KR101918792B1 - 박테리아성 감기에 대한 신규 락트산 박테리아 및 그를 함유하는 조성물 - Google Patents

박테리아성 감기에 대한 신규 락트산 박테리아 및 그를 함유하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집될 수 있는, 락트산 박테리아 목의 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물에 대해 기술한다.

Description

박테리아성 감기에 대한 신규 락트산 박테리아 및 그를 함유하는 조성물 {NOVEL LACTIC ACID BACTERIA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM AGAINST BACTERIAL COLDS}
본 발명은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 상호응집될 수 있는, 락트산 박테리아 목의 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 개인 위생 및 질환 치료에 사용하기 위한, 이러한 미생물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기될 수 있는 모든 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 신규 락트산 박테리아 및/또는 그를 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본원에서 기술되는 진전은 구강 및 인후 영역, 즉 구인두 공간 염증의 예방 및 국부 치료에, 및 상기도 및 피부의 감염에 특이적인 작용을 하는 항미생물 첨가제로 사용될 수 있는 GRAS 미생물 및/또는 락트산 박테리아 형태의 혁신적인 생물학적 생성물이다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 스프레이, 구강 세척제 또는 인후 로젠지 또는 정제, 파스틸(pastille), 코팅된 환제, 에어로졸, 치약, 주스, 시럽 형태의 조성물 또는 제약 제품 또는 의약품 (구강 위생)에서의, 또는 식품에 대한 첨가제 및/또는 식품 보충제로서의 본 발명에 따른 미생물, 그의 유사체 또는 단편의 용도에 관한 것이다.
대부분의 사람들은 이미 인후통 또는 편도염 (인두염)을 앓아본 바 있다. 이들 질환은 모두 바이러스 및 박테리아를 원인으로 할 수 있다. 인후통 및 편도염 사례의 대략 20-30%가 박테리아 기원의 것이다. 임의의 사례에서, 이는 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 감염이 관련된다. 스트렙토코쿠스 피오게네스는 가장 일반적인 인간 병원성 박테리아 중 하나이다. 박테리아성 인두염은 비말 감염(droplet infection)에 의해 확산된다. 5 내지 15세의 어린이 및 청소년들이 이와 같은 감염에 의해 가장 일반적으로 영향을 받는 군이지만, 인간이 붐비는 조건에서는 노인 역시 감염의 위험성이 있다 (문헌 [Bisno 1995]). 미국에서의 에스. 피오게네스 감염의 수는 매년 천만 건인 것으로 추산된다 (문헌 [Kilian 2002]). 관련 비용은 미국에서 매년 대략 10억 달러인 것으로 추산된다 (문헌 [Reid et al. 2001]). 독일에서는, 급성 스트렙토코쿠스 인두염 사례의 수가 매년 백만 내지 백오십만 건인 것으로 추산된다. 감염들 중 일부만이 임상적으로 밝혀진 경로를 가지고 있는데, 다시 말하자면, 전파되는 병원체의 저장소는 더 광범위하다.
스트렙토코쿠스 피오게네스 (군 A 스트렙토코쿠스, GAS로도 지칭)는 긴 사슬을 형성하는 그람-양성 코쿠스에 속하는 인간 병원체이다. 많은 다른 병원체들과 마찬가지로, 스트렙토코쿠스 역시 다수의 발병 인자를 발현하는 능력을 가지고 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스의 발병기전 과정의 첫 번째 단계는 숙주 세포 표면에 대한 박테리아의 부착이다. 널리 받아들여지고 있는 모델에 따르면, 부착은 2개 단계로 이루어지는데: 첫 번째 단계는 인간 세포 표면과의 약하고 상대적으로 비특이적인 상호작용으로 구성되며, 그것은 즉시 고도의 친화성을 갖는 조직-특이적 상호작용으로 이어진다 (문헌 [Hasty et al. 1992]; [Courtney et al. 1999]; [Cunningham 2000]). 1976년에 이미 비체이(Beachey) 등은 박테리아 측에서 최초 부착을 매개하는 분자로 지질타이코산 (LTA)을 확인할 수 있었다. 상피 측에서는, 피브로넥틴이 LTA에 대한 수용체로 확인되어 있다 (문헌 [Simpson and Beachey 1983]). 두 번째 부착 단계의 경우에는, 11종 이상의 다른 박테리아 표면상 구조가 상피 세포에 대한 결합을 제공하는 것으로 확인된 바 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스로 인한 발병기전의 두 번째 단계는 상피 숙주 세포로의 박테리아의 침입이다 (문헌 [LaPenta et al. 1994]). 라펜타(LaPenta) 및 동료들은 GAS가 때로는 살모넬라(Salmonella) 또는 리스테리아(Listeria)와 같은 통상적인 세포내 인간 병원체의 것보다 더 높은 빈도로 인간 상피 세포에 감염될 수 있다는 것을 보였다.
숙주 세포 내부의 병원성 박테리아는 높은 복제 가능성을 갖는데, 그것은 급성 감염을 초래할 수 있다. 잠복 상태에서의 생존은 점막 및 상피 박테리아 감염의 발생 재개로 이어질 수 있으며, 그것은 구인두 점막의 재발성 감염의 원인이 될 수 있다. 특히, 협심증이 어린이에서 GAS에 의해 매우 흔하게 야기되는 재발성 감염이다.
스트렙토코쿠스 피오게네스는 인두염, 성홍열, 농가진, 연조직염과 같은 많은 급성 질환들의 병인학적 요인이다. 괴사성 근막염, 근육염 및 스트렙토코쿠스-유도 독성 쇼크 증후군과 같은 침습성의 독소원성인 감염은 물론, 류마티스열 및 사구체신염과 같은 면역매개 후유증의 발병이 모두 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기된다.
일반적으로 인구 중 5% 내지 15%가 어떠한 질환의 신호도 없는 (보통 해당 인후에서의) 이 박테리아의 보균자인 것으로 추산되고 있다. 정상 균총의 구성요소로서, 면역 시스템이 약화되는 경우에, 스트렙토코쿠스 피오게네스는 감염을 야기할 수 있다. 인후 긁힘(scratchy throat), 인후통, 및 삼킴에 있어서의 어려움과 같은 관련 증상을 동반한 질환의 발병 후에는, 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 조직 (예컨대 기도 또는 피부)의 콜로니화가 이어진다.
또한, 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 감염은 더 아래의 하기도 (중이염, 굴염, 폐렴) 또는 혈류로의 감염의 확산으로 인한 합병증, 및 수막염은 물론, 골 (골수염) 및 관절 (관절염)의 감염으로 이어질 수 있다.
콜로니화의 한 가지 요소는 세포 표면 및/또는 점막 표면에 대한 박테리아 부착이다. 박테리아는 세포 표면에 대한 결합을 매개하는 많은 부착 레퍼토리를 가지고 있다 (예컨대 M 단백질, 피브로넥틴-결합 단백질, LTA, 콜라겐-결합 단백질). 세포 표면에 대한 상호작용, 즉 결합은 숙주 세포에 대한 콜로니화에서는 물론, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 발병기전에서 최초의 역할을 한다.
따라서, 예방 및 치료를 위한 치료제의 조기 사용은 총 GAS 미생물 계수를 감소시키고 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합, 즉 침입을 효율적으로 방지하는 데에 결정적으로 중요하다.
인후 영역에서 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기되는 증상을 완화할 수 있는 치료제에 대해서는 선행 기술에 기술되어 있다.
선행 기술
급성 질환의 표준적인 치료는 항생제를 투여하는 것이다. 다른 어떤 이유보다도, 1980년대 중반 이후의 페니실린 내성의 증가된 발생률로 인하여, 본 질환은 다시 최근 수십년 동안 산업 국가에서 관심이 치솟고 있다 (문헌 [Kaplan 1991]; [Musser and Krause 1998]). 지금까지 기능성의 백신이 개발된 바 없기 때문에, 예방책은 존재하지 않는다. 이는 사용되는 주 항원인 박테리아 세포벽 유래 M 단백질의 다양성, 및 다른 항원 후보들의 인간 단백질과의 면역학적 교차-반응성으로 인한 것이다.
일반적으로, 많은 부작용을 가질 수 있는 항생제 (보통 페니실린 또는 에리트로마이신)를 사용한 치료에도 불구하고, 어떠한 방식으로든 대부분의 환자에서 감염은 진정되는 것으로 나타나 있다.
현재 시중에서 가용한 제제에는 본질적으로 경우에 따라 인후 영역에서 단시간의 증상의 완화을 가져오는 국부 마취제 (리도카인, 벤조카인)와 혼합되어 있는 로젠지, 정제, 인후 세척제 및 인후 스프레이가 포함되지만, 이들 제제가 스트렙토코쿠스 피오게네스를 사멸시키는 것은 아니다.
락트산 박테리아는 일반적으로 병원체에 의해 야기되는 위장관 질환으로부터의 보호를 위한 프로바이오틱 박테리아로 사용되는데, 그것이 종종 락트산 이외에 항박테리아 물질들도 생성하기 때문이다. 락토바실루스 (락트산 박테리아)는 당을 락트산으로 대사할 수 있는 (락트산 발효) 그람-양성의 혐기성 내지 내기성 박테리아이다. 여기에는 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 아에로코카세아에(Aerococcaceae), 카르노박테리아세아에(Carnobacteriaceae), 엔테로코카세아에(Enterococcaceae), 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae) 및 스트렙토코카세아에( Streptococcaceae) 과가 포함된다. 이들은 비병원성인 것으로 간주되며, 일반적으로 위장관 균총을 개선하는 데에, 그리고 위장관 증상들의 치료에 프로바이오틱 박테리아로 사용되고 있다. 락토바실루스는 식품 산업에 특히 중요한데, 거기에서 그것은 "기능성 식품" 분야에서 중요한 역할을 한다. 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 종은 과거에는 락토바실루스로 분류되었었으나 (락토바실루스 비피둠(Lactobacillus bifidum)), 오늘날의 지식에 따라, 이 종은 계통발생학적으로는 이 목과 밀접하게 관련되지 않고 있다. 그러나, 대사와 관련하여서는, 그것이 여전히 락트산 박테리아인 것으로 간주되고 있다. 락트산 박테리아는 또한 식품 산업에서 극히 중요한데, 유제품을 생산하는 데에 그것이 사용되기도 하지만, 페스트(pest)로서 (예컨대 맥주 양조장에서) 그것이 발생할 수도 있기 때문이다. 락트산 박테리아는 비병원성으로 분류된다.
다양한 적용분야에서의 프로바이오틱 박테리아의 사용이 선행 기술에 기술된 바 있다. 예를 들어, WO 2010/130563호는 피부에 대한 수동 식기세척의 부정적인 결과를 감소시키기 위한 식기세척제용 프로바이오틱 박테리아의 사용에 대해 개시하고 있다. 이들 박테리아 역시 피부에 대한 보호 효과를 가지고 있다.
화장품용 피부 처리제에서의 그와 같은 미생물의 사용에 대해서는 이미 알려져 있다. 예를 들어, US 특허 6,790,434호는 UV 방사선에 의해 야기되는 피부 손상에 대항하기 위한 식물 세포외 기질 추출물과 조합된 화장품용 피부 처리제에서의 그와 같은 미생물의 사용에 대해 기술하고 있다. 그러나, 여기에는 이러한 미생물의 세제 및 세정제에서의 사용에 대해서는 개시되어 있지 않다.
더하여, 소정 바실루스 종의 위생 세정제에서의 사용 역시 알려져 있다. 예컨대 WO 97/25865호가 위생 목적의 세정제에서의 바실루스 종의 사용에 대해 기술하고 있는데, 여기에서 그것은 병원체의 복제를 방지하며 유기 오염물을 분해하는 것으로 추정되고 있다. 개시되어 있는 사용은 종종 포자 형태의 불활성화된 박테리아를 포함한다. 포자는 기질에 의해 재활성화되는데, 유전적 결합으로 인하여 복제될 수는 없다. 그러나, 여기에서의 단점은 박테리아의 복제 및/또는 돌연변이가 완전히 배제될 수 없어서, 조절되지 않는 방식으로 박테리아가 복제될 수도 있는 위험성이 잔존한다는 것이다.
한편, 프로바이오틱 박테리아의 경구 투여 형태가 WO 2005/117921호에 개시되어 있는데, 여기서 상기 투여 형태는 1종 이상의 프로바이오틱 미생물 속을 함유하며, 상기 투여 형태 및/또는 박테리아에는 셀룰로스 에테르를 함유하는 코팅이 제공된다.
시험관내 실험으로써, 몇 가지 락토바실루스 균주가 인간 세포주에 대한 GAS의 결합을 방지할 수 있음을 보인 바가 있다. 상기 락토바실루스 균주는 세포 표면 구조에 대하여 GAS와 경쟁함으로써 GAS가 숙주 세포에 침입하는 것을 방지한다. 숙주 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 부착은 발병기전의 첫 번째 단계이며, 숙주 세포에의 침입 과정은 매우 짧은 상황으로 이루어지기 때문에, 이와 같은 방법은 GAS 감염 치료의 단점으로 생각된다. 여기에서 세포 표면에 대한 결합이 이루어져 면역 반응이 유도될 수 있기 전이라면, 플랑크톤성 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포에 대한 상호응집이 바람직할 것이다.
본 발명의 목적은 선행 기술의 결점 또는 단점을 가지지 않는, 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 감염의 치료 및 예방을 위한 작용제 또는 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
상기 목적은 독립 청구항에 의해 달성된다. 유리한 실시양태는 종속 청구항으로부터 유래한다.
제1 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 병원성 미생물과 상호응집될 수 있으며 상기 병원성 미생물은 스트렙토코쿠스 피오게네스인, 락트산 박테리아 목의 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물에 관한 것이다. 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합하는 미생물이 이용가능해질 수 있었으며, 그와 같은 미생물이 락트산 박테리아라는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 락토바실루스 속에 속한다.
상기 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물을 사용하는 바람직한 실시양태에서, 생물학적, 화학적 또는 물리적 처리 후에도 병원성 미생물에 대한 상호응집 능력이 존재한다는 것 역시 완전히 놀라운 것이었다. 병원성 미생물에 대한 상호응집 능력은 대략 3 내지 대략 8의 pH에서도 존재한다. 상기 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 병원성 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는 능력을 갖는 것이 바람직하다. 상기 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물이 피브로넥틴에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지하는 능력을 갖는 것 역시 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물은 피부 또는 점막의 공생 미생물과 상호응집되는 능력은 가지지 않는다.
이와 같은 미생물은 바람직하게는 락토바실루스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실루스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실루스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 프룩티보란스(Lactobacillus fructivorans), 락토바실루스 힐가르디이(Lactobacillus hilgardii), 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 비리데센스(Lactobacillus viridescens), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 락토바실루스 인글루비에이(Lactobacillus ingluviei) 또는 이들의 유사체, 유도체, 단편 또는 돌연변이체를 포함하는 군에서 선택된다.
