-1) 유전자, 아세틸 콜린에스테라제(AChE) 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 mRNA 수준을 측정하였다. 병행 반응에서 측정된 리보좀 18S RNA 수준을 이용하여 mRNA 전사체의 상대적 존재량을 산출하였다[Myers et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 89:10350 (1992); Baltensperger et al., Science 260:1950 (1993)]. 최초 RNA 주형 2.5 ng으로부터 생성된 cDNA, 유전자 특이적 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(표 1) 각 300 nM 및 2x QuantiTect SYBR Green PCR Mix(Qiagen Inc, Valencia, CA) 12.5 ㎕를 함유하는 25 ㎕의 시약에서 PCR 증폭을 행하였다. BIO-RAD iCycler iQ Multi-Color RealTime PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 증폭된 신호를 연속적으로 검출하였다. 사용된 증폭 프로토콜은 다음과 같았다: 처음 15분 동안 95℃에서의 변성 및 효소 활성화, 95℃에서 15초, 55∼60℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 구성된 45 사이클. 어닐링 시간은 iCycler 소프트웨어가 설치된 온도 구배 프로그램을 이용하여 최적화하였다.

[표 1] 실시간 정량적 RT-PCR을 위한 프라이머 쌍

예비 연구에서, 아가로스 젤 전기영동으로 SYBR Green 표지 PCR 생성물을 평가하고, 핵산 서열 분석으로 각각의 앰플리콘의 진정성을 확인하였다. 상보성(c) DNA를 PCRII 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하였다. 기지량의 특정 표적 서열 함유 재조합 플라스미드 DNA의 계열 희석액을 PCR 반응에서 표준 물질로 사용하였으며, 표준 물질의 C_t 값으로부터 생성한 회귀선을 이용하여 mRNA 존재량을 산출하였다. 동일한 샘플에서 측정된 18S에 대한 특정 mRNA의 ng 비로부터 상대적 mRNA 존재량을 결정하였다. 18S는 매우 다량 존재하고 그 수준이 샘플 간에 실질적으로 차이가 없는 반면 하우스키핑(housekeeping) 유전자는 질병 상태에 따라 다를 수 있기 때문에 결과를 18S에 대해 정규화하였다. 군간의 통계 비교는 산출된 mRNA/18S 비를 이용하여 행하였다. 대조군 연구는 1) 주형 무함유 반응; 2) 역전사되지 않은 RNA; 3) DNA 분해효소 I로 전처리한 RNA 샘플; 4) 역전사효소 반응 전에 RNA 분해효소 A로 처리한 샘플; 및 5) 게놈 DNA의 실시간 정량적 PCR 분석을 포함하였다.

수용체 결합 분석법

프로테아제 억제제(1 mM PMSF, 0.1 mM TPCK, 1 ㎍/ml의 아프로티닌, 1 ㎍/ml의 펩스타틴 A, 0.5 ㎍/ml의 루펩틴, 1 mM NaF, 1 mM Na₄P₂O₇)를 함유하는 5배 부피의 NP-40 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA) 중에서 신선한 냉동 조직(∼100 mg)을 균질화하였다. 비신코닌산(BCA) 분석법(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 탐색적 연구는 특이적 결합률 20%에 도달하는 데 필요한 방사성 표지 리간드의 농도와 단백질의 양을 결정하였다. 인슐린 수용체 결합 분석은 100 ㎍의 단백질을 이용하여 수행하였다. IGF-I 결합 분석에는 샘플당 25 ㎍의 단백질이 필요했고, IGF-II 수용체 결합 분석은 10 ㎍의 단백질을 사용하여 최적화하였다. 에탄올 노출과 관련된 성장 인자 결합을 평가하기 위해 경쟁적 평형 결합 분석을 이용하였다. 전체 결합을 위해, 2중의 개별 단백질 샘플을, 결합 완충액(100 mM HEPES, pH 8.0, 118 mM NaCl, 1.2 mM MgSO₄, 8.8 mM 덱스트로스, 5 mM KCl, 1% 소 혈청 알부민) 및 100 nCi/ml의 [¹²⁵I](2000 Ci/mmol; 50 pM) 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II를 함유하는 100 ㎕의 시약 중에서 항온처리하였다. 비특이적 결합률을 측정하기 위해, 0.1 μM의 비표지(콜드) 리간드를 추가한 것을 제외하고는 동일하게 샘플 복사물을 조제하였다.

모든 반응은 1.5 ml의 에펜도르프 튜브(Eppendorff tube)에서 행하였으며, 플랫폼 진탕기에서 약하게 진탕시키면서 4℃에서 16 시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 각각의 튜브에 0.15% 소 감마 글로불린[100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 중에서 조제함] 500 ㎕를 첨가한 후, 37.5% 폴리에틸렌 글리콜 8000[PEG-8000; 100 mM Tris- HCl(pH 8.0) 중에서 조제함] 400 ㎕를 첨가함으로써 결합된 방사성 표지 추적자를 침전시켰다. 이 샘플을 진탕(vortexing)하여 철저히 혼합한 후, 얼음 위에서 적어도 2 시간 동안 항온처리하였다. 샘플을 실온에서 15,000 xg로 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하였다. 비결합(유리) 리간드를 함유한 상청 분획을 전부 감마 카운팅 튜브(Sarstedt, Newton, NC)로 옮겼다. 펠릿을 포함한 에펜도르프 튜브 팁을 잘라 내어 별도의 감마 카운팅 튜브에 바로 옮겼다. 샘플을 LKB CompuGamma CS 감마 카운터에서 1분 동안 카운팅하였다. (비표지 경쟁 리간드 부재하의) 총 결합량(pmol)으로부터 비특이적 결합량, 즉 방사성 비표지 리간드 존재하에 결합된 양(fmol)을 제하여 특이적 결합률을 산출하였다. 그 결과를 GraphPad Prism 4 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 분석하고 플로팅하였다.

시약 공급원

인간 재조합[¹²⁵I] 인슐린, IGF-I 및 IGF-II는 아머샴 바이오사이언스(Piscataway, NJ)로부터 구입하였다. 비표지 인간 인슐린은 시그마-알드리치(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 재조합 IGF-I 및 IGF-II는 바켐(King of Prussia, PA)으로부터 입수하였다. 8-OHdG 및 HNE에 대한 단일 클론 항체는 옥시스 사이언티픽(Foster City, CA)으로부터 구입하였다. 다른 모든 정밀 화학제품과 시약은 캘바이오켐(Carlsbad, CA) 또는 시그마-알드리치(St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

통계 분석

실험은 군당 9 마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 그래프에서 데이터는 평균±S.E.M.으로 표시된다. 군간 비교는 스튜던츠 T 검정을 이용하여 행하였다. 통계 분석은 넘버 크런처 통계 시스템(Number Cruncher Statistical System)(Kaysville, UT)을 이용하여 수행하였다. 유의차에 해당하는 P 값 및 경향은 그래프 위에 표시하였다.

간 구조 및 유전자 발현에 대한 만성 알코올 섭식의 영향

만성 에탄올 섭식은 도 1(상단 패널)에 도시한 바와 같이 간 조직학에서 두드러진 변형을 유발하였다. 에탄올 섭식 군에서, 간세포에 현저한 지질 축적이 존재한다. 더욱 중요하게는, 간 세포 손상, 세포 탈락 및 괴사(삽입)의 부분이 존재한다. 소엽 구조가 뒤틀리고 염증 및 염증성 세포 침윤의 부분이 증거이다. 이 그림은 ALD를 앓는 인간에게서 보여지는 간 손상과 일치한다. 도 1의 중간 패널은 HNE 염색으로 입증된 바와 같이 만성 에탄올 노출에 의해 유발된 지질 과산화를 도 해한다. 또한, 8-OHdG 면역활성에 의해 보여지는 간세포에 대한 광범위한 손상이 있다(하부 패널). 그러므로, 만성 에탄올 노출은 세포 손상의 2가지 주요 메카니즘으로서 간에서 산화적 스트레스 및 DNA 변형을 발생시킨다.

