KR101882790B1 - Dusp1 저해제를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DUSP1 저해제를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 DUSP1 저해제를 함유하는 약제학적 조성물은 DUSP1을 알로스테릭 기작으로 저해하기 때문에 활성 부위를 표적으로 하는 저해제가 갖는 문제점을 해결할 수 있으며, 간암, 유방암, 췌장암 등의 암, C형 간염, 우울증 등 DUSP1 효소가 관여하는 질병의 예방 또는 치료에 효과적이다. 특히, 본 발명에 따른 DUSP1 저해제는 신경세포 성장에 직접적으로 작용하기 때문에 우울증 치료에 매우 효과적이다.

Description

DUSP1 저해제를 함유하는 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition Containing DUSP1 Inhibitor}

본 발명은 DUSP1 저해제를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 4-퀴놀린온 유도체를 포함하는 DUSP1 단백질 활성 저해제를 유효성분으로 함유하는 우울증, C형 간염 및 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

단백질의 인산화(phosphorylation)는 세포성장, 분화, 면역반응, 뇌기능 등의 여러가지 세포 현상 조절에 핵심적인 역할을 한다. 단백질의 부적절한 인산화는 다양한 질병들을 야기할 수 있는데, 예를 들어, 암, 당뇨, 면역질환, 신경계질환 등이 단백질 인산화의 부적절한 조절로 인하여 발병할 수 있다.

따라서, 단백질의 인산화와 탈인산화를 조절하는 단백질 인산화 효소(protein kinases) 및 단백질 탈인산화 효소(protein phosphatases)를 질병 치료를 위한 표적 단백질로서 개발하고자 하는 시도가 있어왔고, 단백질 인산화 효소의 저해제는 이미 질병치료제로서의 효능이 임상에서 증명된 바 있다. 최근에는, 단백질 탈인산화 효소를 표적으로 하는 질병치료제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다.

단백질 티로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatases; PTP)의 패밀리에 속하는 이중특이성 탈인산화 효소 1(dual specificity protein phosphatase 1; DUSP1)은 세포 내에서 ERK 단백질의 인산기를 선택적으로 분해하여 ERK의 신호전달을 조절하는 것으로 알려져 있다. 상기 DUSP1는 유방암, 췌장암, 간암 등의 암 치료에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, C형 간염 및 우울증 치료에도 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다.

구체적으로, 문헌[Candas et al. (2014) Mitochondrial MKP1 Is a Target for Therapy-Resistant HER2 -Positive Breast Cancer Cells. Cancer Res. 74, 7498-7509]에서는 Mitochondrial DUSP1(MKP1)이 치료-내성 HER2-양성(therapy-resistant HER2-positive) 유방암 세포의 표적이라는 것을 증명하였으며, DUSP1의 저해제와 Her2의 저해제를 병용하였을 때 유방암 치료의 효과가 높다는 것을 확인한 바 있다.

또한, 문헌[Liu et al. (2014) DUSP1 Is a Novel Target for Enhancing Pancreatic Cancer Cell Sensitivity to Gemcitabine. Plos One 9, e84982]에서는 DUSP1이 췌장암 세포에서 과발현된다는 것을 발견하고, shRNA를 사용하여 DUSP1을 억제하면 항암제인 젬시타빈(gemcitabine)에 대한 내성이 줄어들고 암세포 성장 억제효과가 현격히 증가한다는 것을 보고하였다.

문헌[Choi et al. (2014) Suppression of Dual Specificity Phosphatase I Expression Inhibits Hepatitis C Virus Replication. Plos One 10, e0119172]에서는 만성 C형 간염 환자에게서 DUSP1이 과발현되어 있는 것을 발견하고, C형 간염의 치료에 인터페론과 DUSP1 저해제를 병용했을 때 효과가 상승될 것을 예측하였다.

