KR101896595B1 - Composition for purifying mouse immunoglobulin G1 and Uses thereof - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a composition for the purification of mouse immunoglobulin G1 and uses thereof. More particularly, the present invention relates to a composition for the purification of mouse immunoglobulin G1 and uses thereof, which comprises a buffer solution and potassium thiocyanate (KSCN). The composition and the purification method for the immunoglobulin G1 purification according to the present invention can selectively purify the mouse immunoglobulin G1 with high purity and high efficiency, thereby solving the high cost, low binding force and contamination problems of the conventional protein A column, and being stable at high pH. A lipid-adsorbing column according to the present invention maintains the initial purification ability even after repeated use, which is useful in terms of the cost of the antibody purification.

Description

쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물 및 이의 용도{Composition for purifying mouse immunoglobulin G1 and Uses thereof}Composition for Purification of Mouse Immunoglobulin G1 and its Use {

본 발명은 쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 완충용액 및 포타슘 싸이오사이아테이트(potassium thiocyanate, KSCN)을 포함하는 쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a composition for purifying rat immunoglobulin G1 comprising a buffer solution and potassium thiocyanate (KSCN), and a method for purifying the composition for purifying the immunoglobulin G1. Lt; / RTI >

면역글로불린은 바이러스나 박테리아 등의 외부 항원을 중화시키는 항체의 기능을 담당하는 단백질로 혈액이나 조직액에 들어있다. 면역글로불린은 5가지 종(IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)이 있으며, 면역글로불린 G(IgG)는 면역글로불린 중 가장 많이 존재하며 외부물질과의 결합으로 면역 반응을 불러일으킴으로써 신체를 보호하는 중요한 물질이다. 면역글로불린 G와 외부물질간의 결합을 면역반응이라고 하며 이러한 특성을 이용하여 특정 항원을 인식하는 일차 면역글로불린 G의 생산 및 일차 면역글로불린 G에 결합하는 이차 면역글로불린 G를 동물 종으로 가장 많이 사용되는 쥐 또는 토끼의 면역학적 반응을 통해 생산하여 생물학적 면역분석법에 활용되고 있다.Immunoglobulin is a protein that functions as an antibody that neutralizes external antigens such as viruses and bacteria. It is contained in blood or tissue fluid. Immunoglobulin G (IgG) is the most abundant immunoglobulin, and by binding to external substances, it stimulates the immune response and protects the body. It is an important material. Binding between immunoglobulin G and an exogenous substance is called an immune response. Using these characteristics, the production of primary immunoglobulin G recognizing a specific antigen and the secondary immunoglobulin G binding to the primary immunoglobulin G are used as animal species Or through immunological reaction of rabbit, and is used for biological immunoassay.

이런 면역글로불린 G의 사용량이 증가하면서 그 정제 기술의 중요도 역시 높아지고 있다. 면역글로불린 G 정제를 위한 가장 효과적인 방법 중 하나는 친화성 크로마토그래피 이다. 면역글로불린 G의 정제를 위하여 현재 주로 사용되고 있는 기술은, 포도상구균에서 발견된 protein A를 이용한 친화성 크로마토그래피 방법이다. Protein A는 면역글로불린의 Fc 분절에 결합하는 특성을 가지고 있어 면역글로불린 G의 정제에 사용되고 있다. 하지만 Protein A 를 이용한 정제법은 리간드의 생산 비용이 높고, 안정성이 낮다는 단점이 있다. 또한 생산과정에 사용되는 높은 pH의 용액 조건에서 protein A는 매우 불안정하기 때문에 protein A 컬럼의 사용 횟수가 줄어들게 되어, 면역글로불린 G의 생산 단가가 증가되는 결과를 초래한다. As the use of such immunoglobulin G increases, the importance of the purification technology is also increasing. One of the most effective methods for immunoglobulin G purification is affinity chromatography. A technique currently used mainly for the purification of immunoglobulin G is an affinity chromatography method using protein A found in Staphylococcus aureus. Protein A has the property of binding to the Fc segment of immunoglobulin and has been used for the purification of immunoglobulin G. However, the purification method using Protein A has a drawback that the production cost of the ligand is high and the stability is low. In addition, protein A is very unstable at the high pH solution used in the production process, resulting in a decrease in the frequency of use of the protein A column, resulting in an increase in the production cost of the immunoglobulin G.

마우스 면역글로불린 G는 4종류의 아형 (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)이 있고, 이중 면역글로불린 G1이 가장 많이 존재하고 있으며, 주요한 면역기능을 가지고 있다. 쥐 면역글로불린G1은 무한 증식능력을 가진 암세포(골수종세포, myeloma cell)와 항체 생산 능력을 지닌 형질 세포(plasma cell)를 융합하여 만들어진 융합종양세포(hybridoma cell)로부터 대량으로 생산 가능하나 기존의 protein A 컬럼은 쥐 면역글로불린 G1에 대해서는 결합력이 낮아 정제 효율이 매우 낮은 문제점을 지니고 있다.Mouse immunoglobulin G has four subtypes (IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3), the immunoglobulin G1 is the most abundant, and it has major immune functions. Mouse immunoglobulin G1 can be produced in large quantities from hybridoma cells made by fusing cancer cells (myeloma cells) capable of infinite proliferation and plasma cells capable of producing antibodies, The A column has a low binding efficiency with respect to mouse immunoglobulin G1 and has a very low purification efficiency.

선행 특허인 대한민국 특허 제10-2016-0012183에서 토끼 및 쥐 면역글로불린 G에 특이적으로 결합하는 리피바디가 개발된 바 있다. 상기 특허에서 개발된 리피바디 중 쥐에 선택적으로 결합하는 리피바디가 면역글로불린 G1에 대해 높은 선택성이 있음이 새롭게 확인되었다. Korean Patent No. 10-2016-0012183, which is a prior patent, has developed a lipid body specifically binding to rabbit and mouse immunoglobulin G. It has been newly confirmed that the lipid body selectively binding to rats among the lipid bodies developed in this patent has high selectivity for immunoglobulin G1.

이에, 본 발명자들은 상기 리피바디를 레진에 접합시켜 정제용 컬럼을 제작하고, 완충용액 및 포타슘 싸이오사이아네이트(potassium thiocyanate, KSCN)을 포함하는 조성물을 이용할 경우, 쥐 혈장으로부터 면역글로불린 G1만을 고 순도, 고 효율로 정제할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the present inventors have found that when a liposome is bound to a resin to prepare a purification column and a composition containing a buffer solution and potassium thiocyanate (KSCN) is used, immunoglobulin G1 alone High purity, and high efficiency. Thus, the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for the purification of mouse immunoglobulin G1.