미생물은 유리하게는 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973의 번호로 독일 미생물 및 세포 배양 협회(German Collection for Microorganisms and Cell Cultures)에 기탁되어 있는 미생물을 포함하는 군에서 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 제약상 또는 화장품용으로 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 고체, 액체, 점성 형태 또는 에어로졸로 존재하는 것이 바람직하다. 조성물은 바람직하게는 페이스트, 연질 젤라틴 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 분말, 과립, 비드, 파스틸, 발포성 정제, 로젠지, 협측 정제, 츄어블 정제, 설하 정제, 용액, 팅크제, 에멀젼, 주스, 농축물, 시럽, 스프레이, 음용 앰플, 겔, 구강 세척제, 치약, 츄잉 검, 정제, 코팅된 환제 또는 봉봉(bonbon)의 형태이다.
조성물은 유리하게는 프로바이오틱스(probiotics), 방부제 또는 기타 활성의 항박테리아 물질을 포함할 수 있고/거나 바람직하게는 항산화제, 비타민, 조효소, 지방산, 아미노산 및 보조인자에서 선택된 1종 이상의 물질을 함유할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물, 수의학적 조성물 또는 화장품 조성물, 또는 식품 보충제 또는 식품 보충제 조성물이다. 조성물은 바람직하게는 1종 이상의 증점제, 1종 이상의 감미제 및/또는 1종 이상의 인공 감미제를 함유하며, 여기서 상기 증점제는 바람직하게는 셀룰로스 에테르, 다당류, 크산탄 검, 젤라틴, 고도 분산 이산화규소, 전분, 알기네이트, 트라가칸트, 아가, 아라비아 검, 펙틴 및 폴리비닐 에스테르를 포함하는 군에서 선택되고, 상기 감미제는 글루코스, 프룩토스, 수크로스 및 글루코스 시럽, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨 및 말티톨, 사카린, 나트륨 시클라메이트, 아세술팜 K 및/또는 아스파르탐을 포함하는 군에서 선택된다.
본 발명에 있어서, 바람직한 제약 제품에는 코 린스, 구강 세척제 및 치과용 린스; 가글 용액, 코 스프레이, 구강 스프레이, 인후 스프레이, 코 점적제, 점적제, 팅크제, 구강, 인후 또는 경부 영역에서의 기침, 인후통, 감기 또는 감염용 주스 또는 시럽, 인후 증상 또는 인후통용 인후 정제, 봉봉, 츄어블 봉봉, 코팅된 환제 및 파스틸은 물론 에어로졸이 포함된다.
본 발명에 있어서, 바람직한 의약품에는 코 린스, 구강 세척제 및 치과용 린스; 가글 용액, 코 스프레이, 구강 스프레이, 인후 스프레이, 코 점적제, 점적제, 팅크제, 구강, 경부 또는 인후 영역에서의 기침, 인후통, 감기 또는 감염용 주스 또는 시럽, 인후 증상 또는 인후통용 인후 정제, 봉봉, 츄어블 봉봉, 코팅된 환제 및 파스틸은 물론 에어로졸이 포함된다.
본 발명에 있어서, 바람직한 화장품에는 치약, 로션, 셰이크 믹스, 파우더, 코 세척제, 구강 세척제 및 치과용 세척제, 가글 용액, 코 스프레이, 구강 스프레이, 인후 스프레이, 츄잉 검, 히드로겔, 크림, 크레사, 연고, 지방-기재 연고, 또는 피부 표면 적용을 위한 페이스트가 포함된다.
본 발명에 있어서, 바람직한 식품 및 영양 보충제에는 발포성 정제, 비타민 정제, 무기질 정제, 미량 원소 정제, 음료 분말, 음료, 주스, 우유 음료, 요구르트, 광천수, 비탄소화수, 봉봉, 츄어블 봉봉, 츄잉 검, 주스 또는 시럽, 인후 정제, 코팅된 환제 및 파스틸은 물론 에어로졸이 포함된다. 또한, 조성물은 빌더, 효소, 전해질, pH 조절제, 증점제, 방오제, 광학 증백제, 노화 억제제, 염료 전달 억제제, 폼 조절제 및/또는 착색제를 함유할 수도 있다.
미생물은 유리하게는 생존 또는 사멸 형태로 조성물 중에 존재할 수 있다. 또한, 미생물은 캡슐화, 분무-건조 및/또는 동결건조 형태로 존재하는 것이 바람직할 수 있으며, 미생물이 세포 용해물의 형태로 존재하는 것 역시 바람직할 수 있다. 또한, 미생물은 0.001 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.005 중량% 내지 10 중량%, 특히 바람직하게는 0.01 중량% 내지 5 중량%의 중량 기준 양으로 조성물에 중에 존재하는 것이 바람직하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하기의 단계들을 포함하는, 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집되는 특성을 갖는 락트산 박테리아의 확인 및/또는 선별 방법에 관한 것이다:
a. 병원성 미생물을 인큐베이션하여 바이오필름을 형성시키는 단계,
b. 시험될 락트산 박테리아를 첨가하고 인큐베이션하여 병원성 미생물과 시험될 락트산 박테리아 사이에서 상호응집이 일어난 혼합물을 얻는 단계,
c. 상청액을 제거함으로써 비결합 락트산 박테리아를 분리하는 단계, 및
d. 상호응집된 락트산 박테리아와 관련하여 바이오필름을 측정하는 단계.
또한, 상기 방법은 추가로 하기의 방법 단계를 포함할 수 있다:
- 시험될 락트산 박테리아를 첨가하여 바이오필름-형성 병원성 미생물의 인큐베이션 동안 병원성 미생물에 의한 바이오필름의 억제를 조사하는 단계, 및/또는 바람직하게는
- 비결합 세포를 제거한 후에 광학 밀도를 측정하고 시험될 락트산 박테리아가 첨가되지 않은 대조군과 비교함으로써 바이오필름 형성을 정량하는 단계.
또한, 본 발명은 피부, 점막 및 구강의 미생물 질환의 치료, 예방 및/또는 요법을 위한 제약 약물, 의약품 또는 화장품을 제조하기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 조성물은 피부, 점막 및 구강의 염증성 질환의 미생물 질환의 국소적 예방 및/또는 치료에 사용될 수도 있다. 조성물은 구강 미생물 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되고, 또한 1종 이상의 향미 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 조성물은 미생물 질환 또는 염증성 질환, 바람직하게는 구강의 미생물 질환 또는 염증성 질환의 국소적 예방 및/또는 치료에 사용되는 것이 바람직한데, 여기서 조성물은 츄어블 매스(chewable mass), 츄잉 검, 봉봉, 파스틸, 치약 또는 구강 세척제의 형태로 사용된다.
1종 이상의 항-염증 또는 항미생물 물질이 조성물에 사용되는 것이 유리할 수 있다. 또한, 조성물은 용매, 비히클, 부형제, 충전제, 향미 물질, 아로마 물질 및/또는 추가적인 성분과 조합되어 사용되는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 표면 처리용 세정제 또는 소독제를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 의약품 및/또는 예방 분야에 사용되는 생성물을 제조하는 데에 조성물이 사용되는 것 역시 바람직하다. 경구, 설하, 협측 섭취용 작용제를 제조하는 데에 조성물이 사용될 경우, 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 구인두 공간 염증의 국소적 치료, 및 상기도 및 피부의 감염을 위한 항미생물 첨가제를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 바람직한 조성물은 특히 예방적으로 또는 치유적으로 사용된다. 조성물이 경구, 설하 또는 협측 적용될 경우, 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명은 신체 위생 장치 또는 기구용의 바람직한 미생물 또는 바람직한 조성물, 린스 및/또는 페이스트를 포함하는 위생 처리용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 감염이 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기되거나, 또는 상기 종이 적어도 감염에 관련되는, 구강 또는 인후 영역에서의 박테리아 감염의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 특히 유아, 소아, 어린이, 건강한 사람, 노인, 면역억제된 사람, 단일-발병 또는 재발성 스트렙토코쿠스 피오게네스 감염에 걸린 사람, 및/또는 인후 및 편도의 박테리아 감염 (인두염)에 걸린 사람에서의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 신규 락트산 박테리아, 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편은 물론, 그를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 놀랍게도 동물에 사용될 수도 있다.
적절하게는, 락트산 박테리아의 투여가 바람직한 인후 증상, 인후통, 적색 인후는 물론, 인후 및 편도의 화농성 및 비화농성 염증의 치료 또는 예방에 유익한 제약 약물을 제조하는 데에 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 조성물은 예를 들어 프로바이오틱으로서 치유적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다.
바람직한 미생물, 즉 락트산 박테리아 속에 속하는 미생물 또는 그의 유사체, 유도체, 돌연변이체 또는 단편은 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 특이적으로 결합하는 상호응집 능력을 가진다. 바람직한 락트산 박테리아가 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)와 같은 공생 미생물에 대해서는 어떠한 상호응집 또는 결합도 야기하지 않는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 스트렙토코쿠스 살리바리우스는 건강한 인간의 인후 영역의 점막에서 발견되며, 건강한 미생물 평형에 기여하기 때문에, 본 발명의 맥락에서는 그의 응집이 바람직하지 않다.
다른 말로 하면, 바람직한 락트산 박테리아는 병원성 박테리아인 스트렙토코쿠스 피오게네스와 특이적으로 상호응집된다. 선행 기술로부터는 이와 같은 유형이 유래할 수 없다. 선행 기술은 인간 세포 주에서 스트렙토코쿠스 피오게네스의 침입 및 복제를 방지하는 락트산 박테리아만을 기술하고 있다. 그러나, 박테리아 발병기전에서는 부착이 필수적인 첫 번째 단계이므로, 이와 같은 접근법은 부작용 없이는 사용될 수 없었다. 그와 달리, 바람직한 상기 락트산 박테리아는, 예를 들어 ATCC 12344 및 ATCC 19615의 DSM 번호를 갖는 균주에서 나타나는 바와 같이, 그것이 숙주 세포에 결합할 수 있기 전에 플랑크톤성 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포와 특이적인 상호응집을 한다. 따라서, 본 발명은 일상에서 벗어난 것으로 간주될 수 있는데, 선행 기술에는 상피 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 감소시키는 쪽으로의 경향이 존재하기 때문이다. 그러나, 병원성 세포가 구강에서 상호응집될 수 있음으로써 상피 세포에 대한 결합이 개시시부터 이루어질 수 없는 것에 대해서는 보고된 바가 없다. 이는 또한 세포 응집체가 타액과 함께 또는 구강 세척제에 의해 삼켜짐으로써, 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포가 위장관 통과시 사멸된다는 중요한 장점을 가진다. 따라서, 이는 사용자-친화성의 적용이기도 한데, 예를 들어 구강 세척제를 뱉어내는 것은 일반적으로 불쾌하고 불편한 것으로 인지되기 때문이다. 바람직한 사용에 있어서, 이와 같은 유형은 필요하지 않다.
건강한 피부 및/또는 점막이 공생체 및/또는 상리공생체로서 바람직한 박테리아 및 진균과 같은 미생물들에 의해 조밀하게 군집화되어 있다는 것은 업계 숙련자에게 알려져 있다. 이들 미생물은 피부 표면의 자연 구성요소를 이루며, 특히 집합적으로 피부 균총으로 지칭된다. 자생 균총이라는 표제하에 포괄되는 상기 미생물은 병원성 미생물로부터 피부 자체 및 전체 신체를 보호하는 데에 중요한 필수구성요소로써, 미생물군집(microbiome)의 일부이다. 이와 같은 점에서, 바람직한 락트산 박테리아는 피부 균총의 불균형을 생성하지 않고, 그 대신 단순히 병원성 박테리아인 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합하고/거나 그와 상호응집되는 것이 특히 유리하다.
다른 무엇보다도, 본 발명에 따른 미생물은 피브로넥틴에 대한 결합을 방지함으로써, 세포의 침입을 방지한다. 바람직한 락트산 박테리아가 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집되고/거나 이러한 박테리아와 관련한 부착 특성을 가지고 있다는 사실로 인하여, 특히 병원성 인자를 차단하고 그에 따라 그것의 잠복을 초래하는데, 이는 이후 인후 영역에서 박테리아 부하의 감소, 및/또는 피브로넥틴 및/또는 세포에 대한 결합의 억제로 이어진다.
본 발명이 특히 일군의 락트산 박테리아에 관한 것이기는 하지만, 본 출원에 따른 교시의 일관성은 존재한다. 청구되는 미생물들은 공통적인 특성 또는 효과를 가진다. 구조 또는 기능적 공통성의 총합은 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 상호응집, 피부 및/또는 점막의 공생 미생물에 대한 비결합, 및 피브로넥틴에에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합 방지의 기능적 관계로 이어진다. 따라서, 이러한 공통적인 특징들은 임의의 특징 총합을 나타내는 것이 아니라, 그 대신, 해당 목적에 대한 이들 미생물의 적합성을 유리하게 가능케 하고 특징화하는, 말하자면 청구되는 미생물들의 공통 지문을 구성한다. 또한 놀랍게도, 본 발명에 따른 미생물의 놀라운 특성, 즉 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 상호응집이 타액 또는 당의 존재 중 어느 하나에서도 억제되지 않는다는 것이 발견되었다. 미생물 및 조성물의 바람직한 사용 부위가 구강에 있으며, 선행 기술에는 일반적으로 상호응집 과정이 높은 당 농도에 의해 억제되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이는 특히 유리하다. 그러나 시험에서, 본 발명에 따른 미생물, 구체적으로 락트산 박테리아에서는 이것이 해당되지 않는 것으로 나타났는데, 그것이 (예를 들어 타액에서는 물론, 발포성 정제, 비타민 정제, 무기질 정제, 미량 원소 정제, 음료 분말, 음료, 주스, 우유 음료, 요구르트, 봉봉, 츄어블 봉봉, 츄잉 검, 주스 또는 시럽, 인후 정제, 코팅된 환제 및 에어로졸과 같은 가능한 투여 형태에서 발생하는 것과 같은) 높은 당 농도에서도 여전히 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집되게 되기 때문이다.
바람직한 미생물이 피부상에서 사용될 수도 있으며, 거기에서도 역시 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집되게 된다는 것 역시 놀라운 것이었다. 업계 숙련자라면, 스트렙토코쿠스 피오게네스가 병원성 상처 생물체로도 알려져 있으며, 그에 따라 바람직한 미생물의 상호응집 능력이 구강으로 제한되지 않고 대신 피부 영역에도 적용될 수 있으면, 특히 유리하다는 것을 알고 있다.