문헌[Duric et al. (2010) A negative regulator of MAP kinase causes depressive behavior. Nature Medicine 16, 1328-1332]은 실험용 쥐에 반복적 스트레스를 가한 뒤 우울증 증상을 보이는 쥐의 뇌에서 DUSP1이 과발현 되었다는 것을 발견하였고, DUSP1 유전자를 결손시킨 쥐에서는 스트레스에 대항하는 능력이 월등하다는 것을 규명한 바 있다. 또한, 문헌[Chen et al. (2012) Microinjection of sanguinarine into the ventrolateral orbital cortex inhibits Mkp -1 and exerts an antidepressant-like effect in rats. Neurosci Lett 506, 327-331]에서는 실험용 쥐의 복측부 궤도 피질(ventrolateral orbital cortex)에 DUSP1의 선택적 저해제로 알려진 상귀나린(sanguinarine)을 주사한 경우 기존의 항우울제와 유사한 항우울 효과를 보인다는 것을 확인하였다.

이와 같이, DUSP1의 억제가 유방암, 췌장암, C형 간염, 우울증 등의 질병 치료에 효과적이라는 것이 알려져 있지만, PTP를 표적 물질로 하는 치료제 개발에 있어서 아직까지 임상에서 성공적인 치료제는 보고되지 않고 있다. 기존의 PTP 저해제 개발은 주로 PTP 효소의 활성 부위를 표적으로 하는데, PTP 활성 부위 포켓은 비교적 깊이가 낮고 저해제 화합물과 강한 상호작용을 할 수 있는 부분이 적기 때문에, 이를 표적으로 한 화합물들은 효소기능 저해강도(potency), 선택성, 세포막 투과성 등의 관점에서 최적화를 하기가 매우 어려운 문제가 있었다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 최근에는 알로스테릭 저해 효과를 갖는 화합물들을 이용하려는 노력이 진행되고 있다. 알로스테릭 저해 방법은 도메인 사이의 포켓을 이용하는 방법, 활성 포켓 부위에 있는 D-loop의 유동성을 이용하는 방법, 및 활성 부위 도메인 끝부분에 있는 비정형 부위를 활용하는 방법 등이 있는데, 이러한 알로스테릭 접근방법을 활용하여 발굴된 저해제의 경우 활성 부위를 표적으로 하는 방법의 문제점을 해결할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

한편, 전 세계적으로 우울증은 일생 중 높은 발생빈도(~16%)와 이로 인한 엄청난 경제적 부담(연간 100조원 이상)을 갖고 있다. 현재 치료제 시장은 약 11조원이며 빠른 속도로 시장이 증가되고 있다. 국내에서도 유병율이 5.6% 이며 매년 2.5%의 증가율을 보이고 있다. 현재 우울증 치료제로서 많이 사용되고 있는 것은 세라토닌의 재흡수를 조절하는 SSRI(selective serotonin reuptake inhibitor) 계열로서 프로작(Prozac), 팍실(Paxil)이 대표적이며, 최근에는 인체용, 동물용의 마취제인 케타민을 우울증 치료제로서 사용하고자 하는 시도가 있다. 그러나 이들 기존 치료제들은 직접적인 표적에 작용하는 것이 아니기 때문에 효과가 나타나는데 시간이 오래 걸리는 문제가 있으며, 자살충동 등 부작용이 있다는 문제가 있다.

또한, 암 사망자는 전세계 사망자의 17%에 해당하는 760만명이며 2030년 기준 1140만명까지 급증할 것으로 예상되고 있다. 암은 국내에서도 사망원인 1위를 고수하고 있고, 건강보험심사평가원의 '약효별 EDI 청구액'을 분석한 결과 항악성 종양제에 5,330억원이 청구되고 있다. 이외에도 사회적 비용이 막대하여 효율적인 암의 예방, 치료제의 개발은 매우 시급하다.

이에 본 발명자들은 DUSP1 활성을 알로스테릭 저해 방식으로 저해할 수 있는 신규한 화합물을 발견하였으며, 이러한 화합물이 우울증, C형 간염 및 암의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암 또는 췌장암일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 DUSP1 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식에서, R₁ 내지 R₁₀은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 카복실기, C₁-C₁₂ 알킬기, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬기, C₅-C₇ 사이클로알케닐기, C₁-C₆ 알킬아미노기, C₁-C₆ 알콕시기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아릴알킬기, 아릴알케닐기 또는 알킬아릴기이다.

