KR101894984B1 - 환원력이 증가된 캔디다 속 변이 균주 및 이의 용도 - Google Patents

환원력이 증가된 캔디다 속 변이 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 내 환원력이 증가된 변이 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이 균주는 대사흐름 조작에 의해 NADPH의 생산능이 향상되었을 뿐만 아니라, 유용물질의 시간당 생산성을 향상시킬 수 있어 유용물질의 산업적 생산에 유용하다.

Description

환원력이 증가된 캔디다 속 변이 균주 및 이의 용도{Mutant Candida strains having enhanced reduction force and uses thereof}
본 발명은 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속(Candida) 변이 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자 및 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자의 이배체가 녹아웃 되어 있는 것을 특징으로 하는 캔디다 속 변이 균주 및 이를 이용한 유용물질의 생산방법에 관한 것이다.
자일리톨(Xylitol)은 오탄당 당알코올로서 높은 감미도를 가지고 있어 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하지만, 체내 섭취 후의 대사과정이 인슐린과 무관하기 때문에, 당뇨병 환자의 설탕 대용 감미료로 사용되고 있다. 특히, 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄트(Streptococcus mutans)의 생육을 억제하는 특성을 가지고 있어, 충치억제성분으로서도 산업적으로 널리 이용되고 있다.
이러한 자일리톨은 현재 옥수수속대, 사탕수수대와 같이 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물을 화학적으로 환원시키는 방법으로 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스를 아라비노스, 포도당과 같은 다른 오탄당 및 육탄당 구성물들로부터 분리 및 정제하기가 어렵고 비용이 많이 들며, 이 과정에서 자일로스의 회수율이 50 ~ 60% 정도로 낮다. 또한, 수소가스 및 니켈촉매를 이용한 고온, 고압의 공정이므로 위험성이 높고 폐기물이 많아서 환경적 문제가 존재한다는 단점이 있다.
근래에는 이러한 단점을 보완하기 위한 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법이 활발하게 연구되고 있다. 생물학적인 방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로서 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 자일리톨 생산이 끝나면 자일로스가 완전히 소모되기 때문에 자일리톨을 분리 정제하는 과정이 간단해져 생산비용을 낮출 수 있으며, 공정 자체가 상온 및 상압에서 이루어지므로 안전하며 친환경적인 생산공정이다.
고생산성, 고수율의 자일리톨 생산을 위해 다양한 세균(bacteria)과 효모 균주(yeast and fungi), 재조합 효모(recombinant yeast)를 통한 자일리톨 생산 연구가 진행되었다(Winkelhausen, E. et al., J. Ferment. Bioeng. 86:1-14, 1998; Granstrom, T. B. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:277-281, 2007). 그러나 세균과 재조합 효모 균주는 자일로스를 이용하는 대사경로가 약하거나 효율이 좋지 못해 산업적인 자일리톨의 생산에 적합하지 않았다. 지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 세포 외부에서 흡수된 자일로스를 자일로스 환원효소(xylose reductase)에 의해 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효소(xylitoldehydrogenase)에 의해 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulokinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산화과정(pentose phosphate pathway)를 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(Laplace, J. M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb. Technol., 16:933-943, 1994).
이때, 자일로스 환원효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADPH;Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)를 보조인자(cofactor)로 이용하고, 자일리톨 탈수소효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(Nicotinamide adenine dinucleotide; NAD+)를 보조인자로 이용한다. 자일로스 환원효소에 의해 자일로스로부터 전환된 자일리톨은 다시 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 전환되는데, 배지 내에 산소의 공급이 제한되어 용존산소의 농도가 0.5% 내지 2.0%로 낮게 유지되면 세포 내의 산화환원력 불균형(redox imbalance)이 유발되어 자일리톨 탈수소효소가 필요로 하는 보조인자(cofactor)인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 공급이 부족하게 되고, 자일리톨이 자일룰로스로 전환되는 과정이 억제된다. 그 결과로 자일리톨이 세포 및 배지에 축적되게 되어 50 ~ 60%의 수율로 자일로스로부터 자일리톨이 생산되는 것이다.
상기와 같이, 현재까지는 자일리톨의 제조 수율이 50 ~ 60% 정도에 불과하여, 보다 제조 수율을 향상시키려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다. 따라서, 생물학적 방법으로 자일리톨의 제조 수율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되고 있다.
이에, 본 연구진은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소를 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 고활성으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)을 수행하여 최적화된 자일로스 환원효소를 획득하였고, 상기 최적화된 유전자를 발현시키기 위해, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 터미네이터 부분을 클로닝하였으며, 이들을 이용하여 발현 카세트를 제조하여 이를 이용해 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스(대한민국특허 제 10-0730315호)에 도입하여 자일로스환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주를 제조하였다(대한민국특허 출원번호 10-2009-0135380호).
이때, 자일로스 환원효소의 항구적인 발현으로 자일리톨을 생산하는 상기 균주에 있어서, 더욱 빠른 자일리톨 생산속도를 갖는 고효율의 새로운 균주를 개발해야 할 필요성을 지각하게 되었다.
본 발명자들은 자일로스 환원효소는 배지 첨가 물질인 자일로스를 자일리톨로 변환시키는 반응 과정에서 NADPH를 조효소로 사용한다는 점에 착안하여, 세포 내의 NADPH의 공급을 주요하게 담당하는 글루코스 대사 경로의 PP 대사 경로로의 물질 흐름을 증가시키기 위해 EMP 경로를 제거하기 위한 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase), 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1) 및 과당인산키나아제2(phosphofructokinase 2)의 녹아웃 카세트를 각각 제작함으로써, 상기 유전자가 여러 조합으로 녹아웃된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주가 자일리톨을 향상된 속도로 생산할 수 있음을 밝혀, 특허를 등록한 바 있다(대한민국 특허 제10-1149001호).
하지만, 세포 내에서 NADPH를 생산하는 경로는 PP 경로 이외에도, TCA cycle에서 아이소시트레이트가 알파-케토글루타릭산으로 전환댈 때에도 생산된다. 다만, 아시소시트레이트는 TCA cycle에서 glyoxylate shunt라는 대사과정을 거쳐 말레이트 또는 숙신산(succinate) 등으로 변화되며, 이때는 NADPH를 생산하지 않는다.