본 발명의 다른 목적은 조성물을 이용하여 쥐 혈장으로부터 면역글로불린 G1만을 고순도 및 고효율로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for purifying only immunoglobulin G1 from rat plasma with high purity and high efficiency using a composition.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 완충용액 및 포타슘 싸이오사이아네이트(potassium thiocyanate, KSCN)을 포함하는 쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for purifying a rat immunoglobulin G1 comprising a buffer solution and potassium thiocyanate (KSCN).

본 발명은 또한, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 리피바디를 흡착시켜 컬럼을 제작하는 단계; (b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음, 쥐 면역글로불린 G1을 포함하는 쥐 혈청을 흡착시키는 단계; (c) 상기 조성물로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및 (d) 항체 용출용액으로 흡착된 쥐 면역글로불린 G1을 용출하는 단계;를 포함하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법을 제공한다.(A) adsorbing a lipid body represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to produce a column; (b) equilibrating the column and then adsorbing rat serum containing a murine immunoglobulin G1; (c) washing the column with the composition; And (d) eluting the murine immunoglobulin G1 adsorbed by the antibody eluting solution.

본 발명에 따른 쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물 및 정제 방법은 쥐 면역글로불린 G1을 선택적으로 고 순도, 고 효율로 정제 할 수 있어 기존의 protein A 컬럼이 지니고 있는 고비용, 낮은 결합력 및 오염 문제를 해결 할 수 있으며, 높은 pH에서도 안정성이 높을 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 리피바디-흡착 컬럼은 반복 재사용 후에도 초기의 정제 능력이 유지됨으로 상기 항체 정제의 비용적인 측면에서도 유용하다.The composition and the purification method for the purified immunoglobulin G1 according to the present invention can selectively purify the mouse immunoglobulin G1 with high purity and high efficiency, thereby solving the high cost, low binding force and contamination problem of the conventional protein A column In addition to high stability at high pH, the lipid-adsorbing column according to the present invention is also useful in terms of the cost of the antibody purification since the initial purification ability is maintained even after repeated reuse.

도 1은 면역글로불린 G1 정제용 컬럼인 A6-CNBr4B 컬럼을 사용하여 정제된 쥐 면역글로불린 G의 회수율과 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과이다.
도 2는 A6-CNBr4B 컬럼으로부터 용출된 면역글로불린 G의 아형(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)을 ELISA를 수행결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에서 나타낸 A6-CNBr4B 컬럼에 흡착되지 않고 빠져나온 면역글로불린 G에 대한 ELISA 결과로, 컬럼에 흡착되지 않은 완충용액 중에는 면역글로불린 G1이 없음을 의미한다.
도 4는 A6-CNBr4B 컬럼의 시료 주입 완충용액의 pH에 따른 면역글로불린 G1의 정제 비율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4에 나나낸 결과를 바탕으로 A6-CNBr4B 컬럼에 pH 구배를 이용한 세척과정으로 면역글로불린 G1의 정제 비율 확인한 결과이다.
도 6은 A6-CNBr4B 컬럼의 세척용 완충용액의 조성 및 카오트로픽 염의 농도에 의한 면역글로불린 G1의 정제 비율 확인한 결과이다.
도 7은 A6-CNBr4B 컬럼과 Protein A 컬럼의 면역글로불린 G1의 정제 성능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Protein A 컬럼으로부터 면역글로불린 G1의 정제방법인 pH 6.0 용출액을 이용하여 정제한 면역글로불린 G1과 A6-CNBr4B 컬럼으로부터 정제된 면역글로불린 G1의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 랭뮤어 등온선 모델을 이용하여 A6-CNBr4B 컬럼과 Protein A 컬럼의 면역글로불린 G1에 대한 결합 수용량 보여주는 그래프이다. FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE analysis and recovery of purified immunoglobulin G using an A6-CNBr4B column, which is an immunoglobulin G1 purification column.
Fig. 2 shows the result of ELISA on immunoglobulin G subtypes (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) eluted from the A6-CNBr4B column.
FIG. 3 shows that immunoglobulin G1 is absent in the buffer solution not adsorbed to the column as a result of ELISA for immunoglobulin G that has not been adsorbed to the A6-CNBr4B column shown in FIG.
FIG. 4 shows the results of confirming the purification ratio of the immunoglobulin G1 according to the pH of the sample injection buffer solution of the A6-CNBr4B column.
FIG. 5 shows the result of confirming the purification ratio of the immunoglobulin G1 by washing with a pH gradient on the A6-CNBr4B column based on the results shown in FIG.
FIG. 6 shows the results of confirming the purification ratio of the immunoglobulin G1 by the composition of the buffer solution for washing of the A6-CNBr4B column and the concentration of the chaotropic salt.
Figure 7 shows the results of comparing the purification performance of the immunoglobulin G1 of the A6-CNBr4B column and Protein A column.
FIG. 8 shows the results of SDS-PAGE of immunoglobulin G1 purified from immunoglobulin G1 and A6-CNBr4B columns purified using pH 6.0 eluant, which is a purification method of immunoglobulin G1 from Protein A column.
9 is a graph showing the binding capacity of the A6-CNBr4B column and protein A column to the immunoglobulin G1 using the Langmuir isotherm model.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 발명에서는 protein A 흡착 컬럼의 문제점을 해결하고, 고순도/고효율로 쥐 면역글로불린 G1을 정제할 수 있는 정제용 조성물 및 정제조건을 확인하고자 하였다. The present invention solves the problems of the protein A adsorption column and confirms the purification composition and the purification conditions capable of purifying the immunoglobulin G1 with high purity and high efficiency.

