KR101881587B1 - Method for manufacturing silk fibroin structures for 3D printing - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 광중합형 3D프린팅을 위한 광가교 작용기가 도입된 실크 피브로인 구조체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 실크피브로인에 이중결합 작용기를 도입하여 광가교가 가능한 실크피브로인 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a silk fibroin structure in which a photo-crosslinkable functional group for photopolymerization type 3D printing is introduced, and more particularly, to a method for producing a silk fibroin structure capable of photo-crosslinking by introducing a double bond functional group into silk fibroin .
대표적 천연단백질 중 하나인 실크 단백질(silk protein)은 누에에서 추출한 천연 고분자 물질로 중심부에 두 가닥으로 존재하는 실크 피브로인(silk fibroin) 성분과 그 주위를 감싸고 있는 세리신(sericin)으로 구성되어 있다. 이 중 친수성이며 점착성을 갖는 단백질인 세리신은 정련과정을 통해 제거되며, 의료용 소재로는 일반적으로 실크 피브로인 소재가 섬유소재 및 봉합사와 같은 소재로 많이 이용되어 왔다. 특히, 실크 피브로인은 우수한 생체적합성 및 세포적합성을 갖는 소재로 체내에서 염증반응을 거의 일으키지 않으며, 섬유아세포나 각질세포 등에 세포의 부착 및 증식이 뛰어난 특성을 갖는다(Tissue regeneration: A silk road, Journal of Funtional Biomaterials, 2016, 7, 22).One of the representative natural proteins, silk protein, is a natural polymeric substance extracted from silkworms. It is composed of silk fibroin and sericin which surrounds the silk fibroin in the center. Of these, sericin, a hydrophilic and adhesive protein, is removed through a refining process. In general, silk fibroin material has been widely used as a material such as a fiber material and a suture material for medical use. In particular, silk fibroin is a material with excellent biocompatibility and cell compatibility, and has little or no inflammatory response in the body, and has excellent properties of adhesion and proliferation of cells in fibroblasts and keratinocytes (Tissue regeneration: A silk road, Journal of Funtional Biomaterials, 2016, 7, 22).
실크 단백질은 천연생체적합성 소재 중 비교적 높은 기계적 강도를 가진다. 또한 결정성이 높아 보통 물에 녹지 않으므로, 별도의 용해공정을 통해 실크 피브로인 수용액이 제조된다. 이러한 실크 피브로인 수용액은 가공방법에 따라 필름, 스펀지, 하이드로젤 등의 형태로 성형될 수 있으며 이러한 다양한 형태의 실크 피브로인 기반 생체재료에 대한 연구가 활발하다(Silk fibroin as biomaterial for bone tissue engineering, Acta Biomaterialia, 2016, 31). 그 중 실크 하이드로젤은 다량의 수분을 함유하여 세포가 성장하기 적합한 환경의 3차원 지지체로 실제 기질을 모방하기 좋은 구조적 장점을 갖는다. 하지만 일반적으로 실크 하이드로젤을 제작하기 위해서는 수용액상의 실크 단백질 2차구조를 변화시켜 물리적 가교결합을 유도해야 한다. Silk proteins have relatively high mechanical strength among natural biocompatible materials. In addition, since it has high crystallinity and is usually insoluble in water, an aqueous solution of silk fibroin is produced through a separate dissolution step. Such a silk fibroin aqueous solution can be formed into a film, a sponge, a hydrogel, or the like depending on a processing method, and studies on various types of silk fibroin-based biomaterials are actively performed (Acta Biomaterialia , 2016, 31). Among them, silk hydrogels contain a large amount of water and have a structural advantage of mimicking the actual substrate with a three-dimensional support of an environment suitable for cell growth. However, in order to produce silk hydrogels in general, it is necessary to change the secondary structure of the silk protein in the aqueous solution to induce physical crosslinking.