이에, 본 발명자들은 EMP 경로를 제거할 뿐만 아니라, TCA cycle 상의 glyoxylate shunt 경로를 제거할 경우, 세포 내 NADPH의 농도가 더욱 높아질 것으로 예상하여 아이소시트레이트 분해효소를 제거하기 위한 녹아웃 카세트를 제작하여 상기 두 경로가 모두 제거된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주를 제작하였으며, 상기 균주가 매우 뛰어난 NADPH 생산능을 나타낸 다는 것으로 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속 변이 균주 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 균주를 이용한 유용물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자 및 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자의 이배체가 녹아웃 되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속(Candida) 변이 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자 및 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 것을 특징으로 하는 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속(Candida) 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 균주를 탄소원이 함유된 배지에서 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 유용물질을 회수하는 것을 특징으로 하는 유용물질의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 특정 유전자 이배체의 녹아웃을 통하여 세포 내 환원력이 증가된 변이 균주를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 변이 균주는 대사흐름 조작에 의해 NADPH의 생산능이 향상되었을 뿐만 아니라, 자일리톨 등 유용물질의 시간당 생산성을 향상시킬 수 있어 유용물질의 산업적 생산에 유용하다.
도 1은 본 발명에서 조작한 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 포도당 대사경로를 나타낸 개략도이다.
도 2의 A는 pfk2 유전자의 첫 번째 및 두 번째 녹아웃 카세트를 나타낸 것이고, B는 녹아웃 결과를 나타낸 개념도이며, C는 녹아웃된 유전자를 확인한 PCR 결과이다(Lanes 1,2 : PFK2B_front_2 (서열번호38) 및 URA-R(서열번호29)로 PCR한 결과이고, Lanes 3,4 : URA-F(서열번호28) 및 PFKB-rear-1 (서열번호39) 로 PCR한 결과이며, Lanes 5,6 : PFKB-front-2 (서열번호38) 및 PFKB-sp1 (서열번호40) 로 PCR한 결과이고, Lanes 1,3,5 는 JY(control) 균주, Lanes 2,4,6은 JYPFK2 균주이며. Lane M는 size marker 임).
도 3의 A는 icl 유전자의 첫 번째 및 두 번째 녹아웃 카세트를 나타낸 것이고, B는 녹아웃 결과를 나타낸 개념도이며, C는 녹아웃된 유전자를 확인한 PCR 결과이다(Lane 1,2 : ICL-F (서열번호41) 및 LEU-R (서열번호37)로 PCR한 결과이고, Lane 3,4 : LEU-F (서열번호36) 및 ICL-R (서열번호42)로 PCR한 결과이며, Lanes 5,6,7 : ICL-F(서열번호41) 및 ICL-R (서열번호42)로 PCR한 결과이고, Lanes 1,3,5 는 JYPFK2(control) 균주, Lanes 2,4,7 는 JYPFK2ICL 균주이며, Lane M 은 DNA size marker 임).
도 4의 A는 Candida tropicalis ATCC20336 균주에 각 유전자 또는 두 유전자를 모두 녹아웃 시켰을 때, 생산되는 NADPH의 양을 확인한 그래프이며, B는 Candida tropicalis ATCC20962 균주에 각 유전자 또는 두 유전자를 모두 녹아웃 시켰을 때, 생산되는 NADPH의 양을 확인한 그래프이다.
도 5는 Candida tropicalis JY 균주에서 각 유전자 또는 두 유전자를 모두 녹아웃 시킨 다음, D-xylose를 포함한 배지에서 배양하여 생산한 자일리톨의 생산량을 측정한 그래프로서, 왼쪽 패널은 배양시간에 따른 세포 양을 나타내는 것이며, 오른쪽 패널은 시간에 따라 생산한 자일리톨의 양을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 세포 내 환원력이이 증가된 변이 균주의 제조에 있어서, NADPH의 생산량을 증가시킬 경우, 어떤 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 캔디다 속 균주에서 포도당의 대사경로 상, EMP pathway로 가는 대사경로 및 TCA cycle에서 아이소시트레이트가 glyoxylate shunt pathway로 진행하는 경로를 차단하는 유전자 녹아웃을 수행하였다. 그 결과, 두 대사경로가 모두 차단되는 변이 균주의 경우, NADPH의 생산량이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 Candida tropicalis 균주에, EMP pathway를 차단하기 위한 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(pfk2) 및 TCA cycle의 glyoxylate shunt pathway를 차단하기 위한 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(icl)의 이배체를 각각 녹아웃 시킨 다음(도 2 및 도 3), 상기 두 유전자가 녹아웃된 변이균주에서 NADPH의 생산량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자 및 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자의 이배체가 녹아웃 되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속(Candida) 변이 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이균주의 세포 내 환원력은 변이균주의 세포 내 NADPH의 생산량이 증가되어 향상되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 캔디다 속에 포함되는 균주이면 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자는 pfk2인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자는 icl인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자 및 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 것을 특징으로 하는 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속(Candida .) 변이 균주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 변이균주는 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 다양한 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 바람직하게는 대한민국 특허 10-1149001호에 개시된 방법으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하기의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 균주는
(a-1) 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 제1유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
(a-2) 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 제2유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
(b-1) 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 icl 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 icl 유전자 단편으로 구성된 제3유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
(b-2) 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 icl 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 icl 유전자 단편으로 구성된 제4유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
(c) 상기 제1유전자컨스트럭트 및 제2유전자컨스트럭트를 도입하여 pfk2 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 변이균주에 상기 제3유전자컨스트럭트 및 제4유전자컨스트럭를 도입하여 icl 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 캔디다 속에 포함되는 균주이면 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 변이 균주를 탄소원이 함유된 배지에서 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 유용물질을 회수하는 단계를 포함하는 유용물질의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유용물질은 탄소원으로부터 NADPH의 환원력을 바탕으로 생산되는 모든 불질일 수 있으며, 바람직하게는 자일리톨, 수산화 프로피오닉산(Hydroxypropionic acid), 수산화 지방산(Hydroxy fatty acid), 옥소 지방산(Oxo fatty acid), 디카르복시산(Dicarboxylic acid) 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 캔디다 속 균주가 성장에 대사할 수 있는 탄소원이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 글루코스(Glucose), 프룩토스(Fructose), 갈락토즈(Galactose), 만노스(Mannose), 말토즈(Maltose), 수크로즈(Sucrose), 락토스(Lactose), 셀로비오스(Cellobiose), 멜리오비오스(Meliobiose), 소비톨(Sorbitol), 아세트산(Acetic acid), 글루쿠론산(Glucuronic acid), 프로피온산(Propionic acid), 말산(Malic acid), 포름산(Formic acid), 지방산(Fatty acid), 에탄올(Ethanol) 및 글리세롤(Glycerol)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 변이 균주의 배양과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용할 수 있고, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용할 수 있다(Lee et al., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol . Lett ., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol . Biotechnol ., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol . Bioeng ., 72: 41, 2001).
