KR101917771B1 - Micro rna for detecting non-alcoholic fatty liver disease derived liver cancer stem cells and using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 비알콜성 지방간 질환 유래 간암 줄기세포 검출용 마이크로 RNA 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to microRNAs for detecting liver cancer stem cells derived from non-alcoholic fatty liver disease and uses thereof.
서구사회 성인의 약 20%가 비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 초기 단계인 지방간(steatosis)이며, 이중 약 2 내지 3%는 계속적인 염증으로 인해 지방간이 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)으로 진행된다. 비알콜성 지방간염이 치료되지 않으면 간경화 및 간암과 같이 사망율이 높은 질환으로 발전한다.Approximately 20% of adults in Western societies are steatosis, an early stage of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), of which about 2 to 3% It progresses to non-alcoholic steatohepatitis (NASH). If nonalcoholic fatty liver disease is not treated, it develops into a disease with high mortality such as cirrhosis and liver cancer.
비알콜성 지방간 질환으로부터 야기된 간암은 종래의 치료 방법에 저항성을 가져 예후가 좋지 않은 대표적인 침습 종양으로, 이의 치료를 위해서는 종래의 방법과는 차별화된 접근방식이 필요하다.Liver cancer caused by non-alcoholic fatty liver disease is a typical invasive tumor which is resistant to conventional treatment methods and has poor prognosis. Therefore, a different approach from conventional methods is needed for treatment thereof.
암의 치료를 위한 다양한 방법이 개발되고 있으나, 종양 내 세포의 이질성(heterogenecity) 및 비대칭분열(asymetric division)로 인해 이들의 치료 효과는 여전히 제한적이다. 이와 관련하여, 최근에는 암 치료 후 줄어든 암세포의 재발 및 전이뿐만 아니라, 치료에 대한 내성 유발과정을 설명할 수 있는 개념으로 암 줄기세포가 제안되었다.Various methods for the treatment of cancer have been developed, but their therapeutic effect is still limited due to the heterogeneity and asymmetric division of the tumor cells. In this regard, recently, cancer stem cells have been proposed as a concept that can explain not only recurrence and metastasis of cancer cells reduced after cancer treatment but also resistance induction to treatment.
암 줄기세포는 자가복제 및 다른 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지며, 오랫동안 생존이 가능한 종양 내 특정 세포군으로 정의된다. 이와 같은 암 줄기세포는 1997년 Bonnet 및 Dick에 의해 최초로 골수 백혈병 세포로부터 CD34+/CD38-의 표지 항원을 지닌 세포가 분리되면서 그 존재가 입증되었다. 이는 2000년대에 들어서면서 유방암, 위암, 뇌암, 전립선암 등과 같은 다양한 고형암에서 분리되었고, 그로부터 암 줄기세포에 대한 연구가 활발해졌다.Cancer stem cells are defined as specific cell populations within a tumor that have the capacity to autonomously replicate and differentiate into different types of cells and are long-lived. Such cancer stem cells were first identified by Bonnet and Dick in 1997 as the cells with the CD34 + / CD38 - labeled antigen from bone marrow leukemia cells were isolated. In the 2000s, it was isolated from various solid tumors such as breast cancer, stomach cancer, brain cancer, and prostate cancer, and research on cancer stem cells became active.
암 줄기세포를 표적으로 하는 새로운 치료제가 개발된다면, 항암 치료에 대한 내성을 극복할 수 있고, 그에 따라 항암 치료를 받는 환자들에게 나타나는 부작용 및 이상반응을 줄일 수 있다. 이는 암 환자의 삶의 질을 향상시킬뿐만 아니라, 항암 치료에 따른 시간적, 경제적 부담도 절감시킬 수 있을 것으로 기대된다.If a new therapeutic agent targeting cancer stem cells is developed, resistance to chemotherapy can be overcome, thereby reducing side effects and adverse reactions in patients receiving chemotherapy. This will not only improve the quality of life of cancer patients, but also reduce the time and economic burden of cancer treatment.
그러나, 현재 암 줄기세포 마커로서 사용되고 있는 종양세포의 표면 또는 세포 내 마커들은 조직 특이적 또는 종양 내 암세포들 사이의 다양성을 반영하지 못해 모든 암 줄기세포를 분리하지 못하는 문제가 있다. 따라서, 암 줄기세포의 분리 및 이와 관련된 기전의 연구를 위해 암 줄기세포 특이적 바이오마커의 개발이 필요한 실정이다.However, the surface or intracellular markers of tumor cells currently being used as cancer stem cell markers do not reflect tissue-specific or diversity among tumor cells in the tumor, and thus there is a problem that all cancer stem cells can not be isolated. Therefore, it is necessary to develop cancer stem cell specific biomarker for the study of the isolation and related mechanism of cancer stem cell.