본 발명에서는 실크피브로인 구조체에 광가교를 일으킬 수 있는 작용기를 도입함으로써 물리적 화학결합이 아닌 화학적 가교결합을 할 수 있는 실크 피브로인 구조체를 제조하고 이를 광중합형 3D 프린팅시스템에 적용하고자 한다.In the present invention, a silk fibroin structure capable of chemical crosslinking rather than physical chemical bonding by introducing a functional group capable of causing photocrosslinking to the silk fibroin structure is prepared and applied to a light-curing 3D printing system.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 광중합형 3D 프린팅 시스템에 최적화된 실크 피브로인 기반 하이드로젤을 제조하기 위하여 예의 연구노력하였다. 본 발명자들은 실크피브로인과 메타아크릴레이트 작용기를 포함하는 화합물을 반응시켜 이중결합이 도입된 실크피브로인을 제조하였고, 이러한 이중결합이 도입된 실크피브로인 구조체와 광개시제를 반응시키는 경우, 실크피브로인 자체적으로 광가교되어 우수한 강도를 가지는 하이드로젤이 형성됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to produce silk fibroin-based hydrogels optimized for light-curing 3D printing systems. The present inventors have produced a silk fibroin having a double bond by reacting silk fibroin with a compound containing a methacrylate functional group. When a silane fibroin structure having such a double bond is reacted with a photoinitiator, Thereby forming a hydrogel having excellent strength, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 광가교성 실크 피브로인 구조체의 제조방법을 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a photocrosslinkable silk fibroin structure.
본 발명의 다른 목적은 광가교성 실크 피브로인 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a photocurable silk fibroin composition.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 광중합형 3D프린팅용 실크 피브로인 조성물을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a silk fibroin composition for photopolymerization type 3D printing produced by the process of the present invention.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
[광중합형 3D 프린팅을 이용한 실크 피브로인 구조체의 제조][Production of silk fibroin structure using light-curing 3D printing]
본 발명의 일 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 광가교성 실크 피브로인 구조체의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a light-crosslinkable silk fibroin structure comprising the steps of:
(a) (i) 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물; 및 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합 및 교반하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계; 및 (a) (i) a methacrylate compound comprising a double bond functional group for photocrosslinking; And (ii) mixing and stirring silk fibroin to introduce a double bond functional group into the silk fibroin; And
(b) 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가한 후, 자외선 또는 가시광선을 조사하여 광가교성 실크 피브로인 구조체를 형성하는 단계.(b) forming a photo-crosslinkable silk fibroin structure by adding a photoinitiator to the silk fibroin to which the double bond is introduced, and then irradiating ultraviolet light or visible light.
본 발명자들은 광중합형 3D 프린팅 시스템에 최적화된 실크 피브로인 기반 하이드로젤을 제조하기 위하여 예의 연구노력하였다. 본 발명자들은 실크피브로인과 메타아크릴에이트 작용기를 포함하는 화합물을 반응시켜 이중결합이 도입된 실크피브로인을 제조하였고, 이러한 이중결합이 도입된 실크피브로인 구조체와 광개시제를 반응시키는 경우, 실크피브로인 자체적으로 광가교되어 우수한 강도를 가지는 하이드로젤이 형성됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to produce silk fibroin-based hydrogels optimized for light-curing 3D printing systems. The present inventors have produced a silk fibroin having a double bond introduced thereinto by reacting silk fibroin with a compound containing a methacrylate functional group. When a silane fibroin structure having such a double bond is reacted with a photoinitiator, Thereby forming a hydrogel having excellent strength, thereby completing the present invention.
실크피브로인은 오래전부터 사용된 대표적 섬유 소재로, 기계적강도 및 생체적합성이 우수해 최근 의료용 바이오소재로 각광받고 있다. 또한 최근 3D 바이오프린팅 기술이 주목받으며 실크피브로인을 활용한 3D 프린팅용 바이오 잉크에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 광중합형 3D프린팅용 바이오 잉크로 사용되는 실크피브로인은 재료자체적으로 광중합을 일으키지 못하므로 광중합이 가능한 다른재료와 혼합하여 많이 사용된다. 하지만 이렇게 제조된 하이드로젤은 실크를 하이드로젤 내부에 함유한 상태일 뿐, 실크가 자체적으로 가교되어 젤을 형성하지는 못한다. 이로 인해, 젤의 강도가 약해지고 젤의 분해가 빠르게 일어나며 세포배양시 배양액에 실크피브로인이 용해되어 빠져나가는 문제가 발생한다. 즉, 실크피브로인 자체가 광중합하여 하이드로젤이 될 수 있도록 실크피브로인의 구조를 개선하는 연구가 필요하다.Silk fibroin is a representative textile material used for a long time, and has excellent mechanical strength and biocompatibility. Recently, 3D bio-printing technology has attracted attention, and bio-ink for 3D printing using silk fibroin has been actively studied. Among them, silk fibroin, which is used as a bio ink for light-curing 3D printing, is often used by mixing with other materials capable of photopolymerization since the material itself does not cause photopolymerization. However, the hydrogel thus prepared contains silk in the hydrogel, and the silk itself can not crosslink itself to form a gel. As a result, the strength of the gel is weakened, the gel is rapidly decomposed, and silk fibroin dissolves in the culture medium when the cell culture is performed. In other words, research is needed to improve the structure of silk fibroin so that silk fibroin itself can be photopolymerized to become a hydrogel.
