KR101891678B1 - 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도 - Google Patents
변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고안정성 bFGF의 N-말단 아미노산 서열의 변형을 통하여 미생물을 이용한 생산과정에서의 분해를 억제함으로써 생산성을 증가시킨 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된, 고안정성 bFGF 변이체에 N-말단의 결실 및 삽입 돌연변이를 유래한 변이체, 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열, 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 bFGF 변이체 생산 방법, 및 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 bFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않는 기능성화장품 및 피부 염증 치료제의 생산이 가능하다.
Description
본 발명은 변형된 N-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF, basic fibroblast growth factor)의 N-말단 아미노산 서열의 변형을 통하여, 미생물을 이용한 생산과정에서 나타날 수 있는 N-말단의 아미노산 소실을 억제하여 순수한 단일성분의 고안정성 bFGF를 생산하는 것에 관한 것이다.
성장인자는 세포의 성장, 증식, 분화를 조절하는 중요한 역할을 수행한다. 따라서 우리 몸은 상처, 수술 등 내적 및 외적요인에 의한 피부의 손상과 노화에 대해 자연적으로 수리하는 시스템이 존재하며 여기서 중요한 역할을 담당하는 것이 성장인자들이다. 각 조직의 기능을 유지하기 위해 각종 성장인자들 등이 생성되어 일정농도로 유지되면서 기능을 수행하고 있다. 나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다.
그 중 bFGF는 154개의 아미노산으로 구성되어있으며, 분자량 17,123 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드로 구성되어 있다. 이는 발생, 혈관생성 그리고 상처치유에 중요한 역할을 한다. bFGF는 마이토젠(mitogen)과 화학주성인자(chemotactic factor)로써, 상처 치유, 혈관생성, 그리고 신경계의 성장에서 강력한 매개체로 알려져 있다.
그러나, 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 성장인자들의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, 특히 bFGF의 경우 그 구조상에 이황화결합(disulfide bond)을 형성하지 않는 4개의 시스테인(cysteine) 잔기를 가짐으로 인하여 그 안정성에 많은 영향을 받는다는 문제점이 있다.
또한, bFGF와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 혈액 내 반감기 및 단백질분해효소에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 방해한다. bFGF를 더욱 효과적으로 용도를 개선하기 위해서는 체내에서의 안정성 외에도 체외에서의 물리 화학적 안정성을 향상시켜야 의약품 및 화장품의 제조, 보관, 유통과정에 사용이 증가할 것이다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 피앤피바이오팜에서는 2016년 고안정성 bFGF(HsbFGF라고 명명됨)를 개발한 바 있다(KR 10-2015-0078930/PCT-KR2015-007734).
하지만, 고안정성 bFGF를 대장균을 이용하여 생산하는 경우, bFGF의 N-말단이 아미노펩티디아제(aminopeptidase)에 의하여 일부 가수분해되어 bFGF의 N-말단부분에서 일부 아미노산의 손실이 일어나게 된다. 이로 인해 고안정성 bFGF 최종 정제물은 N-말단이 서로 다른 개체들이 섞여 있게 되고, 추가적으로 분리하기도 쉽지 않은 문제가 생긴다.
즉, 이러한 N-말단 비균질성(heterogeneity) 문제는 불순물으로 오인되는 즉, 단일성분이 아닌 것으로 인식되어 재조합 단백질의 생산 및 품질관리에 지장을 주며, 의약품 인허가과정에서 저순도 생산품으로 인식되기 때문에 반드시 해결해야만 하는 과제이다(식약처가이드라인. B1-2014-3-018).
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 성공적으로 N-말단 아미노산 소실을 억제할 수 있는 고안정성 bFGF N-말단 변이체(mutant)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체 생산방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 표면의 아미노산 1개가 타이로신으로 치환된 고안정성 bFGF 변이체를 제공한다.
더욱 바람직하게는 기존 고안정성 bFGF 변이체의 N-말단부위의 2개의 아미노산 잔기에 결실돌연변이를 도입하고, 메치오닌을 삽입하여 재조합단백질 발현 직후 발생할 수 있는 N-말단 가수분해를 막음으로써 최종 생산될 재조합단백질의 균질성을 갖도록 하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 bFGF는 분자량 약 18 kDa에 달하는 염기성 단백질(pI 9.58)로서 뇌하수체에서 주로 분비되며 다양한 중배엽 유래 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 혈관 내막 세포 및 평활근 세포의 성장을 촉진하는 단백질로서 외상치료 및 맥관 형성에 탁월한 효능을 나타내고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 유지하며, 정상적인 세포의 성장을 돕고 상처로부터의 회복을 촉진하고, 그 치유작용을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 변이체는, bFGF의 3차 구조와 종간의 상동성 정렬(homology alignment) 방법 및 컴퓨터를 이용한 단백질 분자 모델링을 통해, bFGF의 활성부위와 관련 없는 부위를 선정하고, 변이실험을 통해 제조된 변이체로서, bFGF와 다른 bFGF가 이황화결합을 형성하는 시스테인 아미노산 잔기가 유사한 구조의 세린 잔기로 치환되어 표면의 이황화결합으로 인한 침전에 대하여 안정성이 증가된다. 또한, bFGF 내 루프에서 가까운 잔기 1개를 시스테인으로 치환시켜 이황화결합을 추가적으로 생성시킴으로써 루프 엔트로피(loop entropy)를 감소시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다. 또한, bFGF 내에 히스티딘 잔기를 타이로신으로 치환함으로써 수소결합 및 반데르발스결합(van der Waals interaction)을 증가시켜 단백질 구조 내부의 구멍(cavity) 구조를 안정시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세린으로 치환된 아미노산은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68 번째 시스테인 및 86 번째 시스테인이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시스테인으로 치환된 아미노산은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 25 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 33 번째 아이소루신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 39 번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 49 번째 히스티딘; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 51 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 74 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75 번째 메치오닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 116 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 66 번째 글라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 67 번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 69 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 81 번째 루이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 83 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 107 번째 세린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 135 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 136 번째 아이소루신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 137 번째 루이신; 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 143 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 39 번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 49 번째 히스티딘; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 51 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 74 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75 번째 메치오닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 116 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 74 번째 알라닌이다.