본 발명에서는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 리피바디를 흡착시킨 레진을 컬럼에 충진하여 쥐 면역글로불린 G1에 특이적으로 결합하는 컬럼을 제조한 다음, 다양한 종류의 완충용액 및 다양한 종류의 카오트로픽 염(chatropic salt)의 농도에 따른 쥐 면역글로불린 G1의 정제효과를 확인하였다. In the present invention, a column adsorbing a lipid body represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is packed in a column to prepare a column specifically binding to a mouse immunoglobulin G1. Then, various kinds of buffer solutions and various kinds of CaO The purification effect of rat immunoglobulin G1 according to the concentration of tropic salt (chatropic salt) was confirmed.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 리피바디를 흡착시킨 레진을 컬럼에 충진하여 쥐 면역글로불린 G1에 특이적으로 결합하는 컬럼을 제조한 다음, 평형화 시킨 후, 쥐 혈청을 흘려준 뒤, 소디움 사이트레이트 완충용액(sodium citrate, pH 5.0), 소디움 아세테이트 완충용액(sodium acetate buffer, pH 5.0), 글라이신-HCl 완충용액(Glycine-HCl, pH 5.0) 및 아르기닌-HCl 완충용액(Arginine-HCl, pH 5.0)으로 구성된 군에서 선택되는 완충용액과 마그네슘 클로라이드(Magnesium chloride, MgCl2) 또는 포타슘 싸이오사이아네이트(potassium thiocyanate, KSCN)를 카오트로픽 염(chaotropic salt)으로 포함하는 정제용 조성물로 상기 컬럼을 세척한 후, 항체 용출용액으로 컬럼에 결합한 면역글로불린을 확인한 결과, 아르기닌-HCl 완충용액 및 KSCN을 포함하는 정제용 조성물에서 쥐 면역글로불린 G1이 가장 높은 순도로 정제되는 것을 확인하였다(도 6) That is, in one embodiment of the present invention, a column adsorbing a lipid body represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is packed in a column to prepare a column specifically binding to a mouse immunoglobulin G1. After equilibrium, After the serum was flowed, sodium citrate (pH 5.0), sodium acetate buffer (pH 5.0), glycine-HCl buffer (Glycine-HCl, pH 5.0) and arginine- Buffer solution containing magnesium chloride or potassium thiocyanate (KSCN) as a chaotropic salt in a buffer solution selected from the group consisting of sodium chloride, potassium hydroxide, and a solution (Arginine-HCl, pH 5.0) After washing the column with the composition for purification, the immunoglobulin bound to the column was confirmed with the antibody eluting solution. As a result, the composition for purification containing Arginine-HCl buffer solution and KSCN Standing rat was confirmed to be purified as immunoglobulin G1 have the highest purity (Fig. 6)

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 완충용액 및 포타슘 싸이오사이아네이트(potassium thiocyanate, KSCN)을 포함하는 쥐 면역글로불린 G1 정제용 조성물에 관한 것이다.Accordingly, the present invention, in one aspect, relates to a composition for the purification of a murine immunoglobulin G1 comprising a buffer solution and potassium thiocyanate (KSCN).

본 발명에 있어서, 상기 완충용액은 소디움 사이트레이트(sodium citrate), 소디움 아세테이트(sodium acetate buffer), 글라이신-HCl(Glycine-HCl) 및 아르기닌-HCl(Arginine-HCl)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the buffer solution is selected from the group consisting of sodium citrate, sodium acetate buffer, glycine-HCl, and arginine-HCl. However, the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 pH 3.0 내지 9.0인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the pH of the buffer solution may be pH 3.0 to 9.0, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 완충용액은 0.01 ~ 0.1M 아르기닌-HCl인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the buffer solution may be characterized by being 0.01 to 0.1 M arginine-HCl.

본 발명에 있어서, 상기 KSCN의 농도는 10~100mM 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니나, KSCN의 농도가 10mM 이하일 경우에는 세척효과가 없으며, 100mM 이상일 경우에는 항체 정제 효과가 감소되어 10~100mM 인 것이 바람직하다.In the present invention, the KSCN concentration may be 10-100 mM, but it is not limited thereto. When the KSCN concentration is 10 mM or less, there is no cleaning effect. When the concentration is 100 mM or more, the antibody purification effect is decreased It is preferably 10 to 100 mM.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 리피바디를 흡착시켜 컬럼을 제작하는 단계; (b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음, 쥐 면역글로불린 G1을 포함하는 쥐 혈청을 흡착시키는 단계; (c) 상기 조성물로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및 (d) 항체 용출용액으로 흡착된 쥐 면역글로불린 G1을 용출하는 단계;를 포함하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition comprising the steps of: (a) adsorbing a lipid body represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to produce a column; (b) equilibrating the column and then adsorbing rat serum containing a murine immunoglobulin G1; (c) washing the column with the composition; And (d) eluting the murine immunoglobulin G1 adsorbed with the antibody eluting solution.

서열번호 1 Repebody-A6:SEQ ID NO: 1 Repebody-A6:

ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNELNSIDQIIAYGSDIKSVQGIQYLPNVRYLVLSRNKLHDISALKELTNLTYLELKWNQLQILPNGVFDKLTNLKELVLNSNQLQSLPDGVFDKLTNLTYLNLAHNQLQSLPDGVFDKLTNLTGLELCGNQLQSLPEGVFDKLTQLKDLRLYQNQLKSVPDGVFDRLTSLQYIWLHDNPWDCTCPGIRYLSEWINKHSGVVRLMSSLMAPDSAKCSGSGKPVRSIICPTETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNELNSIDQIIAYGSDIKSVQGIQYLPNVRYLVLSRNKLHDISALKELTNLTYLELKWNQLQILPNGVFDKLTNLKELVLNSNQLQSLPDGVFDKLTNLTYLNLAHNQLQSLPDGVFDKLTNLTGLELCGNQLQSLPEGVFDKLTQLKDLRLYQNQLKSVPDGVFDRLTSLQYIWLHDNPWDCTCPGIRYLSEWINKHSGVVRLMSSLMAPDSAKCSGSGKPVRSIICPT

본 발명의 용어 "리피바디(Repebody)"란, LRR 구조를 갖는 인터날린의 N-말단과 VLR 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩티드이다. 리피바디 단백질은 구조상 오목한 지역(concave)과 볼록한 지역(convex)으로 나누어 질 수 있다 (도 1). 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 리피바디 단백질은 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리화학적 성질을 향상 시킨 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.The term "Repebody " of the present invention refers to a polypeptide that is fused on the basis of the similarity of the VLR structure with the N-terminus of interleukin having an LRR structure and optimized by consensus design. Lipid body proteins can be divided into structurally concave and convex regions (Fig. 1). Here, concave regions are high in sequence diversity and are known to be important for protein interaction. Conversely, the convex region plays a role in maintaining the overall structure of the protein stably based on the highly conserved sequence. Lipid body proteins can include all of the proteins belonging to the LRR family with repetitive modules, both in terms of water solubility and in the fusion lRR family proteins, which have improved the biochemical properties of the proteins.

본 발명의 용어 "가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR)"란, 먹장어와 칠성장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 먹장어와 칠성장어에서 발현되는 면역 기능 단백질로 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩티드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하므로, 이를 기반으로 한 신규 단백질 치료제 제조에 사용될 수 있다.The term "Variable lymphocyte receptor (VLR)" of the present invention refers to a type of LRR family protein expressed in Euphorbia and Echinochloa, And can be usefully used as a skeleton. The polypeptide fused with the N-terminal and the VLR protein of the interleukin B protein is more soluble and expressed more than the VLR protein not having the interlein B protein fused thereto, and thus can be used for the preparation of a novel protein therapeutic based thereon.