이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2017-0049125호는 암 줄기세포의 바이오마커로서 비알콜성 지방간 질환에서 유래된 암 줄기세포 특이적으로 발현하는 유전자를 개시하고 있다.In this regard, Korean Patent Publication No. 10-2017-0049125 discloses a gene specifically expressing cancer stem cells derived from non-alcoholic fatty liver disease as a biomarker of cancer stem cells.
한편, 마이크로 RNA의 연구가 바이오마커의 하나로서 대두되고 있다. 상기 마이크로 RNA는 일반적으로 18 내지 24개 길이의 폴리뉴클레오티드로서 비-암호화 RNA 분자이다. 마이크로 RNA는 RNA의 분해 촉진, mRNA의 번역 저해 및 유전자 전사 과정에 관여하여 단백질의 발현 패턴을 조절한다. 또한, 마이크로 RNA는 발달, 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사작용 등 다양한 과정에서 주요한 역할을 한다. 현재까지 인간 마이크로 RNA로서 약 1,000개의 마이크로 RNA가 알려져 있다.On the other hand, microRNA research is emerging as one of the biomarkers. The microRNA is a non-coding RNA molecule as a polynucleotide, generally 18 to 24 in length. MicroRNAs regulate protein expression patterns by promoting degradation of RNA, inhibiting translation of mRNA, and gene transcription. In addition, microRNA plays a major role in various processes such as development, differentiation, cell proliferation control, stress response and metabolism. To date, about 1,000 microRNAs have been known as human microRNAs.
마이크로 RNA는 특이성 및 감도가 매우 높다는 점에서, 단백질 기반의 바이오마커에 비해 진단 및 검출용 바이오마커로서의 장점을 갖는다. 그러나, 이들 마이크로 RNA는 다양한 요소에 의해 발현 스펙트럼이 쉽게 변한다는 문제가 있으며, 따라서, 표준화된 방법을 이용한 마이크로 RNA의 검출 방법을 개발할 필요성이 요구된다.MicroRNAs have the advantage of being biomarkers for diagnosis and detection as compared to protein-based biomarkers in that they have high specificity and sensitivity. However, these microRNAs have a problem that the expression spectrum is easily changed by various factors. Therefore, there is a need to develop a method for detecting microRNAs using a standardized method.
이에, 본 발명자들은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 간암 줄기세포를 탐지할 수 있는 바이오마커를 연구하던 중, 비알콜성 지방간 질환 세포모델을 제조하고, 상기 제조된 세포로부터 확인된 간암 줄기세포에서 특이적으로 발현량이 변화하는 5종류의 마이크로 RNA를 선별함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have studied a biomarker capable of detecting hepatoma stem cells derived from non-alcoholic fatty liver disease, and have developed a non-alcoholic fatty liver disease cell model, The present inventors completed the present invention by selecting five kinds of microRNAs whose expression levels specifically change.
본 발명의 목적은, 특정 염기서열을 갖는 마이크로 RNA를 이용한 간암 진단용 마이크로어레이 칩 및 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 간암 진단 또는 간암 줄기세포 검출용 키트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a microarray chip for diagnosis of liver cancer using microRNA having a specific base sequence and a kit for the diagnosis of liver cancer or the detection of liver cancer stem cells comprising the microarray chip.
본 발명의 다른 목적은, 특정 염기서열을 갖는 마이크로 RNA를 이용하여 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법 또는 간암 줄기세포 검출 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for confirming microRNA expression change or a method for detecting liver cancer stem cells to provide information on diagnosis of liver cancer using microRNA having a specific base sequence.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 간암 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a microarray chip for diagnosing liver cancer, wherein microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 간암 진단용 키트을 제공한다.The present invention also provides a kit for liver cancer diagnosis comprising the microarray chip.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 간암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting liver cancer stem cells comprising the microarray chip.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 대조군으로부터 분리된 RNA와 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 표지된 RNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 상기 분석한 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting RNA, comprising: labeling RNA isolated from a test sample with a different fluorescent material from RNA isolated from a control; Hybridizing the labeled RNA with the microarray chip of the present invention; Analyzing the hybridized microarray chip; And comparing the result of the analysis with a control group to provide information on the diagnosis of liver cancer.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 대조군으로부터 분리된 RNA와 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 표지된 RNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 상기 분석한 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 간암 줄기세포의 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting RNA, comprising: labeling RNA isolated from a test sample with a different fluorescent material from RNA isolated from a control; Hybridizing the labeled RNA with the microarray chip of the present invention; Analyzing the hybridized microarray chip; And comparing the result of the analysis with a control group. The present invention also provides a method for detecting liver cancer stem cells in vitro.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 cDNA로 합성하는 단계; 상기 합성된 cDNA 및 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(real-time transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 상기 RT-PCR 산물의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for detecting a test sample, comprising: synthesizing RNA isolated from a test sample with cDNA; Performing real-time transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) using the synthesized cDNA and a primer capable of amplifying the microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5; And comparing the expression level of the RT-PCR product with a control group, to provide information on the diagnosis of liver cancer.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 cDNA로 합성하는 단계; 상기 합성된 cDNA 및 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 상기 RT-PCR 산물의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 간암 줄기세포의 검출 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for detecting a test sample, comprising: synthesizing RNA isolated from a test sample with cDNA; Performing real-time RT-PCR using the synthesized cDNA and a primer capable of amplifying the microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5; And comparing the degree of expression of the RT-PCR product with a control group, to provide a method for detecting liver cancer stem cells in vitro.