상기 기술한 종래의 문제점을 해결하고자 연구한 결과, 본 발명에서는 실크피브로인과 이중결합을 갖는 작용기를 반응시켜 실크피브로인에 이중결합이 도입된 구조체를 제조하였다. 이로써 실크피브로인 자체가 광중합하여 하이드로젤을 형성할 수 있으므로 세포배양과정에서 용해될 우려가 없고 더 우수한 젤 강도를 가질 것으로 기대된다.As a result of the study to solve the above-described conventional problems, the present invention produced a structure in which a silane fibroin and a functional group having a double bond were reacted to introduce a double bond into silk fibroin. As a result, silk fibroin itself can be photopolymerized to form a hydrogel, so that it is expected not to be dissolved in the cell culture process and to have a higher gel strength.
이하, 본 발명의 광가교성 실크 피브로인 구조체의 제조방법에 대하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, a method for producing the photocrosslinkable silk fibroin structure of the present invention will be described in detail.
단계 (a): 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계Step (a): introducing a double bond functional group into the silk fibroin
우선, (i) 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트(methacrylate) 화합물; 및 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합 및 교반하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입한다.First, (i) a methacrylate compound containing a double bond functional group for photocrosslinking; And (ii) silk fibroin are mixed and stirred to introduce a double bond functional group into the silk fibroin.
본 명세서에서 용어 “이중결합 작용기”는 이중결합을 포함하는 기능기(functional group)으로서, 임의의 원자간의 이중결합을 의미한다.As used herein, the term " double bond functional group " means a functional group containing a double bond and means a double bond between any atoms.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 메타크릴레이트 화합물은 다음 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the methacrylate compound may be a compound represented by the following formula (1) or (2).
화학식 1
화학식 2(2)
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 교반은 25℃-45℃ 에서 5-7시간동안 실시할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the stirring of step (a) may be carried out at 25 ° C-45 ° C for 5-7 hours.
한편, 단계 (a)의 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)은 디메틸설폭사이드(dimethlyl sulfoxide, DMSO)에 용해될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 실크 피브로인을 DMSO에 완전히 용해시킨 후, 메타크릴레이트 화합물과 혼합한다. Meanwhile, (ii) silk fibroin in step (a) can be dissolved in dimethlyl sulfoxide (DMSO). According to one embodiment of the invention, the silk fibroin is completely dissolved in DMSO and then mixed with the methacrylate compound.
본 발명에서 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인은 우레탄결합, 우레아결합 및 아마이드결합 중 1 이상의 결합을 포함한다(도 7a 참조).In the present invention, the double bond-introduced silk fibroin includes at least one of a urethane bond, a urea bond and an amide bond (see FIG. 7A).
단계 (b): 광가교성 실크 피브로인 구조체를 형성하는 단계Step (b): Step of forming a photocrosslinkable silk fibroin structure
이어, 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가한 후, 자외선 또는 가시광선을 조사하여 광가교성 실크 피브로인 구조체를 제조한다.Then, a photoinitiator is added to the double bond-introduced silk fibroin, and then ultraviolet rays or visible light are irradiated to produce a photocrosslinkable silk fibroin structure.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광개시제는 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물일 수 있다. 화학식 3은 에오신 Y (Eosin Y)이며, 화합물명은 2′,4′,5′,7′-테트라브로모플루오레세인이다.According to one embodiment of the present invention, the photoinitiator may be a compound represented by the following formula (3) or (4). Formula 3 is Eosin Y, and the compound is 2 ', 4', 5 ', 7'-tetrabromofluorescein.