간에서 인슐린 신호화에 대한 에탄올 영향은 도 2에서 나타낸 바와 같이 실시간 PCR에 의해 결정된다. 에탄올 노출된 간을 대조군과 비교 시 인슐린 유전자 발현에 있어서 차이점이 존재하지 않는다(2A). 하지만, 만성 에탄올 섭식 래트로부터 유래된 간에서 IGF-I 유전자 발현의 두드러진 감소(p=0.0004)가 존재하였다(2B). 이와 반대로, IGF-II 발현은 대조군 간과 비교 시 에탄올에서 증가하였다(2C). 마찬가지로, 인슐린 수용체(INS-R) 농도는 대조군과 유사하고, IGF-I 및 IGF-II 수용체 유전자 발현은 알코올 섭식 군에서 증가하였다(2D∼2F). 인슐린 신호화에서 주요한 변화는 도 3A에서 도시한 바와 같이 인슐린 수용체에 대한 인슐린 결합 감소를 포함하였다. 이는 도 4A∼4C에 도시한 바와 같이 IRS-1, 2 및 4의 농도가 에탄올을 대조군에 비교 시 상이하지 않기 때문에 간에서 인슐린 내성을 유발할 것이다. 이 개념을 지지하여 만성 에탄올 섭식 래트로부터 유래된 간에서 아래로 향하는 인슐린 반응성 유전자인 AAH 발현이 감소된다(4D). 따라서, 인슐린 내성의 상태는 신호 전달 캐스캐이드에서 초기 단계(즉, 리간드-수용체 상호작용)를 높게 변형시키기 때문에 모든 인슐린 신호화를 손상시키는 수용체로의 인슐린 결합에서 주요한 결함을 가지고 유발된다.

간 재생에 대한 만성 알코올의 영향

도 5는 2/3 간 절제술 후 24 시간에 BrdU 면역염색에 의해 측정한 간 재생 반응에 대한 만성 에탄올 섭식의 두드러진 영향을 도시한다. 에탄올 섭식 군에서 10% 미만인 데 비해(우측 패널) 세포의 60%에 걸쳐서 대조군 동물의 간세포 핵에서 BrdU의 강한 섭취(좌측 패널)를 주목한다. 이러한 결과들은 간 치유 과정에 대한 에탄올의 반대의 역할을 확신하고, 이와 반대로, 도 6에서 도시한 바와 같이, 에탄올 손상된 DNA 합성의 PPAR 효현제 구조가 존재한다. PPAR-α(하부 좌측 패널) 및 PPAR-γ(하부 우측 패널)가 에탄올 섭식 동물에 비해 대략 20%의 BrdU 표지에서 최선의 증가를 나타내는 것을 주목한다. 만성 에탄올 섭식 래트의 PPAR-δ 치료가 2/3 간 절제술 후 정상적인 대조군 동물에서 보여지는 농도로 간 재생을 필수적으로 회복시키는 것은 예상못한 놀라운 것이었다.

이와 함께, 이러한 연구들은 만성 에탄올 소비가 간 세포 손상 및 염증뿐 아니라 간에 대한 산화적 스트레스 및 DNA 손상을 유도함을 입증한다. 재생시키는 간의 능력은 실질적으로 손상된다. 이러한 PPAR 효현제는 또한 도 7에 도시된 바와 같이 지질 과산화로 인한 손상을 구조하는지 여부를 결정하기 위해 조사된다. 실제로, PPAR 효현제는 실질적으로 만성 에탄올 유발된 간 지질 과산화를 개선하고, HNE 면역염색에 의해 측정된 바와 같이 모든 세 부류(α, γ 및 δ)가 동등하게 효과적이다. 더욱이, 도 8에 도시된 바와 같이 에탄올에 의해 유발된 DNA 손상과 관련하여, PPAR-δ가 가장 현저한 보호 효과를 나타내었고, PPAR-α 및 PPAR-γ의 보호 효과는 그 다음이었다. 그러므로, 이러한 제제는 ALD의 2가지 주요 병리학적 특성, 즉, 진행중인 간 손상 및 회복 과정의 억제를 공격한다. 만성 알코올 남용에 의해 유발된 간 손상을 예방하거나 또는 느리게하는 동시에 간 재생 반응을 촉진 또는 회복시킴으로써 ALD를 앓는 개개인의 성과를 개선시킬 것으로 기대된다.

실시예 2

일반적인 방법

만성 에탄올 노출 모델

성체 수컷(∼200-250 g) 롱-에반스 래트(Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana)를 8 주간 칼로리 함량(9.2% v/v)으로 0%(대조군) 또는 37% 에탄올을 함유하는 동등 칼로리의 액체 식이(BioServ, Frenchtown, NJ)로 섭식제한하였다. 실험을 시작하기 이전 일주일 동안, 래트에게 8%, 17%, 24% 및 37% 에탄올을 함유하는 식이를 각각 2 일간 순차적으로 섭식함으로써 에탄올 포함 식이에 적응시켰다. 음식을 먹인 대조군 래트를 또한 연구하였다. 래트를 매일 모니터하여 동등한 음식 소비 및 체중 유지를 보증하였다. 상기 실험의 마지막 3 주간 0% 또는 37% 에탄올 함유 액체 식이를 유지하고, 2 군의 래트에게 일주일에 2번(월요일 및 목요일) 비이클(염수), PPAR-α(GW7647; 25 ㎍/kg), PPAR-δ(L-165041; 2 ㎍/kg) 또는 PPAR-γ(F-L-Leu; 20 ㎍/kg) 효현제(CalBiochem, Carlsbad, CA)를 복막내(i.p.) 주사하였다. 실험의 결론에서, 래트를 증발시킨 이소플루오란으로 마취시키고(SurgiVet, Inc. Waukesha, WI), 분석을 위해 간과 혈액을 채취하였다. 간 조직 샘플을 조직선택에 담궈 고정하고(Amresco Corp., Solon, OH) 파라핀에 파묻었다. 인접한 조직학 부분을 헤마톡실린 및 에오신 또는 고모리의 트리크롬으로 염색하고 코드 하에 실험하였다. 또한, 간 조직 샘플을 무수 얼음 메탄올 베스에서 순간 냉동시키고 그 다음 후에 mRNA 및 단백질 연구를 위해 -80℃에서 저장하였다. 실험을 통해, 래트를 인간의 조건 하에서 기르고 음식에 대한 접근을 자유롭게 하고 12 시간 명/암 사이클을 유지하였다. 모든 실험들은 국립 보건 연구소에 의해 편찬된 지침을 확신하는 프로토콜에 따라 수행되고, 라이프스팬-로드 아일랜드 하스피클(Lifespan-Rhode Island Hospital)에서 기관의 동물 보호 및 이용 위원회에 의해 승인받았다.

mRNA의 분석

전체 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 TRIzol® 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 간 조직으로부터 추출하였다. 260 nm 및 280 nm에서 측정한 흡광도로부터 RNA 농도 및 순도를 결정하였다. RNA(2 ㎍)를 AMV 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) 및 랜덤 올리고데옥시뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 역전사하였다. 정량적인 역전사효소 중합효소는 연쇄 반응(qRT-PCR) 평가가 특이적 mRNA 전사의 정상적인 농도를 측정하는 데 사용하였다. PCR 증폭은 고유 RNA 주형 2.5 ng으로부터 발생된 cDNA, 유전자 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 각각 300 nM(표 2), 2x QuantiTect SYBR Green PCR Mix(Qiagen Inc, Valencia, CA) 10 ㎕를 함유하는 20 ㎕ 반응에서 수행하였다. 증폭된 신호는 기기 및 소프트웨어(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)를 사용하여 연속적으로 측정하였다. 사용한 증폭 프로토콜은 다음과 같다: 95℃, 95℃ x 15 초, 55℃∼60℃ x 30 초, 및 72℃ x 30 초의 45 사이클에서 초기 15분 변성 및 효소 활성화. 어닐링 온도는 Mastercycler ep realplex 소프트웨어를 사용하여 제공된 온도 구배 프로그램을 이용하여 최적화하였다.