따라서, 본 발명은 또한 구체적으로 유아, 소아, 어린이, 건강한 사람, 노인, 면역억제된 사람, 병리학적 피부 변화 (특히 스태필로코쿠스-열상 피부 증후군), 전염성 농가진, 표재성 모낭염, 농가진화, 피부 농양, 종기 (종기증), 큰종기 (농양), 연조직염, 건성 피부, 소양성 피부, 적색화 피부, 자극성 피부, 극지성 피부, 여드름, 당뇨족, 욕창성 궤양, 신경피부염, 급성 림프절염, 모소낭 (모소 누공, 모소동, 꼬리뼈 누공, 꼬리뼈낭 포함), 피부 및 피하 조직의 기타 국부 감염 (예컨대 농피증, 화농성 피부염, 패혈성 피부염, 화농 피부염)에 걸린 사람의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 미생물, 특히 락트산 박테리아, 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편은 물론, 이들을 함유하는 조성물에 관한 것으로써; 그것은 또한 다양한 형태의 피부염 및 습진 (예컨대 아토피성 습진, 지루성 습진, 기저귀 발진 또는 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 지루성 피부염, 박탈성 피부염, 독성 접촉 피부염, 만성 단순 태선, 가려움발진, 가려움증 및 기타 형태의 피부염); 또한 구진비늘 피부 질환 (건선, 유사건선), 외피 부속기의 질환 (예컨대 탈모성 모낭염을 포함한 흉터 탈모증), 더하기 기타 피부 및 피하 조직의 질환 (예컨대 다리 궤양), 기존의 피부 손상 (예컨대 건성 피부)에 걸린 사람, 인간, 또는 상업용 동물 및 가정용 애완동물에서의 피부 상해 (예컨대 딱지, 상처, 사고 또는 수술 후의 것들 포함)를 치료하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 실시양태에서의 피부는 특히 외부로부터 내부를 구별하는 작용을 하는 인간 또는 동물 신체의 외부 기관인 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 있어서의 피부 영역에는 피부 상층, 코리움(corium) 또는 진피(true skin), 또는 피하 조직의 구성요소가 포함된다. 본 발명에 있어서, 피부 상층 (표피)은 또한 하기의 층들로 구성된다: 스트라툼 코르네움(stratum corneum) (각질 층), 스트라툼 루시둠(stratum lucidum) (투명 층), 스트라툼 그라뉼로숨(stratum granulosum) (과립 층), 스트라툼 스피노숨(stratum spinosum) (가시 세포 층) 및/또는 스트라툼 바살레(stratum basale) (기저 층). 이와 같은 영역에서의 각 세포 변형은 본 발명에 있어서의 피부 영역에서의 세포 변형을 구성한다. 본 발명에 있어서, 피부 영역의 구성요소일 수도 있는 진피 또는 코리움은 바람직하게는 결합 조직 섬유로 구성되며, 표피를 위한 자양분 및 고착력(anchoring)을 제공하는 역할을 한다. 본 발명에 있어서, 표피와의 경계선 구역의 모세관화된 혈관 시스템 역시 피지선 및 한선 또는 땀샘과 마찬가지로 피부 영역에 속한다. 본 발명에 있어서, 진피는 스트라툼 파필라레(stratum papillare) 및 스트라툼 레티큘라레(stratum reticulare)로 하위분할될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 피부 영역은 피하 조직 (피부밑조직) 또는 신체 또는 임의의 기관 또는 기관 구성요소 내부 조직의 또는 조직상의 임의의 영역, 즉 임의의 위치일 수 있다. 본 발명에 있어서, 주변 구조로부터 기관을 구별하는 조직 장벽은 피부일 수 있다. 또한, 본 발명의 피부 영역 개념에는 모발, 피지선, 입모근, 손톱, 뿔 및 한선, 특히 외분비 및 부분분비 한선은 물론 유선과 같은 외피 부속기도 포함되는 것으로 이해될 수 있다. 바람직하게는 피부의 외부 영역으로 제한되지 않고, 어떠한 세포 변형, 특히 정상에서 벗어나는 세포 성장도 본 발명에 따른 작용제를 사용하여 치료될 수 있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 피부 영역에는 손가락 또는 발바닥, 그리고 그와 관련된 그물망 피부(meshed skin) 및 외피 부속기상의 것과 같은 코리움이 포함될 수도 있다.
바람직한 조성물은 특히 비누, 로션, 분말, 합성 세제 또는 합성세제(syndet), 폼, 스틱, 에멀젼, 스프레이, 크림, 겔, 샴푸, 액체 비누 또는 탈취제에 함유될 수 있다. 조성물은 특히 세제, 린스제, 세정제 또는 소독제 (예컨대 비누, 분말, 페이스트, 용액, 에멀젼, 로션), 세정 및/또는 소독 천 또는 타월, 샴푸, 피부, 모발 및/또는 두피용 린스 또는 외용약, 크림, 연고, 피부 세정 로션 및/또는 피부 관리 로션, 안구, 귀, 입, 코 또는 인후에 사용하기 위한 용액 (예컨대 점적제, 스프레이, 린스)으로 첨가될 수 있는 프로바이오틱으로 사용되는 것 역시 바람직하거나, 및/또는 병원성 미생물의 형성을 억제하거나, 거기에 결합하고, 응집물로서 그것을 제거하거나, 및/또는 그것을 억제하거나 그것을 사멸시킴으로써 그 수를 감소시키기 위하여 붕대 또는 상처 드레싱에 도입될 수도 있다.
상기 언급된 제약 형태들에의 그것의 도입에 의해 본 발명에 따른 조성물의 장점이 아직 더 향상될 수 있다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 업계 숙련자라면, 예컨대 피부 적용을 위한 에멀젼 또는 기타 생성물, 예를 들어 바람직하게는 함수 또는 무수의 것일 수 있는 액체 형태 (본 발명에 있어서 수성 형태는 단일-상 시스템 및 다중상 시스템으로 분할될 수 있음)와 같은 비히클 물질들에 본 발명에 따른 조성물을 도입하기 위한 기타 제제 개념에 익숙하다. 또한, 무수 또는 함수인 반고체 형태가 사용될 수 있는데, 이것 역시 단일-상 시스템 및 다중상 시스템으로 분할되는 것이 가능하며, 물을 함유하는 반고체 형태도 가능하다. 친지질성 또는 친수성인 고체 형태가 바람직하게 사용될 수도 있다. 그와 같은 형태의 예에는 상기에서 이미 언급된 형태들 이외에도, 예를 들어 지방-기재 연고, 폼, 분말, 스틱, 겔 크림, 수분산성 겔, 묽은 (비점성) 에멀젼, 로션, 연고, 스프레이 및 크림이 포함된다. 여기에서, 업계 숙련자라면, 그와 같은 비히클 물질들이 먼저 풍부하고/고품질인 것들 및 피부에 대한 감촉을 기준으로 신선하고 가벼운 것들로, 그리고 두 번째로는 점도와 관련하여 낮은 점도를 갖는 것들 및 기타 높은 점도를 갖는 것들 (히드로겔 또는 수화크림 및/또는 O/W 에멀젼 또는 W/O 에멀젼은 높은 점도를 가짐)로 구별될 수 있다는 것을 알고 있다. 액체 적용 형태가 사용되는 경우, 그것은 - 상기에서 설명한 바와 같이 - 함수 및 무수 시스템으로 분할될 수 있다. 무수 시스템 중에서는, 비극성 시스템, 에멀젼화제가 없는 극성 시스템 및 에멀젼화제가 있는 극성 시스템이 특히 바람직하다. 함수 시스템 중에서는, 용액 및 미세에멀젼과 같은 단일-상 시스템이 바람직하며; 다중상 시스템 중에서는, 다중 에멀젼 W/O 에멀젼 또는 O/W 에멀젼이 바람직하다. 고체/액체 시스템 중, 바람직한 형태에는 현탁액 또는 액체/고체/액체 시스템 예컨대 현탁액 시스템/에멀젼 시스템이 포함된다. 업계 숙련자라면, 그와 같은 비히클을 공급함에 있어서의 다양한 가능성들에 대해 알고 있다. O/W 에멀젼의 경우, 바람직한 선도 제약 물질에는 O/W 에멀젼화제, W/O 에멀젼화제, 액체 친수성 성분 및 액체 친지질성 성분이 포함된다. W/O 에멀젼의 경우, 바람직한 제약 선도 물질에는 W/O 에멀젼화제, O/W 에멀젼화제, 액체 및 반고체 친지질성 성분, 겔-형성제, 액체 친수성 성분 및/또는 염이 포함된다.
바람직한 반고체 비히클 물질 중에는, 함수 시스템 및 무수 시스템 모두가 다양한 적용분야에 바람직하다. 무수 시스템은 에멀젼화제가 없는 극성 시스템 또는 비극성 시스템, 예컨대 리포겔, 올레오겔 또는 폴리에틸렌 글리콜 겔로 구성될 수 있고/거나 O/W 흡수 기제 또는 W/O 흡수 기제상의 에멀젼화제가 있는 비극성 시스템으로 구성될 수 있다. 함수 시스템은 바람직하게는 단일-상 시스템 예컨대 히드로겔 또는 미세에멀젼 겔, 또는 다중상 시스템 예컨대 O/W 크림, W/O 크림 또는 친양쪽성 시스템으로 구성될 수 있다. 바람직한 반고체 제제는 실온과 피부 온도 사이의 온도 범위에서 피부 적용시 또는 점막 적용시 퍼짐성이며, 거기에서 국소적 효과를 가지고, 거기에서 활성 성분을 수송하거나, 또는 피부에 대한 연화 또는 보호 효과를 갖는 제제이다. 바람직한 제제에는 좁은 의미에서의 연고, 크림, 겔 및/또는 페이스트가 포함된다. 연고, 크림, 겔 및 페이스트 이외에, 올레오겔이 반고체의 투명한 단일-상 시스템으로 사용될 수도 있다. 업계 숙련자라면, 예를 들어 본 발명에 따른 비-겔(bi-gel)로 지칭될 수 있는 올레오겔 및 히드로겔의 화합물을 포함하여, US 특허 6,187,323호 또는 문헌 [Aiache et al. 2001]에 나와 있는 반고체 시스템을 제제화하기 위한 다양한 무수 화합물들에 대해 알고 있다. 또한, 수화분산액 겔 또는 다양한 지질들이 본 발명에 따른 비히클 물질들을 제공하는 데에 사용될 수 있다. 지질을 사용할 경우, 유기탄소 화합물과 같은 유기규소 화합물이 분산 시스템 중 지질 상을 공급하는 데에 사용될 수 있으며, 여기서 유기탄소 화합물은 예를 들어 비가수분해성 지질 또는 가수분해성 지질 (글리세롤) 또는 왁스 에스테르의 도움으로 공급될 수 있다. 그와 같은 시스템의 장점에는 향상된 피부의 유연성 및 그의 탄성의 증가는 물론, 지질 조성에 따라 물질 방출 및 그의 침투를 증가시키는 효과를 갖는 능력이 포함된다. 업계 숙련자라면, 예를 들어 시간 파라미터 내에서 침투를 증가시키거나 감소시키기 위하여 어떤 지질을 사용해야 하는지에 대해 익숙하다.
추가적인 바람직한 비히클 물질에는 예를 들어 수화분산액 겔 및/또는 미세캡슐, 미세소구체 또는 펠렛 (거대 비드)이 포함된다. 언급된 비히클들은 안정성을 증가시키는 작용을 하고 피부에 대한 최소한의 적용 기간을 보장한다. 바람직한 반고체 단일-상 시스템은 하기의 제약 선도 물질들의 도움으로 제조될 수 있다: 액체 친수성 성분, 특히 물 및 (폴리)알콜, 친수성 겔-형성 물질, 염-형성 물질 및 W/O 에멀젼화제, O/W 에멀젼화제, 액체, 반고체 및 고체 친지질성 성분은 물론, 친지질성 겔-형성 물질들 및 빌더. 업계 숙련자라면, 이들 물질들을 어떻게 조합하여 소정의 효과를 달성해야 하는지를 알고 있을 것이다.
업계 숙련자라면, 피부 제품용의 다른 제약 제제에 대해서도 알고 있을 것이다. 예를 들어 본 특허 출원에 따른 모든 제약 화합물은 문헌 [Daniels and Knie in JDDG; 2007, 5:367-383]의 인용문에 개시되어 있다. 업계 숙련자라면, 상이한 제약 제제가 피부에서 상이한 효과를 가진다는 것을 알고 있어서, 상이한 양으로 생약학적 조성물을 피부에 적용하게 될 것이다. 문헌 [JDDG; 2007, 5:367-383]의 내용은 의거 본 특허 출원에 따른 교시의 개시 내용에 개재된다. 본 발명에 따른 바람직한 생성물에는 예를 들어 친지질성 또는 친수성 용액, 친지질성 또는 친수성 에멀젼, 친지질성 또는 친수성 현탁액, 특별 액체 제제, 소수성 또는 친수성 연고, 수-에멀젼화 연고, 친지질성, 친수성 또는 친양쪽성 크림, 히드로겔, 소수성 또는 친수성 페이스트 및/또는 분말이 포함된다.
바람직한 미생물, 구체적으로 락트산 박테리아는 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 헬베티쿠스, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 쿠르바투스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 레우테리, 락토바실루스 비리데센스, 비피도박테리움 비피둠, 락토바실루스 인글루비에이 또는 이들의 유사체, 유도체, 단편 또는 돌연변이체를 포함하는 군에서 선택되며; 이들 미생물은 서로와의 기능적 관계를 통하여 연합되어 본 발명에 따른 일관된 개념을 형성함으로써 특성 및/또는 효과를 공유하는데, 다시 말하자면, 이들은 병원성 박테리아인 스트렙토코쿠스 피오게네스와 특이적으로 상호응집되며, 피부 및/또는 점막의 임의의 공생 미생물에도 결합하지 않고, 또한 피브로넥틴에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지하거나, 및/또는 피브로넥틴에 결합되는 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포를 파괴한다. 이러한 락트산 박테리아에는 특히 코드 번호 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989, DSM 25973으로 독일 미생물 및 세포 배양 협회에 기탁되어 있는 미생물을 포함하는 군에서 선택되는 미생물 또는 그의 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 조합물이 포함된다. 동일한 유리한 특성들을 가지고 있는 락트산 박테리아 군이 확인될 수 있었다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 비병원성이기도 하면서 피부의 자연 균총에 대해서는 어떠한 손상 또는 영향도 야기하지 않는 이러한 모든 특성들을 조합한 박테리아, 특히 락트산 박테리아에 대해서는 기술된 바가 없다. 조성물로서인지 또는 다른 것으로서인지에 관계없이, 바람직한 락트산 박테리아의 적용은 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 숙주 세포의 결합 및 침입을 방지한다는 것 역시 밝혀졌다. 이의 원인은 지금까지 알려지지 않고 있어서, 추가적인 실험에 의해 확인되어야 한다.
바람직한 미생물, 특히 락트산 박테리아의 또 다른 놀라운 장점은 그것이 예방적으로도 사용될 수 있다는 것이다. 이는 락트산 박테리아 및/또는 그를 함유하는 조성물이 그에 의해 구강 및 인후의 점막 또는 자생 균총을 손상시키지 않으면서도 예방적으로 (바람직하게는 로젠지 또는 봉봉의 형태로) 적용될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 바람직한 실시양태에서의 피부 및/또는 점막은 바람직하게는 특히 외부로부터 내부를 구별하는 작용을 하는 인간 또는 동물 신체의 외부 기관을 지칭하는 것으로 이해된다. 본 발명에 있어서, 바람직한 실시양태에서의 피부 영역에는 점막의 구성요소가 포함된다.