바람직하게는, 상기 R₁ 내지 R₁₀은 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 니트로기 또는 C₁-C₁₂ 알킬기일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 R₁은 할로겐 또는 니트로기이고, 상기 R₂ 및 R₃은 수소이며, 상기 R₄는 할로겐이고, 상기 R₅는 C₁-C₁₂ 알킬기이며, 상기 R₆ 내지 R₁₀은 수소, 할로겐 또는 C₁-C₁₂ 알킬기일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 1 내지 8로부터 선택될 수 있다:

본 발명에 있어서, 상기 DUSP1 저해제는 알로스테릭 저해 효능을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 DUSP1 저해제를 함유하는 약제학적 조성물은 DUSP1을 알로스테릭 저해 기작으로 억제하기 때문에 활성 부위를 표적으로 하는 저해제가 갖는 문제점을 해결할 수 있으며, 간암, 유방암, 췌장암 등의 암, C형 간염, 우울증 등 DUSP1 효소가 관여하는 질병의 예방 또는 치료에 효과적이다.

특히, 본 발명에 따른 DUSP1 저해제는 신경세포 성장에 직접적으로 작용하기 때문에 우울증 치료에 매우 효과적이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 2의 라인웨버-버크(Lineweaver-Burke) 좌표를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 6의 신경돌기 성장 효과를 위상차 현미경(phase contrast microscope)으로 관찰한 이미지를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 유방암, 췌장암, C형 간염, 우울증 등의 질병에 중요한 영향을 미치는 것을 알려진 DUSP1의 활성을 저해할 수 있는 DUSP1 저해제 화합물 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 DUSP1 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식에서, R₁ 내지 R₁₀은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 카복실기, C₁-C₁₂ 알킬기, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬기, C₅-C₇ 사이클로알케닐기, C₁-C₆ 알킬아미노기, C₁-C₆ 알콕시기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아릴알킬기, 아릴알케닐기 또는 알킬아릴기이다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 효과적인 DUSP1 효소 억제 효과 및 신경세포 성장 촉진 효과를 가지며, 알로스테릭 저해 효과를 나타내기 때문에 효소 활성 부위를 표적으로 하는 저해제가 갖는 문제점을 나타내지 않는다.

본 발명에 있어서, 용어 “알로스테릭 저해”란 효소 단백질의 활성 중심(기질결합부) 이외의 부위에 특수한 물질이 결합함으로써 그 효소의 입체구조에 변화가 생기고 그 효소의 기능이 저해되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "C₁-C₁₂ 알킬"은 탄소수 1 내지 12의 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 "C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알킬기"이며, 이는 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 t-부틸을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 있어서, 상기 알킬은 하나 이상의 수소가 할로겐, 바람직하게는 클로로 또는 플루오로, 보다 바람직하게는 플루오로로 치환된 알킬일 수 있으며, 예를 들어, CF₃일 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "알케닐기"는 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분쇄 불포화 탄화수소기를 나타내며, 바람직하게는 C₂-C₆ 직쇄 또는 가지쇄 알케닐기이고, 이는 최소 하나의 이중 결합을 갖는 탄소수 2-6의 탄화수소기로서, 예컨대, 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, t-부테닐, n-펜테닐 및 n-헥세닐을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "사이클로알킬"은 지정된 탄소수를 갖는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하며, 바람직하게는 “C₃-C₈ 사이클로알킬”이고, 이는 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 사이클로펜틸을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "사이클로알케닐"은 지정된 탄소수를 가지며 최소 하나의 이중 결합을 포함하는 사이클릭 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 “C₅-C₇ 사이클로알케닐”이고, 이는 사이클로펜텐, 사이클로헥센 및 사이클로헥사디엔을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 “알킬 아미노”는 아미노 치환체를 갖는 알킬기를 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 “아릴”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 바람직하게는 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 상기 아릴은 치환 또는 비치환된 페닐이다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이 치환되는 경우에는, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬기, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시기, 알킬-치환 설파닐기, 페녹시기, C₃-C₆ 사이클로헤테로알킬기 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있다. 상기 아릴이 비아릴, 예컨대, 나프틸인 경우, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있고, 바람직하게는, 할로겐, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬기, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시기, 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있으며, 보다 바람직하게는 알킬기 치환 아미노기에 의해 치환될 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어, “알콕시”는 알킬기에 산소가 결합된 작용기를 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어, “헤테로아릴”은 헤테로사이클릭 방향족기로서, 헤테로원자로서 N, O 또는 S를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 헤테로아릴은 헤테로원자로서 N을 포함하는 헤테로비아릴이다.