추가적인 변이체로 74 번째 알라닌을 시스테인으로 치환한 변이체에 단백질 표면에 노출되어진 잔기인 히스티딘 49 번 잔기를 타이로신으로 치환한 변이체가 가장 바람직한 변이체이다.
즉, 본 발명의 bFGF 변이체는 천연형 서열(wild-type)에서 N-말단의 2개의 아미노산서열을 제거한 후 시작서열로 메치오닌을 추가한 변이체(서열번호 1)의 68 번째 및 86 번째 아미노산 잔기인 시스테인이 모두 세린으로 치환되고, 49 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환되고, 74 번째 아미노산 잔기인 알라닌이 시스테인으로 추가 치환되어, 분자 내 이황화결합을 형성하고 나머지 아미노산 서열은 천연형의 아미노산 서열과 동일한 인간 bFGF 변이체을 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 위에 언급되어진 기존 HsbFGF(KR 10-2015-0078930/PCT-KR2015-007734)의 서열에 N-말단의 서열의 결실 돌연변이를 유도하여 만들어진 변이체이다.
더욱 바람직하게는 기존 HsbFGF의 N-말단의 첫 번째와 두 번째 서열인 프롤린과 알라닌을 결실돌연변이를 유도하고 메치오닌을 삽입하여 시작서열로 추가하였다.
본 발명의 bFGF 변이체는 단백질 활성은 유지하면서 열에 대한 안정성이 천연형에 비해 증가한다. 하기 실험예 2에서 보는 바와 같이 bFGF 변이체는 천연형과 동등한 활성을 지니고 있으며, 열에 대한 안정성이 역시 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
bFGF 변이체 중에서 68과 86번 아미노산을 세린으로 치환하고, 74번 아미노산을 시스테인으로 치환한 후 이황화결합을 유도한 본 발명의 변이체 K(sbFGF, K74)와 변이체 K에 49번 히스티딘의 타이로신으로 치환된 변이체 O(HsbFGF)의 경우 대조군인 천연형 보다 열안정성이 향상되었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기서열(서열번호 2) 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현벡터는 일반적인 발현용 벡터에 bFGF의 유전자를 삽입하여 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 발현용 벡터로 pET21a 벡터를 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 사용할 수 있는 모든 세포 발현용 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pET21a 벡터에 bFGF 유전자를 삽입한 벡터를 제조하고, 이를 "pSSB-bFGF"라 명명하였다(도 1b).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포인 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 부위특이 돌연변이 유도법 등에 의해 제조한 bFGF 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질 전환시켜 bFGF 변이체를 발현시키는 방법으로 제조할 수 있으며, 또한 화학적 아미노산 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 서열로서 바람직한 것은 천연형 bFGF로부터 N-말단의 프롤린과 알라닌이 제거되고 그 자리에 메치오닌이 삽입되어지고 68 번째와 86 번째 코돈이 세린을 코딩하는 코돈으로 치환되고, 74 번째 코돈이 시스테인을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이다. 또한 상기 변이체 K의 49 번 히스티딘의 타이로신으로 치환된 변이체 O(HsbFGF)의 경우 대조군인 천연형 및 변이체 K(sbFGF)보다 뛰어난 열안정성이 향상되었다.
한편, 코돈의 축중현상(degeneracy)에 의해 하나의 아미노산을 코딩하는 코돈이 다수 존재이므로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA라도 그 뉴클레오티드 서열이 다를 수 있음은 주지된 사실이다.
이와 같은 bFGF 변이체을 코딩하는 DNA는 화학적으로 합성하거나 천연형 bFGF cDNA를 제조하여 이를 바탕으로 부위특이 돌연변이 유도법 등의 방법을 사용하여 제조할 수도 있다.
상기 제조된 본 발명의 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA는 당 분야에 잘 공지된 적당한 원핵 또는 진핵 발현 시스템 중 어느 하나를 사용하여 이를 발현시킬 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989).
발현은 당화되지 않은 bFGF 변이체의 경우 바람직하게는 대장균, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109(DE3), 대장균 NM522 등에서 수행되며, 대장균에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 적당한 벡터들은 샘브룩 등의 문헌(상동) 및 피어스(Fiers)등의 논문("Proced. 8th Int. Biotechnology Symposium", Soc. Frac. de Microbiol., Paris,(Durand et al., eds.), pp. 680-697, 1988)에 언급되어 있다.