스트렙토코쿠스 군의 미생물이 관련되는 인후 영역에서의 박테리아성 염증, 감염, 질환 또는 증상의 성공적인 치료에는, 피부 및 점막에 대한 락트산 박테리아의 허용성(tolerability)이 필수조건 중 하나이다. 바람직한 조성물은 특히 로젠지, 봉봉 또는 코팅된 환제, 주스 또는 시럽, 린스, 스프레이 또는 에어로졸 형태의 프로바이오틱으로 도입되어 선도 병원성 미생물의 형성 및 숙주 세포에 대한 그의 결합을 억제하고, 해당 병원체에 결합하여 응집체로서 그것을 제거하거나, 및/또는 그것을 억제하고/거나 사멸시킴으로써 그 수를 감소시켜야 한다.
본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 봉봉, 로젠지 또는 코팅된 환제로 사용된다. 먼저, 봉봉, 로젠지 또는 코팅된 환제로서의 제제는 대부분의 경우 좋은 맛을 가지게 되는 처방 (당, 당 대체물, 향미제의 첨가 포함)을 가능케 함으로써, 환자 및 소비자 사이에 커다란 호응을 얻게 된다. 두 번째로, 로젠지를 빨 때 함께 분비되는 타액이 점막을 습윤화함으로써, 인후통 또는 편도염 증상이 존재하는 경우 약간의 방출이 이루어진다. 봉봉, 로젠지 또는 코팅된 환제를 빨 때, 본 발명에 따른 조성물은 장기간의 시간에 걸쳐 천천히 방출되는데, 이는 적용 측면에서 유리하다. 또한, 봉봉, 로젠지 또는 코팅된 환제용 조성물에 본 발명에 따른 조성물의 도입을 실행하는 것은 기술적으로 매우 용이하다. 이와 관련하여, 바람직한 능력, 특히 처리 후에도 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 상호응집을 여전히 가지게 되는 방식으로, 체온에서 활성을 가지게 되지만 70 내지 90℃에서의 열처리에서도 생존할 수 있는 가용 미생물을 제조하는 것이 가능하였다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 이는 특히 유리한데, 봉봉의 제조시에는 종종 70℃의 온도가 달성되며, 그에 따라 봉봉의 제조 후에도 미생물이 여전히 상호응집되는 능력을 갖는 봉봉 형태의 미생물 또는 조성물을 사용하는 데에 유리하기 때문이다. 이와 같은 유형은 선행 기술에서는 알려져 있지 않다. 따라서, 바람직한 미생물은 공지의 미생물로부터 그것을 명확히 구별하는 능력을 가진다. 또한, 미생물을 포함하는 조성물을 갖는 봉봉이 구강에서 더욱 천천히 용해됨으로써, 봉봉이 더 우수하고 더 오래-지속되는 효과를 달성하게 된다는 것은 놀라운 것이었다. 이는 본 발명자들에게는 완전히 놀라운 것이었다. 또한, 실험은 특히 느린 미생물 방출을 통하여, 구강 내의 본질적으로 모든 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포가 상호응집될 수 있다는 것을 보였다.
업계 숙련자라면, "체온"이라는 용어하에 포괄되는 것이 무엇이며 그것이 어떻게 측정될 수 있는지에 대해 알고 있다. 여기에서 체온은 본질적으로 인간 및 동물과 관련된다. 업계 숙련자라면, "봉봉"이라는 용어와도 익숙하며, 봉봉의 성분 또는 제조 방법을 탐색하기 위한 표준 문헌에 대해서도 알고 있다. 본 발명이 단순한 봉봉으로 제한되는 것은 아니며, 그 대신 본 발명은 기본적으로 업계 숙련자에게 익숙한 모든 봉봉과 조합될 수 있다. 봉봉 및 그의 제조에 대해서는 무료로 접근가능한 해당 기술 문헌들, 예를 들어 문헌 [Candy Ind. 27, 161 (1996)]; [H. Hoffmann, W. Mauch, W. Untze, Sugar and Sugar Products, 2nd edition, Behr's: Hamburg (2002)]; [R. Lees, B. Jackson, Sugar Confectionery and Chocolate Manufacture, Leonard Hill Books: Plymouth (1999)]; [Federal Association of the German Confectionery Industry (BDSI), editors, Confectioner's Handbook, Molberg, Bonn (2001)]; [Handbook for the Food Chemist, Food Leader, Thieme, Stuttgart (1995)]에서 업계 숙련자에게 개시되어 있다.
봉봉은 다양한 형상, 맛의 종류, 농밀도 및 색상으로 바람직할 수 있다. 그것은 보통 한입-크기의 조각이다. 봉봉은 입방형 또는 충전형, 원형, 계란형, 주사위형 또는 정육면체-형상일 수 있다. 잔류수 함량에 따라, 그것은 경질 (경질 캐러멜) 또는 연질 및 츄어블 (연질 캐러멜)이다. 첨가제에 따라, 특히 인후 봉봉 및 기침용 봉봉, 과일, 캐러멜 및 리프레싱 봉봉 사이에 구별이 이루어진다. 봉봉의 효과 및 맛은 허브 추출물, 정유 (예컨대 유칼립투스) 및 활성 성분 예컨대 멘톨을 사용하는 것에 의해 결정될 수 있다. 과일 봉봉의 경우에는, 향미 물질 및 산 성분이 개별적인 맛을 생성시킬 수 있다. 봉봉에 색상을 부여하기 위하여, 자연 과일 및 식물 추출물 또는 식품용 염료가 첨가될 수도 있다. 캐러멜 봉봉은 특히 농축 우유, 버터 및 크림과 같은 유제품으로부터 제조된다. 가향 및 다양한 첨가제들을 첨가하는 것에 의해, 너트, 아몬드, 꿀, 코코아, 코코넛 등과 같은 맛 변종들이 가능하다. 또한, 츄어블 봉봉, 커트(cut), 엠보싱형, 캐스트(cast) 또는 라미네이트형 봉봉이 바람직하다. 유리한 봉봉에는 다양한 성분들, 예를 들어 비타민, 아미노산, 오일, 허브, 지방, 다양한 탄수화물 또는 당 대체물, 맛 강화제 및/또는 에멀젼화제가 제공될 수 있다. 경질 봉봉은 특히 수크로스 및 글루코스를 함유하며, 바람직하게는 향기를 부여하고 맛을 부여하는 착색 물질, 그리고 봉봉의 특성에 영향을 주는 물질을 사용하여 제조된다. 1-3%의 낮은 잔류수 함량으로 인하여, 경질 캐러멜은 딱딱하고 종종 광택이 나는 농밀도를 가진다. 경질 캐러멜은 감미제 및 당 대체물을 사용하는 것에 의해 당 없이 제조될 수도 있다.
연질 캐러멜은 구체적으로 경질 캐러멜과는 달리 씹을 수 있는 농밀도를 가지며, 수크로스, 기타 유형의 당, 감미제 및/또는 당 알콜은 물론, 글루코스 시럽인 주 성분으로부터 배치식 또는 연속식 조리에 의해 6-10%의 수분 함량으로 제조되는 과자류 제품 군을 나타내는데, 바람직하게는 첨가제로서 지방, 우유 성분, 증점제, 에멀젼화제, 향미 및 맛-부여 물질도 함유한다. 그것은 또한 충전(filling)을 동반하여, 그리고 그것 없이 매우 다양한 형상 및 색상으로 제조될 수 있다.
또한, 봉봉이 다챔버 시스템을 가짐으로써, 한 챔버에는 비타민 또는 기타 보조인자들이 존재하고 하나 이상의 추가적인 챔버에는 바람직한 미생물 또는 조성물이 존재하는 경우, 유리한 것으로 입증되었다. 이와 같은 챔버 시스템을 통하게 되면, 미생물이 최적의 시점에, 그리고 임의로 상이한 투여량으로 방출되는 것을 보장하는 것이 가능하다. 비타민 또는 기타 보조인자들은 미생물의 활성을 촉진할 수도 있다. 예를 들어 놀랍게도, 덩굴월귤이 바이오필름의 발생을 방지하는 효과를 가지고 있는 것으로 밝혀졌는데, 이에 따라 그것은 바람직한 미생물에 대한 최적의 보충제가 된다. 시험은 덩굴월귤의 성분 또는 용액이 함께 존재하는 경우, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 상호응집이 50% 더 효율적임을 보여주었다.
시험은 바람직한 락트산 박테리아, 특히 락토바실루스 세포가 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포와 접촉될 시 상호응집체를 형성한다는 것을 보여주었다. 상호응집체의 형성을 통하여, 스트렙토코쿠스 피오게네스는 특히 인후 영역 세포에서의 콜로니화 및 침입이 방지된다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포, 특히 그의 세포 표면이 락트산 박테리아, 특히 락토바실루스 세포에 의해 차단됨으로써, 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포 대부분은 더 이상 피부 및 점막의 상피 세포에 결합할 수 없게 된다. 염증 반응은 피부 및 점막의 상피 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합이 저지됨으로써 방지된다. 매우 초기 단계에 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집하게 되며 그에 따라 개시시부터 상피세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지하게 되는 미생물을 공급하는 것이 가능하게 되었다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 이는 완전히 놀라운 것으로써, 선행 기술에서는 알려져 있지 않다. 따라서, 바람직한 미생물은 이미 구강에서 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집될 수 있다. 또한, 바람직한 미생물이 타액에서 나타나는 효소 및 기타 인자들에 의해 억제되지 않는다는 것, 즉 그의 스트렙토코쿠스 피오게네스 상호응집 능력이 억제되지 않는다는 것은 완전히 놀라운 것이었다.
자연상의 타액은 특히 박테리아에 대한 방어물로 작용하며 특히 그람-양성 박테리아의 세포 벽을 직접적으로 공격할 수 있는 리소자임과 같은 항미생물 물질을 함유한다. 그러나, 바람직한 미생물은 자연 타액의 존재 및 거기에 함유되어 있는 항미생물 물질에도 불구하고 여전히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 특이적인 상호응집을 할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이는 완전히 놀라운 것으로써, 선행 기술 대비 상당한 장점이다.
본 발명에 있어서, 프로바이오틱 미생물은 인간 및/또는 동물 신체에 대하여 유리한 효과를 갖는 세포를 포함한다. 바람직한 조성물은 프로바이오틱 조성물로서 사용되며, 인간 및/또는 동물 신체에 대하여 유리한 효과를 갖는 락트산 박테리아를 함유한다. 유리한 효과는 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 경부 및 인후 영역에서의 미생물 부하 감소에 있을 수 있다. 특히 자생 균총 중 스트렙토코쿠스 피오게네스와 같은 원치 않는 미생물이 프로바이오틱 미생물과 원치 않는 미생물의 간접적인 상호작용, 특히 프로바이오틱 미생물의 발현 생성물에 의한 원치 않는 미생물 대사의 억제를 기반으로 하는 간접적인 상호작용에 의해 억제될 수 있다. 시험은 바람직한 락트산 박테리아와의 상호응집 후에는 병원성인 스트렙토코쿠스 피오게네스 미생물이 더이상 어떠한 성장도 나타내지 않으며, 즉 세포괴(cell mass)의 더 이상의 복제가 존재하지 않으며, 그 대신 특히 세포가 차단되고/거나 사멸된다는 것을 보여주었다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 락트산 박테리아의 생물학적, 화학적 또는 물리적 처리에 의해 제조되며, 놀랍게도 처리 후에도 유리한 특성들을 나타내는, 본원에서 기술되는 락트산 박테리아의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 유사체 또는 단편에 관한 것이다. 락트산 박테리아는 유리하게는 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 헬베티쿠스, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 쿠르바투스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 레우테리, 락토바실루스 비리데센스, 비피도박테리움 비피둠, 락토바실루스 인글루비에이를 포함하는 군에서 선택되며, 바람직하게는 독일 미생물 및 세포 배양 협회에 기탁되어 있으며 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989, DSM 25973의 번호를 갖는 미생물을 포함하는 군에서 선택된다.
또한, 락트산 박테리아, 그의 단편, 유도체, 돌연변이체, 유사체 또는 조합이 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 사멸 후에도 여전히 유리한 특성들을 가지게 된다는 것은 놀라운 것이었다. 예를 들어, 바람직한 균주, 즉 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973은 70℃에서의 20분 동안의 열처리 또는 초음파를 사용한 처리 후에도 병원체에 대한 상호응집을 생성하며, 피브로넥틴에 대한 결합을 방지하고, 또한 공생 미생물에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않는다. 따라서, 조성물의 바람직한 실시양태에서는, 상기 락트산 박테리아, 그의 단편, 유도체, 돌연변이체, 유사체 또는 조합이 유리하게도 사멸된 형태로 존재할 수도 있다. 이와 같은 방식으로, 조성물의 안정성 및 유용성이 실질적으로 연장될 수 있다. 또한, 살아있는 미생물의 사용을 허용하지 않으며, 열적 사멸 또는 동결건조에 의해, 특히 생물학적, 화학적 또는 물리적 사멸 방법에 의해 제조되고, 유사체 또는 단편이 사멸 또는 분무 건조후에도 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 능력을 여전히 가지며, 상기 미생물은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에서 선택되는, 추가적인 적용 분야에서 상기 조성물이 사용된다. 락트산 박테리아가 생존 또는 비생존 (사멸) 형태로 조성물 중에 존재하고, 그럼에도 불구하고 여전히 병원성 미생물에 특이적으로 결합하고/거나 그와 상호응집된다는 것은 완전히 놀라운 것이었다.
또한, 본 발명은 상기에 표시한 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 능력을 가지고 있는 본 발명에 따른 미생물 또는 그의 유사체 또는 단편 또는 유도체를 함유하며, 특히 식품, 식품 첨가제, 동물 사료 또는 음료로 사용되는 조성물에 관한 것이기도 하다. 바람직한 조성물은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에 속하는 1종 이상의 병원성 미생물에 대한 특이적인 결합 및/또는 상호응집 능력을 가지고 있는 본 발명에 따른 락트산 박테리아, 또는 그의 유사체, 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 함유하며, 그에 따라 감기의 치료 또는 예방에 사용된다.
본 발명에 따른 바람직한 미생물은 락트산 박테리아 속, 즉 글루코스의 발효에 의해 락트산을 생성하는 그람-양성 박테리아를 나타낸다. 본 발명에 따른 미생물은 한편으로는 그것이 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물에 대한 특이적인 결합, 즉 상호응집 능력을 가진다는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 결합은 본 발명에 따른 미생물과 특이적으로 결합된 병원성 미생물의 응집체 형성으로 이어진다. 응집체의 형성으로 인하여, 후자, 즉 병원성 미생물은 예를 들어 과거에 알려져 있던 수단으로는 불가능했던 표적화되고 용이한 절차에서의 그의 헹굼 제거에 의해 기계적으로 제거될 수 있다.