본 발명에 있어서, 용어, “아릴알킬(아랄킬)”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 바람직하게는 벤질기이다.

본 발명에 있어서, 용어, “알킬아릴”은 하나 또는 그 이상의 아릴기로 이루어진 구조에 결합된 알킬기를 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어, “아릴알케닐”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 바람직하게는 페닐 에테닐기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₁ 내지 R₁₀은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 니트로기 또는 C₁-C₁₂ 알킬기일 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₁은 할로겐 또는 니트로기일 수 있고, 상기 R₂ 및 R₃은 수소일 수 있으며, 상기 R₄는 할로겐, 바람직하게는 Cl일 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₅는 C₁-C₁₂ 알킬기일 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₆ 내지 R₁₀은 수소, 할로겐 또는 C₁-C₁₂ 알킬기일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 DUSP1 저해제로서 사용될 수 있는 가장 바람직한 화합물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에서, 아래의 표 1과 같은 치환기를 갖는 화합물이다.

R1	R2	R3	R4	R5	R6	R7	R8	R9	R10
NO2	H	H	Cl	이소프로필	H	Cl	H	Cl	H
Cl	H	H	Cl	CH3	H	H	Cl	H	Cl
F	H	H	Cl	CH3	Cl	H	Cl	H	H
F	H	H	Cl	CH3	Br	H	Br	H	H
NO2	H	H	Cl	사이클로프로필	H	Cl	H	Cl	H
F	H	H	Cl	CH3	H	CF3	H	CF3	H
NO2	H	H	Cl	이소부틸	H	Cl	H	Cl	H
NO2	H	H	Cl	이소부틸	Cl	Cl	H	H	H

본 발명에서, DUSP1 저해제로서 사용될 수 있는 구체적인 화합물의 예는 아래 화합물 1 내지 8로 나타낸 바와 같다:

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 DUSP1 효소의 활성을 알로스테릭 활성 저해 기작에 의해 억제함으로써, 우울증, C형 간염, 및 간암, 유방암 및 췌장암과 같은 암의 예방 또는 치료 효능을 발휘할 수 있다.

따라서, 본 발명은 DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 DUSP1 저해제 화합물이 신경세포의 성장을 촉진함으로써 우울증 치료에 효과적일 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 C형 간염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 간암, 유방암 또는 췌장암일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, DUSP1 활성을 억제함으로써 치료될 수 있는 모든 암을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 DUSP1 저해제를 사용하는 경우 간암 세포를 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 DUSP1 저해제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효 성분으로 이용되는 것은 상기 화학식 1의 화합물 자체뿐만 아니라, 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물 또는 프로드러그이다.

본 발명에서, 용어 “약제학적으로 허용 가능한 염”은 소망하는 약리학적 효과, 즉 혈관 평활근 세포의 증식 또는 종양세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 히드로클로라이드, 히드로브로마이드 및 히드로요오다이드와 같은 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 유기산을 이용하여 형성될 수 있다.

본 발명에서, 용어 “약제학적으로 허용 가능한 수화물”은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 수화물을 나타낸다.