본 발명에서 용어 "LRR(Leucine Rich Repeat) 단백질"이란, 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌을, x는 임의의 아미노산을 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체 내에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것과 더불어 컨센서스 디자인(consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.The term "LRR (Leucine Rich Repeat) protein" in the present invention means a protein consisting of a combination of modules in which lysine is repeated at a predetermined position, and includes (i) one or more LRR repetition modules, (ii) (Iii) the LRR repetition module has conservative pattern "LxxLxxLxLxxN ", wherein L is alanine, glycine, phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, valine and tryptophan N is asparagine, glutamine, serine, cysteine or threonine; x is any amino acid; and (iv) LRR family protein means a protein having a three-dimensional structure such as horseshoe. The LRR family protein of the present invention has a sequence unknown to the natural world through a design such as a consensus design in addition to the sequence already known or discovered using newly derived mRNA or cDNA in vivo, Lt; RTI ID = 0.0 > of < / RTI >

본 발명에서 용어 "인터날린 B 단백질"이란, 리스테리아(Listeria) 균주에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종으로, 다른 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 다른 LRR 패밀리 단백질들과는 상이한 N-말단 구조를 가지고 있어 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복 모듈의 접힘(folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐만 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 안정적인 모양을 가졌기에 미생물에서 LRR 패밀리 단백질들의 안정적인 발현을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다. The term "internulin B protein" in the present invention is a kind of LRR family protein expressed in a Listeria strain, and has a different N-terminal structure from other LRR family proteins in which other hydrophobic cores are uniformly distributed throughout all molecules. And is known to be stably expressed in microorganisms. The N-terminus of this interleukin protein is not only the N-terminal region that is most important for the folding of the repetitive module, but also has a stable shape including the alpha helices. Therefore, the stable expression of the LRR family proteins in the microorganism Can be used effectively.

본 발명에서 용어, "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif) 및 인터날린 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 제한 없이 포함하며, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE" 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 또한 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN"을 포함할 수 있다. 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 임의의 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.The term "N-terminus of internulin protein" in the present invention means the N-terminus of the interleukin protein necessary for water-soluble expression and folding of the protein and includes repeating modules of alpha helical capping motif and interleukin protein it means. The N-terminus of the internulin protein includes, without limitation, the N-terminus of the interleukin protein required for the water-soluble expression and folding of the protein, for example the alpha helical capping motif "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE" and repetitive modules. The repeating module pattern may also include "LxxLxxLxLxxN ". Among the repeating module patterns, L is alanine, glycine, phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, valine or tryptophan; N means asparagine, glutamine, serine, cysteine or threonine, and x means any hydrophilic amino acid. Depending on the type of LRR family protein that can be fused, the N-terminal of the internulin protein can be selected at the N-terminal with high structural similarity. The most stable amino acid can be selected by calculation of the binding energy and the like, Variation is possible.

본 발명에서 상기 리피바디를 흡착시켜 컬럼을 제조하는 단계는 먼저, 상기 리피바디를 레진에 흡착시킨 다음, 빈 컬럼에 충진하여 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the step of adsorbing the lipid body to the column may be performed by first adsorbing the lipid body on the resin, and filling the lipid body in an empty column.

본 발명에서 상기 레진은 단백질을 흡착시켜 컬럼에 충진할 수 있는 종류이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 사이아노겐 브로마이드 활성화 세파로즈 4B(Cyanogen bromide(CNBr)-activated Spharose 4B) 레진인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the resin may be any resin capable of adsorbing a protein and filling the column. Preferably, the resin is a cyanogen bromide (CNBr) -activated Spharose 4B resin. But is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 평형화는 친화성 크로마토그래피를 수행하기 전 컬럼을 안정화시키기 위한 용액이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 0.1M 소디움 사이트레이트(Sodium citrate) pH 9.0 용액을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the equilibrium can be used as long as it is a solution for stabilizing the column before carrying out the affinity chromatography, but it is preferably carried out by using a solution of 0.1 M sodium citrate pH 9.0 However, the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 세척 용액은 컬럼에 결합한 면역글로불린 G1 이외의 불순물을 제거할 수 있는 용액이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 10~100 mM KSCN (potassium thiocyanate)을 포함하고 있는 0.01 ~ 0.1M 아르기닌-HCl(Arginine-HCl), pH 5.0인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the washing solution may be used without limitation as long as it is a solution capable of removing impurities other than immunoglobulin G1 bound to the column, but it is preferably 0.01-1.0 mM containing 10-100 mM KSCN (potassium thiocyanate) M arginine-HCl, pH 5.0, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 용출용액은 세척 후, 컬럼에 결합한 면역글로불린 G1을 용출시킬 수 있는 용액이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 0.1M 소디움 아세테이트(Sodium acetate), pH 약 3.0인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the elution solution can be used without limitation as long as it is a solution capable of eluting immunoglobulin G1 bound to the column after washing. Preferably, the elution solution is 0.1 M sodium acetate and the pH is about 3.0 But is not limited thereto.

실시예Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: 쥐 면역글로불린 G1 (IgG1) 친화성 레진 및 흡착 컬럼 제작Example 1 Preparation of Mouse Immunoglobulin G1 (IgG1) Affinity Resin and Adsorption Column

대한민국 특허 제10-2016-0012183호의 서열번호 13(repebody-A6)을 이용한 항체 정제용 레진을 제작하기 위하여 레진 제조사에서 제공하는 방법에 따라 repebody-A6 흡착 레진을 제작 하였다. 구체적으로, 1 ml의 Cyanogen bromide (CNBr)-activated Sepharose 4B (GE Healthcare Life Science, United Kingdom)를 15 mg repebody-A6가 포함된 0.1 M NaHCO₃ (pH 8.5, 5 ml)에서 4 ℃에서 하루 동안 반응 시킨다. 반응액을 제거 한 후 블로킹 완충용액(0.5 M ethanolamine, 0.5 M NaCl, pH 8.3)에 상온에서 두 시간 동안 반응 시킨다. 반응 후 PBS (Phosphate-buffered saline, pH 8.4)로 세척하여 4 ℃에 보관하였다. 제작된 레진 1 ml을 빈 컬럼에 충진하여 항체 정제용 A6-CNBr4B 컬럼을 제작하여 항체 정제에 이용하였다.In order to prepare a resin for purification of antibody using Korean Patent No. 10-2016-0012183 of SEQ ID NO: 13 (repebody-A6), a repebody-A6 adsorption resin was prepared according to a method provided by a resin manufacturer. Specifically, 1 ml of Cyanogen bromide (CNBr) -activated Sepharose 4B (GE Healthcare Life Science, United Kingdom) was dissolved in 0.1 M NaHCO ₃ (pH 8.5, 5 ml) containing 15 mg of repebody- Respectively. After the reaction solution has been removed, the reaction mixture is reacted at room temperature for 2 hours in blocking buffer (0.5 M ethanolamine, 0.5 M NaCl, pH 8.3). After the reaction, the cells were washed with PBS (phosphate-buffered saline, pH 8.4) and stored at 4 ° C. 1 ml of the prepared resin was filled in an empty column to prepare an A6-CNBr4B column for antibody purification and used for antibody purification.