본 발명에 따른 5종류의 마이크로 RNA는 비알콜성 지방간 질환 세포모델로부터 유래된 간암 줄기세포 특이적으로 발현하므로, 간암의 진단을 위한 키트 또는 간암을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.Since the five types of microRNAs according to the present invention are expressed specifically in liver cancer stem cells derived from a non-alcoholic fatty liver disease cell model, they can be usefully used for diagnosis of kits or liver cancer for diagnosis of liver cancer.
도 1은 NAFLD 세포모델로부터 유래된 간암 줄기세포를 DCV(dye cycle violet) 방법으로 염색하여 확인한 도면이다.
도 2는 베라파밀을 첨가 유무에 따른 간암 줄기세포(SP) 및 비암 줄기세포(non-SP)의 염색 결과와 miRNA 마이크로어레이 실험조건을 나타내는 도면이다.
도 3은 간암 줄기세포에서 발현이 변화된 마이크로 RNA를 상관성 플롯 및 주성분 분석방법으로 확인한 도면이다.
도 4는 간암 줄기세포 및 비암줄기세포에서 발현이 변화하는 마이크로 RNA를 나타내는 모식도이다.
도 5는 최종 선별된 5 종류의 마이크로 RNA의 유용성을 나타내는 도면이다.FIG. 1 is a diagram showing staining of liver cancer stem cells derived from a NAFLD cell model by a DCV (dye cycle violet) method.
FIG. 2 is a diagram showing the staining results of liver cancer stem cells (SP) and non-cancer stem cells (non-SP) with and without addition of verapamil, and miRNA microarray experimental conditions.
FIG. 3 is a graph showing microRNAs whose expression is changed in liver cancer stem cells by correlation plot and principal component analysis method.
4 is a schematic diagram showing microRNAs whose expression changes in liver cancer stem cells and non-cancer stem cells.
Fig. 5 is a graph showing the utility of five types of microRNAs finally selected.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 간암 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.The present invention provides a microarray chip for diagnosing liver cancer in which microRNAs represented by SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated.
상기 마이크로 RNA는 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA일 수 있다. 상기 마이크로 RNA는 이의 상보가닥 분자와 결합할 수 있는 능력이 보존되는 한에서 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 갖는 마이크로 RNA의 변이체일 수 있다. 상기 마이크로 RNA의 변이체는 서열번호 1 내지 5로 기재되는 본 발명에 따른 마이크로 RNA와 95% 이상, 구체적으로 97% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.The microRNA may be the microRNA described in SEQ ID NOS: 1 to 5. The microRNA may be a variant of a microRNA having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or a combination of nucleotides as long as the ability to bind to the complementary strand molecule is conserved. The mutant of the microRNA may have a homology of 95% or more, specifically 97% or more, more specifically 99% or more, to the microRNA according to the present invention represented by SEQ ID NOS: 1-5.
상기 간암은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 용어, "비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)"은 알코올의 섭취와 무관하게 간세포 속에 지방이 축적된 상태를 의미한다. NAFLD의 1단계는 과지방 섭취로 인한 간 내 유리지방산(free fatty acid, FFA)의 축적에 따른 지방증의 발생을 포함할 수 있다. NAFLD의 2단계는 장내 박테리아 및 지방세포의 활성에 의한 염증성 사이토카인의 발현에 따른 지방 축적 및 간세포 사멸을 포함할 수 있다. 상기 NAFLD의 2단계는 간경화 또는 간암으로 발전될 수 있다.The liver cancer may be derived from nonalcoholic fatty liver disease. The term " non-alcoholic fatty liver disease " (NAFLD) refers to the accumulation of fat in the hepatocytes regardless of the consumption of alcohol. The first stage of NAFLD may include the development of fatty acidosis due to accumulation of free fatty acid (FFA) in the liver due to fat intake. The second stage of NAFLD may involve fat accumulation and hepatocyte death due to the expression of inflammatory cytokines by intestinal bacterial and adipocyte activation. The two stages of the NAFLD may develop into liver cirrhosis or liver cancer.