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 자일로오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 유용물질을 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 유용물질을 수집할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 유전자 녹아웃 카세트의 제조
대한민국특허 제10-1149001호에 개시된 방법으로 도 2 및 도 3에 개시된 바와 같은 pfk2icl 녹아웃 카세트를 제조하였다.
구체적으로, C. tropicalis ATCC 20336에서 URA3 마커 유전자 및 pfk2 , icl 유전자를 준비하였으며, URA3 popout unit을 제조하기 위하여, Bacillus subtilis 아미노산 생합성 오페론 서열의 일부를 PCR을 통해 확보하였다(트립토판, 트레오닌, 아르기닌, 글루타민산, 류신의 영역). 즉, 서열번호 12 및 서열번호 13 프라이머로 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2의 유전자 단편을 제조하였고, 서열번호 28 및 서열번호 29 프라이머로 서열번호 3으로 기재되는 URA3 유전자를 제조하였으며, 서열번호 14 및 서열번호 15 프라이머로 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편을 제조하여, 이를 벡터에 도입한 다음, DraI 효소로 절단하여 제1유전자 컨스트럭트를 제조하였다.
같은 방식으로 서열번호 16 및 서열번호 17 프라이머로 서열번호 6로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2의 유전자 단편을 제조하였고, 서열번호 28 및 서열번호 29 프라이머로 서열번호 3으로 기재되는 URA3 유전자를 제조하였으며, 서열번호 18 및 서열번호 19 프라이머로 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편을 제조하여, 이를 벡터에 도입한 다음, SmaI효소로 절단하여 제2유전자 컨스트럭트를 제조하였다.
icl 유전자 녹아웃 카세트의 경우, 먼저 서열번호 20 및 서열번호 21 프라이머로 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 icl의 유전자 단편을 제조하였고, 서열번호 28 및 서열번호 29 프라이머로 서열번호 3으로 기재되는 URA3 유전자를 제조하였으며, 서열번호 22 및 서열번호 23 프라이머로 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 icl 유전자 단편을 제조하여, 이를 벡터에 도입한 다음, DraI효소로 절단하여 제3유전자 컨스트럭트를 제조하였다.
그 다음, 서열번호 24 및 서열번호 25 프라이머로 서열번호 10로 기재되는 염기서열을 갖는 icl의 유전자 단편을 제조하였고, 서열번호 28 및 서열번호 29 프라이머로 서열번호 3으로 기재되는 URA3 유전자를 제조하였으며, 서열번호 26 및 서열번호 27 프라이머로 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 icl 유전자 단편을 제조하여, 이를 벡터에 도입한 다음, SmaI 효소로 절단하여 제4유전자 컨스트럭트를 제조하였다(도 2 및 도 3).
상기 유전자 녹아웃 카세트에 개시된 유전자의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
녹아웃 카세트 유전자 염기서열
서열번호 이름 서열
4 pfk2_1_F CGATGATATCATCTGATTGCACCAGCTGTGTTAATTTTTTTTTAATTTTTTCATCTTTGTGCGTCAGTGGGTGAGAAGCACAGGGCCACAATAACCCGATGGGTGGCATCACCATACTAAATTTTTTTTTTTTTTTTCTCTTCCTCTCCCTGTGCTCATTGCGGGTGGTGGGCCAGGGTACACGCCATGAGAAGAATATTCGCCTGAGCTCAGTCCGTCAGGTGGTGGTGGGTCACACCAGGGAGTGCGGAAGGAAAAAGAGAATCTCAGATATAAAGATAATCATAATCCAGGCTGTTTCCCCCTTTTTTCCTTTGTTTCAACAAGCTTAATTATGATTTCAATCGTTAATGGCACTTCCACGCATTC
5 pfk2_1_R GTATTGTATGTCTCGTGGCCACACCCCATATGCCATTCACAATGGGTTCGCTGGGTTGTCGAGACACGAGTCGGTGAAGCTGATGAACTGGATTGACATTGAAGGTTGGAACAGCATTGGTGGGTCGGAGATTGGTACGAACAGACAGACGCCAGATGATACTGACATTGGTATGATTGCCCATTATTTTGAGAAATACCAGTTTGACGGGTTGATTATTGTTGGTGGGTTCGAAGCGTTCGTGTCGTTGGAGCAGTTGGAGAGGTCGAGGGCCATGTACCCAGCTTTTAGAATCCCTATGGTTTTGATCCCGGCTACTATTTCG
6 pfk2_2_F CGATTGGAGATCATTGGATACGACTAATGTTTTCAAAGTGGAGAGTTTGGTTGCCTTGATTGAGACGTTGTCTACCTACAAGTACACTTTGCAGATTACGCCAAACGAATTGTACCCAAACGAAGTCTACTGTGTTGATCCCTTGGGGTACATTGTTGGTTTCACGGCATGTGAGGAGCCATTGACATTGGTGCCTCCTTTGCAAAAGTCCAACCCGAAGTTTGACGGCACTTCCAATTTGATGTCAACCTCGGGCTCGCAGTCTAGGGCTGTGGAGGAGAACAAGCAAGTCAGAAGAAAC
7 pfk2_2_R GGTGGATAGATTGGGATTGGATACGAGAATTACCGTTTTAGGACACGTGCAGAGAGGTGGTACTGCTGTTGCCTACGACAGAATCTTGGCTACTTTGCAAGGTGTTGAAGCAGTGAAGGCTATCTTGGAGTTGACTCCTGATGTGTCATCTCCTTTGATTGCGATTGATGAGAACAAGATTTGTTGCAAGCCATTGGTGGAAGCTGTCAAGATCACCAAGTCTGTCGCTGCCGCCATTGAAGCTCAGGACTTTGAGAAGGCTATGTCGTTGAGAGACCACGAGTTTAAAGAGCACTTGGCTAACTTTATGGCCATGAACTCG