본 발명은 물론 보통 미생물학 및 위생, 특히 인간 미생물학 및 신체 위생 분야에 있어서, "특이적인 결합" 또는 "상호응집"이라는 용어는 유전적으로 상이한 유형의 세포에 속하는 세포들의 상호 인식 및 부착인 것으로 이해된다. 본 발명에 있어서, 상호응집은 구체적으로 부착, 상호작용, 결합, 특이적인 결합, 친화성 또는 상호작용으로 이해되며, 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스와 응집물을 형성하는 바람직한 미생물의 능력을 특징으로 한다. 여기서 박테리아들은 해당 세포 표면상에서, 세포들 사이의 부착에 사용되는 다른 세포 유형에의 부착을 위한 수용체 및 구조를 발현한다. 이와 같은 부착은 병원성은 물론 공생 미생물과의 콜로니화에서 뛰어난 역할을 하기 때문에, 부착시의 개재는 광범위한 결과를 초래할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물이 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에 속하는 1종 이상의 미생물과 특이적으로 결합하는 능력, 특히 상호응집의 능력을 가지고 있다는 사실로 인하여, 본 발명에 따른 미생물과 병원성 미생물은 응집한다. 생성되는 상호응집체는 예를 들어 표면, 피부, 조직 및/또는 기타 다른 콜로니화 부위 또는 저장소를 헹구는 것에 의해 용이하게 제거될 수 있기 때문에, 병원성 미생물의 수가 확실하게 감소된다. 또한, 병원성 미생물의 표면 구조를 차단함으로써, 표면, 피부, 조직 및/또는 기타 콜로니화 부위 또는 저장소에 대한 최초 및/또는 보충되는 부착이 방지 및/또는 감소된다. 세포가 서로 결합하여 응집체를 형성하는 경우, 이와 같은 과정은 구체적으로 응집으로 지칭된다. 이와 같은 응집체의 형성에 1종의 세포 종만이 관련되는 경우라면, 그것은 자가응집 또는 자체응집으로 지칭된다. 2종 이상의 상이한 세포 종들이 응집체의 형성에 관련되는 경우, 그 과정은 특히 상호응집으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, "1종 이상 병원성 미생물에 대한 특이적인 결합"은 구체적으로 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에 속하는 1종 이상 박테리아에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 미생물의 특성을 지칭하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 미생물의 바람직한 실시양태에서 있어서, 그것은 또한 1종 이상 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 능력이 생물학적, 화학적 또는 물리적 처리, 예를 들어 최소 70℃에서의 열처리 후에도 존재한다는 것을 특징으로 한다. 다른 말로 하면, 병원성 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스와 특이적으로 상호작용하거나 그에 결합하는 능력이 영향을 받지 않으며, 그에 따라 결합 또는 상호작용이 확립될 수 있기 때문에, 바람직한 락트산 박테리아는 바람직하게도 바람직한 조성물 중에 사멸된 형태로 존재할 수 있다.
상기 언급된 열처리 및/또는 "열처리에 대한 내성" 또는 "열 안정성"은 70℃ 이상 승온에서의 30분 이상 소정 길이의 시간 기간 후에도 여전히 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물과 특이적인 결합에 진입할 수 있는, 박테리아의 특성을 지칭하는 것으로 이해된다. 죽거나 사멸된 락트산 박테리아 세포는 특히 유리할 수 있는데, 락트산 박테리아 세포가 어떠한 대사 활성도 격발할 수 없기 때문이다. 본 발명에 있어서, "죽거나 사멸된" 형태는 구체적으로 해당 형태의 본 발명에 따른 미생물이 더 이상 분열할 수 없는 것, 예를 들어 그것이 살아있는 생명체용 염료(live living dye)에 의해 염색될 수 없으며, 대사적으로 활성이 아니고, 예를 들어 대사 생성물의 어떠한 DNA 복제 또는 단백질 생합성 또는 분비도 나타내지 않는다는 것을 특징으로 한다.
상기한 특성 이외에도, 락트산 박테리아의 또 다른 바람직한 특성에 따라, 본 발명에 따른 미생물은 열적 안정성, 즉 스트렙토코쿠스 피오게네스 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성 미생물에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 할 수도 있는데, 바람직하게는 대략 60℃ 이상, 더욱 바람직하게는 65℃ 이상, 더욱 더 바람직하게는 70℃ 이상의 고온에서 20분 이상, 바람직하게는 25분, 더욱 바람직하게는 대략 30분 이상의 기간 동안의 처리를 생존하면서도 상기 언급된 병원성 미생물에 대한 그의 특이적인 결합의 상호응집 능력과 관련하여 변화되지 않고 유지될 수 있다.
조성물의 바람직한 실시양태에서는, 그것이 상호응집 및/또는 피브로넥틴에 대한 결합의 방지 능력을 여전히 가지고 있다는 전제하에, 살아있는 것 또는 사멸된 것이거나, 또는 해당 박테리아의 일부 및 단편, 예를 들어 효소 또는 기계적 절단 생성물 (예컨대 프렌치 프레스(French press) 등) 또는 대사 생성물인 락트산 박테리아가 바람직하다. 락트산 박테리아가 캡슐화, 분무-건조 및/또는 동결건조 형태로 사용되는 것, 즉 캡슐화되거나, 분무-건조되거나 또는 동결건조된 형태로 바람직한 조성물 중에 존재하는 것 역시 바람직하다. 또한, 락트산 박테리아는 소화된 세포의 형태로 사용될 경우 유리할 수 있다.
또한, 병원성 미생물에 대하여 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 능력은 대략 3 내지 8의 pH에서도 지속될 경우 바람직하다. 이는 락트산 박테리아가 3 내지 8의 pH를 갖는 배지 중에 존재하면서도 여전히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합하는 그의 능력을 가지고 있을 수 있다는 것을 의미한다. 바람직한 락트산 박테리아는 유리하게는 넓은 pH 범위에서 사용되거나, 및/또는 바람직한 범위에서 바람직한 특성을 가질 수 있다. 따라서, 바람직한 락트산 박테리아는 상이한 신체 영역에서 범용으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 락트산 박테리아는 놀랍게도 특히 대략 25℃-42℃의 넓은 온도 범위에서 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 상호응집 특성을 나타내었다. 따라서, "약" 또는 "대략"과 같은 용어를 특징으로 하는 여기에서는 물론 본 발명에서 주어지는 범위에 대한 모든 언급에서, "약" 또는 "대략"과 같은 표현과 함께 정확한 숫자 범위가 표시되어야 할 필요는 없으며, 그 대신 표시되는 숫자와 관련한 약간의 상향 또는 하향 편차도 역시 본 발명의 영역에 속한다는 것이 업계 숙련자에게는 명백할 것이다. 열거되어 있는 병원성 미생물에 대한 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 결합은 바람직하게는 병원성 미생물의 성장 억제를 초래한다.
병원성 미생물과 본 발명에 따른 락트산 박테리아를 결합시키는 것에 의해, 응집체가 형성되고, 그것이 구체적으로 10초 동안 바람직하게는 300 g의 원심력으로 원심분리된 다음, 특히 교반 없이 실온에서 바람직하게는 10분의 인큐베이션 후, 침강물로서 존재할 수 있다는 것은 놀라운 것이었다.
또 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 따른 락트산 박테리아는 스트렙토코쿠스 살리바리우스와 같은 공생 구인두 균총에 결합하는 능력은 가지지 않는데, 여기서 스트렙토코쿠스 살리바리우스는 구체적으로 피부 균총 중 크게 눈에 띄지는 않는 공생체이다. 피부에 또는 피부상에 존재하는 다양한 미생물들의 상호작용에 있어서, 이와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 종은 많은 포유동물의 건강한 피부 균총에 존재하며, - 적어도 건강한 피부에서는 - 그들과 미생물 평형 상태에 있다. 표적화된 목적의 신체 위생에 있어서, 예를 들어 응집으로 인한 이와 같은 박테리아에 대한 영향, 그리고 그에 따른 존재할 수도 있는 다른 미생물에 대한 영향은 본 발명의 영역에서는 바람직하지 않다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 바람직한 실시양태의 락트산 박테리아가 그의 유사체, 단편, 돌연변이체, 유도체 또는 조합으로 구성되며, 바람직하게는 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는, 락트산 박테리아, 그의 유사체, 단편 또는 유도체에 관한 것이다: a) 열 안정성, 또는 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 처리 후의 안정성, 또는 b) 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 숙주 세포의 부착을 억제하는 능력. 본 발명에 따른 락트산 박테리아가 특히 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 처리 후에도 여전히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합할 수 있다는 것은 완전히 놀라운 것이었다.
본 발명에 따른 락트산 박테리아의 또 다른 특성은 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 숙주 세포에 대한 결합을 억제하는 능력으로써, 여기서 이미 플랑크톤 형태로 존재하는 해당 세포는 특이적으로 상호응집된 다음, 응집체로 세척 제거된다. 이와 같은 상호응집으로 인하여, 해당 병원성 박테리아는 더 이상 생물학적 표면을 콜로니화하고 침입할 수 없으며, 그에 따라 또한 어떠한 질환도 야기할 수 없다.
따라서, 본 발명에 있어서, "스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 숙주 세포 (구인두 세포)에 대한 결합을 억제하는 것"이라는 구는 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호작용하는, 즉 거기에 결합하거나, 아니면 그것이 더 이상 구인두 세포에 결합할 수 없도록 하는 방식으로 그에 영향을 주는, 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 특성을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명에 따른 미생물은 언급된 특성들, 즉 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리에 대한 내성, 내열성, 특이적인 결합의 능력, 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 상호응집 중 하나 이상을 가질 수 있다. 바람직한 특성 조합에는 예를 들어 2개 또는 3개의 특성들, 즉 예를 들어 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리에 대한 내성, 내열성, 그리고 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합하는 능력, 또는 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리에 대한 내성, 내열성, 그리고 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 구인두 세포에 대한 결합의 억제가 포함될 것이다.
이미 언급된 바와 같이, 본 건에서는 "락트산 박테리아 속에 속하는 미생물"이라는 표현 역시 본원에서 기술되는 본 발명에 따른 미생물의 특색 및/또는 특징 또는 특성들을 여전히 가지고 있는 그의 유도체, 돌연변이체, 유사체 또는 단편을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 락트산 박테리아는 바람직하게는 락토바실루스 파라카세이 아종 파라카세이, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 크리스파투스 및 락토바실루스 인글루비에이 종의 박테리아이다.
따라서, 락트산 박테리아 속에 속하는 상기 언급된 미생물의 "돌연변이체 또는 유도체", 특히 본 특허 출원의 일부로서 DSMZ 협회에 기탁된 락토바실루스 종의 돌연변이체 또는 유도체는 본 건의 발명에 따른 락트산 박테리아, 특히 DSMZ에 기탁된 것과 동일한 균주에 대하여 청구되는 것과 동일한 특징들을 갖는데; 이는 적어도 스트렙토코쿠스 피오게네스의 군에서 선택되는 1종 이상 병원성 미생물에 대한 특이적인 결합인 상호응집 능력을 지칭하게 된다. 또한, 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 것이 바람직하다: (i) 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 처리, 특히 70℃ 초과에서의 30분 이상 동안의 열처리에 대한 특이적인 결합 능력의 내성; (ii) 스트렙토코쿠스 살리바리우스에 대한 결합 없음; (iii) 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 특이적인 결합 능력; (iv) 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 구인두 세포에 대한 결합을 억제하는 능력; (v) pH 3-8에서의 특이적인 결합의 존재; (vi) 자연 타액에서의 특이적인 결합 능력. 해당하는 바람직한 유도체들은 예를 들어 유전 공학에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, "유전 공학에 의해 제조되는"이라는 용어에는 구체적으로 재조합 DNA 기술에 의해 유전적 변형이 유도될 수 있도록 함으로써 유전자가 변형될 수 있도록 하는, 시험관내 및 생체내 핵산 변형용으로 유전 공학 분야에서 업계 숙련자에게 익숙한 모든 방법이 포함된다.
따라서, 본 발명에는 특히 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 특성들을 여전히 가지고 있는 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 단편도 포함된다. 본 발명에 있어서, "단편"은 구체적으로 본 발명에 따른 미생물의 세포 구성요소, 바람직하게는 세포 막의 일부이다. 업계 숙련자라면, 선행 기술로부터 세포 막 분획을 수득하는 방법과 적당히 친숙할 것이다.
본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 단리 또는 정제된 형태로 존재하며, 여기서 "단리된"이라는 용어는 구체적으로 락트산 박테리아가 그의 배양 배지 - 예를 들어 그의 자연 배지 포함 -로부터 유래함을 의미한다. "정제된"이라는 용어가 절대적인 정제로 제한되는 것은 아니다.
살아있는 형태의 본 발명에 따른 미생물 이외에, 본 발명에 따른 미생물의 사멸된 형태 역시 본 발명의 영역 내에 포함되는 것이 바람직하다. 적합한 사멸 방법 (예컨대 생물학적, 화학적 또는 물리적 사멸 방법)에 대해서는 업계 숙련자에게 충분히 익숙하다. 그러나, 본 건에서는, 미생물이 동결건조된 형태로 사용될 수도 있다. 동결건조된 세포는 액체 또는 고체 배지에서의 적합한 배양 후에 다시 성장하도록 만들 수 있다. 이는 완전히 놀라운 것으로써, 신규하고 독창적인 분야와 관련된다. 선행 기술에는 예를 들어 포자를 함유하는 표면 세정용 용액이 포함되는데, 여기에서는 포자가 해당하는 기질과 접촉되었을 때 박테리아가 재활성화된다. 바람직한 미생물 및 조성물의 경우에는, 이와 같은 유형이 필요하지 않다. 바람직한 미생물은 또한 활성이기도 한데, 즉 그것은 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집되며, 또한 상기한 바와 같은 다른 특성들도 가지지만, 어떠한 대사 활성도 더 이상 가지지 않으며, 미생물학의 업계 숙련자에 의해 "사멸된" 것으로 지칭되게 된다. 따라서, 미생물이 더 이상 성장, 분열, 복제 또는 대사 생성물 분비를 할 수 없게 됨으로써, 그의 사용 범위가 크게 확대된다.