상술한 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환은 통상적인 방법 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989; Ito et al., J. Bacteriol. 153:263, 1983).
대장균을 형질 전환시킬 경우, DNA를 흡수할 수 있는 수용성 세포(competent cell)를 준비하고, 이어서 공지된 방법 등에 따라 처리할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 고안정성 bFGF변이체 생산 방법을 제공한다:
(a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법의 (b) 단계는,
(c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 제거하는 단계;
(d) 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
(e) 상기 이온교환 수지 후 고안정성 bFGF 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 목적 발현 벡터를 함유하는 숙주 미생물은 목적 단백질의 생산을 최대화하는 범위에서 그들의 최적 성장 조건에서 배양된다. 예를 들면, 엠피실린 저항 유전자를 선택 표지로 포함하는 벡터로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3) 세포는 엠피실린이 포함된 LB 배지에서 37℃로 배양한다.
형질 전환된 숙주세포를 배양한 후 생산된 bFGF 변이체의 회수 및 정제는 당해 분야에 공지된 여러 방법 또는 그들을 조합하여 사용함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환된 대장균 세포에서 발현된 bFGF 변이체는 세포 배양물로부터 또는 세포의 파쇄 후에 단백질화학분야에 공지된 적합한 방법에 의해 추출함으로써 회수될 수 있다.
바람직하게는, bFGF 변이체를 정제하기 위해, 재조합 대장균 세포의 배양액을 원심 분리하여 세포를 수확하고, 수확한 세포를 리소자임이 첨가된 완충용액에 현탁시키고 초음파로 파쇄한다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 불용성 과립형태의 응집체를 제거한다. 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제하고, 이온교환 수지 후 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하여 결과물인 고안정성 bFGF 변이체를 획득한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 피부 염증, 급ㆍ만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성 단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름과 같은 피부 질환의 예방 또는 치료에 이용된다.
또한, 본 발명의 조성물은 창상 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 폐쇄창(closed wound) 및 개방창(open wound)의 치료에 이용된다. 폐쇄창의 예는 좌상(contusion or bruise)을 포함하고, 개방창의 예는 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 결출상(avulsion), 관통상(penetrated wound) 및 총상(gun-shot wound)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 유효량"은 상술한 bFGF 변이체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제조에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏ 체중이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선에 이용된다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장료 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 bFGF 변이체와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물들은 상술한 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 의하면, N-말단의 변형을 통해 만들어진 신규 HsbFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않으며 미생물에서 생산 시, 순수한 단일물질로 만들어지는 물질이며 이는 기능성화장품의 소재 및 피부창상 치료제 등으로 활용이 가능하다.
도 1은 플라스미드 pSSB-bFGF의 조립에 관한 개요를 보여준다.
도 2는 천연형 bFGF와 기존 발명의 K75(sbFGF)와 본 발명에서 개발한 신규 HsbFGF(변이체 O)의 최종 정제 후 SDS-PAGE를 이용한 분석이다.
도 3은 천연형 bFGF와 K74(변이체 K), 기존 HsbFGF(기존 발명의 변이체)와 신규 HsbFGF(변이체 O)의 열안정성의 지표인 Tm(melting temperature) 의 차이 결과를 보여준다.
도 4는 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF 및 신규 HsbFGF(변이체 O)의 인산완충액 상태에서 50 ℃ 에서 5일간 incubation한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 5는 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF와 신규 HsbFGF(변이체 O)의 인산완충액 상태에서 60 ℃ 에서 5일간 incubation한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 6는 천연형 bFGF와 본 발명의 신규 HsbFGF(변이체 O)와 기존 HsbFGF 활성 비교결과를 보여준다.
도 7은 (a) 본 발명의 신규 HsbFGF(변이체 O)의 N-말단 분석결과와 (b) 기존 HsbFGF의 N-말단 분석결과를 나타낸다.
도 8은 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF 변이체, 신규 HsbFGF(변이체 O)의 37℃ 1달간 incubation 결과를 농도 정량을 통하여 분석한 결과이다.
도 9은 본 발명의 천연형 bFGF와 K74(변이체 K), 그리고 신규 HsbFGF(변이체 O)의 37℃ 100일간 incubation 결과를 (a) HPLC와 (b) SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과이다.
도 10은 신규 HsbFGF(변이체 O)의 L929세포를 이용한 독성실험 결과이다.
도 2는 천연형 bFGF와 기존 발명의 K75(sbFGF)와 본 발명에서 개발한 신규 HsbFGF(변이체 O)의 최종 정제 후 SDS-PAGE를 이용한 분석이다.
도 3은 천연형 bFGF와 K74(변이체 K), 기존 HsbFGF(기존 발명의 변이체)와 신규 HsbFGF(변이체 O)의 열안정성의 지표인 Tm(melting temperature) 의 차이 결과를 보여준다.
도 4는 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF 및 신규 HsbFGF(변이체 O)의 인산완충액 상태에서 50 ℃ 에서 5일간 incubation한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 5는 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF와 신규 HsbFGF(변이체 O)의 인산완충액 상태에서 60 ℃ 에서 5일간 incubation한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 6는 천연형 bFGF와 본 발명의 신규 HsbFGF(변이체 O)와 기존 HsbFGF 활성 비교결과를 보여준다.