[표 2] 정량적 RT-PCR을 위한 프라이머 쌍

예비 연구에서, SYBR 녹색 표지 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 평가하고, 신뢰성은 핵산 시퀀싱에 의해 증명하였다. 상보성(c) DNA를 PCR-II 백터(Invitrogen, Carlsbad, CA) 안으로 클로닝하였다. 또한, 용융 곡선 평가는 프라이머-이량체 피크의 형성 없이 단일 PCR 생성물의 존재를 입증하였다. 표적 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 DNA의 연속적인 희석을 PCR 반응에서 표준으로 이용하였고, 표준의 Ct 값으로부터 생성된 퇴화 선을 mRNA 풍부를 측정하는 데 사용하였 다. 상대적인 mRNA 발현은 18S가 매우 풍부하고 그 농도가 질환 상태에 의해 조정되지 않기 때문에 특이적 mRNA 대 동일한 샘플에서 측정한 리보솜(r)의 ng 비로서 표현하였다. 측정한 mRNA/18S 비를 이용하여 통계 비교를 하였다. 대조군 연구는 1) 주형 유리 반응; 2) 역전사되지 않은 RNA; 3) DNAse I로 예비 처리한 RNA 샘플; 4) 역전사효소 반응 이전에 RNAse A로 처리한 샘플; 및 5) 게놈 DNA의 분석을 포함하였다.

수용체 결합 분석

포화 결합 연구는 PPAR 효현제 치료가 간에서 에탄올 손상된 인슐린 및 IGF 수용체 결합을 개선하는 지를 결정하는 데 사용하였다. 새로운 냉동 간 조직을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 프로테아제(1 mM PMSF, 0.1 mM TPCK, 1 ㎍/ml 아프로티닌, 1 ㎍/ml 펩스타틴 A, 0.5 ㎍/ml 레이펩틴, 1 mM NaF, 1 mM Na₄P₂O₇)를 함유하는 세포 용해 완충제 및 포스파타제(2 mM Na₃VO₄) 억제제 5 부피 중에 균질화하였다. 단백질 농도는 비신코닌산(BCA) 분석(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 결정하였다. 탐구를 위한 연구는 20% 특이적 결합을 달성하기 위해 필요한 단백질의 최적량 및 방사성 표지된 리간드의 농도를 결정하였다. 인슐린 수용체 결합은 분석 튜브당 100 ㎍ 단백질을 사용하여 측정하였다. IGF-I 결합 분석은 샘플당 25 ㎍의 단백질을 필요로 하고, IGF-II 수용체 결합 분석은 반응당 10 ㎍의 단백질을 필요로 한다.

결합 과정을 일반화하기 위해, 군당 8 마리의 래트로부터 샘플을 동등한 비 율로 공동화하고 단백질 농도는 각각의 군에 동일하도록 조정하였다. 전체 결합을 위해, 중복 샘플은 결합 완충제(100 mM HEPES, pH 8.0, 118 mM NaCl, 1.2 mM MgSO₄, 8.8 mM 덱스트로스, 5 mM KCl, 1% 보빈 혈청 알부민) 및 0.0031∼1 μCi/ml의 [¹²⁵I](2000 Ci/mmol) 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II를 함유하는 100 ㎕의 반응에서 배양하였다. 비특이적 결합을 위해, 중복 샘플은 0.1 ㎛ 미표지된(콜드) 리간드를 첨가한 것을 제외하고는 동일하게 제조하였다. 배양은 비결합 96 웰 플레이트(Corning Incorporated Life Science, Lowell, MA)에서 4℃에 16 시간 동안 수행하였다. 0.33% 폴리에틸렌이민(PEI) 용액에서 30 분간 예비 섭취시킨 96 웰 GF/C 필터 플레이트로 상기 시약을 진공 채취하였다(Corning, Lowell, MA). 이 필터는 50 mM 완충제[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진-에탄설폰산(HEPES), pH 7.4, 500 mM NaCl 및 0.1% BSA를 함유하는 완충제를 사용하여 5번 씻어주었다. 건조 후, 50 ㎕ 마이크로신트-20(Packard Instrument Company, Meriden, CT)을 각각의 웰에 첨가하고, 결합한 [¹²⁵I] 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II의 농도를 톱카운트 머신(Packard Instrument Company, Meriden, CT)에서 측정하였다. 특이적 결합은 결합한 동위 원소의 전체 fmol/mg으로부터 비특이적으로 결합한 동위 원소의 fmol/mg, 즉 콜드 리간드의 존재하에 결합한 양을 제함으로써 계산하였다. 상기 데이터를 분석하고 GraphPad Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 그래프화하였다.

단백질 연구

단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석법 또는 효소 면역 평가법(ELISA)에 의해 조사하였다. 웨스턴 블롯 분석법은 AAH 및 GAPDH 발현을 측정하는 데 이용하였다. 또한, PI3 키나제의 p85 아단위에 해당하는 면역활성은 음성(장입) 대조군으로서 측정하였다. 웨스턴 블롯 분석법을 위해, 간 조직은 프로테아제(1 mM PMSF, 0.1 mM TPCK, 1 mg/ml 아프로티닌, 1 mg/ml 펩스타틴 A, 0.5 mg/ml 루이펩틴, 1 mM NaF, 1 mM Na₄P₂O7) 및 포스파타제(2 mM Na₃VO₄) 억제제를 함유하는 방사성 면역침강 평가(RIPA) 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.25% Na-데옥시콜레이트, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA) 5 부피 중에 균질화하였다. 단백질 농도는 BCA 평가법(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 결정하였다. 20 ㎍의 단백질을 함유하는 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분획화하고 PVDF 막으로 옮겼다. 비특이적 결합 부위를 SuperBlock-TBS(Pierce, Rockford, IL)로 차단하고, 온화한 플랫폼 교반하면서 4℃에서 1차 항체(0.5∼1 ㎍/ml)로 밤새 배양하였다. 면역활성은 호오스디시 퍼옥시다제(HRP) 공액 2차 항체, 개선된 화학발광(ECL) 시약(Pierce, Rockford, IL), 및 코닥 디지털 사이언스 이미징 스테이션(NEN Life Sciences, Boston, MA)으로 검출하였다.

ELISA는 AAH, GAPDH 및 β-액틴(음성 대조군)에 해당하는 면역활성을 측정하는 데 사용하였다. ELISA는 96 웰 불투명 폴리스티렌 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester, NY)에서 수행하였다. TBS(40 ng /100 ㎕)에서 희석시킨 RIPA 단백질 추출물은 4℃에서의 밤새 배양으로 웰의 바닥에 섭취되었다. TBS에서 린스 후, 상기 웰은 250 ㎕/TBS 중 2% BSA의 웰에서 4 시간 동안 차단하였다. 그 다음 이 단백질을 실온에서 1 시간 동안 1차 항체(0.01∼0.1 ㎍/ml)로 배양하였다. 면역활성은 HRP 공액 2차 항체(1:10000; Pierce) 및 앰플렉스 적색 가용성 형광원(Molecular Probes)을 사용하여 검출하였다. 앰플렉스 적색 형광을 M-5 머신(형광 단위; FLU)에서 측정하였다(Ex 530/Em 595). 결합 특이성은 관련 없는 항체, 또는 생략된 1차 또는 2차 항체를 사용하여 평행한 음성의 대조군 배양으로부터 결정하였다. 특이적 AAH, GAPDH 및 β-액틴 면역활성의 평균 농도는 군간의 통계 비교에 사용되었다.