8 icl_1_F CACAAAGATCGACATCAACCAAGAAGATGCTGACTTCCAAAAAGAAGTTGCTGAAATCAAAAAATGGTGGTCCGAACCAAGATGGAGAAAGACCAAGAGAATCTATTCTGCTGAAGACATTGCTAAGAAGAGAGGTACCTTGAAGATTGCCTACCCATCTTCTCAACAATCCGACAAATTGTTCAAGTTGTTGGAAAAGCACGACGCTGAAAAATCTGTCTCCTTCACCTTTGGTGCTTTGGACCCAATC
9 icl_1_R AACTTACATCAAGAGATTGGGTCAATTGGGTTACGTGTGGCAATTCATCACCTTGGCCGGTTTGCACACCACTGCTTTGGCTGTTGATGACTTCTCTAACCAATACTCTCAAATTGGTATGAGAGCATACGGTCAAACCGTCCAACAACCAGAAATCGAAAAGGGTGTCGAAGTTGTCAAGCACCAGAAATGGTCCGGTGCTAACTACATTGACGGTTTGTTGAGAATGGTTAGTGGTGGTGTCACTTCT
10 icl_2_F TACTTGGACTCCATCTACGTTTCCGGATGGCAGTGTTCCTCTACCGCTTCCACTTCTAACGAACCATCCCCAGATTTGGCTGACTACCCTATGGACACCGTTCCAAACAAGGTCGAGCACTTGTGGTTTGCTCAGTTGTTCCACGACAGAAAGCAAAGAGAAGAAAGATTGAACATGACCAAGGAAGAAAGAGCAAACACCCCATACATTGACTTTTTGAGACCCATCATTGCTGATGCCGACACTGGTC
11 icl_2_R AGCTTTGATCAAGAAATTCACCGACAAGGTTAACCCATTGTCCCACACCTCCCACAAGGAAGCCAAGAAGTTGGCCAAGGAATTGACCGGTAAGGACATCTACTTCAACTGGGACGTTGCCAGAGCCAGAGAAGGTTACTACAGATACCAAGGTGGTACCCAATGTGCCGTCATGAGAGGTAGAGCTTTCGCTCCATACGCGGACTTGATCTGGATGGAATCCGCTTTGCCAGACTACAACCAAGCCAAG
각 유전자 카세트를 제조하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 개시된 바와 같다.
프라이머 서열
서열번호 이름 서열 제한효소
12 pfk2_1_FF TTTAAA CGATGATATCATCTGATTGCACCAGC DraI
13 pfk2_1_FR TTTAAA AAAGATAATCATAATCCAGGCTGTTT DraI
14 pfk2_1_RF TTTAAA GTATTGTATGTCTCGTGGCCACACC DraI
15 pfk2_1_RR TTTAAA ATAGGGATTCTAAAAGCTGGGTACAT DraI
16 pfk2_2_FF CCCGGG CGATTGGAGATCATTGGATACGAC SmaI
17 pfk2_2_FR CCCGGG TTTCTTCTGACTTGCTTGTTCTCCT SmaI
18 pfk2_2_RF CCCGGG GGTGGATAGATTGGGATTGGATACG SmaI
19 pfk2_2_RR CCCGGG GCCAAGTGCTCTTTAAACTCGTGGTC SmaI
20 icl_1_FF TTRTAAA CACAAAGATCGACATCAACCAAGAA DraI
21 icl_1_FR TTTAAA GATTGGGTCCAAAGCACCAAAGGTG DraI
22 icl_1_RF TTTAAA AACTTACATCAAGAGATTGGGTCAA DraI
23 icl_1_RR TTTAAA AGAAGTGACACCACCACTAACCAT DraI
24 icl_2_FF CCCGGG TACTTGGACTCCATCTACGTTTCC SmaI
25 icl_2_FR CCCGGG GACCAGTGTCGGCATCAGCAATGATG SmaI
26 icl_2_RF CCCGGG AGCTTTGATCAAGAAATTCACCGACA SmaI
27 icl_2_RR CCCGGG CTTGGCTTGGTTGTAGTCTGGCAA SmaI
28 URA3_F GGTTTGGATTGTTGGAGAATTTCAAG
29 URA3_R TGAAGTCCTCGTTTGTGTTGCTTG
30 Trp_F CAC AGATCT GCTCTCTTTCGGAGACTGCACC BglII
31 Trp_R GT GGATCC TTGAGTTATACCGAGTGCTTAGGATCG BamHI
32 Thr_F CAC AGATCT GCGACGTGCTCTACTTTTGACAGC BglII
33 Thr_R GT GGATCC AACAGGTAACACTTCCGCTGCTGC BamHI
34 His_F AGATCT GTCAGCCACATGAGCTATTACACAGG BglII
35 His_R GGATCC GTATGCTAACGCCGCAATCG BamHI
36 Leu_F CAC AGATCT ACCGGCTGACTGCTTTAGGATTCCAATTTGA BglII
37 Leu_R GT GGATCC CTACAGCTTTCGCTTCCTCTTCAAG BamHI
실시예 2: 녹아웃 카세트를 이용한 트로피칼리스( Candida tropicalis )의 유전자 녹아웃
실시예 1에서 제조한 각각의 유전자 녹아웃 카세트를 순서대로 C. tropicalis JY, C. tropicalis ATCC 20962 및 C. tropicalis ATCC20336 균주에 처리하여 pfk2 및 icl이 녹아웃된 균주를 제조하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 제조한 선형의 녹아웃카세트를 잘 알려진 효모의 유전자 도입법인(YEAST TRANSFORMATION-LIAC METHOD) 리튬아세테이트법을 이용하여 상기 균주들에 도입하였고, 이를 우라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스(무아미노산) 6.7 g/ℓ, 포도당 20 g/ℓ, 한천 가루 20 g/ℓ)에 도말한 후 30℃에서 2일간 정치 배양하였다. 우라실 결핍 배지에서 생존한 균주들을 대상으로 PCR을 수행하였으며 상기의 카세트가 유전체에 정상적으로 삽입된 균주를 선별하여 캔디다 트로피칼리스 변이주들을 수득하였다.
그 결과, 도 2의 C에 개시된 바와 같이, pfk2 유전자의 이배체가 모두 녹아웃된 것을 확인할 수 있었다.