도 7은 (a) 본 발명의 신규 HsbFGF(변이체 O)의 N-말단 분석결과와 (b) 기존 HsbFGF의 N-말단 분석결과를 나타낸다.
도 8은 천연형 bFGF와 기존 HsbFGF 변이체, 신규 HsbFGF(변이체 O)의 37℃ 1달간 incubation 결과를 농도 정량을 통하여 분석한 결과이다.
도 9은 본 발명의 천연형 bFGF와 K74(변이체 K), 그리고 신규 HsbFGF(변이체 O)의 37℃ 100일간 incubation 결과를 (a) HPLC와 (b) SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과이다.
도 10은 신규 HsbFGF(변이체 O)의 L929세포를 이용한 독성실험 결과이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험방법 및 재료
DNA
주형제작
(construction)
단백질 발현 벡터인 pET21a(도 1a)와 발현용 E. coli 균주로는 BL21(DE3)을 Novagen에서 구입하였으며 cloning용 E. coli 균주는 Top10을 사용하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 NEB(New England Biolabs)의 제품이며, ligase는 Roche사의 T4 DNA ligase이다. PCR시 사용된 Ex taq DNA polymerase는 Takara사의 제품이며 점 돌연변이에 사용된 pfuUltra HF DNA polymerase는 Agilent사의 제품이다. DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 (주)코스모진텍의 제품이다. 또한, 프라이머들은 (주)코스모진텍에서 제작하였으며, DNA sequencing도 (주)코스모진텍에 의뢰하여 수행하였다.
단백질 발현(Protein expression)
발현 유도체인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 항생제로 쓰인 앰피실린과 클로람페니콜은 모두 Sigma에서 구입하였다. E. coli 배양 LB배지를 만들 때 사용한 bacto tryptone, yeast extract는 BD(Becton Dicknson)사에서 구입하였으며, NaCl은 덕산 제품을 사용하였다.
단백질 정제(Protein purification)
정제과정에 사용되는 시약은 최대한 순도가 높은 제품을 사용하였으며, 정제 과정에서 사용한 시약은 다음과 같다. sodium phosphate monobasic(Sigma), sodium phosphate dibasic(Sigma), sodium chloride(Sigma)이다. FPLC에서 사용된 column은 SP-sepharose, 헤파린 친화 칼럼을 사용하였다.
FPLC
FPLC는 GE UPC-800을 사용하였다.
CD(Circular
dichroism
)
CD는 Jasco사의 J-810 spectropolarimeter를 사용하였다.
상동성
모델링
(Homology modeling)
Homology modeling은 Modeller(Andrej Sali)를 이용하였다.
에너지 최소화(Energy minimization)
에너지최소화는 Chimera에 포함된 Amber 99FF force field를 사용하였다.
이황화결합
예측(Disulfide predict)
이황화 결합의 형성에 따른 예측은 YASARA Web server를 이용하였다.
이황화결합
거리 측정
이황화결합이 가능한 거리를 측정해주는 plotting program은 Protein contact map visualization (Andreas Viklund)을 이용하였다.
점 돌연변이(Point mutation)
bFGF의 안정성을 증가시키기 위하여 단백질의 구조(PDB:4FGF)와 분자모델방법을 통하여 변화시킬 아미노산 부분을 찾았고, 하기 프라이머(실시예2)를 사용하여 pfuUltra HF DNA polymerase를 이용하여 Quickchange mutagenesis 방법을 이용하여 증폭시켰다. 사용한 천연형 bFGF 주형을 제거하기 위하여 DpnI 반응을 진행하여 Top10에 형질전환(transformation)시켰고, 서열분석을 통하여 변이체(mutant)를 확인하였다.
분자
모델링
(Molecular modeling)
PDB에 등록된 단백질의 구조인 1BLA(NMR)을 이용하여 이황화 결합이 가능한 후보군을 설정하였다. Protein contact map visualization 프로그램을 이용하여 두 개의 아미노산의 C-alpha 탄소의 거리가 7Å 이하, C-beta 탄소의 거리가 5 Å인 잔기를 plot 을 이용하여 분석하였다. 이후 Yasara energy minimization server를 이용하여 이황화결합의 생성유무를 분석 하였고 chimera의 AMBER force field FF99를 이용하여 에너지 최소화를 진행하였다. 이후 생성된 단백질의 구조를 천연형의 bFGF와 구조 정렬하여 RMSD를 측정 0.5이하인 값을 갖는 구조를 실험으로 진행하였다.
CD(Circular
dichroism
)
천연형 bFGF와 변이체의 구조분석 및 Tm 측정을 위하여 각각 bFGF를 0.2 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, pathlength length 1 cm, accumulation 8 번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다. 온도 안정도를 분석하기 위하여 melting temperature는 20 ℃와 95 ℃에서의 205 nm 파장에서 0.1 cm 큐벳에 0.2 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~ 95 ℃까지 측정하였다.
세포 증식 분석 및 독성실험(cell proliferation assay)
만들어진 천연형 bFGF와 변이체가 실제로 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 세포 증식 능력을 이용한 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 NIH-3T3, L929 cell 은 10 % 열불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete 배지를 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 분주(seeding)하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample 용액을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다.