시약 공급원

PPAR 효현제, GW7647(PPAR-α), L165, 041(PPAR-δ) 및 Fmoc-Leu(PPAR-γ)는 캘바이오켐(Tecumsula, CA)으로부터 구입하였다. 인간 재조합[¹²⁵I] 인슐린, IGF-I 및 IGF-II는 아머샴 바이오사이언스(Boston, MA)로부터 구입하였다. 미표지된 인간 인슐린, 재조합 IGF-I 및 재조합 IGF-II는 바켐(Torrance, CA)으로부터 구입하였다. QuantiTect SYBR Green PCR Mix는 퀴아겐 인크(Valencia, CA)로부터 얻었다. GAPDH 및 β-액틴에 대한 단일클론 항체는 케미콘(Tecumsula, CA)으로부터 구입하였다. AAH를 검출하는 데 사용된 A85G6 마우스 단일클론 항체는 정제된 재조합 인간 단백질을 사용하여 일반화하였다. 다른 모든 정밀한 화학물질들은 캘바이오켐(Carlsbad, CA) 또는 시그마-알드리치(St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

통계 분석

그래프에 표시된 데이터는 각각의 군에 대해 평균±S.E.M. 또는 평균±95% C.I.L.을 나타낸다. 군간 비교는 변화의 반복된 측정 분석법(ANOVA) 및 유의성을 위한 사후 Tukey-Kramer 테스트를 이용하여 행하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 수행하였다.

PPAR 효현제는 에탄올 유발성 간 병리를 전환한다

대조군 액체 식이 또는 음식을 먹인 래트로부터 얻은 간은 지방증, 핵 크기의 변형, 또는 간 세포 사라짐의 최소한의 근거를 가진 예상되는 잘 조직된 엽상 구조를 보여주었다(도 9A, 9E, 9I). 이와 반대로, 에탄올 노출된 간은 엽상내 림프단핵구 핵의 세포 염증의 여러 병소 및 산재된 면적의 아폽토시스 및/또는 괴사를 가진 미세소낭성 및 거대소낭성 지방증을 나타내었다(도 1OA, 1OE, 10I). 또한, 만성 에탄올 섭식은 규칙적인 건의가 소실되고 간 세포 핵의 크기의 변이성이 증가하는 간장의 구조적 혼란을 초래하였다. 증가된 섬유증, 발생하는 결절 형성, 또는 에탄올 노출된 간에서 간경변의 근거가 없었다. PPAR-α 효현제로 처리한 대조군 래트는 비이클 처리한 대조군에 비해 검출 가능한 조직학적 간의 변화가 없었다(도 9B, 9F, 9J). 이와 반대로, PPAR-δ(도 9C, 9G, 9K) 또는 PPAR-γ(도 9D, 9H, 9L) 효현제 처리한 대조군 래트는 사인 확장으로 인해 잘 조직된 간장 구조가 적고, 간 세포 군집화가 확실히 증가한다. 또한, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 치료는 간세포의 세포질의 미세공포 형성 및 핵 돌출이 증가하는 결과를 초래하였다. 미세공포 형성은 글리코겐 축적 증가와 일치하는 PAS(periodic-acid Schiff) 염색 증가와 관련이 있었다. 에탄올 섭식 군에 있어서, PPAR 효현제에 의한 치료는 다양하나 간 조직학에 대한 직접적인 효과는 구조적 혼란, 지방증, 및 세포 사멸의 감소에 의한 간 조직학에 대한 직접적인 영향은 만성 에탄올 노출에 의해 야기된다(도 10). PPAR-α, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 혼란스러운 구조를 감소시키고, 간 세포의 더 많은 건 유사 배열을 초래하며, 미세지방증 및 거대지방증 둘 다의 범위를 공공연하게 감소시켰다. 그럼에도 불구하고, 이들 손상들이 일반적으로 비이클 처리한 간, 에탄올 노출된 간에서보다 덜 뚜렷하지만, 괴사(도 10J, 삽입), 염증(도 1OG, 삽입 및 도 1OH, 화살표) 및 아폽토시스(도 1OL, 삽입)의 작은 병소는 쉽게 검출되었다. 간 조직학에서의 가장 두드러진 개선은 PPAR-δ(도 1OC 및 10K) 또는 PPAR-γ(도 1OD 및 10L) 효현제로 처리한 에탄올 섭식시킨 래트에서 발생하였다.

qRT-PCR 연구에 관한 일반적인 설명

qRT-PCR의 이용은 모든 샘플을 동시에 분석할 수 있게 하고 결과의 일관성을 입증하기 위해 충분한 복제를 갖도록 하였다. 상기 기술들을 사용하면, PPAR 효현제 치료에 관계없이, 대조군 에탄올 섭식 래트의 간에 대해 얻어진 유사한 18S C_t 값 및 일정한 28S:18S 비율에 기초하여 볼 때 조직으로부터 생성된 cDNA의 질은 우수하다고 판단되었다. 증폭 산물이 작아서(주로 <150 bp), 종종 만성 에탄올 노출 및 산화적 스트레스를 일으키는 부분적인 RNA 퇴화, 예를 들어 닉 생성과 관련된 잠재적 문제들에 의해, qRT-PCR의 이용은 유전자 발현의 정밀한 분석법에 이상적으로 적합하였다. 증폭된 생성물의 특이성은 직접적인 핵산 서열화에 의해 증명되었다. cDNA 주형을 배제하거나, RNA를 역전사하지 않거나, RNA 샘플을 RT 단계 이전 에 RNAse A로 미리 처리하거나, 또는 게놈 DNA를 반응에서 사용한 대조군 연구는 qPCR 분석법 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 입증된 바와 같이 검출 가능한 증폭 생성물을 생성하지 않았다. RT 단계 이전에 DNAse I에 의한 RNA 샘플의 치료는 증폭된 유전자 생성물의 검출 농도에 영향을 미치지 않았다.

PPAR 효현제 치료는 간에서 세포 증식 프로파일을 변형시킨다

알부민, 정점의 나트륨 의존적 담즙 수송자 단백질(ASBT), 신경아교원섬유 산성 단백질(GFAP), 쿠퍼 세포 수용체(KCR), 데스민 및 콜라겐의 간 mRNA 농도는 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 알부민 발현은 간 세포 풍부/기능의 표시로서 사용되었다. ASBT는 담관 상피 세포를 반영한다. GFAP는 별 모양의 세포 활성화의 초기 표지이고, 데스민은 근섬유모세포 안으로 간의 별 모양 세포를 교차분화시킨다. KCR은 쿠퍼 세포의 표지이고, 증가된 발현은 손상에 대한 간내 반응을 반영할 수 있다. 콜라겐 유전자 발현은 섬유화 잠재적 또는 활성적인 섬유조직성장에 해당한다. 요컨대, "세포 프로파일링"이라고 하는 간에서 유전자 발현의 이러한 평가는 간 세포 유형 및 기능에 있어서 관련된 상대적인 움직임에 대해 에탄올 및 PPAR 효현제를 정량할 수 있게 하였다.

비이클 처리한 대조군 래트의 간은 비이클 처리한 에탄올 노출 래트로부터 얻은 간과 비교 시 알부민 mRNA의 평균 농도가 유의적으로 더 높았다(도 11A). PPAR-α 효현제가 아닌 PPAR-δ 또는 PPAR-γ에 의한 치료는 대조군 간에서 알부민 mRNA의 평균 농도를 유의적으로 증가시켰다. 에탄올 섭식 군에서, PPAR-α 또는 PPAR-δ 효현제에 의한 치료는 비이클 처리한 에탄올 섭식 래트에 비해 알부민 발 현을 유의적으로 증가시켰으나, 대조군 군 중 임의의 것에 비해서는 그렇지 않았다. PPAR-γ 치료는 에탄올 노출된 간 중 알부민 발현을 유의적으로 변경시키지 않았다.