본 발명에서, 용어 “약제학적으로 허용 가능한 용매화물”은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 용매화물을 나타낸다. 상기 수화물 및 용매화물도 상기한 산을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명에서, 용어 “약제학적으로 허용 가능한 프로드러그”는 상기 화학식 1의 화합물의 약리학적 효과를 발휘하기 이전에 생물전환을 하여야 하는 상기 화학식 1의 화합물의 유도체를 나타낸다. 이러한 프로드러그는 화학적 안정성, 환자 수용성, 생물학적 이용성, 기관 선택성 또는 조제의 편의를 개선하기 위하여, 작용 기간의 장기화 및 부작용의 감소를 위하여 제조된다. 본 발명의 프로드러그의 제조는 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 당업계의 통상적인 방법(예: Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 5th ed., 1:172-178 and 949-982(1995))에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: DUSP1 활성 저해 화합물의 스크리닝

DUSP1 저해제를 발굴하기 위하여 효소 효능 검색법을 사용하였다. 효소효능 검색의 대상화합물은 한국화학연구원의 화합물 은행에서 제공하는 대표화합물 라이브러리의 6,000여종 화합물을 사용하였다. 여기서 발굴된 모핵으로서 퀴놀린온(quinolinone) 화합물을 선정하여 전체 화합물 라이브러리에서 같은 골격을 같는 화합물 250여종을 다시 분주 받아 효소저해능이 우수한 화합물을 선별하였다.

DUSP1 단백질의 catalytic domain을 발현 및 정제하여 알로스테릭 저해제를 탐색하였다. 우선 catalytic domain의 활성도를 억제하는 화합물들을 선별하고 이들 중에서 알로스테릭 저해 효과를 갖는 화합물들을 찾아내기 위하여 단백질의 융점이 화합물과 결합했을 때와 결합하지 않았을 때 달라지는 것을 이용하여 활성 부위 저해제와 알로스테릭 부위 저해제의 경쟁 정도를 측정하여 비교하였다. 융점 분석 방법으로 압축된 알로스테릭 저해제 화합물 8종은 아래와 같다.

실시예 2: DUSP1 활성 저해 효능 측정

상기 실시예 1에서 스크리닝된 화합물 8종에 대하여 DUSP1 활성의 저해 효능을 측정하였다.

96-웰 마이크로플레이트에 에세이 버퍼, 기질 및 효소 단백질을 첨가하고 화합물 1 내지 8을 각각 첨가하여 효소 반응에 의해 발생되는 형광을 측정하였다.

에세이 버퍼로는 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.01% Triton X-100 및 5mM DTT를 사용하였고, 기질은 형광 기질인 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate(DiFMUP) 10μM를 사용하였으며, DUSP1 효소는 활성화 도메인(아미노산 잔기 166-316)을 발현 정제하여, 효소 반응에 50nM 농도로 사용하였다.

활성화 도메인의 발현 정제는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. DUSP1 활성화 도메인(아미노산 잔기 166-316)을 pET28a(Novagen) 벡터에 클로닝하고, 대장균 BL21 스트레인(strain)에서 발현하였다. DUSP1 활성화 도메인 발현 벡터로 형질 전환된 대장균을 0.1mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 37℃에서 발현 촉진하였다. DUSP1 활성화 도메인이 발현된 대장균을 소니케이터로 부순 후 니켈 친화 컬럼을 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질은 브래드포드 방법(Bradford assay)으로 정량하여 효소 반응에 사용하였다.

화합물 1 내지 8은 5mM의 농도로 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 원용액(stock solution)을 만든 후 효소 반응의 웰에 첨가하여 사용하였고 효소 반응 용액에서의 DMSO 농도가 5%로 유지되도록 조건을 조정하여 사용하였다.

효소 작용에 의해 발생되는 형광은 빅터 분광형광계(Victor spectrofluorometer; PerkinElmer)를 이용하여 여기/방출 파장을 355nm/460nm로 하여 측정하였다. 얻어진 결과로부터 시그마플랏(Sigmaplot) 프로그램패키지(Systat software Inc.)의 4-매개변수 로지스틱(4-parameter logistic) 방법에 따라 억제중간값(IC₅₀)을 산출하여, DUSP1 효소 활성 저해 효능 측정 결과를 아래의 표 2에 나타내었다.