PFK 확인용 프라이머 서열
서열번호 이름 서열
38 PFKB_front_2 GCTGTCTTACCAGTGGATGGAGG
39 PFK_B_rear_1 TTAGCCAAACGGTGACATCACTTCTGG
40 PFKB-sp1 CAGTAGGTCTGCTTGATGTACTCTGG
같은 방식으로 icl 유전자 녹아웃 카세트를 상기 pfk2 녹아웃 균주에 도입하여 도 3에 개시된 바와 같이 icl 유전자의 이배체가 모두 녹아웃 된 것을 확인하였다.
ICL 확인용 프라이머 서열
서열번호 이름 서열
41 ICL_F CAAACAACTATATATCTATCAACCATGGC
42 ICL_R TGAATTGGTCTTCAGTAACACCAGCACC
실시예 3: 유전자 녹아웃 캔디다 트로피칼리스의 NADPH 생산량 확인
실시예 2에서 제조한 두 유전자가 모두 녹아웃 된 균주, 하나씩 녹아웃 된 균주 및 야생형 균주를 하기의 방법으로 배양하여, NADPH 생산량을 측정하였다.
자일로스 50 g/ℓ, 글루코스 20 g/ℓ, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2g/ℓ 및 효모추출물 10 g/ℓ가 포함된 배지에서 30℃, 200 rpm에 12시간 동안 배양 후, 세포를 회수하여 NADPH를 측정할 수 있는 OD450nm에서 흡광도를 NADP+/NADPH Quantification Kit(BioVision)로 측정하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 두 유전자가 모두 녹아웃된 균주에서 NADPH의 생산량이 100% 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 유전자 녹아웃 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 생산속도의 확인
실시예 2에서 유전자형을 확인한, C. tropicalis JY 및 C. troplicalis JYPFK2ICL 균주의 자일리톨 생산속도를 비교하기 위하여, 자일로스 50 g/ℓ, 글루코스 20 g/ℓ, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2g/ℓ 및 효모추출물 10 g/ℓ가 포함된 배지에서 30℃, 200 rpm에 50시간 동안 배양하였다. 이때, 탄소원으로는 포도당 1.25 g/ℓ를 배양 후 13시간 뒤부터 1시간 간격으로 총 8회 첨가하였다.
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이, pgi, pfk1pfk2를 모두 발현하는 대조군에 비해, pfk2 이배체 및 icl 이배체가 녹아웃된 균주인 JYPFK2ICL 균주의 자일리톨 생산속도가 증가된 것을 확인하였다.
본 발명에서 개발한 균주
균주 특성
C. tropicalis JY 본 연구팀에서 ATCC20336를 기반으로 개발한 균주
(대한민국 특허 : 10-1246780)
C. tropicalis ATCC 20962 ATCC20336 기반으로 beta-oxidation pathway(POX4,5)가 낙아웃된 균주
C. tropicalis ATCC20336 wild-type
C. tropicalis ATCC 20962PFK2 PFK2 gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis ATCC 20962ICL ICL gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis ATCC 20962PFK2ICL 20962PFK2균주를 기반으로 ICL gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis ATCC 20336PFK2 Wild-type 균주 기반으로 PFK2 gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis ATCC 20336ICL Wild-type 균주 기반으로 ICL gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis ATCC 20336PFK2ICL 20336PFK2균주를 기반으로 ICL gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis JYPFK2 JY균주 기반으로 PFK2 gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis JYICL JY균주 기반으로 ICL gene이 낙아웃 된 균주
C. tropicalis JYPFK2ICL JYICL 균주 기반으로 ICL gene이 낙아웃 된 균주
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Mutant Candida strains having enhanced reduction force and uses thereof <130> P16-B272 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3013 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2 <400> 1 gctgtcttac cagtggatgg aggcccagca atcaacacgg ccctgccagc aattttgcca 60 gcctgcacca ttttcaaaat gacacctgcg gctttacgtg cttgtaactg gccaaccata 120 ccctgggcgt tctccttggg ctgcaagttg tcgtccaatc caagacccga tatgtgggag 180 tgggcagcta ttaaagacaa cccggagacg tcgctggttg tcacctttgt tgtgatggtg 240 cttgttgcct gagcatgtta gtaaatgaac ggggggaaaa ataaaggtgg gtcggaagta 300 cataccattg tgtttattga tgaattggta ggtggtctgg cgatgggtcg tcgttgtttc 360 tgtttttgtt gttctaggtt tttttttcag gcagagaatg agcgctgcac gactgattat 420 ataataacgg gtggtgtaag tgtcacgtga gagtcacaac cccaaatgag attcgcacat 480 acgatgcacg ttctacttgc cgaggaagca ccaacagata cgtcatataa acccgatgat 540 atcatctgat tgcaccagct gtgttaattt ttttttaatt ttttcatctt tgtgcgtcag 600 tgggtgagaa gcacagggcc acaataaccc gatgggtggc atcaccatac taaatttttt 660 tttttttttt ctcttcctct ccctgtgctc attgcgggtg gtgggccagg gtacacgcca 720 tgagaagaat attcgcctga gctcagtccg tcaggtggtg gtgggtcaca ccagggagtg 780 cggaaggaaa aagagaatct cagatataaa gataatcata atccaggctg tttccccctt 840 ttttcctttg tttcaacaag cttaattatg atttcaatcg ttaatggcac ttccacgcat 900 tcgttgattg ctgggactaa agagtcattg agccaggcca tcaacttcta cacaaacatc 960 cttggcttga gcgtgcactc ggagaacgat gatttaacct atttgtctaa tgaggacaac 1020 aagatgattg tcaagatcaa gttggaccca aagaccgggt tgtctaccgc tgcagtccat 1080 gatagaagag aggagattat ttctaaattg aatgtcatcg attggagatc attggatacg 1140 actaatgttt tcaaagtgga gagtttggtt gccttgattg agacgttgtc tacctacaag 1200 tacactttgc agattacgcc aaacgaattg tacccaaacg aagtctactg tgttgatccc 1260 ttggggtaca ttgttggttt cacggcatgt gaggagccat tgacattggt gcctcctttg 1320 caaaagtcca acccgaagtt tgacggcact tccaatttga tgtcaacctc gggctcgcag 1380 tctagggctg tggaggagaa caagcaagtc agaagaaaca ttgctgttat gacttctggt 1440 ggtgactccc agggtatgaa tgccgccgtg agagccgttg tcagggccac gattttccgt 1500 ggctgcaaag cgtttgtcat tagagaggga tactctggtt tggttaaagg tgggccagag 1560 tacatcaagc agacctactg gcaagacgtg agaggtttcc tttccgaagg tggtacaaac 1620 attggtactg ccagatgtat ggagtttaag gagcgttggg ggagattgtt ggggtgcaag 1680 cacttgattg aggcaggaat tgacgggttg attgtctgtg gtggtgacgg ttccttgact 1740 ggtgctgayc ttttcagaca tgagtggcca tctttgatta gggagttgaa agacaarggg 1800 gaaatcaccc ctgagcaata cgaaaagcac aarcacttgt ayatytgtgg tatggttgga 1860 tccattgata acgatatggc yatgacggat tccaccattg gtgggtactc rgctttggag 1920 agaatttgta gggccattga ctacattgat gcmacggcaa gctcccaytc scgtgctttt 1980 