본 건에서 "사멸된" 또는 "사멸 형태" 및 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "돌연변이체"라는 용어에는 본 발명에 따른 미생물의 용해물, 분획 또는 추출물도 포함되며, 여기서 상기 용해물, 분획 또는 추출물은 바람직하게는 락트산 박테리아의 특성들을 가지고, "용해물" - 은 물론 "추출물"이라는 용어 -는 특히 본 발명에 따른 미생물 세포의 수성 배지 중 용액 또는 현탁액을 지칭하는 것으로써, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등은 물론 세포 파편과 같은 거대분자들을 포함한다. 용해물에는 바람직하게는 세포 벽 또는 세포 벽 구성요소들도 포함된다. 용해물을 제조하는 방법에 대해서는 업계 숙련자에게 충분히 잘 알려져 있는데, 예를 들어 "프렌치 프레스" 또는 효소 용해, 유리 비드 또는 철제 비드를 사용하는 볼 밀의 사용이 포함된다. 세포는 효소적, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 파손 개방될 수 있다. 효소적 세포 용해의 예에는 개별 효소는 물론, 효소 칵테일 예컨대 프로테아제, 프로테이나제 K, 리파제, 글리코시다제가 포함될 수 있으며; 화학적 용해는 이온운반체, 세제 예컨대 SDS, 산 또는 염기에 의해 유도될 수 있고; 물리적 방법은 또한 프렌치 프레스와 같은 고압을 사용하는 것, 삼투몰농도, 온도 또는 열과 냉의 교호를 사용하는 것에 의해 실행될 수 있다. 또한, 당연히, 화학적, 물리적 및 효소적 방법들이 조합될 수도 있다. 본 발명에 따른 미생물의 "사멸된 형태" 또는 "사멸 형태" 및 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "돌연변이"는 바람직하게는 상기 언급된 균주들과 동일한 특성들을 가진다. "사멸된 형태" 또는 "사멸 형태" 및 "유도체" 또는 "유사체"는 바람직하게는 더 이상 어떠한 대사 활성도 가지지 않는다. 본 발명에 따른 미생물의 유사체는 용해물 또는 단편의 일 형태이다. 본 발명에 따른 미생물의 단편은 세포의 일부, 예를 들어 세포 막, 거대분자 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등은 물론 세포 파편이다. 돌연변이체 및/또는 유전적으로 변경된 변이체 또는 유도체는 예를 들어 재조합 DNA 기술 (재조합 핵산의 클로닝, 서열분석, 형질전환)은 물론, 예컨대 자외선에 의한 물리적 돌연변이유발뿐만 아니라, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)와 같은 화학적 작용제를 통해서도 유전적으로 변경된다. 긍정적인 특성의 변경이 선택될 수 있다. 유전적으로 변경된 돌연변이체는 본 발명에 따른 미생물의 세포를 함유하며, 그의 박테리아 염색체 및/또는 플라스미드에 재조합 핵산을 보유한다. 점 돌연변이를 통한 변형 역시 어떠한 직접적인 유전적 조작도 없이 발현/전사/번역은 물론 자발적 돌연변이에 대한 효과를 유발할 수 있다. 유사체 또는 단편에는 예컨대 표면적을 증가시키는 것에 의해 본 발명에 따른 해당 특성들을 유지하고 있거나 심지어는 그것이 향상된, 본 발명에 따른 미생물의 열적으로 사멸 (사망)되거나 동결건조된 형태가 포함될 수 있다. 어떤 상황하에서는, 동결건조 (냉동 건조) 후에도 세포가 여전히 살아있다. 이러한 세포는 상이한 온도에서의 특별한 저장 과정에 의해 사멸될 수 있다. 사멸된 세포는 예를 들어 무손상이거나 파열된 세포 막을 가질 수 있으나, 어떠한 대사 활성도 가지지 않는다. 사멸된 세포를 수득하는 방법에는 예를 들어 유리 비드를 사용한 처리가 포함될 수 있는데, 여기에서는 세포와 유리 비드 사이의 전단력의 효과가 세포의 파열을 초래한다. UV 조사, 자가용해법 또는 상이한 온도에서의 특별한 저장 과정에서와 마찬가지로, 프렌치 프레스, 고-압 균질화, 볼 밀 또는 냉동-해동 과정 및 오토클레이빙과 같은 다른 물리적 방법들이 세포의 사멸을 초래하며, 또한 본 발명에 따른 미생물의 단편으로 이어진다.
락트산 박테리아 속에 속하는 미생물이 본 발명에 따른 특성들을 가지고 있는지 여부는 여기 및 하기에서 기술되는 시험들을 기반으로 예를 들어 업계 숙련자에 의해 시험 및 입증될 수 있다. 본 발명에 있어서는, "락토바실루스 세포"라는 용어가 락트산 박테리아 또는 락토바실루스를 포함하고, 락트산의 발효에 탄수화물 특히 글루코스 및 락토스를 필요로 하며 보통 엠덴-마이어홉(Embden-Meyerhof) 생합성 경로를 사용하는 미생물을 포함하는 데에 사용될 수도 있다. 락토바실루스 세포는 분류학적으로 락토박테리아세아에(Lactobacteriaceae) 과에 분류된다. 이들은 그람-양성이며, 비-포자-형성이고, 일반적으로 비이동성이다. 락토바실루스 세포는 혐기성이지만, 내기성이고, 그럼에도 불구하고 어떠한 헤민(hemin) (시트크롬, 카탈라제)도 함유하지 않는다 (문헌 [Schleifer et al., System. Appl. Microb. 18, 461-467 (1995)] 또는 [Ludwiq et al., System. Appl. Microb. 15, 487-501 (1992)]). 락토바실루스 세포 및/또는 종은 탄수화물 이용 양식을 기준으로, 특히 API 시험 (바이오메리(Biomerieux) 사)을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명에 있어서, 여기에는 특히 동종발효성 락트산 발효 또는 이종발효성 락트산 발효에 적합한 종들이 포함된다. 그와 같은 락토바실루스 세포는 바람직하게는 또한 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 헬베티쿠스, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 가쎄리, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 쿠르바투스 및 락토바실루스 플란타룸 (이들 모두는 동종발효성임), 또한 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 레우테리, 락토바실루스 비리데센스는 물론, 비피도박테리움 비피둠, 락토바실루스 인글루비에이 (이들 모두는 이종발효성임)을 포함하는 군에서 선택된다. 예로서 적합하며, 본 출원인에 의해 기탁된 락토바실루스 세포에는 하기가 포함된다: 모두 본 발명에 있어서 바람직한 락토바실루스 파라카세이 아종 파라카세이 (DSM 25972), 락토바실루스 크리스파투스 (DSM 25987, DSM 25988), 락토바실루스 플란타룸 (DSM 25989), 락토바실루스 인글루비에이 (DSM 25973).
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물은 각각 기탁 번호 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989, DSM 25973으로 브라운슈베이그의 독일 미생물 및 세포 배양 협회 (DSMZ)에 기탁되어 있는 락토바실루스 파라카세이 아종 파라카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 인글루비에이에서 선택된다. 상기 언급된 DSMZ 기탁은 특허 기탁 목적의 미생물 기탁에 대한 국제적 공인과 관련한 부다페스트 조약에 따라 수행되었다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 바람직하게는 살아있는 미생물 또는 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편은 물론, 바람직하게는 하기 중 1종 이상에서 선택되는 1종 이상의 비히클 또는 부형제를 함유하는 조성물에 관한 것이다: 화장품용으로 허용되는 비히클 또는 부형제, 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제, 또는 피부과용으로 허용되는 비히클 또는 부형제.
본 발명에 있어서, "조성물"이라는 용어에는 특히 1종 이상의 본 발명에 따른 미생물, 또는 그의 단편, 유도체, 유사체 또는 돌연변이체는 물론, 다른 임의의 성분 예컨대 비히클 또는 부형제, 또는 임의로 다른 활성 성분 및 염을 함유하는 조성물만이 포함되는 것으로 이해된다. 화장품용으로, 제약상 또는 피부과용으로 허용되는 첨가제, 비히클 또는 부형제는 일반적으로 화장품, 제약 또는 치과 분야에서 활성 성분 또는 조성물, 즉 본 건에서는 1종 이상의 미생물, 그의 유사체 또는 유도체 또는 돌연변이체 또는 단편을 화장품용으로 또는 제약상 사용, 투여 또는 효과적으로 적용하기 위한 소정의 물질인 것으로 이해된다.
본 발명 및 청구범위에 있어서, "점막(mucosa)" 또는 "점막(mucous membrane)"이라는 용어는 중공 기관에 라이닝되어 샘 분비에 의해 습윤성으로 유지하는 내부 층을 지칭하는 것으로 이해된다. 여기에서는 특히 구강 및 코 점막, 결합 조직, 위장관로의 점막, 및 화학적 영역의 점막을 지칭한다.
본 상세한 설명 및 특허 청구범위의 문맥에서, "염증성 질환"은 피부, 점막 또는 구강과 관련된 급성, 아급성, 만성 이완성 또는 만성 지속성인 질환 상태를 포함하는 질환을 지칭하는 것으로 이해된다. 염증성 질환은 임상적으로 발적, 부기, 통증, 소양증, 삼출, 배지큘레이션(vasiculation), 과다각화증, 과다비늘화(squamation), 짓무름, 궤양 및 기타 물질 결함은 물론 딱지, 소포 및 기타 발진을 특징으로 한다. 조직학적으로, 염증 세포는 진피 및/또는 표피에서 발견될 수 있다. 본 발명 및 특허 청구범위에 있어서, "염증성 질환" 또는 "염증 상태"는 구체적으로 예를 들어 (전적인 것은 아님) 습진, 아토피성 습진, 지루성 습진, 알레르기성 또는 독성 접촉 습진, 건선 및 기타 과다각화성 염증, 급성 및 만성 상처, 양진성 피부 질환은 물론, 희귀 염증 예컨대 홍색 편평 태선, 육아종성 및 유사건선성 피부 변화는 물론 피부 징후를 동반한 대규모 군의 자가면역 질환들과 같은 질환 및 이상들을 지칭하는 것으로 이해된다. 본 상세한 설명 및 청구범위에서의 "예방(prophylaxis)" 또는 "예방(prevention)"이라는 용어에는 모든 유형의 예방, 즉 건강한 사용자 및/또는 환자의 예방적 치료는 물론, 피부, 점막 또는 구강의 미생물 질환에 걸리는 경향이 있는 사용자 및/또는 환자 또는 염증성 질환에 걸리는 경향이 있는 사용자 및/또는 환자 (소위 "소인"을 가지고 있는 사람들)의 예방적 치료 모두가 포함되는 것으로 이해된다. 또한, 예방에는 이미 피부, 점막 또는 구강의 미생물 질환 또는 염증성 질환에 한번 걸린 바 있으며, 예를 들어 본 상세한 설명 및 청구범위에서 제공되는 치료와 같은 성공적인 치료에 의해 어느 땐가 질환을 극복한 바 있는 사용자 및/또는 환자의 예방적 치료 (소위 "재발 예방")가 포함되는 것으로 이해되기도 한다. 또한, 본 상세한 설명 및 청구범위에 있어서, 예방에는 또한 화장품용 치료는 물론, 자극을 발생시키는 경향이 있는 피부의 관리 및 회복 치료가 포함되는 것으로 이해된다.
조성물은 본 발명에 따른 미생물들 중 1종, 또는 그의 유사체, 돌연변이체, 유도체 또는 단편만을 함유할 수 있는 것이 아니라, 본 발명에 따른 미생물들의 혼합물, 또는 유사체, 유도체, 돌연변이체 또는 단편들의 혼합물, 또는 본 발명에 따른 미생물과 그의 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 유사체들의 혼합물도 함유할 수 있는 것이 바람직하다.
조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 또는 점성 형태 또는 에어로졸일 수 있으며, 예를 들어 분말, 정제, 용액, 과립, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 페이스트, 겔, 스프레이 등의 형태로, 즉 투여에 적합한 어떠한 형태로도 사용될 수 있다. 조성물이 추가적인 프로바이오틱스, 방부제 또는 기타 항박테리아 물질, 그리고 바람직하기는 하나 임의로 당류 및 보존제, 향미제, 감미제, 비타민, 무기질, 방향제 등을 포함하는 경우 역시 바람직하다. EP 2 133 414 A1호에 바람직한 조성물에 사용될 수 있는 수많은 성분들이 열거되어 있다. 이 문헌을 명시적으로 참조한다. 또한, 바람직한 조성물에는 충전제, 유동 조절제, 유변물성 개질제, 연화제, 안정화제 또는 반응성으로 가교결합되는 단량체, 예를 들어 메타크릴레이트가 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 조성물은 EDTA, 마그네슘, 칼슘, SDS 또는 이들의 염 또는 유사 염과 같은 물질들을 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 물질이 먼저 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 바이오필름의 형성을 억제할 뿐만 아니라 바람직한 미생물의 상호응집 능력을 촉진하기도 한다는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 본 발명에 따른 조성물은 특히 신체 위생, 치료 및 예방에서의 투여에 사용되며, 1종 이상의 본 발명에 따른 미생물 또는 그의 유도체, 돌연변이체, 단편 또는 유사체를 함유한다.
조성물은 특히 프로바이오틱으로서, 즉 경구로 섭취될 수 있으며 프로바이오틱을 섭취하는 사람 및/또는 그것이 투여되는 사람에 대한 건강-증진 효과를 갖는 살아있는 미생물을 함유하는 제제로서 사용되는 것이 바람직하다. 그와 같은 제제는 식품 또는 식품 첨가제, 또는 동물 사료 또는 사료 첨가제 또는 약제일 수 있다. 본 발명에 있어서, 조성물은 모든 상업용 동물 및 가정용 동물, 즉 인간을 제외한 개, 고양이, 말, 낙타, 매 등에도 사용될 수 있다. 이를 달성하기 위하여, 미생물 및/또는 그를 함유하는 조성물은 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 츄어블 본즈, 츄 스틱, 동물 트리트(treat), 동물 사료, 펠렛, 비터블(bitable) 및 츄어블 물품 또는 동물용 완구 등에서, 또는 거기에 상기 조성물을 적용하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 미생물 또는 조성물은 동물 및 인간에서 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기되는 인후 영역 박테리아 감염의 치료 및/또는 예방에 사용되는 경우, 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물이 사용되는 원래의 투약 및 투여는 구체적인 용도 및 구체적인 환자 - 특히 연령, 체중, 일반적인 상대 등 -에 따라 달라지게 되는데, 해당 조성물의 사용을 시도하게 되는 업계 숙련자의 능력 및 평가의 영역에 속한다.
본 발명에 따른 조성물은 화장품, 의약품 또는 제약 제품일 수 있다. 조성물은 바람직하게는 0.001 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.005 중량% 내지 10 중량%, 특히 바람직하게는 0.01 중량% 내지 5 중량%의 양으로 락트산 박테리아를 함유한다. 구체적으로 0.001 중량% 내지 20 중량% 양의 사용이 더 긴 시간 기간 동안 분해가 가용하도록 하는, 즉 안정하게 유지되도록 하게 되는 것은 완전히 놀라운 것이었다. 0.005 중량% 내지 10 중량%의 양으로 락트산 박테리아가 사용될 경우, 이는 놀랍게도 조성물의 유변학적 특성에 긍정적인 효과를 초래하며, 조성물이 더 낮은 점도를 가지도록 함으로써, 피부상에 더 잘 분산되도록 하거나, 구강에 더 용이하게 도입되도록 한다. 0.01 중량% 내지 5 중량% 양의 락트산 박테리아 사용은 놀랍게도 조성물의 구성요소들을 서로 더 잘 결합하도록 하였으며, 작용 시간이 감소됨으로써 다시 제조 비용의 감소로 이어지는 균질 조성물의 공급 가능성을 초래하였다. 그러나, 특별한 적용분야에서는 여기에서 열거된 것과 상이한 다른 양이 사용될 수도 있다는 것은 자명하다. 본 발명에 따른 락트산 박테리아가 인간 타액에서 극히 높은 상호응집 활성을 가진다는 것은 특히 놀라운 것이었다. 생성되는 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 응집체는 극히 우수한 안정성을 가지며, 그에 따라 헹굼 또는 삼킴에 의해 매우 용이하게 효율적으로 제거될 수 있다.