화학식 4는 이르가큐어 (Irgacure) 2959이며, 화합물명은 2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시) 페닐]-2-메틸-1-프로파논이다.Formula 4 is Irgacure 2959 and the compound is 2-hydroxy-1- [4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] -2-methyl-1-propanone.
화학식 3(3)
화학식 4Formula 4
본 발명에 따르면, 상기 단계 (b)는 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인을 5% 내지 30%로 포함하는 수용액에, UV 광개시제(photoinitiator)를 PBS 중량에 대하여 0.1~5 중량% 로 첨가하여 실시할 수 있다. 실크 피브로인 수용액은 PBS또는 증류수에 실크 피브로인을 첨가하여 제조할 수 있다.According to the present invention, the step (b) is carried out by adding a UV photoinitiator to an aqueous solution containing 5% to 30% of the silk fibroin having the double bond introduced therein in an amount of 0.1 to 5% by weight based on the weight of PBS can do. The aqueous solution of silk fibroin can be prepared by adding silk fibroin to PBS or distilled water.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 이중결합이 도입된 실크 피브로인을 PBS에 5% 내지 30%로 녹인 후 광개시제를 첨가한다. UV 광개시제는 실크피브로인, PBS 및 광개시제를 포함하는 전체 조성물에 대하여 0.1~5 중량% 로 첨가될 수 있다. 가시광영역 광개시제는 실크피브로인, PBS 및 광개시제를 포함하는 전체 조성물에 대하여 0.01 mM 내지 0.03 mM의 농도로 포함될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the silk fibroin with double bonds is dissolved in PBS at 5% to 30%, and the photoinitiator is added. The UV photoinitiator may be added in an amount of 0.1 to 5% by weight based on the total composition including silk fibroin, PBS and photoinitiator. The visible light region photoinitiator may be included at a concentration of 0.01 mM to 0.03 mM relative to the total composition comprising silk fibroin, PBS and photoinitiator.
UV 광개시제는 λ=200 내지 500 nm 의 파장 범위에서 광에 의해 실질적으로 여기된다. 가시광선 광개시제는 λ=500 내지 700 nm 의 파장 범위에서 광에 의해 실질적으로 여기된다.The UV photoinitiator is substantially excited by light in the wavelength range of? = 200 to 500 nm. The visible light photoinitiator is substantially excited by light in the wavelength range of? = 500 to 700 nm.
적절한 UV 광개시제는 문헌(CRIVELLO, J.V., et al. VOLUME III: Photoinitiators for Free Radical Cationic &Anionic Photopolymerisation. 2nd edition Edited by BRADLEY, G.. London,UK: John Wiley and Sons Ltd, 1998. p. 287-294)에 개시되어 있다.Suitable UV photoinitiators are described in detail in CRIVELLO, JV, et al. VOLUME III: Photoinitiators for Free Radical Cationic & Anionic Photopolymerisation. 2nd edition Edited by BRADLEY, G. London, UK: John Wiley and Sons Ltd, 1998. p 287-294 ).
광개시제의 구체적인 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기 화합물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다: 벤조페논 및 치환된 벤조페논류, 1- 히드록시시클로헥실 페닐 케톤, 이소프로필티오크산톤과 같은 티오크산톤류, 2-히드록시-2-메틸-1-페닐프로판-1-온, 2-벤질-2-디메틸아미노-(4-모르폴리노페닐)부탄-1-온, 벤질 디메틸케탈, 비스(2,6-디메틸벤조일)-2,4,4-트리메틸펜틸포스핀 옥사이드, 2,4,6-트리메틸벤조일디페닐포스핀 옥사이드, 2-메틸-1-[4-(메틸티오) 페닐]-2-모르폴리노프로판-1-온, 2,2-디메톡시-1,2-디페닐에탄-1-온 또는 5,7-디아이오도-3-부톡시-6-플루오론.Specific examples of photoinitiators may include, but are not limited to, the following compounds or combinations thereof: benzophenone and substituted benzophenones, 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone, thioxanes such as isopropyl thioxanthone, (4-morpholinophenyl) butan-1-one, benzyldimethylketal, bis (2-hydroxy-2-methylpropyl) Dimethylbenzoyl) -2,4,4-trimethylpentylphosphine oxide, 2,4,6-trimethylbenzoyldiphenylphosphine oxide, 2-methyl-1- [4- (methylthio) 2-morpholinopropane-1-one, 2,2-dimethoxy-1,2-diphenylethane-1-one or 5,7-diiodo-3-butoxy-6-fluororone.