gttgttgaag ttatgggcag acactgtggt tggttagcct tgatggccgg tattgccaca 2040 agtgcygatt acatccttat tccagagaag ccggcttcyt ccaaggaytg gaaggaccag 2100 atgtgtgaca ttgtcggcaa gcacagagct aagggkaaga gaaagaccat tgttatygtt 2160 gccgaaggtg ccattacatc tgaattgaaa ccratttcgt cygatgaggt gaagracgtg 2220 ttggtggata gattgggatt ggatacgaga attaccgttt taggacacgt gcagagaggt 2280 ggtactgctg ttgcctacga cagaatcttg gctactttgc aaggtgttga agcagtgaag 2340 gctatcttgg agttgactcc tgatgtgtca tctcctttga ttgcgattga tgagaacaag 2400 atttgttgca agccattggt ggaagctgtc aagatcacca agtctgtcgc tgccgccatt 2460 gaagctcagg actttgagaa ggctatgtcg ttgagagacc acgagtttaa agagcacttg 2520 gctaacttta tggccatgaa ctcggccgtg catgagaagc caacgttgcc cgtggagaag 2580 cgcaagaaga ttgccattgt caacattggt gcccccgctg gtggtatgaa ctctgccgtg 2640 tatgctatgg ctacgtattg tatgtctcgt ggccacaccc catatgccat tcacaatggg 2700 ttcgctgggt tgtcgagaca cgagtcggtg aagctgatga actggattga cattgaaggt 2760 tggaacagca ttggtgggtc ggagattggt acgaacagac agacgccaga tgatactgac 2820 attggtatga ttgcccatta ttttgagaaa taccagtttg acgggttgat tattgttggt 2880 gggttcgaag cgttcgtgtc gttggagcag ttggagaggt cgagggccat gtacccagct 2940 tttagaatcc ctatggtttt gatcccggct actatttcga acaatgttcc aggtactgaa 3000 tactccttgg gtg 3013 <210> 2 <211> 1530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl <400> 2 ggatccgtct gaagaaatca agaaccaaca gttggatatc atcaagggaa tattaggcga 60 agaggcatct agtagtagtg gcagtggtga gaacgtgggc gctgctatag tgaacaatct 120 ccagtcgatg gttaagaaga agagtgacaa accagcagtg aatgacttgt ctgggtccgt 180 gaggaaaaga aagaagcccg acacaaagga cagtaacgtc aagaaaccca agaaataggg 240 gggacctgtt tagatgtata ggaataaaaa ctccgagatg atctcaatgt gtaatggagt 300 tgtaatattg caaaggggga aaatcaagac tcaaacgtgt gtatgagtga gcgtacgtat 360 atctccgaga gtagtatgac ataatgatga ctgtgaatca tcgtaatctc acacaaaaac 420 cccattgtcg gccatatacc acaccaagca acaccacata tcccccggaa aaaaaaacgt 480 gaaaaaaaga aacaatcaaa actacaacct actccttgat cacacagtca ttgatcaagt 540 tacagttcct gctagggaat gaccaaggta caaatcagca ccttaatggt tagcacgctc 600 tcttactctc tctcacagtc ttccggcccc tattcaaaat tctgcacttc catttgaccc 660 cagggttggg aaacagggcc acaaaagaaa aacccgacgt gaatgaaaaa actaagaaaa 720 gaaaaaaaat tatcacacca gaaatttacc taattgggta attcccatcg gtgtttttcc 780 tggattgtcg cacgcacgca tgctgaaaaa agtgttcgag ttttgctttt gcctcggagt 840 ttcacgcaag tttttcgatc tcggaaccgg agggcggtcg ccttgttgtt tgtgatgtcg 900 tgctttgggt gttctaatgt gctgttattg tgctcttttt ttttcttctt tttttggtga 960 tcatatgata ttgctcggta gattactttc gtgtgtaggt attcttttag acgtttggtt 1020 attgggtaga tatgagagag agagagtggg tgggggagga gttggttgta ggagggaccc 1080 ctgggaggaa gtgtagttga gttttccctg acgaatgaaa atacgttttt gagaagataa 1140 tacaggaaag gtgtgtcggt gaatttccat ctatccgagg atatgagtgg aggagagtcg 1200 tgtgcgtgtg gttaatttag gatcagtgga acacacaaag taactaagac agagagacag 1260 agagaaaaat ctggggaaga gacaaagagt cagagtgtgt gagttattct gtattgtgaa 1320 atttttttgc ccaactacat aatattgctg aaactaattt tacttaaaaa gaaaagccaa 1380 caacgtcccc agtaaaactt ttctataaat atcagcagtt ttccctttcc tccattcctc 1440 ttcttgtctt ttttcttact ttcccttttt tatacctttt cattatcatc ctttataatt 1500 gtctaaccaa caactatata tctatcaacc 1530 <210> 3 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA3 <400> 3 agatctgatc tggtttggat tgttggagaa tttcaagaat ctcaagattt actctaacga 60 cgggtacaac gagaattgta ttgaattgat caagaacatg atcttggtgt tacagaacat 120 caagttcttg gaccagactg agaatgcaca gatatacaag gcgtcatgtg ataaaatgga 180 tgagatttat ccacaattga agaaagagtt tatggaaagt ggtcaaccag aagctaaaca 240 ggaagaagca aacgaagagg tgaaacaaga agaagaaggt aaataagtat tttgtattat 300 ataacaaaca aagtaaggaa tacagattta tacaataaat tgccatacta gtcacgtgag 360 atatctcatc cattccccaa ctcccaagaa aaaaaaaaag tgaaaaaaaa aatcaaaccc 420 aaagatcaac ctccccatca tcatcgtcat caaaccccca gctcaattcg caatggttag 480 cacaaaaaca tacacagaaa gggcatcagc acacccctcc aaggttgccc aacgtttatt 540 ccgcttaatg gagtccaaaa agaccaacct ctgcgcctcg atcgacgtga ccacaaccgc 600 cgagttcctt tcgctcatcg acaagctcgg tccccacatc tgtctcgtga agacgcacat 660 cgatatcatc tcagacttca gctacgaggg cacgattgag ccgttgcttg tgcttgcaga 720 gcgccacggg ttcttgatat tcgaggacag gaagtttgct gatatcggaa acaccgtgat 780 gttgcagtac acctcggggg tataccggat cgcggcgtgg agtgacatca cgaacgcgca 840 cggagtgact gggaagggcg tcgttgaagg gttgaaacgc ggtgcggagg gggtagaaaa 900 ggaaaggggc gtgttgatgt tggcggagtt gtcgagtaaa ggctcgttgg cgcatggtga 960 atatacccgt gagacgatcg agattgcgaa gagtgatcgg gagttcgtga ttgggttcat 1020 cgcgcagcgg gacatggggg gtagagaaga agggtttgat tggatcatca tgacgcctgg 1080 tgtggggttg gatgataaag gcgatgcgtt gggccagcag tataggactg ttgatgaggt 1140 ggttctgact ggtaccgatg tgattattgt cgggagaggg ttgtttggaa aaggaagaga 1200 ccctgaggtg gagggaaaga gatacaggga tgctggatgg aaggcatact tgaagagaac 1260 tggtcagtta gaataaatat tgtaataaat aggtctatat acatacacta agcttctagg 1320 acgtcattgt agtcttcgaa gttgtctgct agtttagttc tcatgatttc gaaaaccaat 1380 aacgcaatgg atgtagcagg gatggtggtt agtgcgttcc tgacaaaccc agagtacgcc 1440 