상기 간암 진단용 마이크로어레이 칩은 간암 줄기세포를 검출함으로써 간암을 진단할 수 있다.The microarray chip for diagnosing liver cancer can diagnose liver cancer by detecting liver cancer stem cells.
본 발명에 따른 마이크로어레이 칩은 통상의 기술분야에 알려진 방법으로 제작될 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자를 칩의 기판에 고정시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 고정은 잉크젯 방식일 수 있다. 상기 기판은 슬라이드 글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로오스 막과 같은 재질로 제조될 수 있다. 또한, 상기 기판은 에폭시, 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성기가 코팅된 것일 수 있다. The microarray chip according to the present invention can be manufactured by a method known in the art. For example, the microarray chip may comprise immobilizing the microRNA or its complementary strand molecules as set forth in SEQ ID NOs: 1-5 in a chip substrate, and the fixation may be an ink jet method. The substrate may be made of a material such as a slide glass, plastic, metal, silicon, nylon film, and nitrocellulose film. In addition, the substrate may be coated with any one or more active groups selected from the group consisting of epoxy, amino-silane, poly-L-lysine and aldehyde.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 NAFLD 세포모델을 제조한 뒤, 상기 세포모델에 TNF-α를 첨가함으로써, NAFLD 세포모델이 간암으로 발전할 수 있는 환경을 조성하였다. 상기의 조건에서 배양된 NAFLD 세포모델에서 간암 줄기세포의 발현을 확인한 뒤, 이를 FACS 분석 방법을 사용하여 분리하였다(도 1 참조).In a specific example of the present invention, the present inventors prepared an NAFLD cell model and then added TNF-a to the cell model, thereby creating an environment in which the NAFLD cell model can develop into liver cancer. After the expression of liver cancer stem cells was confirmed in the NAFLD cell model cultured under the above conditions, it was separated using a FACS analysis method (see FIG. 1).
상기 분리된 간암 줄기세포로부터 RNA를 추출하고, 이를 간암 줄기세포로 발전하지 않은 NAFLD 세포모델에서 추출된 RNA와 비교하여 간암 줄기세포에 특이적으로 발현이 변화되는 5종류의 마이크로 RNA를 선별하였다(도 3, 도 4 및 표 1 참조). 따라서, 상기 선별된 5종류의 마이크로 RNA는 간암, 특히 NAFLD로부터 발전된 간암을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.RNA was extracted from the isolated liver cancer stem cells and compared with the RNA extracted from the NAFLD cell model which did not develop into liver cancer stem cells, five kinds of microRNAs whose expression was specifically changed in liver cancer stem cells were selected 3, 4 and Table 1). Therefore, the five kinds of microRNAs selected can be useful for diagnosing liver cancer developed from liver cancer, particularly NAFLD.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 포함하는 간암 진단용 키트을 제공한다.The present invention also provides a kit for liver cancer diagnosis comprising a microarray chip according to the present invention.
상기 마이크로어레이 칩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 것일 수 있다. 이때, 상기 간암은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다.The microarray chip may have the above-described characteristics. For example, the microarray chip may be one in which the microRNAs described in SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated. At this time, the liver cancer may be derived from non-alcoholic fatty liver disease.
상기 키트는 마이크로어레이 결과를 확인할 수 있도록 형광물질을 더 포함할 수 있다. 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescence) 및 화학발광물질(chemiluminescence)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The kit may further include a fluorescent material so that the microarray result can be confirmed. The fluorescent material may be at least one selected from the group consisting of streptavidin-like phosphatase conjugate, chemifluorescence, and chemiluminescence. Specifically, the fluorescent material includes Cy3, Cy5, polyL-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate , RITC), and rhodamine.
상기 키트는 추가적으로 반응시약을 포함할 수 있다. 이때, 상기 반응시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식 시약, 세척 완충용액 등을 포함할 수 있다.The kit may further comprise a reaction reagent. At this time, the reaction reagent may include a buffer solution used for hybridization, a labeling reagent such as a chemical inducer of a fluorescent dye, and a washing buffer solution.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 포함하는 간암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting liver cancer stem cells comprising the microarray chip according to the present invention.
상기 마이크로어레이 칩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 것일 수 있다. 이때, 상기 간암 줄기세포는 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다.The microarray chip may have the above-described characteristics. For example, the microarray chip may be one in which the microRNAs described in SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated. At this time, the liver cancer stem cells may be derived from non-alcoholic fatty liver disease.