장기보존실험(Incubation test)
실온에서 보존정도를 확인하기 위하여 천연형 bFGF와 변이체의 incubation test를 진행하였다. 1X PBS(pH 7.2)에서 각각의 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37 ℃, 50 ℃ 와 60 ℃ 수조에서 incubation을 하였다. 24 시간 단위로 sampling하여 13000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 nano drop을 통한 정량 및 HPLC 분석을 진행하였다.
<실시예 1: 사람 bFGF cDNA를 포함하는 pSSB-bFGF 플라스미드의 구축 및 정제>
사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄 반응에 의해 bFGF를 코딩 하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
센스 프라이머:5'-GGCGGGCATATGTTGCCCGAGG-3'
안티센스 프라이머:3'-CCTCGGGCAACATATGCCCGCC-5'.
도 1b의 bFGF 부분을 상기에 명시된 프라이머를 이용하여 증폭하였고, 증폭된 DNA 절편 1 ug을 50 ul TE(pH8.0) 용액에 녹인 후 2 단위(unit)의 NdeI(NEB사)과 2 단위의 BamHI(NEB사)과 섞은 후, 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시켜 5'-말단에 NdeI 제한효소 부위와 3'-말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하였다. DNA 정제 키트(GeneAll사)를 사용하여 DNA만을 정제한 후, 이 DNA 절편 20 ng을 동일한 방법으로 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 준비한 20 ng의 pET21a(+) 플라스미드(Novagen사)와 함께 10 ul의 TE(pH 8.0) 용액에 섞은 후, 1 단위의 T4 DNA리가제(NEB사)를 첨가하여 16 ℃에서 4 시간 동안 반응시켜 접합시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pSSB-bFGF이라고 명명하였다. 이렇게 제조되어진 발현 플라스미드로 E. coli BL21(DE3)에 heat shock으로 형질전환 시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종하였다. 선별된 발현균주를 37 ℃에서 12 시간 동안 배양한 후 100 % 글리세롤과 1:1로 섞어 -70℃에 보관하였다.
발현균주를 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종한 후 12 시간 이상 배양하였다. 그 후 500 ml의 LB배지(LB/ 앰피실린)에 옮겨 흡광도 O.D600 0.4 ~ 0.5일 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37 ℃에서 4 시간 동안 200 rpm 속도로 진탕 배양한 후 8000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 얻었다 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다. 그 후 FPLC를 이용하여 SP 및 헤파린 칼럼 정제하였다. 각 분획에 대하여 SDS-PAGE 분석법을 통하여 bFGF가 포함된 분획을 확인 후, Bradford assay 법으로 정량을 진행하였고 결과적으로 10 ~ 18 mg의 bFGF를 획득하였다.
<실시예 2: pSSB-bFGF 변이체 플라스미드의 구축>
천연형의 pSSB-bFGF 플라스미드를 주형으로 pfuUltra HF DNA 중합효소를 이용하여 각각의 변이체들에 해당하는 두 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 pSSB-bFGF 변이체 플라스미드들을 만들었다. 변이체 플라스미드를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
68 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TCT ATC AAA GGA GTG TCT GCT AAC CGT TAC CTG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CAG GTA ACG GTT AGC AGA CAC TCC TTT GAT AGA-5';
86 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TTA CTG GCT TCT AAA TCT GTT ACG GAT GAG TGT-3' 및 안티센스프라이머 3'-ACA CTC ATC CGT AAC AGA TTT AGA AGC CAG TAA-5';
74 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-GCT AAC CGT TAC CTG TGC ATG AAG GAA GAT GGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCC ATC TTC CTT CAT GCA CAG GTA ACG GTT AGC-5';
25 번째 라이신의 코돈인 AAA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG CGG CTG TAC TGC TGC AAC GGG GGC TTC TTC-3'및 안티센스프라이머 3'-GAA GAA GCC CCC GTT GCA GCA GTA CAG CCG CTT-5';
33 번째 아이소루신의 코돈인 ATC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGC TTC TTC CTG CGC TGC CAC CCC GAC GGC CGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCG GCC GTC GGG GTG GCA GCG CAG GAA GAA GCC-5';
39 번째 발린의 코돈인 GTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CAC CCC GAC GGC CGA TGC GAC GGG GTC CGG GAG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CTC CCG GAC CCC GTC GCA TCG GCC GTC GGG GTG-5';
49 번째 히스티딘의 CAC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TGC ATC AAG CTA CAA CTT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT GCA AGG GTC GCT CTT CTC-5';
51 번째 라이신의 코돈인 AAG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AGC GAC CCT CAC ATC TGC CTA CAA CTT CAA GCA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TGC TTG AAG TTG TAG GCA GAT GTG AGG GTC GCT-5';
75 번째 메치오닌의 코돈인 ATG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAC CGT TAC CTG GCT TGC AAG GAA GAT GGA AGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCT TCC ATC TTC CTT GCA AGC CAG GTA ACG GTT-5';
116 번째 알라닌의 코돈인 GCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ACC AGT TGG TAT GTG TGC CTG AAG CGA ACT GGG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CCC AGT TCG CTT CAG GCA CAC ATA CCA ACT GGT-5';
66 번째 글라이신의 코돈인 GGA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GTT GTG TCT ATC AAA TGC GTG TCT GCT AAC CGT-3' 및 안티센스프라이머 3'-ACG GTT AGC AGA CAC GCA TTT GAT AGA CAC AAC-5';