gcctcaaacc acgtcacatt cgccctttgc ttcatccgca tcacttgctt gaaggtatcc 1500 acgtacgagt tgtaatacac cttgaagaac ggcttcgtct gacccttgag cttcgcctcg 1560 ttgtaatgat tatacacatc caacgcttcc aacctcgata aatggatctt ctgcactttt 1620 gaaatcgggt actggatcgc aagcaacgag aacgccgccg atgctccggc aagcaacaca 1680 aacgaggact tcaagatcgg atcc 1704 <210> 4 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_1_F <400> 4 cgatgatatc atctgattgc accagctgtg ttaatttttt tttaattttt tcatctttgt 60 gcgtcagtgg gtgagaagca cagggccaca ataacccgat gggtggcatc accatactaa 120 attttttttt tttttttctc ttcctctccc tgtgctcatt gcgggtggtg ggccagggta 180 cacgccatga gaagaatatt cgcctgagct cagtccgtca ggtggtggtg ggtcacacca 240 gggagtgcgg aaggaaaaag agaatctcag atataaagat aatcataatc caggctgttt 300 cccccttttt tcctttgttt caacaagctt aattatgatt tcaatcgtta atggcacttc 360 cacgcattc 369 <210> 5 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_1_R <400> 5 gtattgtatg tctcgtggcc acaccccata tgccattcac aatgggttcg ctgggttgtc 60 gagacacgag tcggtgaagc tgatgaactg gattgacatt gaaggttgga acagcattgg 120 tgggtcggag attggtacga acagacagac gccagatgat actgacattg gtatgattgc 180 ccattatttt gagaaatacc agtttgacgg gttgattatt gttggtgggt tcgaagcgtt 240 cgtgtcgttg gagcagttgg agaggtcgag ggccatgtac ccagctttta gaatccctat 300 ggttttgatc ccggctacta tttcg 325 <210> 6 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_2_F <400> 6 cgattggaga tcattggata cgactaatgt tttcaaagtg gagagtttgg ttgccttgat 60 tgagacgttg tctacctaca agtacacttt gcagattacg ccaaacgaat tgtacccaaa 120 cgaagtctac tgtgttgatc ccttggggta cattgttggt ttcacggcat gtgaggagcc 180 attgacattg gtgcctcctt tgcaaaagtc caacccgaag tttgacggca cttccaattt 240 gatgtcaacc tcgggctcgc agtctagggc tgtggaggag aacaagcaag tcagaagaaa 300 c 301 <210> 7 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_2_R <400> 7 ggtggataga ttgggattgg atacgagaat taccgtttta ggacacgtgc agagaggtgg 60 tactgctgtt gcctacgaca gaatcttggc tactttgcaa ggtgttgaag cagtgaaggc 120 tatcttggag ttgactcctg atgtgtcatc tcctttgatt gcgattgatg agaacaagat 180 ttgttgcaag ccattggtgg aagctgtcaa gatcaccaag tctgtcgctg ccgccattga 240 agctcaggac tttgagaagg ctatgtcgtt gagagaccac gagtttaaag agcacttggc 300 taactttatg gccatgaact cg 322 <210> 8 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_1_F <400> 8 cacaaagatc gacatcaacc aagaagatgc tgacttccaa aaagaagttg ctgaaatcaa 60 aaaatggtgg tccgaaccaa gatggagaaa gaccaagaga atctattctg ctgaagacat 120 tgctaagaag agaggtacct tgaagattgc ctacccatct tctcaacaat ccgacaaatt 180 gttcaagttg ttggaaaagc acgacgctga aaaatctgtc tccttcacct ttggtgcttt 240 ggacccaatc 250 <210> 9 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_1_R <400> 9 aacttacatc aagagattgg gtcaattggg ttacgtgtgg caattcatca ccttggccgg 60 tttgcacacc actgctttgg ctgttgatga cttctctaac caatactctc aaattggtat 120 gagagcatac ggtcaaaccg tccaacaacc agaaatcgaa aagggtgtcg aagttgtcaa 180 gcaccagaaa tggtccggtg ctaactacat tgacggtttg ttgagaatgg ttagtggtgg 240 tgtcacttct 250 <210> 10 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_2_F <400> 10 tacttggact ccatctacgt ttccggatgg cagtgttcct ctaccgcttc cacttctaac 60 gaaccatccc cagatttggc tgactaccct atggacaccg ttccaaacaa ggtcgagcac 120 ttgtggtttg ctcagttgtt ccacgacaga aagcaaagag aagaaagatt gaacatgacc 180 aaggaagaaa gagcaaacac cccatacatt gactttttga gacccatcat tgctgatgcc 240 gacactggtc 250 <210> 11 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_2_R <400> 11 agctttgatc aagaaattca ccgacaaggt taacccattg tcccacacct cccacaagga 60 agccaagaag ttggccaagg aattgaccgg taaggacatc tacttcaact gggacgttgc 120 cagagccaga gaaggttact acagatacca aggtggtacc caatgtgccg tcatgagagg 180 tagagctttc gctccatacg cggacttgat ctggatggaa tccgctttgc cagactacaa 240 ccaagccaag 250 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_1_FF <400> 12 tttaaacgat gatatcatct gattgcacca gc 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_1_FR <400> 13 tttaaaaaag ataatcataa tccaggctgt tt 32 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_1_RF <400> 14 tttaaagtat tgtatgtctc gtggccacac c 31 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_1_RR <400> 15 tttaaaatag ggattctaaa agctgggtac at 32 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_2_FF <400> 16 cccgggcgat tggagatcat tggatacgac 30 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_2_FR <400> 17 cccgggtttc ttctgacttg cttgttctcc t 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_2_RF <400> 18 cccgggggtg gatagattgg gattggatac g 31 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk2_2_RR <400> 19 cccggggcca agtgctcttt aaactcgtgg tc 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_1_FF <400> 20 ttrtaaacac aaagatcgac atcaaccaag aa 32 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_1_FR <400> 21 tttaaagatt gggtccaaag caccaaaggt g 31 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_1_RF <400> 22 tttaaaaact tacatcaaga gattgggtca a 31 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_1_RR <400> 23 tttaaaagaa