적절한 상업적 UV 광개시제는 CIBA SPECIALTY CHEMICALS사로부터 입수 가능한 Irgacure TM 184, Irgacure TM 500, Irgacure TM 907, Irgacure TM 369, Irgacure TM 1700, Irgacure TM 651, Irgacure TM 819, Irgacure TM 1000, Irgacure TM 1300, Irgacure TM 1870, Irgacure TM 2959, Darocur TM 1173, Darocur TM 2959, Darocur TM 4265 및 Darocur TM ITX, BASF AG사로부터 입수 가능한 Lucerin TM TPO, LAMBERTI사로부터 입수 가능한 Esacure TM KT046, Esacure TM KIP150, Esacure TM KT37 및 Esacure TM EDB, SPECTRA GROUP Ltd.사로부터 입수 가능한 H-Nu TM 470 및 H-Nu TM 470X를 포함한다.Suitable commercial UV photoinitiators include, but are not limited to, Irgacure TM 184, Irgacure TM 500, Irgacure TM 907, Irgacure TM 369, Irgacure TM 1700, Irgacure TM 651, Irgacure TM 819, Irgacure TM 1000, Irgacure TM 1300, Escherure TM KT046, EsacureTM KT150, EsacureTM KT37, and EsacureTM KT37, available from LAMBERTI, Darocur TM ITX, available from LAMBERTI, and Darocur TM ITX, Darocur TM 2959, Darocur TM 2959, TM EDB, H-Nu ™ 470 and H-Nu ™ 470X available from SPECTRA GROUP Ltd.
한편, 가시광 영역의 광개시제는 가시광선에 의하여 활성화되어 상기 이중결합이 도입된 실크피브로인을 광중합시킨다. 즉, 이중결합이 도입된 실크피브로인을 “단량체”로 하여 광중합반응이 일어난다. 본 발명에서 이용될 수 있는 가시광선은 예컨대, He-Ne(633nm), Ar(515nm, 488nm), YAG (532nm), He-Cd (442nm) 등의 파장 400-650nm의 레이저광일 수 있다.On the other hand, the photoinitiator in the visible light region is activated by visible light to cause the double bond-introduced silk fibroin to be photopolymerized. That is, a photopolymerization reaction takes place with silk fibroin having a double bond introduced therein as a " monomer ". The visible light that can be used in the present invention may be laser light having a wavelength of 400-650 nm such as He-Ne (633 nm), Ar (515 nm, 488 nm), YAG (532 nm), He-Cd (442 nm)
본 발명에서 유용하게 사용될 수 있는 가시광개시제는 본 기술분야에서 공지된 것들 중에서 선택될 수 있으며, 더욱 상세하게는 공지의 전자 공여성 광개시제로부터 선택될 수 있다. 구체적으로는, N-페닐글리신, N,N-디알킬아닐린 화합물, 3급 아민 화합물, 유기보레이트염(organoborate salts) 등을 들 수 있다. N,N-디알킬아닐린 화합물로의 구체적인 예로서는 4-시아노-N,N-디메틸아닐린, 4-브로모-N,N-디메틸아닐린, 4-아세틸-N,N-디메틸아닐린, 4-메틸-N,N-디메틸아닐린, 4-아미노-N,N-디메틸아닐린, 4-에톡시-N,N-디메틸아닐린, 3-히드록시-N,N-디메틸아닐린, N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-디아닐린, 2,6-디에틸-N,N-디메틸아닐린, p-t--부틸-N,N-디메틸아닐린 등을 들 수 있다. 3급 아민 화합물의 구체적인 예로서는 트리에틸아민, 디메틸에탄올아민(DMEA), 트리에탄올아민(TEA), 트리이소프로판올아민 등을 들 수 있다. Visible photoinitiators that can be usefully employed in the present invention can be selected from those known in the art, and more particularly, can be selected from known electron donative photoinitiators. Specific examples thereof include N-phenylglycine, N, N-dialkyl aniline compounds, tertiary amine compounds, and organoborate salts. Specific examples of the N, N-dialkylaniline compound include 4-cyano-N, N-dimethylaniline, 4-bromo-N, N-dimethylaniline, N, N ', N'-tetramethyl aniline, N, N-dimethylaniline, N, N-dimethylaniline, N'-tetramethyl-1,4-dianiline, 2,6-diethyl-N, N-dimethylaniline and pt-butyl-N, N-dimethylaniline. Specific examples of the tertiary amine compound include triethylamine, dimethylethanolamine (DMEA), triethanolamine (TEA), triisopropanolamine, and the like.