또한, 상기 간암 줄기세포 검출용 키트는 상술한 바와 같은 형광물질 및 반응시약 등을 더 포함할 수 있다.The kit for detecting liver cancer stem cells may further include a fluorescent substance and a reaction reagent as described above.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 대조군으로부터 분리된 RNA와 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 표지된 RNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 상기 분석한 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting RNA, comprising: labeling RNA isolated from a test sample with a different fluorescent material from RNA isolated from a control; Hybridizing the labeled RNA with the microarray chip of the present invention; Analyzing the hybridized microarray chip; And comparing the result of the analysis with a control group to provide information on the diagnosis of liver cancer.
상기 방법에 있어서, 상기 피검시료는 혈액, 조직, 세포, 소변, 혈장 또는 혈청일 수 있다.In the above method, the test sample may be blood, tissue, cell, urine, plasma or serum.
상기 방법에 따른 마이크로어레이 칩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 것일 수 있다. 이때, 상기 간암은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다.The microarray chip according to the above method can have the above-described characteristics. For example, the microarray chip may be one in which the microRNAs described in SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated. At this time, the liver cancer may be derived from non-alcoholic fatty liver disease.
상기 형광물질은 상술한 바와 같이 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질, 화학형광물질 및 화학발광물질로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.The fluorescent substance may be any one selected from the group consisting of a streptavidin-alkaline dephosphorylase conjugate, a chemiluminescent substance, and a chemiluminescent substance, as described above.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 대조군으로부터 분리된 RNA와 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 표지된 RNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 상기 분석한 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 간암 줄기세포의 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting RNA, comprising: labeling RNA isolated from a test sample with a different fluorescent material from RNA isolated from a control; Hybridizing the labeled RNA with the microarray chip of the present invention; Analyzing the hybridized microarray chip; And comparing the result of the analysis with a control group. The present invention also provides a method for detecting liver cancer stem cells in vitro.
상기 줄기세포의 검출 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 피검시료는 혈액, 조직, 세포, 소변, 혈장 또는 혈청일 수 있다. 또한, 상기 방법에 따른 마이크로어레이 칩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 것일 수 있다. 이때, 상기 간암은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다.The method for detecting stem cells may have the above-described characteristics. For example, the test sample may be blood, tissue, cells, urine, plasma or serum. In addition, the microarray chip according to the above method can have the above-described characteristics. For example, the microarray chip may be one in which the microRNAs described in SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated. At this time, the liver cancer may be derived from non-alcoholic fatty liver disease.
상기 형광물질은 상술한 바와 같이 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질, 화학형광물질 및 화학발광물질로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.The fluorescent substance may be any one selected from the group consisting of a streptavidin-alkaline dephosphorylase conjugate, a chemiluminescent substance, and a chemiluminescent substance, as described above.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 cDNA로 합성하는 단계; 상기 합성된 cDNA 및 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(real-time transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 상기 RT-PCR 산물의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for detecting a test sample, comprising: synthesizing RNA isolated from a test sample with cDNA; Performing real-time transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) using the synthesized cDNA and a primer capable of amplifying the microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5; And comparing the expression level of the RT-PCR product with a control group, to provide information on the diagnosis of liver cancer.
상기 RNA 발현 변화 확인 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 피검시료는 혈액, 조직, 세포, 소변, 혈장 또는 혈청일 수 있다. 또한, 상기 방법에 따른 마이크로어레이 칩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 것일 수 있다. 이때, 상기 간암은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다.The method for confirming the change in RNA expression may have the above-described characteristics. For example, the test sample may be blood, tissue, cells, urine, plasma or serum. In addition, the microarray chip according to the above method can have the above-described characteristics. For example, the microarray chip may be one in which the microRNAs described in SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated. At this time, the liver cancer may be derived from non-alcoholic fatty liver disease.
또한, 본 발명은 피검시료로부터 분리된 RNA를 cDNA로 합성하는 단계; 상기 합성된 cDNA 및 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 상기 RT-PCR 산물의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 간암 줄기세포의 검출 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for detecting a test sample, comprising: synthesizing RNA isolated from a test sample with cDNA; Performing real-time RT-PCR using the synthesized cDNA and a primer capable of amplifying the microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5; And comparing the degree of expression of the RT-PCR product with a control group, to provide a method for detecting liver cancer stem cells in vitro.
상기 R간암 줄기세포의 검출 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 피검시료는 혈액, 조직, 세포, 소변, 혈장 또는 혈청일 수 있다. 또한, 상기 방법에 따른 마이크로어레이 칩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 5로 기재되는 마이크로 RNA 또는 이의 상보 가닥분자가 집적된 것일 수 있다. 이때, 상기 간암은 비알콜성 지방간 질환으로부터 유래된 것일 수 있다.The detection method of R liver cancer stem cells may have the above-described characteristics. For example, the test sample may be blood, tissue, cells, urine, plasma or serum. In addition, the microarray chip according to the above method can have the above-described characteristics. For example, the microarray chip may be one in which the microRNAs described in SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated. At this time, the liver cancer may be derived from non-alcoholic fatty liver disease.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, but the present invention is not limited thereto.