ASBT 발현은 비이클 처리한 대조군 간에서 가장 높고, 각각 PPAR-효현제 처리한 대조군 간은 비이클 처리한 대조군과 비교 시 ASBT의 평균 농도가 유의적으로 더 낮았다(도 11B). 비이클 처리한, 에탄올 노출된 래트로부터 얻은 간은 상응하는 대조군 군에 비해 ABST 발현의 평균 농도가 유의적으로 더 낮았다. 에탄올 섭식 래트에서, PPAR-α 효현제 치료는 비이클에 비해 간의 ASBT 발현을 유의적으로 증가시켰으나, 임의의 대조군 식이 섭식 래트에 비해서는 그렇지 않았다. PPAR-δ 또는 PPAR-γ 치료는 에탄올 노출된 간에서 ASBT mRNA 농도를 유의적으로 변경하지 않았다.

KCR 발현은 비이클 처리한 대조군 및 에탄올 노출된 간에서 가장 낮았다. PPAR-α, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 대조군 및 에탄올 노출된 간에서 KCR mRNA의 평균 농도를 증가시켰다; 하지만, 상응하는 비이클 치료와의 차이점은 에탄올 섭식 래트에 대해 단지 통계적으로 유의적이었다(도 HC). PPAR-α, PPAR-δ 및 PPAR-γ 치료는 에탄올 노출된 간에서 유사한 수준의 KCR 발현 증가 정도를 산출하였다. 하지만, KCR 발현은 PPAR-γ 치료 군에서 단지 대조군에 비해 에탄올 노출에서 유의적으로 더 높았다.

GFAP는 방사상 세포 활성화의 이른 표지이다. GFAP mRNA 농도는 비이클 처리한 에탄올 노출된 래트와 비교 시 비이클 처리한 대조군으로부터 얻은 간에서 유의 적으로 더 높았다. GFAP 발현은 대조군 및 에탄올 노출된 래트에서 PPAR-α 치료에 의해 유의적으로 증가하였고(도 11D), 에탄올 섭식 군에서, PPAR-γ 치료는 비이클 치료에 비해 GFAP 발현을 유의적으로 증가시켰다.

데스민은 근섬유모세포 유사 세포로의 교차분화 동안 방사상 세포에서 발현된 중간 필라멘트이다. 데스민 mRNA의 평균 농도는 비이클 처리한 대조군 및 에탄올 노출된 간에서 유사하였다(도 11E). 하지만, 대조군 군에서, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 비이클에 비해 데스민 mRNA 농도를 유의적으로 감소시켰다. 에탄올 노출된 간에서, PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 비이클 치료에 비해 데스민 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키는 한편, PPAR-α 또는 PPAR-δ 효현제에 의한 치료는 데스민 mRNA 농도에 대한 유의적인 효과를 보이지 않았다.

콜라겐 유전자 발현은 섬유조직성장을 반영한다. 콜라겐 mRNA 발현은 비이클 처리한 대조군 간에서 가장 낮았다(도 11F). PPAR 효현제 치료가 대조군에서 콜라겐 유전자 발현의 평균 농도를 증가시키지만, 비이클에 비한 차이점은 단지 PPAR-δ 처리한 군에 대해 통계적으로 유의적이었다. 만성 에탄올 노출은 대조군(비이클 처리한 하위군)에 비해 콜라겐 mRNA의 평균 농도를 유의적으로 증가시켰다. 에탄올 함유 식이를 섭식시킨 래트에서, PPAR-α 효현제에 의한 치료는 콜라겐 유전자 발현을 증가시키는 한편, 폴리펩티드 PPAR-δ 및 PPAR-γ 효현제는 비이클 치료에 비해 콜라겐 mRNA의 평균 농도를 유의적으로 감소시켰다.

인슐린 및 IGF 폴리펩티드, 이들의 수용체, 및 IRS 분자의 간 발현에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제의 효과

QRT-PCR은 대조군 및 에탄올 섭식 래트(도 12) 둘 다의 간에서 인슐린, IGF-I, IGF-II 폴리펩티드 유전자, 이들의 상응하는 수용체, 및 IRS-1, IRS-2 및 IRS-4의 입증된 발현을 연구하며, 이는 인슐린 및 IGF 신호화에 대해 요구되는 상류 유전자가 모두 성체 래트 간에서 발현됨을 가리킨다. 상기 폴리펩티드 유전자 중에서, 인슐린이 가장 덜 풍부하고, 그 다음 IGF-II이고, IGF-I이 가장 풍부하였다(도 12A∼12C). 비이클 처리한 대조군 및 에탄올 노출된 간은 인슐린, IGF-I 및 IGF-II의 유사한 평균 mRNA 농도를 가졌다. 대조군 군에서는 PPAR-δ 및 PPAR-γ는 인슐린 유전자 발현을 유의적으로 증가시키는 한편, 에탄올 노출된 군에서는 인슐린 유전자 발현이 PPAR-α 또는 PPAR-δ 치료에 의해 감소되었다. 인슐린 유전자 발현은 상응하는 대조군 간에 비해 에탄올 노출된 PPAR-δ 및 PPAR-γ 처리에서 유의적으로 낮았다. IGF-I mRNA 농도는 대조군 래트에서 PPAR 효현제 치료에 의해 유의적으로 조절되지 않았으나, 에탄올 노출된 군에서 PPAR 효현제 치료는 비이클 및 모든 상응하는 PPAR 효현제 처리 대조군에 비해 IGF-I 발현을 유의적으로 감소시켰다(도 12B). 대조군에서, IGF-II 발현은 또한 PPAR 효현제 치료에 의해 유의적으로 조절되지 않았으나, 만성 에탄올 섭식에 의해, PPAR-α 또는 PPAR-γ 치료는 비이클 및 모든 상응하는 PPAR 효현제 처리한 대조군에 비해 IGF-II mRNA의 평균 농도를 유의적으로 감소시켰다(도 12C).

IGF-II 수용체 mRNA 전사 유전정보가 가장 풍부하였고(도 12F), 그 다음이 IGF-I 수용체(도 12E)이고, 그 다음 인슐린 수용체였다(도 12D). 대조군에서, PPAR-δ 효현제에 의한 치료는 비이클에 비해 인슐린 수용체 발현의 평균 농도를 증가시켰다. 만성 에탄올 섭식은 대조군에 비해 인슐린 수용체 발현의 평균 농도를 유의적으로 증가시켰으나, 대조군에서 그것의 효과와 반대로, PPAR-δ 효현제는 에탄올 섭식 래트 간에서 인슐린 수용체 발현을 유의적으로 감소시켰다(도 12D). 대조군에서, IGF-I 수용체 발현은 PPAR 효현제 치료에 관계없이 유사하게 풍부하였다. 만성 에탄올 섭식은 IGF-I 수용체 발현의 평균 농도를 유의적으로 증가시켰으나, PPAR 효현제 치료는 상응하는 대조군에서 관찰된 것으로 IGF-I 수용체 mRNA 농도를 감소시켰다(도 12E). IGF-II 수용체 발현은 대조군 및 에탄올 노출된 간에서 유사하게 풍부하였고, PPAR 효현제 치료는 두 군에서 IGF-II 수용체 mRNA의 평균 농도를 유사하게 감소시켰다(도 12F).