실시예 2: A6-CNBr4B 컬럼의 쥐 면역글로불린 G 정제능 분석Example 2: Purification of mouse immunoglobulin G from A6-CNBr4B column

실시예 1에서 제작된 컬럼에 대하여 쥐 면역글로불린 G에 대한 정제능을 분석하기 위하여 PBS (pH 8.4)에 용해된 쥐 면역글로불린 G (sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 컬럼은 PBS로 평형화 시킨 후, 상기 완충용액 5 ml에 1 mg의 쥐 면역글로불린 G를 용해시켜 컬럼에 흡착 시켰다. 항체를 흡착시킨 컬럼은 상기 완충용액 5 ml로 세척 한 후, 항체 용출용액(0.1 M sodium acetate, pH 3.0)을 이용하여 1 ml씩 분취하였으며, UV 흡광도 254 nm에서 흡광도를 측정하여 용출된 면역글로불린 양을 측정하였다. 용출액은 붕산계 완충용액(1 M, pH 8.5)으로 곧 바로 중화 시킨 후, SDS-PAGE로 분석하였다. Rat immunoglobulin G (Sigma-Aldrich, USA) dissolved in PBS (pH 8.4) was used to analyze the purification ability of the column prepared in Example 1 for mouse immunoglobulin G. The column was equilibrated with PBS, and 1 mg of mouse immunoglobulin G was dissolved in 5 ml of the buffer to adsorb it on the column. The column adsorbed the antibody was washed with 5 ml of the buffer solution, and the antibody was eluted with 1 ml of antibody eluting solution (0.1 M sodium acetate, pH 3.0). The absorbance at 254 nm of UV absorbance was measured to determine the eluted immunoglobulin The amount was measured. The eluate was immediately neutralized with boric acid buffer solution (1 M, pH 8.5) and analyzed by SDS-PAGE.

그 결과, A6-CNBr4B 컬럼으로부터 용출된 항체는 약 56%의 회수율을 나타내었으며 95% 이상의 순도로 정제된 것을 확인하였다(도 1).As a result, it was confirmed that the antibody eluted from the A6-CNBr4B column showed a recovery of about 56% and purified at a purity of 95% or more (FIG. 1).

실시예 3: 정제한 항체의 면역글로불린 G 아형(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)의 혼합 비율 측정Example 3: Measurement of mixing ratio of immunoglobulin G subtypes (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) of purified antibodies

실시예 2에서 정제한 항체에 포함되어져 있는 면역글로불린 G 아형의 비율을 확인하기 위하여 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. 용출된 항체를 100 ng/ml 농도로 96-웰 플레이트에 4℃에서 고정시킨 후 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 3번 세척하였다. 세척한 플레이트를 5% BSA (Bovine serum albumin)를 포함하고 있는 TBST 용액으로 상온에서 2 시간 동안 블로킹 하였다. 이후 각각의 아형에 대한HRP (Horseradish peroxidase)가 결합된 이차 항체를 0.2 ug/ml으로 상기 플레이트에 처리하였다. 상온에서 1 시간 반응 후 TPBS로 3번 세척 후 HRP의 기질인 TMB (Tetramethylbenzidine)를 처리하였고, 반응을 중지하기 위해 황산을 처리하여 450 nm 파장에서 흡광도 값을 측정하였다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to confirm the ratio of the immunoglobulin G subtype contained in the antibody purified in Example 2. The eluted antibody was fixed at 4O < 0 > C in a 96-well plate at a concentration of 100 ng / ml and washed three times with PBS solution (TPBS) containing 0.05% Tween 20. The washed plate was blocked with TBST solution containing 5% BSA (Bovine serum albumin) at room temperature for 2 hours. Then, the plate was treated with 0.2 ug / ml of a secondary antibody conjugated with HRP (Horseradish peroxidase) for each subtype. After reacting for 1 hour at room temperature, TBS (Tetramethylbenzidine), which is a substrate of HRP, was treated after 3 washes with TPBS. The absorbance value was measured at 450 nm wavelength by treatment with sulfuric acid to stop the reaction.

실시예 2에 이용한 쥐 면역글로불린 G에는 면역글로불린 G1과 면역글로불린 G2a가 각각 53.6%, 42.6%, 면역글로불린 G2b와 면역글로불린 G3가 나머지 3.8%로 나타났다. A6-CNBr4B 컬럼으로부터 용출된 항체에서는 면역글로불린 G1이 87.9%로 가장 높은 비율을 차지하였으며 다음으로 면역글로불린 G2a가 11.4%로 나타났다. 상기 결과에서 A6-CNBr4B 레진은 쥐 면연글로불린 G중에서도 아형인 면역글로불린 G1에 결합력이 높다는 것을 확인하였다(도 2).Immunoglobulin G1 and immunoglobulin G2a used in Example 2 were 53.6% and 42.6%, and immunoglobulin G2b and immunoglobulin G3 were 3.8%, respectively. In the antibody eluted from the A6-CNBr4B column, immunoglobulin G1 occupied the highest proportion (87.9%), followed by immunoglobulin G2a (11.4%). From the above results, it was confirmed that the A6-CNBr4B resin has a high binding capacity to the immunoglobulin G1, which is a subtype of the rat gamma globulin G (FIG. 2).

실시예 2에서 A6-CNBr4B 컬럼에 흡착되지 않고 빠져나온 분획을 이용하여 다시 A6-CNBr4B 컬럼에 주입하였다. 이때 컬럼에 흡착되지 않고 빠져 나온 분획과 용출액으로부터 용출된 분획을 상기의 ELISA를 수행 하였다. 그 결과, 쥐 면역글로불린 G를 컬럼에 주입한 후 빠져 나오는 분획에서는 면역글로불린 G1이 없음을 확인하였다(도 3). 따라서 A6-CNBr4B 컬럼은 면역글로불린 G1을 선택적으로 정제할 수 있음을 확인하였다. The fraction eluted from the A6-CNBr4B column without adsorption in Example 2 was injected again into the A6-CNBr4B column. At this time, the ELISA was performed on the fractions eluted from the eluate and the fractions exiting without being adsorbed on the column. As a result, it was confirmed that no immunoglobulin G1 was present in the excreted fraction after injecting the mouse immunoglobulin G into the column (FIG. 3). Therefore, it was confirmed that the A6-CNBr4B column can selectively purify the immunoglobulin G1.