실시예Example 1. One. 비알콜성Non-alcoholic 지방간 질환 세포모델의 제조 Production of fatty liver disease cell model
간 세포 내 축적된 지방에 의해 생성되는 암 줄기세포 특이적 유전체를 발굴하기 위해, 비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 세포모델을 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 이때, 초기 간 종양 샘플 간의 다양성으로 야기되는 유전체 데이터 해석의 어려움을 배제하고자, 항상성있게 배양할 수 있는 인간 간암세포인 HepG2를 사용하여 세포모델을 제조하였다.A cell model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) was prepared in the following manner to identify cancer stem cell-specific genomes produced by accumulated fat in liver cells. At this time, a cell model was prepared using HepG2, a human liver cancer cell that can be cultured constantly, in order to exclude the difficulty of interpretation of dielectric data caused by diversity between early liver tumor samples.
먼저, HepG2(ATCC, 미국) 세포를 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 EMEM(Eagle's Minimun Essential Medium) 배지를 사용하여 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 24웰 플레이트에 웰당 5x104개가 되도록 분주하고, 배양 24시간 마다 총 3회의 1 mM 유리 지방산(FFA) 혼합물을 첨가하였다. 이때, FFA 혼합물로서 올레산염(oleate, C18:1n-9) 및 팔미톨리에이트(palmitoleate, C16:1n-7)를 2:1의 부피비로 혼합한 혼합물이 사용되었다. 한편, NAFLD가 간암으로 발전하는데 관여하는 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α를 5 ng/㎖의 농도로 함께 첨가함으로써, NAFLD로부터 간암으로 발전할 수 있는 환경을 조성하였다.First, HepG2 (ATCC, USA) cells were prepared by culturing in EMEM (Eagle's Minimun Essential Medium) medium containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C . The prepared cells were dispensed into 24 well plates to 5x10 4 cells per well and a total of 3 mM 1 F free acid (FFA) mixture was added every 24 hours. At this time, a mixture of oleate (C18: 1n-9) and palmitoleate (C16: 1n-7) as a FFA mixture in a volume ratio of 2: 1 was used. On the other hand, TNF-α, a representative inflammatory cytokine involved in the development of NAFLD into liver cancer, was added at a concentration of 5 ng / ml to create an environment capable of generating hepatic cancer from NAFLD.
실시예Example 2. 2. NAFLDNAFLD 세포모델로부터 간암 줄기세포의 분리 Isolation of liver cancer stem cells from cell model
NAFLD 세포모델로부터 DCV 염료 유출방식(dye cycle violet 용 efflux)에 기반한 FACS 분리 방법을 사용하여 간암 줄기세포를 분리하였다(Goodell et al ., 1996).Hepatic stem cells were isolated from the NAFLD cell model using the FACS separation method based on the DCV dye efflux (efflux for dye cycle violet) (Goodell et al . , 1996).
먼저, 실시예 1에서 제조된 NAFLD 세포모델을 트립신 처리하여 원심분리하고, 펠렛을 수득하였다. 수득된 세포 펠렛을 37℃의 배양 배지를 이용하여 1x106 cells/㎖의 농도가 되도록 현탁시켰다. 상기 현탁액에 ABCG2-매개 유출의 특이 억제제인 베라파밀(verapamil)을 첨가함으로써 간암 줄기세포의 존재를 확인하였다.First, the NAFLD cell model prepared in Example 1 was trypsinized and centrifuged to obtain pellets. The obtained cell pellet was suspended at a concentration of 1 x 10 6 cells / ml using a culture medium at 37 ° C. The presence of liver cancer stem cells was confirmed by adding verapamil, a specific inhibitor of ABCG2-mediated efflux, to the suspension.