대조군 및 에탄올 노출된 간에서, IRS-1 mRNA 농도가 가장 높았고(도 12G), 다음은 IRS-2(도 12H)이고, 그 다음은 IRS-4였다(도 121). IRS-1의 평균 농도는 대조군 및 에탄올 섭식 래트에 대해 유사하였다(도 12G). PPAR 효현제 치료는 대조군에서 IRS-1 유전자 발현을 유의적으로 변경하지는 않았으나, 에탄올 섭식 래트에서 PPAR-δ 치료는 비이클 및 상응하는 PPAR-δ 처리한 대조군에 비해 IRS-1 mRNA 농도를 유의적으로 감소시켰다. IRS-2 발현의 평균 농도는 대조군 간에 비해 에탄올 노출된 간에서 유의적으로 더 높았다(도 12H). 대조군 군에서, IRS-2 발현은 PPAR-δ 효현제를 사용한 치료에 의해 유의적으로 증가하는 한편, 에탄올 노출된 래트에서 IRS-2 발현은 PPAR-γ 효현제를 사용한 치료에 의해 유의적으로 감소하였다. IRS-4 mRNA의 평균 농도는 대조군 및 에탄올 노출된 간에 대해 유사하였고, 대조군 군에서 PPAR 효현제를 사용한 치료는 IRS-4 발현의 평균 농도를 유의적으로 변경하 지 않았다(도 12I). 이와 반대로, 에탄올 노출된 군에서 PPAR-δ 효현제를 사용한 치료는 IRS-4 발현의 평균 농도를 유의적으로 감소시켰고, IRS-1에 대한 그것의 효과와 유사하였다(상기 참조).

인슐린 및 IGF 수용체 결합에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 효과

포화 결합 분석은 인슐린, IGF-I 및 IGF-II 수용체 결합에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 효과를 증명하는 데 이용하였다. 이 연구는 각각의 하위군 내에서 8마리 래트(단백질 함량에 의한 동등한 비율)로부터 얻은 공동화한 간 조직 샘플로 수행하였다. 결합 곡선±95% C.I.L., Kd(해리 상수; 친화도) 및 BMAX(최고 수준의 결합)의 계산, 및 군간 통계적인 비교는 Prism Graphics 5 소프트웨어를 사용하여 산출하였다. 모든 실험 조건에서, 단일 위치 모델은 가장 높은 R², 즉 최선의 적합을 산출하였다. 만성 에탄올 섭식은 3MAX를 유의적으로 감소시켰으나, 인슐린 수용체 결합에 있어서의 Kd에 대해 유의적인 효과를 가지지 않았다(도 13A, 13E 및 표 3). 대조군 군에서, 인슐린 수용체 결합에 대한 BMAX는 PPAR-α, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제를 사용한 치료에 의해 유의적으로 감소하였다(도 13A∼13D 및 표 3). PPAR-α 치료는 감소하는 인슐린 수용체 BMAX에 의해 가장 유력한 효과를 나타내었다. 이와 반대로, PPAR 효현제 치료는 인슐린 결합에 대한 Kd를 유의적으로 변경하지는 않았다. 에탄올 노출된 래트에서, PPAR-α 치료는 또한 BMAX를 무디게 하고 비이클과 관련된 Kd를 증가시키는 한편, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제를 사용한 치료는 인슐린 수용체 BMAX를 유의적으로 증가시키고 Kd를 낮추었으며, 이 는 비이클 및 상응하는 PPAR 효현제 처리한 대조군 간 둘 다에 비해 더 높은 농도의 최대 결합 및 결합 친화도 증가를 가리킨다(도 13E∼13H 및 표 3).

[표 3A] 인슐린 수용체 결합

*대조군 + 비이클에 대하여 P<0.05; **P<0.001; ***P<0.0001

[표 3B] IGF-I 수용체 결합

대조군 + 비이클에 대하여 *P<0.05; **P<0.001; ***P<0.0001

[표 3C] IGF-II 수용체 결합

*대조군 + 비이클에 대하여 P<0.05; **P<0.001; ***P<0.0001

만성 에탄올 섭식은 IGF-I BMAX 및 Kd를 유의적으로 감소시켰다. 대조군 섭식 래트에서, PPAR-α 치료는 IGF-I BMAX를 감소시키는 한편, PPAR-δ 및 PPAR-γ 치료는 IGF-I BMAX를 유의적으로 증가시켰다(도 14). PPAR 효현제 치료는 대조군 섭식 래트에서 IGF-I Kd를 유의적으로 변경시키지는 않았다(도 14A∼14D). 에탄올 섭식 래트에서, PPAR-α 또는 PPAR-δ 치료는 BMAX 및 Kd 둘 다를 유의적으로 증가시키는 한편, PPAR-γ 치료는 Kd를 증가시키나 IGF-I 수용체 결합에 대한 BMAX를 낮추었다(도 14E∼14H). 만성 에탄올 섭식은 또한 BMAX를 유의적으로 감소시키고 IGF-II 수용체 결합의 Kd를 증가시키며, PPAR 효현제 치료는 대조군 또는 에탄올 노출된 군 중 하나에서 BMAX 또는 Kd에 대한 유의적인 효과를 나타내지 않았다(도 15 및 표 3).

에너지 대사 및 조직 리모델링과 관련된 인슐린/IGF 반응성 유전자 발현에 대한 에탄올 및 PPAR 효현제 치료의 효과

AAH 발현은 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II 자극으로 증가하고, 간세포의 성장 및 운동성에 대한 양성 효과를 가진다(Cantarini et al, Hepatology 44:446 (2006); de Ia Monte et al, J Hepatol. 44:971 (2006)). GAPDH는 당 대사에서 중요한 역할을 하는 인슐린 반응성 유전자이다. 웨스턴 블롯 분석법은 모든 간 샘플에서 AAH 및 GAPDH 면역활성을 검출하였다(도 16A). β-액틴에 대한 단일클론 항체와 블롯의 재반응은 모든 래인에서 대략 동등한 단백질 로딩을 증명하였다. 웨스턴 블롯 신호의 디지털 이미지 정량화는 에탄올 노출된 비이클 처리 간에서 더 낮은 농도의 AAH 및 GAPDH를 밝혀냈다. 대조군에서, PPAR 효현제 치료는 AAH의 평균 농도에 대한 검출 가능한 효과를 가지지 않으나(도 16B), GAPDH(도 16C) 및 β-액틴(도 16D)의 평균 농도를 약간(유의적이지는 않으나) 조정하였다. PPAR 효현제 치료는 또한 에탄올 섭식 군에서 간의 AAH 및 GAPDH 발현에서 약간 그러나 유의적이지는 않게 조정하였다. AAH 및 GAPDH 단백질의 평균 농도에서 순 이동은 AAH 및/또는 GAPDH 단백질 발현에서 유의적인 군간 차이를 없앴다. 하지만, 보다 정제된 PPAR 효현제 치료의 효과를 조사하기 위해, 형광성 리포터 시약을 사용한 매우 민감한 직접적인 ELISA 분석을 이용하였다.

ELISA는 또한 대조군 간(비이클 처리)에 비해 에탄올 노출된 간에서 유의적으로 더 낮은 평균 농도의 AAH(도 17A) 및 GAPDH(도 17B) 발현을 증명하였다. PPAR-α 효현제에 의한 치료는 대조군 또는 에탄올 노출된 간 중 하나에서 AAH 또는 GAPDH 발현에 대한 유의적인 효과를 가지지 않았다. 이와 반대로, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 에탄올 노출된 간에서 GAPDH 발현을 증가시켰고, 대조군에 비교할만한 평균 농도를 초래하였다. PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 대조군 간에서 AAH 발현을 유의적으로 감소시켰고, 이는 상응하는 에탄올 섭식 군에서의 것과 유사한 AAH 농도를 초래하였으며, β-액틴 면역활성은 에탄올 노출 또는 PPAR 효현제 치료에 의해 유의적으로 조정되지 않아, 그러므로 β-액틴의 평균 농도에서 유의적인 군간 차이점이 관찰되지 않았다(도 17C).