실시예 4: 리피바디 A6 레진의 쥐 면역글로불린 G1에 대한 정제 순도 증대 방법 수행Example 4: Performing a purification purity increasing method for the murine immunoglobulin G1 of Lipid body A6 resin

4-1: 시료 주입 완충용액의 pH에 따른 정제 순도 증대 방법4-1: Increasing the purification purity according to the pH of the sample injection buffer solution

쥐 면역글로불린 G 각각의 아형들은 완충용액의 pH에 따라 리간드에 대한 다른 결합력을 나타내므로 쥐 면역글로불린 G1을 최대로 A6-CNBr4B 컬럼에 흡착시키기 위하여 컬럼에 시료 주입시 사용되는 완충용액의 pH를 조절하여 면역글로불린 G를 흡착 시킨 후 용출되어져 나오는 면역글로불린 G1의 비율을 비교하였다. 쥐 면역글로불린 G를 2 M 소듐클로라이드(Sodium chloride, NaCl)을 포함하고 있는 pH 7.4, pH 8.7, pH 9.3의 각각의 완충용액에 용해시킨 후 상기 실시예 2, 3과 같이 항체를 용출하여 ELISA를 수행하였다.Because each subtype of mouse immunoglobulin G exhibits different binding affinities to the ligand depending on the pH of the buffer solution, the pH of the buffer solution used for sample injection into the column is adjusted to maximize the adsorption of the mouse immunoglobulin G1 to the A6-CNBr4B column And the ratio of immunoglobulin G1 eluted after adsorption of immunoglobulin G was compared. The murine immunoglobulin G was dissolved in each buffer solution containing 2 M sodium chloride (NaCl) at pH 7.4, pH 8.7, and pH 9.3. Then, the antibody was eluted and analyzed by ELISA Respectively.

그 결과 pH 9.3 완충용액(100 mM sodium carbonate buffer)에서 90%로 가장 높은 효율로 면역글로불린 G1이 정제 되는 것을 확인하였다(도 4).As a result, it was confirmed that the immunoglobulin G1 was purified with the highest efficiency of 90% in the pH 9.3 buffer (100 mM sodium carbonate buffer) (FIG. 4).

4-2: pH 구배를 이용한 세척과정을 통한 정제 순도 증대 방법4-2: Refining purity increase method by washing with pH gradient

protein A 컬럼의 경우에는 용출액의 pH를 조절하여 면역글로불린 아형을 서로 분리 할 수 있다. 따라서, 실시예 2에서와 같이 A6-CNBr4B 컬럼에 쥐 면역글로불린 G를 주입한 후 면역글로불린 G1을 제외한 면역글로불린 G의 다른 아형 및 불순물들을 제거하기 위하여 pH 구배를 사용하였다. 즉, 소디움 사이트레이트 완충용액(sodium citrate buffer, 0.1 M)으로 pH 6.0에서 pH 3.0 까지 순차적으로 용출시켰다. For protein A columns, the pH of the eluate can be adjusted to separate immunoglobulin subtypes from each other. Thus, a pH gradient was used to remove other subtypes and impurities of the immunoglobulin G except for the immunoglobulin G1 after the rat immunoglobulin G was injected into the A6-CNBr4B column as in Example 2. That is, the solution was sequentially eluted from pH 6.0 to pH 3.0 with sodium citrate buffer (0.1 M).

그 결과, pH 구배에 따라, pH 5.0에서 면역글로불린 G1의 손실 없이 다른 아형의 면연글로불린이 제거됨을 확인하였다(도 5). As a result, it was confirmed that, depending on the pH gradient, other subtypes of gamma globulin were removed without loss of immunoglobulin G1 at pH 5.0 (FIG. 5).

4-3: 카오트로픽 염(chaotropic salt) 농도에 따른 정제 순도 증대 방법4-3: Improvement of purification purity according to chaotropic salt concentration

면역글로불린 G는 카오트로픽 염의 농도에 따라 항체와의 결합력이 다르게 나타나므로 세척용 완충용액에 카오트로픽 염을 첨가하여 면역글로불린 G1 정제 순도를 비교하였다. 세척용 완충용액으로는 실시예 4-2에서 사용한 소디움 사이트레이트 완충용액(sodium citrate, pH 5.0), 소디움 아세테이트 완충용액(sodium acetate buffer, pH 5.0), 글라이신-HCl 완충용액(Glycine-HCl, pH 5.0), 아르기닌-HCl 완충용액(Arginine-HCl, pH 5.0)을 사용하였으며, 카오트로픽 염으로 마그네슘 클로라이드(Magnesium chloride, MgCl2) 및 포타슘 싸이오사이아네이트(potassium thiocyanate, KSCN)를 포함하고 있다 (표 1).Immunoglobulin G and purified cholinesterase G1 were purified by adding chaotropic salts to the buffer solution for washing. As the buffer solution for washing, sodium citrate (pH 5.0), sodium acetate buffer (pH 5.0), glycine-HCl buffer (Glycine-HCl, pH 5.0 and Arginine-HCl buffer (Arginine-HCl, pH 5.0) were used as a chaotropic salt, and magnesium chloride (MgCl2) and potassium thiocyanate (KSCN) Table 1).

[표 1][Table 1]

완충용액 및 카오트로픽 염 조건Buffer and chaotropic salt conditions

A6-CNBr4B 컬럼에 Balb/c 쥐에서 분리한 혈청(serum) 1 ml을 실시예 4-1에서 확인한 0.1 M 소디움 사이트레이트 완충용액(pH 9.0)에 4 ml에 희석 하여 주입하였다. 쥐 혈청을 주입한 컬럼은 표 1에 제시한 세척용 완충용액을 이용하여 세정과정을 거친 후 용출용액을 이용하여 항체를 용출한 후 ELISA를 통해 면역글로불리 G1의 비율을 비교하였다.To the A6-CNBr4B column, 1 ml of serum isolated from Balb / c mice was diluted into 4 ml of 0.1 M sodium citrate buffer (pH 9.0) as confirmed in Example 4-1. The column injected with the rat serum was washed with the buffer solution for washing shown in Table 1, and eluted with the elution solution, and the ratio of immunoglobulin G1 was compared by ELISA.