화합물	1	2	3	4	5	6	7	8
IC50(μM)	5.1	6.1	7.5	6.1	4.1	4.2	3.5	4.8

상기 표 2에서 확인 가능한 바와 같이, 화합물 1 내지 8의 IC₅₀ 값은 3.5 내지 7.5μM의 수치 범위로서 종래 DUSP1의 선택적 저해제로 알려진 상귀나린의 IC₅₀ 값인 10μM보다 더 낮은 수치를 나타내어, 화합물 1 내지 8의 DUSP1의 활성 억제 효능이 매우 우수하다는 것을 알 수 있다.

특히, 화합물 5 내지 8의 경우 IC₅₀ 값이 모두 5.0μM 이하로서 매우 뛰어난 DUSP1 저해 효능을 나타내었다.

실시예 3: 알로스테릭 저해 기작 확인

상기 화합물들이 알로스테릭 저해 기작을 갖는 것을 확인하기 위하여 라인웨버-버크 좌표(Lineweaver-Burke plot)를 이용하였다.

화합물 2를 최종 농도 5, 7 및 10 μM로 25nM DUSP1 용액에 5분간 상온에서 배양한 후, DIFMUP를 최종 농도 50, 25, 12.5, 6.3, 3.1 및 1.6μM로 첨가하여 반응을 시작하고 형광을 측정하였다. 형광은 빅터 분광형광계(PerkinElmer)를 사용하여 여기/방출 파장 358nm/460nm로 하여 측정하였다. 얻어진 값들을 아래의 방정식을 사용하여 도 1에 나타내었다.

도 1로부터, 서로 다른 기질의 농도와 반응을 하였을 때 얻어지는 직선들이 X-축상에서 교차하는 것을 확인하였다. 이로부터 화합물 2가 알로스테릭 기작을 갖는다는 것을 알 수 있으며, 화합물 2와 유사한 구조를 갖는 화합물 1 및 3 내지 8도 알로스테릭 기작을 갖는다는 것을 예상할 수 있다.

실시예 4: 신경세포 분화 측정

본 발명의 DUSP1 저해제가 신경세포의 분화를 촉진함으로써 우울증 치료에 효능이 있는지를 확인하기 위하여 신경돌기 증식 분석(neurite outgrowth assay)을 수행하였다.

신경돌기 증식 분석은 PC12 신경세포를 사용하여 진행하였으며, 문헌[Ishima et al. (2015) Potentiation of neurite outgrowth by brexpiprazole , a novel serotonin-dopamine activity modulator: A role for serotonin 5- HT1A and 5- HT2A receptors. Eur. Neuropsychopharm. 25, 505-511]에 기재된 프로토콜을 적절히 변경하여 사용하였다.

PC12 신경돌기 세포는 한국세포주은행(서울대학교)에서 분양받아 사용하였고, 7000세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 준비하였다. 세포 배양은 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media), 10% FBS 및 1% Anti-anti(Gibco)에서 수행하였다. 준비된 세포를 37℃에서 15시간 배양 후 화합물 1 내지 7을 최종 DMSO 농도 0.5%로, 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 최종 농도 2.5ng/ml로 배지 교환시에 첨가하였다.

72시간 후에 신경돌기 증식의 개수와 길이를 위상차 현미경(phase contrast microscope)로 관측하여 그 결과를 도 2(화합물 6) 및 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서는 화합물을 신경세포에 처리했을 때 신경돌기가 뻗어나오는 것이 대조군과 비교하여 확연히 구분되기 시작하는 농도와 이때의 신경돌기 개수 및 길이를 현미경으로 관찰하여 상중하로 평가한 결과를 나타내었다.

화합물	신경돌기 증식 농도(μM)	신경돌기 개수 및 길이
1	3.5	중
2	2.5	중상
3	3.5	중
4	3.5	중
5	3.5	중
6	0.6	상
7	0.6	상

도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군의 경우 세포 모양이 대부분 구형을 나타내어 큰 변화가 없다는 것을 알 수 있지만, 화합물 6을 첨가한 배지의 경우 신경돌기가 세포로부터 뻗어나온 형상을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 DUSP1 저해제는 신경세포의 분화를 촉진함으로써 우울증의 예방 및 치료에 작용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

또한, 표 3에서 확인 가능한 바와 같이, 화합물 1 내지 7 모두 신경돌기 증식을 유도하였으며, 화합물 6 및 7은 매우 낮은 농도(0.6μM)에서도 신경돌기의 길이와 개수가 "상"으로 평가되어 가장 효과적으로 신경돌기 증식을 유도한다는 것을 알 수 있다.