본 발명에서 UV 또는 가시광 광개시제는 각각 단독 또는 2 이상의 조합으로 사용될 수 있다. In the present invention, the UV or visible light photoinitiators may be used alone or in combination of two or more.
한편, 광가교 반응시에는 UV 영역 또는 가시광선 영역의 광에 의해 활성화될 수 있는 촉매를 추가적으로 포함할 수 있다.On the other hand, a catalyst capable of being activated by light in the UV region or visible light region during the photo-crosslinking reaction may be additionally included.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 3D 프린팅 방법으로 광가교성 실크 피브로인 구조체를 형성할 수 있다. 본 발명의 실크 피브로인 구조체 제조방법은 3D 프린팅 방법에 최적화하여 고안되었다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 이중결합이 도입된 실크피브로인에 광개시제를 첨가한 용액을 SLA 또는 DLP방식의 3D프린팅용 바이오 잉크로 사용하여 광가교된 3차원의 구조체를 제조할 수 있다 (도 8 참조).According to an embodiment of the present invention, the step (b) may form a photocrosslinkable silk fibroin structure by a 3D printing method. The method of manufacturing the silk fibroin structure of the present invention is designed to be optimized for the 3D printing method. According to a specific embodiment of the present invention, a photo-crosslinked three-dimensional structure can be prepared by using a solution in which a photoinitiator is added to silk fibroin having a double bond of the present invention as a bioinjection for SLA or DLP type 3D printing (See Fig. 8).
본 발명의 조성물은 SLA 방식의 3D 프린터용 액체 잉크 또는 DLP 방식의 3D 프린터용 광경화성 바이오잉크 소재로서 사용될 수 있다. The composition of the present invention can be used as a liquid ink for SLA type 3D printer or as a photo-curable bio ink material for 3D printer of DLP type.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 광가교성 실크 피브로인 조성물의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of making a photocurable silk fibroin composition comprising the steps of:
(a) (i) 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물; 및 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계; 및 (a) (i) a methacrylate compound comprising a double bond functional group for photocrosslinking; And (ii) silk fibroin to introduce a double bond functional group into the silk fibroin; And
(b) 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가하여 광가교성 실크 피브로인 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 광가교성 실크 피브로인 조성물에 자외선 또는 가시광선을 조사시 상기 실크 피브로인이 광가교된다.(b) adding a photoinitiator to the silk fibroin to which the double bond is introduced to prepare a photo-crosslinkable silk fibroin composition, wherein when the photo-crosslinkable silk fibroin composition is irradiated with ultraviolet light or visible light, the silk fibroin is photo- do.
본 발명의 광가교성 실크 피브로인 조성물의 제조방법은 상술한 본 발명의 실크 피브로인 구조체 제조방법을 이용하므로, 공통된 사항은 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Since the method of manufacturing the photocurable silk fibroin composition of the present invention uses the above-described method of manufacturing the silk fibroin structure of the present invention, the description thereof is omitted in order to avoid excessive redundancy of the present specification.
본 발명의 실크 피브로인 조성물은 3D 프린팅 방법에 최적화하여 적용되도록 고안되었으며, 본 발명의 제조방법에 의한 광가교성 실크 피브로인 조성물에 자외선 또는 가시광선을 조사하여 실크 피브로인이 광가교되도록 함으로써 우수한 강도를 가지는 하이드로젤 3차원 구조체를 형성할 수 있다.The silk fibroin composition of the present invention is designed to be optimally applied to the 3D printing method. The silk fibroin composition of the present invention is irradiated with ultraviolet light or visible light to the photo-crosslinkable silk fibroin composition according to the production method of the present invention, Gel three-dimensional structure can be formed.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 메타크릴레이트 화합물은 다음 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the methacrylate compound may be a compound represented by the following formula (1) or (2).