놀랍게도, 보조인자 (EDTA, MgCl2, CaCl2, SDS)의 존재하에서는 상호응집 효율이 상당히 증가될 수 있다. 특히 EDTA가 본 발명에 따른 락트산 박테리아의 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 상호응집에 대하여 강한 긍정적 효과를 가지게 된다는 것은 완전히 예상치 못한 것이었다. 상기에서 이미 언급된 바와 같이, 바람직한 실시양태에 있어서, 조성물 및/또는 미생물은 인후 및 편도 감염의 예방 및 치료 분야에서 상기 언급된 병원성 미생물을 응집하는 데에, 즉 거기에 결합하는 데에 사용될 수 있다. 이와 같은 상호응집은 삼키는 것 또는 헹구는 것에 의해 용이하게 제거될 수 있고/거나 현탁액의 경우에는 특히 그것이 헹굼 제거될 수 있는데, 이는 유리하게도 병원체 수의 감소를 달성한다. 락트산 박테리아 및/또는 그를 함유하는 조성물은 이와 같은 목적에 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 그것은 로젠지, 인후 정제, 파스틸, 코팅된 환제, 에어로졸, 치약, 주스, 시럽으로, 또는 식품의 첨가제 및/또는 식품 보충제로서 스프레이, 가글 용액 또는 구강 세척제에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 신체 위생 및 의약품 및 예방 분야에서 사용되며 본 발명에 따른 락트산 박테리아를 함유하는 모든 생성물에 관한 것이기도 하다. 따라서, 상기한 실시양태는 포유동물에서의 치료, 요법 및 예방 분야용으로 고려된다. 따라서, 미생물 및/또는 그를 함유하는 조성물은 다양한 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 및/또는 본 발명에 따른 미생물이 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기되는 인후 증상인 건성 위축성 인두염(Pharyngitis atrophicans et sicca), 건성 인두염, 외측 협심증, 편도염의 치료 또는 예방을 위한 제약 약물을 제조하는 데에 사용되는 경우, 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 미생물 및 그를 함유하는 조성물은 상기 질환들이 유리하게 치료 및/또는 예방될 수 있는 작용제를 제공한다. 이미 나타낸 바와 같이, 미생물 및/또는 그를 함유하는 조성물은 인간 및 수의과용 의약 모두에서, 특히 개, 고양이, 말, 낙타 및 매에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 및/또는 미생물 - 또는 그의 단편, 유도체 또는 돌연변이체 -는 특히 식품 첨가제, 위생 제품으로, 및/또는 미생물을 함유하는 위생 제품으로 또는 제약 제제로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 하기의 단계들을 포함하는, 본 발명에 따른 특성들을 갖는 락토바실루스 sp. 속 미생물의 확인 및/또는 선별 방법에 관한 것이다: a) 피브로넥틴에 대한 결합을 위하여, 스트렙토코쿠스 피오게네스에서 선택된 병원성 미생물의 배치를 인큐베이션하는 단계, b) 조사될 락토바실루스 속 미생물을 첨가하고 배치를 인큐베이션함으로써, 병원성 미생물과 조사될 속의 미생물 사이에 특이적인 결합을 형성시키는 단계, c) 상청액을 제거함으로써 비결합 락토바실루스 속 미생물을 분리하는 단계, 및 d) 결합 및 응집된 락토바실루스 속 미생물과 관련하여 피브로넥틴 결합을 측정하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 또한 피브로넥틴에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합의 방지를 조사하는 단계를 포함한다. 여기에서, 조사될 락토바실루스 속 미생물은 피브로넥틴-결합 형광-표지 병원성 미생물의 인큐베이션 동안 첨가되었다. 비결합 세포의 제거 후, 피브로넥틴에 대한 결합의 특이적 정량은 바람직하게는 시험될 미생물을 첨가함으로써, 대조군과 비교하였을 때의 형광을 측정하는 것에 의해 수행된다.
상기에 언급된 특징들 및 아직 아래에서 기술되어야 할 것들이 본 발명의 영역을 벗어나지 않고도 주어진 특정 조합으로는 물론 단독으로도 사용될 수 있다는 것은 자명하다.
하기 도면 및 이와 관련하여 수행된 실험은 물론 예시적인 실시양태로부터 추가적인 장점들이 유추된다. 모든 바람직한 락트산 박테리아를 사용하여 실험이 수행되었지만, 여기에서는 소수의 실험만을 제시한다. 업계 숙련자라면, 하기의 실시예를 기반으로 본 발명을 재현할 수 있다:
도 1은 비결합 세포를 3회 세척한 후, 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 형성되는 바이오필름에 대한 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 한 실시양태 (DSM 25972, DSM 25989, DSM 25973), 그리고 그와의 비교를 위한 것으로써, 본 발명에 따른 것이 아니며 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합할 수 없는 추가적인 락토바실루스 균주 (락토바실루스 종 1 및 락토바실루스 종 2)의 특이적인 결합 및/또는 응집 (결합 검정)을 나타내며; 형광 측정 (Ex 485 nm/Em 535 nm)에 기초한, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서의 에스. 피오게네스 바이오필름에 대한 CFDA-표지된 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 결합 및/또는 응집의 특이적 정량을 나타낸다. 이와 같은 방식으로, 바람직한 미생물이 특히 구인두 영역에서 발생하는 박테리아 감염에 사용될 수 있다는 것을 업계 숙련자가 알게 된다.
도 2는 사진 문서화 시스템에서, 24-웰 스케일(scale) 내 상호응집 배치에서의 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 실시양태 (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973)는 물론, 모두 단독인 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 표적 균주의 특이적인 결합의 거시적 대조 (24-웰 마이크로타이터 플레이트의 사진)를 나타낸다. 상호응집 (및 관련 침전)에 의해 백색의 침전물이 형성된다. 이후, 응집물은 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스가 인후의 상피 세포에 결합할 수 없게 되도록 한다. 환자에서의 시험은 바람직한 미생물에 의해 박테리아 감염이 방지 또는 감소될 수 있음을 나타내었다.
도 3은 상호응집 후의 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포에 대한 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 실시양태 (DSM 25987 및 DSM 25973)는 물론, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 단독의 특이적인 결합의 미시적 표현을 나타낸다. 현미경 사진 (위상차, 1000× 배율); 거대 세포 응집물로서 상호응집을 볼 수 있다.
도 4는 사진 문서화 시스템에서, 인간 타액 중에서의 스트렙토코쿠스 피오게네스 세포에 대한 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 실시양태 (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM25989 및 DSM25973)는 물론, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 단독의 특이적인 결합 (상호응집)의 거시적 대조 (24-웰 마이크로타이터 플레이트의 사진)를 나타낸다. 역시 백색 침착물이 상호응집 (및 관련 침전)에 의해 야기된다. 바람직한 미생물이 이미 타액 중에서 스트렙토코쿠스 피오게네스에 결합함으로써, 구체적으로는 거기에서 상호응집됨으로써, 상피 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지한다는 것은 놀라운 것이었다. 바람직한 미생물이 타액에 존재하는 효소로 인하여 그의 바람직한 능력을 상실하지 않는다는 것 역시 놀라운 것이었다. 따라서, 바람직한 미생물은 특히 봉봉과 같은 경구 적용제에서 사용하기에 유리하다.
도 5는 PBS에서 세척된 락토바실루스 현탁액 (생존) 및 열처리에 의해 사멸된 락토바실루스 현탁액 (사멸)과 함께 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 스트렙토코쿠스 피오게네스 균주 ATCC 19615의 피브로넥틴 결합 방지에 대한 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 실시양태 (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973)의 영향을 나타낸다. 특이적 정량은 피브로넥틴으로 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 대한 CFDA-표지된 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합이다. 이는 %로 표시되는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 나타내는데, 여기서 100%는 락토바실루스 현탁액의 첨가가 없는 마이크로타이터 플레이트의 피브로넥틴 코팅에 대한 에스. 피오게네스 (ATCC 19615) 단독의 결합을 나타낸다. 바람직한 미생물이 인후에서의 상피 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지함으로써, 박테리아 감염 역시 방지한다는 것이 발견된다.
도 6은 (PBS에서 세척된 락토바실루스 현탁액 (생존) 및 열처리에 의해 사멸된 락토바실루스 현탁액 (사멸)과 함께) 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 피브로넥틴에의 스트렙토코쿠스 피오게네스 (균주 ATCC 12344)의 결합에 대한 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 한 실시양태 (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973)의 영향을 나타낸다. 이는 피브로넥틴-코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 대한 CFDA-표지된 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합의 특이적 정량을 나타낸다. 이는 %로 표시되는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 나타내는데, 여기서 100%는 락토바실루스 현탁액의 첨가가 없는 마이크로타이터 플레이트의 피브로넥틴 코팅에 대한 에스. 피오게네스 단독의 결합을 나타낸다.
도 7은 사진 문서화 시스템에서, PBS 완충제 중 본 발명에 따른 미생물의 예시적인 한 실시양태 (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973)와 스트렙토코쿠스 살리바리우스는 물론, 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 스트렙토코쿠스 살리바리우스 단독의 상호응집의 거시적 표현 (24-웰 마이크로타이터 플레이트의 사진)을 나타낸다. 상호응집 (및 결과적인 침전)에 의해 백색의 침착물이 형성된다.
예시적인 실시양태의 상세한 설명
실시예 1:
본 발명에 따른 미생물의 확인 및 선별을 위하여, 락토바실루스 균주 은행으로부터의 다양한 균주들을, 먼저 그것을 표적 병원 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스 (이하 "표적 미생물"로도 지칭)에 결합하는 능력과 관련하여 스크리닝한 (결합 검정) 다음, 제1 단계에서 확인된 균주를, 쌍안 입체 현미경을 사용하여 각 표적 미생물과의 상호응집을 정성적으로 측정하는 마이크로타이터 플레이트 스케일에서 상호응집 검정으로 시험하는, 4-단계 스크리닝 과정에 의해 시험하였다. 본 발명에 있어서, "상호-응집"이라는 용어는 "상호응집"이라는 용어와 동의어로 사용된다. 또한, 상호응집의 강도 및 표적 미생물에 대한 결합의 안정성은 물론, 피브로넥틴에 대한 결합을 방지하는 능력을 조사하였는데, 궁극적으로 확인된 본 발명에 따른 예시적인 미생물 (락토바실루스)로 이어졌다.
결합 검정
선별된 락토바실루스 균주의 결합 활성의 정량을 가능케 하도록, 96-웰 플레이트에서 병원성 미생물에 대한 락토바실루스 균주 결합의 정량 검출을 가능케 하는 결합 검정을 설정하였다. 표적 미생물과의 락토바실루스 세포의 결합 활성은 상호응집 활성 및/또는 상호응집 능력과 상관된다. 이를 실험적으로 시험하였다. 이와 관련하여, 도 2는 락토바실루스 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973과 스트렙토코쿠스 피오게네스 ATCC 19615의 상호응집의 예를 나타낸다.
측정 방법은 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 대한 본 발명에 따른 균주의 특이적인 결합에 기초한다. 검정을 위하여, 정해진 양의 본 발명에 따른 균주를 형광 염료 (CFDA 용액, 인비트로겐(Invitrogen) 사)로 표지하고, 바이오필름에 결합되어 있는 정해진 양의 표적 미생물과 혼합하였다. 수회 세척 후, 형광 광도계를 사용하여 표적 균주에 결합된 본 발명에 따른 균주의 존속을 측정한다.
이러한 시험을 수행하기 위하여, 표준 프로토콜에 따라 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스를 배양하였다. 균주는 5% CO2 분위기 중 37℃의 호기성 조건하에 THY (토드 헤위트 브로스(Todd Hewitt broth)) 배지에서 배양하였다. 락토바실루스 균주는 MRS 배지 중 37℃에서 혐기성으로 배양하였다 (문헌 [de Man et al. (1960) "A medium for the cultivation of Lactobacilli," J. Appl. Bact. 23 (130-135)] 참조). 표적 미생물의 후처리를 위하여, 평균 지수 성장 단계에서 5 내지 6시간 배양 후 세포를 수확한 다음, PBS (포스페이트-완충된 식염수, pH 7.4)를 사용하여 3회 세척하고, PBS 중에 용해시켰다. 그렇게 하기 위하여, 100 μL의 현탁액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 위치시켰다. 5% CO2 중 37℃에서의 16-시간 인큐베이션 동안, 표적 미생물에 의해 바이오필름이 형성된다. 인큐베이션 후, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 사용하여 3회 세척함으로써, 비결합 세포를 제거하였다. 락토바실루스 균주의 처리를 위하여, 24시간 동안 배양 후에 그것을 수확한 다음, PBS로 3회 세척하고, PBS에 위치시킨 후, CFDA 용액 (인비트로겐 사)을 첨가함으로써 형광으로 표지하였다. 결합 검정을 수행하기 위하여, 100 μL의 형광-표지된 락토바실루스 현탁액을 각 웰의 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 첨가하였다. 병행하여, 락토바실루스 현탁액의 첨가가 없는 대조 배치를 수행하였다. 인큐베이터에서 37℃로 1시간 동안 인큐베이션한 후, 비결합 세포를 PBS로 3회 분리 및 세척하였다. 각 세척 단계 후, 형광 플레이트 광도계 (Em 485 nm/Ex 535 nm)에서 형광을 측정하였다. 락토바실루스 세포가 없는 대조군과 비교하였을 때의 락토바실루스 균주가 있는 배치에서의 형광 (Em 485 nm/Ex 535 nm)의 증가를 바이오필름-결합 락토바실루스 세포의 양과 상관시켰다. 락토바실루스 세포의 결합 후 측정된 형광은 결합 강도에 부합하였다. 이 값이 높을수록, 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 대한 표지된 락토바실루스 세포의 결합은 더 우수하였으며, 시험된 락토바실루스 세포의 결합 활성은 더 컸다.
이러한 실험은 결합 검정에서 비결합 세포의 제거 후, 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대하여 본 발명에 따른 락토바실루스 균주가 17까지의 배수로 형광의 증가를 야기한다는 것을 보여주었는데, 3회 세척 후 바이오필름에 결합되어 있는 표적 균주에 대한 표지된 락토바실루스 세포의 결합으로 인한 것이다. 도 1은 본 발명에 따른 예시적인 미생물로서의 락토바실루스 DSM 25972, DSM 25989 및 DSM 25973의 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 결합 검정의 결과를 나타낸다. 비교 목적으로, 도 1은 본 발명에 따른 것이 아니며 표적 미생물에 대한 특이적인 결합을 할 수 없는 락토바실루스 균주 (락토바실루스 종 1 및 2)에 대한 데이터도 보여준다. 스트렙토코쿠스 피오게네스와 특이적으로 상호응집되기 때문에, 바람직한 미생물은 인간 및 동물에서 박테리아 감염을 예방할 수 있고/거나 그의 치료에 사용될 수 있다는 것이 발견된다. 이와 같은 방식으로, 한편으로 상피 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합이 예방되면서도, 다른 한편으로는 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의한 바이오필름의 형성이 예방되거나 이미 형성된 임의의 바이오필름이 용해 또는 파괴된다.