67 번째 발린의 코돈인 GTG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환 센스프라이머 5'-GTG TCT ATC AAA GGA TGC TCT GCT AAC CGT TAC-3' 및 안티센스프라이머 3'-GTA ACG GTT AGC AGA GCA TCC TTT GAT AGA CAC-5';
69 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ATC AAA GGA GTG TCT TGC AAC CGT TAC CTG GCT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AGC CAG GTA ACG GTT GCA AGA CAC TCC TTT GAT-5';
83 번째 루이신의 코돈인 TTA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG GAA GAT GGA AGA TGC CTG GCT TCT AAA TCT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AGA TTT AGA AGC CAG GCA TCT TCC ATC TTC CTT-5';
85 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAT GGA AGA TTA CTG TGC TCT AAA TCT GTT ACG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CGT AAC AGA TTT AGA GCA CAG TAA TCT TCC ATC-5';
107 번째 세린의 코돈인 TCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TAC AAT ACT TAC CGG TGC AGG AAA TAC ACC AGT-3' 및 안티센스프라이머 3'-ACT GGT GTA TTT CCT GCA CCG GTA AGT ATT GTA-5';
135 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGA CCT GGG CAG AAA TGC ATA CTT TTT CTT CCA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TGG AAG AAA AAG TAT GCA TTT CTG CCC AGG TCC-5';
136 번째 아이소루신의 코돈인 ATA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CCT GGG CAG AAA GCT TGC CTT TTT CTT CCA ATG-3' 및 안티센스프라이머 3'-CAT TGG AAG AAA AAG GCA AGC TTT CTG CCC AGG-5';
137 번째 루이신의 코돈인 CTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGG CAG AAA GCT ATA TGC TTT CTT CCA ATG TCT-3' 및 안티센스프라이머 3'-AGA CAT TGG AAG AAA GCA TAT AGC TTT CTG CCC-5'; 및
143 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TTT CTT CCA ATG TCT TGC AAG AGC TGA TGA-3' 및 안티센스프라이머 3'-TCA TCA GCT CTT GCA AGA CAT TGG AAG AAA-5'.
49 번째 히스티딘의 코돈인 CAC가 타이로신의 코돈인 TAT로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TAT ATC AAG CTA CAA CTT -3' 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT ATA AGG GTC GCT CTT CTC-5'.
<실시예 3: bFGF 변이체의 생산 및 정제>
bFGF 변이체의 발현 LB배지(LB/앰피실린) 500 ml에 배양하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 정제하여 각각 약 18 KDa 크기의 bFGF를 얻었다. 이 때 얻어진 변이체의 양은 변이체에 따라 각각 차이가 있었으며 변이체에 따라 약 4 ~ 12 mg의 bFGF를 얻을 수 있었으며 순도는 98% 이상이었다.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 33 번째 아이소루신 및 66 번째 글라이신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 33 번째 아이소루신 및 69 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 33 번째 아이소루신 및 83 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 39 번째 발린 및 81 번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 39 번째 발린 및 83 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 49 번째 히스티딘 및 68 번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 51 번째 라이신 및 67 번째 발린이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 메치오닌 및 107 번째 세린이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 116 번째 알라닌 및 135 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 116 번째 알라닌 및 136 번째 아이소루신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 25 번째 라이신 및 86 번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 137 번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 51 번째 라이신 및 143 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체.
서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 49 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 변이체.
천연형과 변이체의 정제는 SP-sepharose와 헤파린 친화 칼럼을 통해 정제가 가능하다. 최종 헤파린 친화 칼럼 정제를 진행한 후 SDS-PAGE 분석을 하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 천연형의 경우 이량체(dimer)와 삼량체(trimer)가 관찰되는 반면, 변이체(HsbFGF) 경우 단량체(monomer) 사이즈에 단일 밴드 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 활성이 없는 이량체, 삼량체가 완벽하게 제거되고 단량체 상태로 존재한다는 것을 보여주는 자료이다.
<실험예 1: 천연형과 변이체 bFGF의 circular dichroism을 이용한 구조 분석>
J-810 spectropolarimeter(JASCO)를 사용하여 circular dichroism 분석을 통하여 실시예 3의 정제된 bFGF 변이체의 구조와 열 안정성을 측정하였다. 천연형 bFGF은 실시예 1에서 정제된 bFGF를 사용하였다. 구조분석을 위하여 각각의 bFGF를 20 mM sodium phosphate(pH 7.0)에 녹여 최종농도가 0.1 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다.
열 안정도를 분석하기 위하여 Tm는 20 ℃와 95 ℃에서의 far-UV를 비교 분석하여 208 nm 파장을 결정하였으며 0.1 cm 큐벳에 0.1 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~ 95 ℃까지 측정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.