그 결과, 소디움 사이트레이트 완충용액, 소디움 아세테이트 완충용액, 글라이신-HCl 완충용액에서는 면역글로불린 G1의 비율이 85% ~ 91%로 카오트로픽 염에 관계없이 낮은 세척효율이 나타났으며, 아르기닌-HCl 완충용액에서 95%이상 높은 세척 효율을 나타내는 것을 확인하였다(도 6).As a result, the immunoglobulin G1 ratio in the sodium citrate buffer solution, sodium acetate buffer solution and glycine-HCl buffer solution was 85% ~ 91%, which showed low washing efficiency irrespective of the chaotropic salt and arginine-HCl buffer And showed a cleaning efficiency of 95% or higher in the solution (Fig. 6).

실시예 5: A6-CNBr4B 컬럼의 면역글로불린 G1 정제 순도 검증Example 5 Purification of Immunoglobulin G1 Purification of A6-CNBr4B Column

실시예 4-3으로부터 아르기닌-HCl 완충용액을 이용한 세척 단계를 통해 정제된 면역글로불린 G1의 정제 순도를 검증하기 위하여, 머크사(Merck Millipore, USA)에서 구매한 쥐 면역글로불린 G1으로 표준항체용액(Standard IgG1 solution)을 제조하여 검량선을 작성하였다. 면역글로불린 G1에 대한 1차 항체(goat anti-mouse IgG1)가 코팅된 96-웰 플레이트에 상기 용출된 면역글로불린 G1을 100 ng/ml 농도로 처리하였다. 상온에서 2 시간 반응 후 TPBS로 3 번 세척하고 HRP가 결합된 면역글로불린 G1에 대한 2차 항체(rabbit anti-mouse IgG1:HRP)를 처리하였다. 상온에서 1 시간 반응 후 TPBS로 3 번 세척한 후 TMB 용액을 이용하여 450 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 검량선에 대조하여 면역글로불린 G1의 농도를 확인하여 정제 순도를 검증하였다. From Example 4-3, to verify the purification purity of the purified immunoglobulin G1 through the washing step with arginine-HCl buffer, a standard antibody solution (manufactured by Merck Millipore, USA) Standard IgG1 solution) was prepared and a calibration curve was prepared. The eluted immunoglobulin G1 was treated at a concentration of 100 ng / ml in a 96-well plate coated with primary antibody (goat anti-mouse IgG1) for immunoglobulin G1. After 2 hours of reaction at room temperature, the cells were washed 3 times with TPBS and treated with a secondary antibody (rabbit anti-mouse IgG1: HRP) against immunoglobulin G1 bound to HRP. After reacting for 1 hour at room temperature, it was washed 3 times with TPBS and absorbance value was measured at 450 nm using TMB solution. The measured absorbance value was compared with the calibration curve to confirm the concentration of immunoglobulin G1, and the purification purity was verified.

그 결과, 세척용 완충용액으로 이용된 아르기닌-HCl의 농도와는 관계없이 완충용액에 첨가한 카오트로픽 염인 KSCN의 농도 50 mM에서 97% 이상의 높은 정제 순도가 나타나며, Balb/C 혈청에 존재하는 면역글로불린 G1 (2.06 mg/ml)에 대해서 회수율이 97% 이상으로 높은 효율성이 나타나는 것을 확인하였다(표 2). As a result, irrespective of the concentration of arginine-HCl used as a buffer solution for washing, a purified purity of 97% or more at a concentration of 50 mM of KSCN, which is a chaotropic salt added to the buffer solution, It was confirmed that the efficiency of recovery was 97% or more for globulin G1 (2.06 mg / ml) (Table 2).

[표 2][Table 2]

정제 순도 검증 결과Refining purity verification result

실시예 6: A6-CNBr4B 컬럼과 protein A 컬럼의 쥐 면역글로불린 G1의 정제 성능 비교Example 6: Comparison of purification performance of mouse immunoglobulin G1 on A6-CNBr4B column and protein A column

A6-CNBr4B 컬럼과 시중에서 판매되고 있는 항체 정제용 컬럼인 protein A 컬럼의 면역글로불린 G1의 정제 성능을 비교 분석하기 위하여 Balb/C 쥐 혈청을 이용하여 실시예 2에서 기술한 것과 같이 면역글로불린 G를 정제하고, 실시예 3에서와 같이 ELISA를 수행하였다. To compare the purification performance of the immunoglobulin G1 of the A6-CNBr4B column and the protein A column, which is a commercially available antibody purification column, Balb / C mouse serum was used to compare the immunoglobulin G Purified and subjected to ELISA as in Example 3.

그 결과, 쥐 혈청 1 ml을 주입한 protein A 컬럼은 모든 아형의 면역글로불린 G가 용출되었으며, 이중 면역글로불린 G1의 비율은 30% ~ 32%로 나타났다. A6-CNBr4B 컬럼에서는 상기 실시예에서와 같이 정제 조건을 최적화 하지 않았음에도 면역글로불린 G1의 비율이 92%로 나타나는 것을 확인하였다(도 7). As a result, the protein A column injected with 1 ml of rat serum eluted all subunit immunoglobulin G, and the ratio of double immunoglobulin G1 was 30% ~ 32%. In the A6-CNBr4B column, it was confirmed that the ratio of immunoglobulin G1 was 92% even though the purification conditions were not optimized as in the above example (Fig. 7).

일반적으로 protein A 컬럼은 항체 용출용액의 pH를 조절하여 면역글로불린 아형을 분리할 수 있다. 면역글로분린 G1은 pH 6.0의 용출용액에 분리되어 정제가 가능하다. 따라서 상기의 방법으로 쥐 혈청 1 ml을 주입하고 pH 6.0에서의 면역글로불린 G1을 분리 용출 한 후 나머지 면역글로불린 G 아형들은 pH 3.0 용출액으로 모두 분리 정제하여 A6-CNBr4B 컬럼과 비교하였다. In general, the protein A column can separate the immunoglobulin subtypes by controlling the pH of the antibody eluting solution. Immunoglobulin G1 can be separated and purified in an elution solution of pH 6.0. Therefore, 1 ml of rat serum was injected and immunoglobulin G1 was eluted at pH 6.0, and the remaining immunoglobulin G subtypes were separately purified by pH 3.0 eluate and compared with the A6-CNBr4B column.