구체적으로, 2% FBS 및 10 mM HEPES를 포함하는 HBSS(LifeTechnologies, 미국)에 10 μM의 DCV(ThermoFisher, 미국)를 첨가하여 SP 완충액을 제조하였다. 여기에 10 μM의 베라파밀을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 전처리하고, 10 μM의 베라파밀이 포함된 SP 완충액을 첨가하고 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포를 차가운 HBSS를 사용하여 세척하고, 염색된 세포는 FACSAria 세포 분류기(BD Bioscience, 미국)를 이용하여 분석 및 분리하였다. 이때, 분석은 DCV에 의해 적색(650 LP) 또는 청색(450/40 BP)으로 배출되는 다중-파라미터 분석(multi-parameter analysis) 방법을 사용하여 수행되었다. 상기 배출은 408 ㎚의 바이올렛 다이오드 레이저에 의한 여기(excitation)에 의한 반응으로 나타난다. 한편, 간암 줄기세포의 위치는 베라파밀의 첨가에 의해 사라지는 세포 군집을 간암 줄기세포로 판별함으로써 확인되었다.Specifically, SP buffer was prepared by adding 10 [mu] M DCV (ThermoFisher, USA) to HBSS (Life Technologies, USA) containing 2% FBS and 10 mM HEPES. 10 μM Verapamil was added thereto, and the mixture was pretreated at 37 ° C. for 30 minutes. SP buffer containing 10 μM Verapamil was added thereto, followed by reaction at 37 ° C. for 90 minutes. The cells were washed with cold HBSS and the stained cells were analyzed and separated using a FACSAria cell sorter (BD Bioscience, USA). At this time, the analysis was carried out using a multi-parameter analysis method in which DCV was emitted as red (650 LP) or blue (450/40 BP). The emission appears as a reaction by excitation by a 408 nm violet diode laser. On the other hand, the location of liver cancer stem cells was confirmed by discriminating cell clusters disappearing by addition of verapamil as liver cancer stem cells.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 증가된 염료 유출로 인해서 약한 DVC 염색 결과를 나타내는 세포 군집으로 판별되는 간암 줄기세포가 전체 세포의 0.07 내지 0.7%로 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 이는 NAFLD 세포모델로부터 유래되었을 때 1.5 내지 2배 정도 증가하였다(도 1).As a result, as shown in Fig. 1, it was confirmed that liver cancer stem cells identified as cell clusters showing a result of weak DVC staining due to increased dye outflow were 0.07 to 0.7% of total cells. It also increased by 1.5 to 2-fold when derived from the NAFLD cell model (Fig. 1).
실시예Example 3. 3. NAFLDNAFLD 세포모델 유래의 간암 줄기세포로부터 마이크로 From the cell-model derived liver cancer stem cells, RNA의RNA 분석 analysis
간암 줄기세포에 존재하는 마이크로 RNA를 하기와 같은 방법으로 분석하여, 이를 대조군과 비교함으로써 간암 줄기세포 특이적으로 발현되는 5종류의 마이크로 RNA를 선별하였다.The microRNAs present in liver cancer stem cells were analyzed by the following method and compared with the control group, five kinds of microRNAs specifically expressed in liver cancer stem cells were selected.
구체적으로, 실시예 2에서 분리된 간암 줄기세포로부터 통상적인 방법으로 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 사용하여 Affymetrix miRNA 3.0을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 마이크로 어레이를 수행함으로써, NAFLD로부터 유발되는 간암 줄기세포에서 유의적으로 발현이 증가 또는 감소하는 마이크로 RNA를 선별하였다. 이때, 대조군으로서는 실시예 1에서 제조된 비알콜성 지방간 세포로부터 유래한 비암줄기세포를 사용하였다(도 2). 한편, 마이크로 어레이 결과는 GeneSpring GX v.11.0(Agilent Technologies, 미국) 프로그램을 사용하여 발현 변화를 분석하였다.Specifically, RNA was isolated from liver cancer stem cells isolated in Example 2 by a conventional method. Microarrays were performed using Affymetrix miRNA 3.0 using the separated RNAs according to the manufacturer's protocol to select microRNAs whose expression was significantly increased or decreased in NAFLD-induced liver cancer stem cells. At this time, non-cancer stem cells derived from the non-alcoholic fatty liver cells prepared in Example 1 were used as the control group (Fig. 2). Meanwhile, microarray results were analyzed using GeneSpring GX v.11.0 (Agilent Technologies, USA) program.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 간암 줄기세포에서 발현이 변화된 마이크로 RNA를 상관성 플롯(correlation plot) 및 주성분 분석(PCA)으로 확인하였다(도 3).As a result, as shown in FIG. 3, microRNAs whose expression was changed in liver cancer stem cells as compared with the control group were confirmed by correlation plot and principal component analysis (PCA) (FIG. 3).
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 간암 줄기세포에서 특이적으로 발현이 변화하는 39종류의 마이크로 RNA 및 비알콜성 지방간 세포에서 특이적으로 발현이 변화하는 29종류의 마이크로 RNA를 선별하고, 상기 두 세포에서 공통적으로 발현이 변화하는 7종류의 마이크로 RNA를 선별하였다(도 4).In addition, as shown in Fig. 4, 39 types of microRNAs whose expression is specifically changed in liver cancer stem cells and 29 kinds of microRNAs whose expression is specifically changed in non-alcoholic fatty liver cells were selected, Seven kinds of microRNAs whose expression was commonly changed in the cells were selected (Fig. 4).