| 변이체 bFGF 명칭 | 구조변화 (Tm) | 변이체 bFGF 명칭 | 구조변화(Tm) | 변이체 bFGF 명칭 | 구조변화(Tm) |
| 본 발명의 bFGF (서열번호 1) |
- (57.5℃) |
변이체 A C68S,C86S I33C,G66C (서열번호 3) |
감소 48℃ |
변이체 B C68S,C86S I33C,A69C (서열번호 4) |
변화 없음 |
| 변이체 C C68S,C86S I33C,A83C (서열번호 5) |
변화 없음 | 변이체 D C68S,C86S V39C,L81C (서열번호 6) |
변화 없음 | 변이체 E C68S,C86S V39C,A83C (서열번호 7) |
변화 없음 |
| 변이체 F C68S,C86S H49C (서열번호 8) |
변화 없음 | 변이체 G C68S,C86S K51C,V67C (서열번호 9) |
변화 없음 | 변이체 H C68S,C86S M75C,S107C (서열번호 10) |
변화 없음 |
| 변이체 I C68S,C86S A116C,A135C (서열번호 11) |
변화 없음 | 변이체 J C68S,C86S A116C,I136C (서열번호 12) |
변화 없음 | 변이체 K C68S,C86S A74C (서열번호 13) |
변화 (62℃) |
| 변이체 L C68S,C86S L25C (서열번호 14) |
변화 없음 | 변이체 M C68S,C86S K137C (서열번호 15) |
변화 없음 | 변이체 N C68S,C86S K51C,A143C (서열번호 16) |
변화 없음 |
| 변이체 O C68S,C86S A74C,H49Y (서열번호 17) |
(65℃) |
표 1은 천연형 bFGF와 bFGF 변이체에 대한 구조 변화 정도와 열 안정성 측정 실험인 circular dichroism 분석 중 208 nm의 파장에서 온도 별 풀림 구조비율(unfolded fraction)을 측정한 결과를 나타낸 값이다. 접힘-풀림 현상이 일어날 때에는 208 nm 부근의 구간에서 구조의 변화를 보이게 되는데 이를 이용하여 20 ~ 95 ℃범위 내에서 Tm을 측정하여 정확한 Tm값을 분석하였다.
본 표 1에서 서열번호 1은 천연서열에서 N-말단의 2개의 아미노산서열을 제거한 후 시작서열로 메치오닌을 추가한 변이체임.
상기 발명에서 제작되어진 신규 변이체를 대상으로 Tm 측정을 한 결과, 기존 특허((KR 10-2015-0078930/PCT-KR2015-007734)의 결과와 비교하였을 때 기존 HsbFGF와 유사한 Tm 패턴을 나타내어 N-말단 서열은 bFGF의 구조에는 큰 영향을 미치지 않음을 보여준다.
기존 특허에서 보였던 양상과 같이, 구조변화 측면에선 대부분이 천연형 bFGF와 동일한 구조를 나타내었으며 이황화결합을 추가한 변이체들에서 특별한 구조를 가지지 않았다. 열 안정도를 나타내는 Tm의 경우 기존의 특허의 실험과 거의 유사하게 나왔으며 58℃인 천연형 bFGF와 비교하여 거의 대부분이 bFGF 변이체와 동일하였고, 그 중 기존 특허의 K75와 동일하게, 변이체 K(K74)에서 62℃까지 Tm 값이 상승하였고, 변이체 K에 49번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 변이체 O(신규 HsbFGF)의 열 안정도를 나타내는 Tm은 65℃까지 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 실험을 토대로 열 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었고 기존 특허의 내용과 일치하는 데이터를 보여주었다.
<실험예 2: 천연형과 변이체 bFGF의 세포증식검정>
만들어진 천연형 bFGF와 변이체 중 용해도와 circular dichroism을 이용한 구조와 Tm의 결과분석을 통하여 좋은 결과를 보여준 bFGF을 선정하여 세포증식검정을 실시하였다. 세포증식검정은 bFGF에 민감한 피부세포인 NIH-3T3 세포주를 가지고 수행하였다. 실험 방법으로는 NIH-3T3 cell을 10 % 열불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete 배지을 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample solution을 각각의 농도 별로 처리하고, 72시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다(도 4 ~ 6, 도 8).
<실험예 3: 천연형과 변이체 bFGF의 incubation에 따른 단백질의 정량 분석>
천연형 bFGF와 변이체들의 안정성을 확인하기 위하여, 37 ℃, 50 ℃, 60 ℃ incubation test를 진행하였다. 인체의 상태와 가장 유사한 인산완충액(PBS)상태에서 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 각 온도의 water bath에서 incubation을 하였다. 0, 24, 48 시간, 7 일, 10 일 단위로 sampling 하여 13,000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 nano drop을 이용하여 단백질을 정량하였다. 시간이 지날수록 천연형 bFGF 와 변이체들의 농도를 정량하였고, 천연형 bFGF가 변이체에 비하여 더 심한 감소를 보였다.
또한, 상기 결과들을 토대로, 열 안정성이 증가된 기존 HsbFGF, 신규 HsbFGF 변이체 및 천연형 bFGF를 incubation 진행하였다. 그 결과 천연형 bFGF에 비하여 변이체들은 안정도가 월등히 높았다. 이러한 실험을 토대로 천연형과 기존 HsbFGF와 신규 HsbFGF를 한달간 37℃에서 incubation을 진행하면서 비교한 결과 천연형에 비해 월등히 우수한 결과를 보여주었다.
<실험예 4: 천연형과 변이체 bFGF들의 37℃ 장기간 incubation에 따른 SDS-PAGE 및 HPLC 분석>
천연형 bFGF과 변이체 K 및 신규 HsbFGF 변이체 안정성을 확인하기 위하여, 37℃에서 100일간 incubation test를 진행하였다. 인산완충액 상태에서 각각의 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37 ℃인 수조에서 incubation을 하였다. 날짜에 따라 분획을 취하여 13,000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 HPLC 및 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분석하였다.