이 연구는 롱-에반스 래트 모델에서 생성된 만성 ALD가 간의 인슐린 내성과 관련이 있는지를 결정하기 위해 디자인되었으며, 동시에, 인슐린 증감제가 연속적인 에탄올 소비에 대한 임상적인 설정에서 간 조직학을 회복시키는 데 사용될 수 있다는 가설을 조사하였다. 이러한 연구를 수행하기 위해, 래트를 PPAR-α, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제로 처리하였다. 이 접근법은, 조사 연구가 모든 3가지 수용체가 간에서 발현되나 PPAR 효현제의 종류가 ALD에서 간의 구조 및 기능을 회복시키는 데 가장 적합할 것임을 나타내는 결정적인 데이터가 존재하지 않음을 입증하기 때문에 택했다.

만성 에탄올 섭식은 핵 크기 및 간 세포 사라짐의 변화와 주요한 구조상 혼란을 비롯한 인간에서의 ALD를 닮은 병리조직학적 변화를 산출하였으나, 소엽 사이 또는 교섬유화, 간경변, 재생 결절 형성, 또는 신생 변형의 어떠한 근거도 존재하지 않았다. PPAR-α, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 대조군에서 간 조직학에 대해 아무런 측정 가능한 효과를 산출하지 못하였으나, 그것들은 연속된 에탄올 노출에도 불구하고 에탄올 관련된 구조상 혼란 및 지방증을 두드러지게 감소시켰다. PPAR-δ 및 PPAR-γ 효현제는 간의 구조를 회복하는 데 있어서 PPAR-α 효현제보다 더욱 효과적이었다. PPAR 효현제의 효과는 그들의 공지된 항염증성 작용뿐 아니라, 이들의 인슐린 증감제 특성에 해당한다.

간 조직학에 대한 PPAR 효현제 치료의 효과를 보다 객관적으로 정량화하기 위해, 상이한 세포 유형에 해당하는 특이적 유전자의 상대적인 발현을 평가하는 방법, 즉, 간 세포 프로파일링을 이용하였다. 이러한 분석들은 만성 에탄올 노출이 알부민 및 ASBT 발현을 유의적으로 감소시킴을 증명하였고, 만성 에탄올 섭식이 간 세포 및 담즙관 상피 세포 풍부 및/또는 기능을 유의적으로 감소시킴을 제시한다. 전반적으로, PPAR 효현제 치료는 대조군 및 에탄올 노출된 간에서 알부민 및 ASBT 발현을 증가시키나; 그 효과는 PPAR 효현제의 아형이 더욱 효과적이고 반응의 정도에 있어서 상이하였다. 이와 관련하여, PPAR-α 및 PPAR-δ 효현제는 에탄올 노출된 간에서 알부민 및 ASBT 발현을 표준화하는 한편, PPAR-δ 및 PPAR-γ 효현제는 알부민을 유의적으로 증가시키고 대조군 간에서 ASBT 발현을 감소시켰다. 이러한 발견은 PPAR 효현제 치료가 간 세포 및 담즙 상피 세포 생존과 기능에 대한 이로운 효과를 가질 수 있음을 제시한다. 에탄올 노출된 PPAR 효현제 처리한 간에서 관찰되는 KCR의 발현 증가는 유의성이 불확실하다. 한가지 가능한 해석은, 간 조직학에서의 개선과 관련하여, 회복 과정을 다루는 데 증가된 쿠퍼 세포 기능이 요구된다는 것이다.

GFAP 및 데스민은 방사상 세포 활성화의 표지이고, 피브리노겐 반응에 대한 경향이 있다. 콜라겐 유전자 발현은 활성 섬유조직성장의 지표로서 사용되었다. 그 결과는 GFAP 및 콜라겐의 발현 농도가 대조군 및 에탄올 섭식 래트에서 PPAR-α 치료에 의해 증가되는 것을 증명하였고, PPAR-α 효현제가 방사상 세포를 활성화할 수 있고 결국 섬유조직성장, ALD의 설정에서 악화될 수 있는 효과를 촉진시킴을 제시한다. 이와 반대로, PPAR-δ 효현제에 의한 치료는 에탄올 섭식 래트에서 콜라겐 유전자 발현을 감소시키나 대조군 래트에서 그것을 증가시켰고, PPAR-γ 효현제 치료는 에탄올 노출된 간에서 단지 데스민 발현을 증가시켰다. 이러한 결과가 복합적임에도 불구하고, 한가지 잠재적 해석은 특정 방사상 세포 및 피브로겐 반응이 만성 에탄올 유발성 간 손상의 면에서 간 회복에 요구될 수 있다는 것이다.

QRT-PCR 분석법은 인슐린 및 IGF 신호화에 요구되는 "기구"의 완전성을 평가하기 위해 사용되었다. 이 연구들은 인슐린, IGF-I 및 IGF-II 폴리펩티드, 상응하는 수용체 및 IRS 분자의 발현 농도가 만성 에탄올 노출된 간에서 상대적으로 보존되었고, 이는 만성 에탄올 노출에 의해 야기되는 인슐린 또는 IGF 신호화의 장애가 국부적 성장 인자 결핍, 수용체의 하위 조절 또는 손실, 또는 하류 신호를 전달하는 주요 도킹 분자의 손상된 발현에 기여할 수 없음을 가리킨다. 물론, PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료가 대조군 간에서 인슐린 및 IGF-I 발현을 유의적으로 증가시키나, 에탄올 노출된 간에서 영양 인자 유전자 발현을 억제하거나 또는 유의적인 효과를 가지지 않았다. 유사하게, 인슐린, IGF-I, 및 IGF-II 수용체, 및 IRS-1, IRS-2 및 IRS-4 발현 농도는 PPAR 효현제 치료에 의해 조절되지 않았다. 그 러므로, 에탄올 섭식 래트에서 PPAR 효현제 치료와 관련된 간 조직학에서 임의의 개선은 국소적인 성장 인자, 성장 인자 수용체 또는 IRS 유전자의 발현 증가 때문이 아니었다.

효과적인 리간드 결합은 신호화 캐스캐이드에 결정적이고, 감소된 세포 생존을 비롯하여 에탄올 노출된 간에 보고된 손상된 인슐린 신호화의 대부분의 효과는 인슐린 수용체로의 인슐린 결합의 억제에 의해 매개될 수 있다. IGF-I 또는 IGF-II를 통한 신호화가 IRS 경로를 직접 또는 혼선에 의해 활성화시킨다는 사실이 주어지면, 이러한 모델에서 또한 IGF-I 및 IGF-II 수용체 결합을 측정하는 것이 관심의 대상이었다. 경쟁적인 포화 결합 분석을 이용한 연구는 만성 에탄올 노출이 감소된 BMAX(최상위 수준 결합) 및 증가된 Kd(감소된 친화도)에 의해 명백해진 인슐린, IGF-I, 및 IGF-II 수용체로에 대한 리간드 결합을 유의적으로 손상시킴을 증명하였다. PPAR-δ, 및 몇몇 예에서 PPAR-γ 효현제 치료는 더 높은 결과를 내는 인슐린, IGF-I, 및/또는 IGF-I체 결합을 유의적으로 증가시키는데, 즉, 에탄올 노출된 간에서 BMAX 값을 정상화하였다. 증가된 수용체 결합의 메카니즘이 아직 결정되지 않았지만, 이 효과는 이전 연구에서, 인슐린 및 IGF 수용체에 대한 리간드 결합이 막 콜레스테롤 부족으로 인해 손상되고, 막 콜레스테롤 과다에 의해 회복됨이 증명되었기 때문에 막 지질 조성물에서 상관관계에 의해 매개될 수 있었다. 메카니즘에 관계없이, 인슐린 및 IGF 수용체 결합에서 PPAR 효현제 관련된 증가는 연속적인 에탄올 노출에도 불구하고 인슐린/IGF 반응성 유전자 발현을 비롯한 간 구조와 기능을 회복하는 데 있어서 중대한 역할을 할 것 같다.