특히, 화합물 7의 경우 효소 반응에서 IC₅₀가 가장 낮아 다른 화합물보다 현저히 우수한 DUSP1 억제 효능을 나타내었는데(표 2 참조), 이는 효소 억제 활성도와 신경세포의 분화 효능이 관련성을 가지는 것을 의미하고, 따라서 본 발명의 DUSP1 저해제 화합물이 세포 내에서 DUSP1 효소를 표적으로 작용하고 있음을 알 수 있다.

실시예 5: 간암세포 성장 저해 분석

본 발명의 DUSP1 저해제 화합물의 간암세포 성장저해 효능을 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다.

인간 간암 세포주 Hep3B를 DMEM, 10% FBS, 1% Anti-anti(Gibco)에서 배양하여 7000세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 준비하고, 정상 간세포주 BNL-CL2 세포를 DMEM, 10% FBS, 1% Anti-anti(Gibco)에서 배양하여 3000세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 준비하였다.

37℃에서 15시간 배양 후, 화합물 6 내지 8을 배지의 화합물 최종 농도가 각각 2.5μM 및 5.0μM가 되도록 배지 교환시에 처리하였고, 화합물 처리 후 배지의 최종 DMSO 농도는 0.5%로 유지될 수 있도록 처리 조건을 조정하였다.

96시간 후 로슈 세포 증식 분석 I(MTT) 키트를 사용하여 세포성장율을 측정하였다. MTT 용액 10μL를 각각의 100μL 웰에 최종 농도 0.5mg/ml가 되도록 첨가한 후, 37℃에서 4시간 배양하고, 키트에서 제공되는 가용 버퍼(solubilization solution) 100μL를 첨가하였다. 이후 15시간 경과 후에 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

화합물	HEP3B 세포주		BNL-CL2 세포주
	화합물 농도 (5.0μM)	화합물 농도 (2.5μM)	화합물 농도 (5.0μM)	화합물 농도 (2.5μM)
6	14	18	8	111
7	27	40	125	156
8	16	15	54	139
Control	106	104	107	95

상기 표 4에서, 화합물 6 내지 8를 사용한 경우, 정상간세포 대조군(BNL-CL2 세포주)에 비하여 간암 세포(HEP3B 세포주)의 성장이 크게 억제되었다는 것을 확인할 수 있다. 이로부터, 본 발명의 DUSP1 저해제가 간암의 예방 또는 치료에 효과적이라는 것을 알 수 있다.

특히, 화합물 7의 경우는 화합물 농도가 5.0μM 일 때 정상간세포주에는 성장억제 효과가 보이지 않는데 간암세포는 성장억제가 확연한 것으로 나타나 화합물 7은 선택적인 간암치료제로서의 개발 가능성이 높다는 것을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 DUSP1 저해제를 유효성분으로 함유하는 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 화학식에서, R₁ 내지 R₁₀은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 카복실기, 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환될 수 있는 C₁-C₁₂ 알킬기, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬기, C₅-C₇ 사이클로알케닐기, C₁-C₆ 알킬아미노기, C₁-C₆ 알콕시기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아릴알킬기, 아릴알케닐기 또는 알킬아릴기이다.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 R₁ 내지 R₁₀이, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 니트로기 또는 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환될 수 있는 C₁-C₁₂ 알킬기인 것을 특징으로 하는, 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 R₁이 할로겐 또는 니트로기이고,
   상기 R₂ 및 R₃은 수소이며,
   상기 R₄는 할로겐이고,
   상기 R₅는 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환될 수 있는 C₁-C₁₂ 알킬기이며,
   상기 R₆ 내지 R₁₀은 수소, 할로겐 또는 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환될 수 있는 C₁-C₁₂ 알킬기인 것을 특징으로 하는, 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 하기 화합물 1 내지 8로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
   

   

   .
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 DUSP1 저해제가 알로스테릭 저해 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 우울증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제

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