gtgacaccac cactaaccat 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_2_FF <400> 24 cccgggtact tggactccat ctacgtttcc 30 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_2_FR <400> 25 cccggggacc agtgtcggca tcagcaatga tg 32 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_2_RF <400> 26 cccgggagct ttgatcaaga aattcaccga ca 32 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icl_2_RR <400> 27 cccgggcttg gcttggttgt agtctggcaa 30 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA3_F <400> 28 ggtttggatt gttggagaat ttcaag 26 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA3_R <400> 29 tgaagtcctc gtttgtgttg cttg 24 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp_F <400> 30 cacagatctg ctctctttcg gagactgcac c 31 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp_R <400> 31 gtggatcctt gagttatacc gagtgcttag gatcg 35 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thr_F <400> 32 cacagatctg cgacgtgctc tacttttgac agc 33 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thr_R <400> 33 gtggatccaa caggtaacac ttccgctgct gc 32 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His_F <400> 34 agatctgtca gccacatgag ctattacaca gg 32 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His_R <400> 35 ggatccgtat gctaacgccg caatcg 26 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu_F <400> 36 cacagatcta ccggctgact gctttaggat tccaatttga 40 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu_R <400> 37 gtggatccct acagctttcg cttcctcttc aag 33 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKB_front_2 <400> 38 gctgtcttac cagtggatgg agg 23 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFK_B_rear_1 <400> 39 ttagccaaac ggtgacatca cttctgg 27 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKB-sp1 <400> 40 cagtaggtct gcttgatgta ctctgg 26 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICL_F <400> 41 caaacaacta tatatctatc aaccatggc 29 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICL_R <400> 42 tgaattggtc ttcagtaaca ccagcacc 28

Claims (13)

  1. (a-1) 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(phosphofructokinase 2, pfk2) 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(phosphofructokinase 2, pfk2) 단편으로 구성된 제1유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    (a-2) 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(phosphofructokinase 2, pfk2) 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(phosphofructokinase 2, pfk2) 단편으로 구성된 제2유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    (b-1) 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(isocitrate lyase, icl) 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(isocitrate lyase, icl) 단편으로 구성된 제3유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    (b-2) 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(isocitrate lyase, icl) 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(isocitrate lyase, icl) 단편으로 구성된 제4유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    (c) 상기 제1유전자컨스트럭트 및 제2유전자컨스트럭트를 도입하여 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(phosphofructokinase 2, pfk2) 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 변이균주에 상기 제3유전자컨스트럭트 및 제4유전자 컨스트럭를 도입하여 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(isocitrate lyase, icl) 유전자의 이배체를 녹아웃 시키는 단계를 포함하는 방법으로, 6-인산-프룩토스(fructose-6-phosphate) 인산화 효소를 코딩하는 유전자(phosphofructokinase 2, pfk2) 및 아이소시트레이트 분해효소를 코딩하는 유전자(isocitrate lyase, icl)의 이배체가 녹아웃 되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 내 환원력이 증가된 캔디다 속(Candida) 변이 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 내 환원력은 세포 내 NADPH의 생산량이 증가되어 향상되는 것을 특징으로 하는 변이 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 균주.
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  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이 균주를 탄소원이 함유된 배지에서 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 유용물질을 회수하는 단계를 포함하는 유용물질의 생산방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유용물질은 자일리톨, 수산화 프로피오닉산(Hydroxypropionic acid), 수산화 지방산(Hydroxy fatty acid), 옥소 지방산(Oxo fatty acid), 디카르복시산(Dicarboxylic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유용물질의 생산방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코스(Glucose), 프룩토스(Fructose), 갈락토즈(Galactose), 만노스(Mannose), 말토즈(Maltose), 수크로즈(Sucrose), 락토스(Lactose), 셀로비오스(Cellobiose), 멜리오비오스(Meliobiose), 소비톨(Sorbitol), 아세트산(Acetic acid), 글루쿠론산(Glucuronic acid), 프로피온산(Propionic acid), 말산(Malic acid), 포름산(Formic acid), 지방산(Fatty acid), 에탄올(Ethanol) 및 글리세롤(Glycerol)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유용물질의 생산방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20060132577A (ko) * 2003-11-06 2006-12-21 메타볼릭 익스플로러 Nadph를 소비하는 생합성 경로를 위하여 최적화시킨미생물 균주
KR20110097157A (ko) * 2010-02-24 2011-08-31 한국과학기술원 포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법

Patent Citations (2)

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