그 결과, 면역글로불린 G1의 정제 조건으로 protein A 컬럼으로부터 정제된 100 ng/ml의 면역글로불린 G에 대한 면역글로불린 G1의 비율은 90%이며, 쥐 혈청 1 ml으로부터 정제된 면역글로불린 G1의 양이 평균 0.215 mg으로 A6-CNBr4B 컬럼의 98.6%, 1.7 mg의 면역글로불린 G1에 대해서 낮은 정제 성능이 나타나는 것을 확인하였다(표 3). 또한, SDS-PAGE를 통한 면역글로불린 G의 정제 순도를 확인 결과에서도 A6-CNBr4B 컬럼은 98% 이상으로 고순도로 정제 가능하였으나 면역글로불린 G1의 정제조건에서의 protein A 컬럼은 94%로 상대적으로 낮은 순도로 정제되는 것을 확인하였다(도 8).As a result, the ratio of immunoglobulin G1 to 100 ng / ml immunoglobulin G purified from the protein A column as the purification condition of immunoglobulin G1 was 90%, and the amount of purified immunoglobulin G1 from the rat serum 0.215 mg, indicating that the purification performance was low for 98.6% of the A6-CNBr4B column and 1.7 mg of the immunoglobulin G1 (Table 3). In addition, the purified purity of immunoglobulin G by SDS-PAGE was confirmed, and the A6-CNBr4B column was purified to a high purity of 98% or more. However, the protein A column in the purification condition of immunoglobulin G1 had 94% (Fig. 8).

[표 3][Table 3]

Protein A 컬럼과 본 발명의 컬럼 성능 비교Comparison of Protein A Columns and Column Performance of the Invention

실시예 7: 면역글로불린 G1에 대한 A6-CNBr4B 컬럼의 최대 결합 수용량(Maximum binding capacity) 검증Example 7: Verification of maximum binding capacity of A6-CNBr4B column for immunoglobulin G1

상기 실시예에서 이용한 흡착 컬럼들에 대한 면역글로불린 G1의 최대 결합 수용량을 비교하기 위하여 랭뮤어 등온선 모델(Langmuir isotherm model)을 이용하여 계산하였다 (도 9). The maximum binding capacity of the immunoglobulin G1 to the adsorption columns used in the above examples was calculated using the Langmuir isotherm model (FIG. 9).

그 결과, 시중에 판매되고 있는 protein A 컬럼은 면역글로불린 G1에 대해서 27.2 mg/ml의 최대 결합 수용량을 나타내는 반면, A6-CNBr4B 컬럼은 최대 결합 수용량이 42.8 mg/ml로 나타났으며, 이는 protein A 컬럼에 비해 약 20 mg/ml 높은 수용력 가지고 있음을 확인 할 수 있었다(도 9).As a result, the commercially available protein A column showed a maximum binding capacity of 27.2 mg / ml for immunoglobulin G1, while the A6-CNBr4B column showed a maximum binding capacity of 42.8 mg / ml, indicating that protein A (Fig. 9), which is about 20 mg / ml higher than that of the column.

상기의 예시에 제시한 결과로 부터 시료의 주입은 2M 소디움 클로라이드를 포함하는 pH 9.0 이상의 완충용액을 사용하고, 컬럼 세척과정은 카오트로픽 염 50 mM KSCN을 포함하는 pH 5.0의 아르기닌-HCl 완충용액을 사용함으로써 면역글로불린 G1을 고순도로 효율적으로 정제할 수 있음을 알 수 있다. 또한 A6-CNBr4B 컬럼은 기존의 protein A 컬럼과 비교해 약 1.5배 이상의 많은 양의 면역글로불린 G1를 한 번에 정제할 수 있다.From the results shown in the above example, the sample is injected using a buffer solution having a pH of 9.0 or more containing 2M sodium chloride, and the column washing procedure is carried out using an arginine-HCl buffer solution of pH 5.0 containing chaotropic salt 50 mM KSCN It can be seen that immunoglobulin G1 can be efficiently purified with high purity by use. In addition, the A6-CNBr4B column is able to purify the immunoglobulin G1 at a time, which is about 1.5 times greater than the conventional protein A column.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereto will be. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

SEQUENCE LISTING <110> Repugen Co., Ltd <120> Composition for purifying mouse immunoglobulin G1 and Uses thereof <130> P18-B051 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Repebody-A6 <400> 1 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Tyr Gly Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Val Leu Ser Arg Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Leu Lys Trp Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Val Leu Asn Ser Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Glu Leu Cys Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Leu 225 230 235 240 Met Ser Ser Leu Met Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265                          SEQUENCE LISTING <110> Repugen Co., Ltd   <120> Composition for purifying mouse immunoglobulin G1 and Uses        the <130> P18-B051 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Repebody-A6 <400> 1 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr             20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala         35 40 45 Tyr Gly Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn     50 55 60 Val Arg Tyr Leu Val Leu Ser Arg Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Leu Lys Trp Asn Gln                 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys             100 105 110 Glu Leu Val Leu Asn Ser Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val         115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln     130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Glu Leu Cys Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val                 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln             180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln         195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile     210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Leu 225 230 235 240 Met Ser Ser Leu Met Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly                 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr             260 265

Claims (11)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 리피바디를 흡착시켜 컬럼을 제작하는 단계;
(b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음, 쥐 면역글로불린 G1을 포함하는 쥐 혈장을 흡착시키는 단계;
(c) 10~100mM 포타슘 싸이오사이아네이트(potassium thiocyanate, KSCN)을 포함하는 0.01 ~ 0.1M 아르기닌-HCl 용액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및
(d) 항체 용출용액으로 흡착된 쥐 면역글로불린 G1을 용출하는 단계;
를 포함하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법.
(a) preparing a column by adsorbing a lipid body represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) equilibrating the column and then adsorbing rat plasma comprising the murine immunoglobulin G1;
(c) washing the column with 0.01 to 0.1 M arginine-HCl solution containing 10 to 100 mM potassium thiocyanate (KSCN); And
(d) eluting the murine immunoglobulin G1 adsorbed by the antibody eluting solution;
Lt; RTI ID = 0.0 &gt; Gl &lt; / RTI &gt;
제6항에 있어서, 상기 평형화는 0.1M 소디움 사이트레이트(Sodium citrate) pH 9.0 용액을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법.
7. The method of claim 6, wherein the equilibration is performed using 0.1 M sodium citrate pH 9.0 solution.
삭제delete 제6항에 있어서, 상기 세척용액의 pH는 5.0인 것을 특징으로 하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법.
7. The method of claim 6, wherein the pH of the washing solution is 5.0.
제6항에 있어서, 상기 용출용액은 0.1M 소디움 아세테이트(Sodium acetate)인 것을 특징으로 하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법.
7. The method of claim 6, wherein the elution solution is 0.1 M sodium acetate.
제10항에 있어서, 상기 용출용액의 pH는 3.0인 것을 특징으로 하는 쥐 면역글로불린 G1의 정제방법.11. The method of claim 10, wherein the pH of the elution solution is 3.0.

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