도 9에 나와 있듯이 신규 HsbFGF의 경우 (a) SDS-PAGE와 (b) HPLC분석결과 유일하게 100 일 이후에도 보존되어지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 5: L929 사멸 분석>
Mouse L929 세포(ECACC, no. 85011425)를 10 % 열불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete 배지를 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 5x103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24 시간 배양된 L929 cell에 sample 용액을 각각의 농도 별로 처리하고, 24 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2 시간 반응시킨 후 이용하여 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다. 도 10에서 보여지듯 새로이 제작된 새로운 HsbFGF는 독성이 검출되지 않았다.
<실험예 6: N-말단분석>
상기 과정을 통해 정제되어진 단백질을 (주)한국질량분석기술원에 Edman N-말단 분석법을 실시하였다. 0.5 mg/ml이 되도록 준비한다. PVDF membrane을 100 % MeOH 에 30 초 ~ 1 분간 담근다. 이후 0.45 um의 PVDF membrane을 이용하여 transfer를 진행한다. blotting이 끝난 membrane 을 3차 증류수에 5분간 담가둔다. 염색시약을 이용하여 5분 이내로 염색을 진행한다. 염색시약을 버린 후, 탈색시약을 이용하여 바로 탈색을 실시한다. 단백질의 band가 명확히 보이는 시점에서 탈색시약을 버린 후, 3차 증류수로 세척한다. 세척이 끝난 membrane을 충분히 풍건(공기건조)한다. 이후 phenylisothiocyanate(PITC) coupling 반응을 통한 N- 말단의 폴리펩타이드 사슬들이 형성되는 초기 반응을 개시로 phenylthiocarbamyl (PTC)-polypetide, anilinothiazolamine(ATZ)-amino acid 그리고 최종 phenylthiohydantoin(PTH) derivative amino acid 형태의 안정화된 구조 형성을 시키고 HPLC에 매 반복에서 생성된 아미노산 유도체를 주입하여 순차적으로 서열을 확인한다. 도 7에 나와있는 PITC 피크의 경우 N-말단의 아미노산을 PITC시약을 이용하여 coupling시키는 과정 중 잔여 PITC 시약이 남아 질량분석에 보여지는 피크로서 이는 N-말단 아미노산과는 관련이 없다. 또한 하기 피크중 Dptu는 기준 및 표준 시약으로써 크로마토그래피를 이용한 분리에서 기준으로 사용되어지는 시약이다.
도 7(a)에서 볼 수 있듯이 본 발명의 변이체 O(New HsbFGF)은 단일 성분으로 분석되는 반면에, 도 7(b)의 기존 발명의 Old HsbFGF의 경우는 N-말단이 상이한 물질이 섞인 것으로 분석되어 본 발명의 우수성을 보여준다.
<110> PnP Biopharm Co., Ltd.
<120> A High-Stable Mutant of Basic Fibroblast Growth Factor with
Modified N-Terminal Amino acid Region, And Uses Thereof
<130> P16-0253HS
<160> 17
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 1
Met Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
20 25 30
Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
50 55 60
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Ser
145
<210> 2
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 2
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cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac 120
ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc aagctacaac ttcaagcaga agagagagga 180
gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga 240
ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat 300
aactacaata cttaccggtc aaggaaatac accagttggt atgtggcact gaagcgaact 360
gggcagtata aacttggatc caaaacagga cctgggcaga aagctatact ttttcttcca 420
atgtctgcta agagc 435
<210> 3
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 3
Met Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
20 25 30
Cys His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
50 55 60
Lys Cys Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg
65 70 75 80
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Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 4
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1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
20 25 30
Cys His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
50 55 60
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100 105 110
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Ser
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
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His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
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Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 7
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Ser
145
<210> 8
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 8
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1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
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Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
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Ser
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 9
Met Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
20 25 30
Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
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His Ile Cys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
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Lys Gly Cys Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg
65 70 75 80
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Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser
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Ser
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 10
Met Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
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Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Cys Lys Glu Asp Gly Arg
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Ser
145
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 11
Met Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
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Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
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Ser
145
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 12
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Ser
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<210> 13
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 13
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Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
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Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
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Ser
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<220>
<223> Mutant
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<220>
<223> Mutant
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130 135 140
Ser
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1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
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Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
His Ile Cys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg
65 70 75 80
Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg
85 90 95
Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser
100 105 110
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130 135 140
Ser
145
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 17
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Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg
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Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
Tyr Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Cys Met Lys Glu Asp Gly Arg
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Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg
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Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser
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Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys
115 120 125
Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys
130 135 140
Ser
145
Claims (12)
- 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이체에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF, basic fibroblast growth factor) 변이체(mutant).
- 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 68 번째 및 86 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 74 번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 추가로 49번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF, basic fibroblast growth factor) 변이체(mutant).
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항의 변이체를 코딩하는 유전자.
- 삭제
- 제 5 항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
- 제 7 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
- 다음 단계를 포함하는 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 생산 방법:
(a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계. - 제 9 항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
(c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 제거하는 단계;
(d) 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
(e) 이온교환 수지 후 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항의 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
- 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항의 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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| KR1020160092598A KR101891678B1 (ko) | 2016-07-21 | 2016-07-21 | 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도 |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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