에탄올 노출된 간에서 인슐린 및 IGF 수용체 결합의 PPAR 효현제 매개 증가의 결과를 조사하기 위해, 인슐린 및 IGF 반응성 유전자 발현은 웨스턴 블롯 분석법 및 ELISA에 의해 평가하였다. 예상한 바와 같이, 비이클 처리한 래트의 에탄올 노출된 간은 유의적으로 감소된 농도의 GAPDH 및 AAH를 가졌고, 이들은 각각 조직의 재생 및 리모델링에 요구되는 에너지 대사 및 세포 운동성을 매개한다. PPAR-δ 또는 PPAR-γ 효현제에 의한 치료는 GAPDH 발현을 유의적으로 증가시키고, 비이클 처리한 대조군에 비해 농도의 표준화를 초래한다. 그러므로, 증가된 리간드-수용체 결합의 하류 결과는, 연속적인 에탄올 노출에도 불구하고, 증가된 인슐린/IGF 반응성 유전자 발현 및/또는 개선된 간 조직학이었다. 중요하게도, GAPDH의 증가된 농도는 지방증의 감소에서 개선된 에너지 대사 및 ATP 생성으로 인한 중요한 인자가 될 수 있는 한편, 증가된 AAH 발현은 간 리모델링 및 수선을 도울 수 있었고, 이로써 비교적 정상적인 간 조직학을 유지하도록 도왔다. 동시에, 상기 결과들은 PPAR 효현제 치료가 특히 간 구조와 기능의 회복과 관련된 만성 ALD의 반대 작용 중 몇몇을 역행시키는 데 도움이 될 수 있음을 제시한다.

지금까지 본 발명을 충분히 설명하였으나, 당업자라면 본 발명의 범위 또는 그 임의의 실시형태에 영향을 미치지 않도록 조건, 제제 및 다른 파라미터의 다양한 균등 범위 내에서 본 발명이 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본원에 그 전체가 참고 문헌으로서 완전히 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Rhode Island Hospital <120> Treatment, Prevention, and Reversal of Alcohol-Induced Liver Disease <130> 2306.003PC01 <140> PCTUS0719610 <141> 2007-09-21 <150> US 60/842,983 <151> 2006-09-08 <160> 36 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 18S rRNA primer <400> 1 ggacacggac aggattgaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 18S rRNA primer <400> 2 acccacggaa tcgagaaaga 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insulin primer <400> 3 ttctacacac ccaagtcccg tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insulin primer <400> 4 atccacaatg ccacgcttct gc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insulin receptor primer <400> 5 tgacaatgag gaatgtgggg ac 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insulin receptor primer <400> 6 gggcaaactt tctgacaatg actg 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-I primer <400> 7 gaccaagggg cttttacttc aac 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-I primer <400> 8 tttgtaggct tcagcggagc ac 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-I receptor primer <400> 9 gaagtctgcg gtggtgataa agg 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-I receptor primer <400> 10 tctgggcaca aagatggagt tg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-II primer <400> 11 ccaagaagaa aggaagggga cc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-II primer <400> 12 ggcggctatt gttgttcaca gc 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-II receptor primer <400> 13 ttgctattga ccttagtccc ttgg 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IGF-II receptor primer <400> 14 agagtgagac ctttgtgtcc ccac 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic albumin primer <400> 15 cttcaaagcc tgggcagtag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic albumin primer <400> 16 tggagatagt ggcctggttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ASBT primer <400> 17 gcattggcat ttctctggtt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ASBT primer <400> 18 ggttcaatga tccaggcact 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic KCR primer <400> 19 tcacaaatgc tgtggaccat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic KCR primer <400> 20 gtcttcacgc tctccgtttc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic GFAP primer <400> 21 ggtggagagg gacaatctca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic GFAP primer <400> 22 ctcgaacttc ctcctcatgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic desmin primer <400> 23 acctgcgaga ttgatgctct 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic desmin primer <400> 24 acatccaagg ccatcttca 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic colla2 primer <400> 25 acctcagggt gttcaaggtg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic colla2 primer <400> 26 cggattccaa taggaccaga 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IRS-1 primer <400> 27 gataccgatg gcttctcaga cg 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IRS-1 primer <400> 28 tcgttctcat aatactccag gcg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IRS-2 primer <400> 29 caacattgac tttggtgaag ggg 23 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IRS-2 primer <400> 30 tgaagcagga ctactggctg agag 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IRS-4 primer <400> 31 acctgaagat aaggggtcgt ctgc 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IRS-4 primer <400> 32 tgtgtggggt ttagtggtct gg 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic GAPDH primer <400> 33 agtgggcatc aatggatttg g 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic GAPDH primer <400> 34 ggggatttcc ttaggttctt tgc 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic AAH primer <400> 35 tgcctgctcg tcttgtttgt g 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic AAH Primer <400> 36 atccgttctg taacccgttg g 21

Claims

동물에 있어서 알코올 유발성 간 질환의 치료, 예방 또는 역행용 약학 조성물로서, 치료적 유효량의 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(PPAR)-δ 선택적 효현제를 포함하며, 상기 PPAR-δ 선택적 효현제는 하기 화학식의 L-165041인 약학 조성물.
동물에 있어서 만성 알코올 섭취에 의한 간 손상의 치료, 예방 또는 역행용 약학 조성물로서, 치료적 유효량의 PPAR-δ 선택적 효현제를 포함하며,

상기 PPAR-δ 선택적 효현제는 하기 화학식의 L-165041인 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 간 손상이 산화적 스트레스와 관련이 있는 것인 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 간 손상이 지질 과산화와 관련이 있는 것인 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 간 손상이 DNA 손상과 관련이 있는 것인 약학 조성물.
만성 알코올 섭취에 의해 유발된 동물의 간에 있어서의 인슐린 내성의 치료, 예방 또는 역행용 약학 조성물로서, 치료적 유효량의 PPAR-δ 선택적 효현제를 포함하하며,

상기 PPAR-δ 선택적 효현제는 하기 화학식의 L-165041인 약학 조성물.
알코올을 만성적으로 섭취한 동물의 간 재생 반응의 촉진 또는 회복용 약학 조성물로서, 치료적 유효량의 PPAR-δ 선택적 효현제를 포함하며,

상기 PPAR-δ 선택적 효현제는 하기 화학식의 L-165041인 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 간 질환이 지방증, 알코올성 간염 또는 알코올성 간경변인 약학 조성물.
제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만성 알코올 섭취량이 0.1 g의 순수 알코올/kg 체중/일 이상인 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 만성 알코올 섭취량이 0.5 g의 순수 알코올/kg 체중/일 이상인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 만성 알코올 섭취량이 1 g의 순수 알코올/kg 체중/일 이상인 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 인슐린 내성이 인슐린 수용체에 대한 인슐린의 결합이 감소된 결과인 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 간 재생 반응이 상기 PPAR-δ 선택적 효현제의 부재시의 반응보다 10% 더 높은 수준까지 촉진되는 것인 약학 조성물.
제16항에 있어서, 상기 간 재생 반응이 상기 PPAR-δ 선택적 효현제의 부재시의 반응보다 50% 더 높은 수준까지 촉진되는 것인 약학 조성물.
제1항, 제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간인 약학 조성물.
제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만성 알코올 섭취량이 매일의 식이의 2 내지 37% (v/v) 또는 등가의(equivalent) 칼로리 함유량의 에탄올, 평균적으로 매일 체중 1 kg당 0.1 g 이상의 순수 에탄올 또는 인간의 경우 평균적으로 매일 체중 1 kg당 10g 이상의 순수 에탄올을 포함하는 것인 약학 조성물.
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