실시예 2:
상호응집 검정
1.0 mL의 부피 및/또는 24-웰 플레이트에서의 하기 검사를 사용하여, 선별된 락토바실루스 균주의 상호응집 활성을 예시한다.
본 방법에서는, 락토바실루스 및 표적 균주의 상호응집 거동을 별도로 고찰하며, 최종적으로 혼합물 중에서의 락토바실루스와 표적 균주 함께의 상호응집을 고찰한다. 이와 같은 분석은 24-웰 플레이트의 사진을 사용하여 거시적으로 수행함은 물론, 미시적으로도 수행하였다. 이러한 시험을 수행하기 위하여, 표준 프로토콜에 따라 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스를 배양하였다. 균주는 5% CO2 분위기 중 37℃의 호기성 조건하에 THY (토드 헤위트 브로스) 배지에서 배양하였다. 락토바실루스 균주는 MRS 배지 중 (문헌 [de Man et al. (1960) "A medium for the cultivation of lactobacilli," J. Appl. Bact. 23 (130-135)] 참조) 37℃에서 혐기성으로 배양하였다. 표적 미생물의 후처리를 위하여, 중간 지수 성장 단계에서 5 내지 6시간 배양 후 세포를 수확하고, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS, pH 7.4)를 사용하여 2회 세척한 후, OD600=4로 조정하였다. 락토바실루스 균주의 후처리를 위하여, 16시간 동안 배양한 후에 그것을 수확하고, PBS로 2회 세척한 다음, 일정 부피의 PBS에 위치시키고, OD600=4로 적절히 조정하였다. 상호응집 검정을 수행하기 위하여, 24-웰 플레이트에서, 웰 당 500 μL의 표적 미생물 현탁액 분획을 500 μL의 락토바실루스 현탁액과 합쳤다. 500 μL의 표적 미생물 더하기 500 μL의 PBS 또는 500 μL의 각 락토바실루스 현탁액 더하기 500 μL의 PBS (대조군 1)를 사용하는 대조 배치를 병행 시험하였다. 데스크탑 교반기에서 25℃로 10분 동안 인큐베이션한 후, 미시적으로 관찰하는 것에 더하여 사진 문서화 시스템을 사용하여 거시적으로 배치들을 관찰하였다. 사멸된 락토바실루스 세포의 상호응집 능력의 분석을 위하여, 먼저 수조에서 70℃로 30분 동안의 열처리에 의해 그것을 사멸시킨 다음, 상호응집 검정에 사용하였다.
이러한 실험은 선별된 락토바실루스 균주가 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스와 상호응집하게 됨으로써, 웰 내에서 불규칙하게 밀집되고/거나 과립형인 영역으로 거시적으로 눈에 보이는 혼합물 중 응집물 (응집체)를 관찰하는 것이 가능하다는 것을 보여주었다. 표적 균주 및/또는 본 발명에 따른 락토바실루스 균주를 별도로 함유하는 웰에는 응집물 또는 응집체의 형성이 존재하지 않는다. 웰 내 세포 현탁액은 균질하게 유지된다. 도 2는 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 생존 및 사멸 모두의 선별된 락토바실루스 균주의 상호응집 배치에서의 거시적 결과를 나타낸다. 현미경 관찰에서는, 모든 본 발명에 따른 락토바실루스 균주에서 표적 미생물에 대한 뚜렷한 친화성이 존재함으로써, 상호응집의 현미경 관찰에서 상이한 응집체 크기로 이어졌다. 도 3은 예를 들어 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 DSM 25987 및 DSM 25973의 상호응집 배치에서의 미시적 결과를 나타낸다. 바람직한 미생물은 특히 환자 또는 동물에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스에 의해 야기되고/거나 스트렙토코쿠스 피오게네스가 관련되어 있는 박테리아 감염을 방지 또는 퇴치할 수 있다.
실시예 3:
인간 타액에서의 상호응집
자연 인간 타액에서의 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 상호응집 능력을 조사하기 위하여, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 16시간의 배양 후 그것을 수확하고, PBS에서 2회 세척한 후, 인간 타액 중에 위치시켰다. 타액은 미리 수명의 사람으로부터 수집한 후, 혼합하여, 8000 g에서의 20분 동안의 원심분리에 의해 입자로부터 분리하였다. 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 표적 미생물을 후처리하여, 역시 PBS에서 2회 세척한 후 인간 타액 중에 위치시켰다. 상호응집 검정을 수행하기 위하여, 24-웰 플레이트에서, 웰 당 500 μL의 타액 중 표적 미생물 현탁액 분획을 500 μL의 타액 중 락토바실루스 현탁액과 합쳤다. 500 μL의 표적 미생물 더하기 500 μL의 타액 또는 500 μL의 각 락토바실루스 현탁액 더하기 500 μL의 타액 (대조군 1)을 사용하는 대조 배치를 병행 수행하였다. 데스크탑 교반기에서 25℃로 10분 동안 인큐베이션한 후, 사진 문서화 시스템을 이용하여 배치를 거시적으로 관찰함은 물론, 미시적으로도 관찰하였다.
시험은 자연 타액 중 본 발명에 따른 락토바실루스 균주가 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스와 특이적인 상호응집을 할 수 있다는 것을 보여주었다. 이는 구인두 공간에서의 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 적용에 있어서의 최고의 필요조건을 제공한다. 이를 위한 바람직한 미생물은 예컨대 봉봉으로서 경구로 투여됨으로써, 박테리아 감염의 완화 또는 심지어는 완전한 치료로 이어질 수 있다. 도 4는 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 자연 인간 타액 중에서의 상호응집의 거시적 결과를 나타낸다.
실시예 4:
피브로넥틴에 대한 결합의 방지
피브로넥틴에의 표적 병원성 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스 (ATCC 19615)의 결합에 대한 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 효과를 조사하기 위하여, 피브로넥틴-코팅된 96-웰 플레이트에서의 형광-표지된 표적 미생물의 결합에 대한 정량적 검출을 가능케 하는 결합 검정을 설정하였다. 결합의 개시시에 바로 CFDA-표지된 표적 미생물에 본 발명에 따른 락토바실루스 균주를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 비결합 세포를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후, 형광 플레이트 광도계에서 Em 485 nm/Ex 535 nm로 형광을 측정함으로써, 결합된 표적 미생물 세포의 특이적 정량을 수행하였다. 이러한 시험을 수행하기 위하여, 표준 프로토콜에 따라 표적 미생물 및 본 발명에 따른 락토바실루스 균주를 배양하였다. 락토바실루스 균주의 후처리를 위하여, 배양 후 그것을 PBS 중에서 2회 세척한 다음, PBS 중에 위치시켰다. 일부 락토바실루스 균주는 PBS에서의 세척 후 70℃에서의 30분 동안의 저온살균에 의해 사멸시켰다. 표적 균주의 후처리를 위하여, 정상 상태 성장 단계에 도달할 때까지 16시간 동안 그것을 배양한 다음, 수확하여, CFDA 형광을 첨가함으로써 표지하고, OD600nm=3.0으로 조정하였다. 결합 검정을 수행하기 위하여, 결합의 개시시에 바로 형광-표지된 표적 미생물에 락토바실루스 세포를 첨가하고, 37℃에서 미세호기성 조건하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 락토바실루스 현탁액의 첨가가 없는 대조 배치를 병행 수행하였다. 플랑크톤성 세포를 제거하고 바이오필름에서 발견되는 세포를 세척한 후, 락토바실루스 세포 존재 및 부재하의 형광 측정에 의해 결합된 표적 미생물 세포의 특이적 정량을 수행하였다. 락토바실루스가 없는 표적 미생물의 대조군과 비교하였을 때의 형광의 감소를 피브로넥틴-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 대한 표적 미생물 스트렙토코쿠스 피오게네스 결합의 강도와 상관시켰다. 이와 같은 감소를 바이오필름 형성의 %저해로 나타낸다. 도 5는 피브로넥틴에 대한 결합을 저해함에 있어서의 락토바실루스 균주 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973을 사용하여 수득된 결과를 나타내는데; 이들 균주는 본 발명에 있어서의 미생물, 즉 스트렙토코쿠스 피오게네스 ATCC 19615를 예로 하여 시험되었다. 실험은 생존 및 사멸 형태 모두의 상기에 열거된 바와 같은 본 발명에 따른 락토바실루스 균주로 인하여, 그것이 피브로넥틴에 대한 표적 미생물 결합의 저해로 이어진다는 것을 보여주었다. 따라서, 이는 본 발명에 따른 락토바실루스 균주가 숙주 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지할 수 있음을 나타낸다. 또한, 동일 속 및 종의 표적 미생물의 함수로서의 본 발명에 따른 락토바실루스 균주의 결합 특성 및/또는 응집 특성의 특이성은 물론, 피브로넥틴에 대한 결합의 방지 능력을 묘사하기 위하여, 동일 속 및 종의 추가적인 미생물을 사용한 실험도 수행하였다. 이와 같은 목적으로는, 특히 스트렙토코쿠스 피오게네스 ATCC 12344가 선택되었다. 피브로넥틴에의 표적 미생물인 스트렙토코쿠스 피오게네스 ATCC 12344의 결합에 대한 그의 효과를 조사하기 위하여, 상기한 바와 같은 표준 조건하에서 본 발명에 따른 락토바실루스 균주와 표적 미생물을 배양한 다음, 후처리하여 검정에 사용하였다.
시험은 동일 종 및 속의 다른 미생물들 역시 본 발명에 따른 락토바실루스 균주에 의해 응집될 수 있다는 것, 및 본 발명에 따른 락토바실루스 균주가 다른 표적 미생물이 피브로넥틴에 결합하는 것도 방지할 수 있다는 것을 보여주었다. 도 6은 예시적인 본 발명에 따른 미생물로서의 락토바실루스 균주 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 및 DSM 25973에 의한 피브로넥틴에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스 (균주 ATCC 12344)의 결합 방지의 결과를 나타낸다. 인간 또는 동물에 바람직한 미생물을 투여하는 것이 스트렙토코쿠스 피오게네스와 동일한 속 및 종의 추가적인 미생물들이 감염에 관련되었을 수도 있는 박테리아 감염을 예방 또는 치료하는 데에 이용될 수 있었다는 것은 완전히 놀라운 것이었다.
실시예 5:
스트렙토코쿠스 살리바리우스의 상호응집
상호응집 검정에서, 표준 조건에 따라 본 발명에 따른 락토바실루스 균주 및 스트렙토코쿠스 살리바리우스를 배양하고, PBS에서 3회 세척한 후, 인간 타액 중에서 사용하였다. 결과는 스트렙토코쿠스 살리바리우스가 본 발명에 따른 락토바실루스 균주에 의해 상호응집되지 않음을 나타내었다 (도 7). 따라서, 여기에서 예로서 스트렙토코쿠스 살리바리우스로 대표되는 공생 균주는 락토바실루스 균주에 의해 상호응집되지 않으며 그의 자연 서식처로부터 제거될 가능성이 배제될 수 있다. 이는 특히 바람직한 락트산 박테리아가 박테리아 감염에 대하여 특이적인 작용을 함을 보여준다.
참고문헌 목록
Figure 112013112826132-pct00001
독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25972 20120805 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25987 20120805 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25988 20120805 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25989 20120805 독일 미생물 및 세포 배양 협회 DSM25973 20120805

Claims (39)

  1. 독일 미생물 및 세포 배양 협회(German Collection for Microorganisms and Cell Cultures)에 기탁되어 있으며 DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 또는 DSM 25973의 번호를 갖는 락트산 박테리아를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나의 미생물 또는 그의 세포 용해물이며, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 상호응집될 수 있는 락트산 박테리아 목의 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  2. 제1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 상호응집 능력이 생물학적, 화학적 또는 물리적 사멸 후에도 존재하는 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스트렙토코쿠스 피오게네스와의 상호응집 능력이 pH 3 내지 8에서 존재하는 것인 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 바이오필름 형성을 억제하는 능력을 가진 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피브로넥틴에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 결합을 방지하는 능력을 가진 미생물 또는 그의 세포 용해물.
  6. 제1항 또는 제2항에 따른 1종 이상의 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는, 피부, 점막 및 구강의 미생물 질환 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물.
  7. 제1항에 따른 1종 이상의 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는 화장용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 고체, 액체 또는 점성 형태이거나 에어로졸인 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 페이스트, 연질 젤라틴 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 분말, 과립, 비드, 파스틸(pastille), 발포성 정제, 로젠지, 협측 정제, 츄어블 정제, 설하 정제, 용액, 팅크제, 에멀젼, 주스, 농축물, 시럽, 스프레이, 음용 앰플, 겔, 구강 세척제, 치약, 츄잉 검, 정제, 코팅된 환제 또는 봉봉(bonbon)의 형태인 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 프로바이오틱스(probiotics) 또는 방부제를 포함하는 조성물.
  12. 제1항에 따른 1종 이상의 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는 식품 보충제 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 1종 이상의 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는, 피부, 점막 및 구강의 미생물 질환 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 수의학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 항산화제, 비타민, 조효소, 지방산, 아미노산 및 보조인자에서 선택된 1종 이상의 물질을 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 1종 이상의 증점제, 1종 이상의 감미제 또는 1종 이상의 인공 감미제를 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 증점제가 셀룰로스 에테르, 다당류, 크산탄 검, 젤라틴, 고도-분산 이산화규소, 전분, 알기네이트, 트라가칸트, 아가, 아라비아 검, 펙틴 및 폴리비닐 에스테르를 포함하는 군에서 선택되고, 감미제가 글루코스, 프룩토스, 수크로스 및 글루코스 시럽, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨 및 말티톨, 사카린, 나트륨 시클라메이트, 아세술팜 K 및 아스파르탐을 포함하는 군에서 선택되는 것인 조성물.
  17. 제6항에 있어서, 미생물이 생존 또는 사멸 미생물로서 존재하는 조성물.
  18. 제6항에 있어서, 미생물 또는 그의 세포 용해물이 캡슐화, 분무-건조 또는 동결건조 형태로 존재하는 조성물.
  19. 제6항에 있어서, 미생물 또는 그의 세포 용해물이 0.001 중량% 내지 20 중량%의 양으로 존재하는 조성물.
  20. 제6항에 있어서, 츄어블 화합물, 츄잉 검, 봉봉, 파스틸, 치약, 스프레이 또는 구강 세척제의 형태로 사용되는 조성물.
  21. 제6항에 있어서, 1종 이상의 항-염증 또는 항-미생물 물질을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는 표면 처리용 세정제 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 빌더(builder) 물질, 효소, 전해질, pH 조절제, 증점제, 방오제, 광학 증백제, 노화 억제제, 염료 전달 억제제, 폼 조절제 및 착색제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 세정제 조성물.
  24. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물을 포함하는, 구인두 공간 염증의 국소적 치료에, 및 상기도 및 피부의 감염에 특이적인 효과를 가진 항미생물 첨가제 조성물.
  25. 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 또는 그의 세포 용해물, 및 신체 위생 장치 또는 장비, 린스 또는 페이스트를 포함하는 위생 처리용 키트.
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