나아가, 상기 7종류의 마이크로 RNA로부터 종래에 보고되지 않은 비알콜성 지방간 세포유래 간암 줄기세포 마이크로 RNA로서 5종류의 마이크로 RNA를 하기 표 1에 나타난 바와 같이 최종 선별하였다. 이때, miR-1180 및 miR-149는 간암 줄기세포에서 대조군에 비해 그 발현이 증가하였고, miR-181d, miR-183 및 miR-4690-5p는 간암 줄기세포에서 대조군에 비해 그 발현이 감소하였다(도 5 및 표 1).Further, five kinds of microRNAs as non-alcoholic fatty liver cell-derived liver cancer stem cell microRNAs not previously reported from the seven kinds of microRNAs were finally selected as shown in Table 1 below. The expression of miR-181d, miR-183 and miR-4690-5p was decreased in liver cancer stem cells compared to the control group, while the expression of miR-1180 and miR-149 was increased in liver cancer stem cells compared with the control group 5 and Table 1).
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology
<120> MICRO RNA FOR DETECTING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE DERIVED
LIVER CANCER STEM CELLS AND USING THEREOF
<130> 2017P-05-016
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-1180
<400> 1
uuuccggcuc gcgugggugu gu 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-149
<400> 2
ucuggcuccg ugucuucacu ccc 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-181d
<400> 3
aacauucauu guugucggug ggu 23
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-183
<400> 4
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-4690-5p
<400> 5
gagcaggcga ggcugggcug aa 22
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology
<120> MICRO RNA FOR DETECTING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE DERIVED
LIVER CANCER STEM CELLS AND USING THEREOF
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-1180
<400> 1
uuuccggcuc gcgugggugu
Claims (10)
A microarray chip for diagnosing liver cancer, wherein five types of microRNAs represented by SEQ ID NOS: 1 to 5 or complementary strand molecules thereof are integrated.
The microarray chip for diagnosis of liver cancer according to claim 1, wherein the liver cancer is derived from non-alcoholic fatty liver disease.
The microarray chip for diagnosis of liver cancer according to claim 1, wherein the liver cancer is diagnosed by detecting liver cancer stem cells.
A kit for diagnosing liver cancer comprising the microarray chip of claim 1.
A kit for detecting liver cancer stem cells comprising the microarray chip of claim 1.
2) 상기 단계 1)의 표지된 RNA를 제1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼성화된 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 분석한 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법.
1) labeling the RNA isolated from the test sample with the RNA separated from the control group and a different fluorescent substance;
2) hybridizing the labeled RNA of step 1) with the microarray chip of claim 1;
3) analyzing the hybridized microarray chip of step 2); And
4) comparing the result of the analysis of step 3) with that of the control group to confirm the microRNA expression change.
The method according to claim 6, wherein the test sample is blood, tissue, cell, urine, plasma or serum.
2) 상기 단계 1)의 표지된 RNA를 제1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼성화된 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 분석한 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 간암 줄기세포의 검출 방법.
1) labeling the RNA isolated from the test sample with the RNA separated from the control group and a different fluorescent substance;
2) hybridizing the labeled RNA of step 1) with the microarray chip of claim 1;
3) analyzing the hybridized microarray chip of step 2); And
4) comparing the result of the analysis of step 3) with that of the control group.
2) 상기 단계 1)의 합성된 cDNA 및 서열번호 1 내지 5로 기재되는 5 종류의 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(real-time transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 RT-PCR 산물의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단의 정보를 제공하기 위한 마이크로 RNA 발현 변화 확인 방법.
1) synthesizing RNA isolated from a test sample with cDNA;
2) performing real-time transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) using the synthesized cDNA of step 1) and primers capable of amplifying the five kinds of microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5 ;
3) comparing the degree of expression of the RT-PCR product of step 2) with the control group.
2) 상기 단계 1)의 합성된 cDNA 및 서열번호 1 내지 5로 기재되는 5 종류의 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 RT-PCR 산물의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 간암 줄기세포의 검출 방법.1) synthesizing RNA isolated from a test sample with cDNA;
2) performing real-time RT-PCR using the synthesized cDNA of step 1) and primers capable of amplifying the five kinds of microRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 5;
3) comparing the expression level of the RT-PCR product of step 2) with a control group.
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| KR (1) | KR101917771B1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100197770A1 (en) | 2007-06-08 | 2010-08-05 | The Government of the USA as represented by the Secretary of Dept. of Health & Human Services | Methods for Determining Heptocellular Carcinoma Subtype and Detecting Hepatic Cancer Stem Cells |
-
2017
- 2017-06-01 KR KR1020170068682A patent/KR101917771B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100197770A1 (en) | 2007-06-08 | 2010-08-05 | The Government of the USA as represented by the Secretary of Dept. of Health & Human Services | Methods for Determining Heptocellular Carcinoma Subtype and Detecting Hepatic Cancer Stem Cells |
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