화학식 1
화학식 2(2)
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 교반은 25℃-45℃ 에서 5-7시간동안 실시할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the stirring of step (a) may be carried out at 25 ° C-45 ° C for 5-7 hours.
한편, 단계 (a)의 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)은 디메틸설폭사이드(dimethlyl sulfoxide, DMSO)에 용해될 수 있다.Meanwhile, (ii) silk fibroin in step (a) can be dissolved in dimethlyl sulfoxide (DMSO).
본 발명에서 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인은 우레탄결합, 우레아결합 및 아마이드결합 중 1이상의 결합을 포함한다(도 7a 참조).In the present invention, the double bond-introduced silk fibroin includes at least one of a urethane bond, a urea bond and an amide bond (see FIG. 7A).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광개시제는 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물일 수 있다. 광개시제에 대한 설명은 상술한 바와 같다.According to one embodiment of the present invention, the photoinitiator may be a compound represented by the following formula (3) or (4). The description of the photoinitiator is as described above.
화학식 3(3)
화학식 4Formula 4
본 발명에 따르면, 상기 단계 (b)는 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인을 5% 내지 30%로 포함하는 수용액에 UV 광개시제(photoinitiator)를 PBS 중량에 대하여 0.1~5 중량% 로 첨가하여 실시할 수 있다. 실크 피브로인 수용액은 PBS또는 증류수에 실크 피브로인을 첨가하여 제조할 수 있다. 가시광영역 광개시제는 실크피브로인, PBS 및 광개시제를 포함하는 전체 조성물에 대하여 0.01 mM 내지 0.03 mM의 농도로 포함될 수 있다.According to the present invention, the step (b) is carried out by adding a UV photoinitiator in an amount of 0.1 to 5% by weight to the weight of PBS, in an aqueous solution containing the double bond-introduced silk fibroin at 5% to 30% . The aqueous solution of silk fibroin can be prepared by adding silk fibroin to PBS or distilled water. The visible light region photoinitiator may be included at a concentration of 0.01 mM to 0.03 mM relative to the total composition comprising silk fibroin, PBS and photoinitiator.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된, (i) 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물; (ii) 실크 피브로인(silk fibroin); 및 (iii) 광개시제(photoinitiator)를 포함하는 광중합형 3D프린팅용 실크 피브로인 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a photocrosslinking layer comprising: (i) a methacrylate compound comprising a double bond functional group for photocrosslinking; (ii) silk fibroin; And (iii) a photoinitiator. The present invention also provides a silk fibroin composition for photopolymerization type 3D printing.
본 발명의 광중합형 3D프린팅용 실크 피브로인 조성물은 상술한 본 발명의 광가교성 실크 피브로인 조성물의 제조방법에 의한 조성물로서, 공통된 사항은 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.The silk fibroin composition for photopolymerization type 3D printing of the present invention is a composition of the above-mentioned photocurable silk fibroin composition of the present invention, and the description thereof is omitted in order to avoid excessive redundancy of the present specification.
한편, 상기 광가교성 실크 피브로인 구조체의 제조방법; 및 광가교성 실크 피브로인 조성물의 제조방법은 하기 “하이드로젤용 실크 피브로인 조성물의 제조방법”에 의해 제조된 실크 피브로인을 이용하여 실시할 수 있다.On the other hand, a method of manufacturing the light-crosslinkable silk fibroin structure; And the method for producing the photocurable silk fibroin composition can be carried out using the silk fibroin prepared by the following " Process for producing silk fibroin composition for hydrogel ".
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 광가교성 실크 피브로인 구조체의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of making a photocrosslinkable silk fibroin structure comprising the steps of:
(a) (i) 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물; 및 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합 및 교반하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계; 및 (a) (i) a methacrylate compound comprising a double bond functional group for photocrosslinking; And (ii) mixing and stirring silk fibroin to introduce a double bond functional group into the silk fibroin; And
(b) 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가한 후, 자외선 또는 가시광선을 조사하여 광가교성 실크 피브로인 구조체를 형성하는 단계; 를 포함하며, (b) adding a photoinitiator to the silk fibroin to which the double bond is introduced, and then irradiating ultraviolet light or visible light to form a photo-crosslinkable silk fibroin structure; / RTI >
상기 단계 (a)의 실크 피브로인(silk fibroin)은 다음 단계를 포함하는 하이드로젤용 실크 피브로인 조성물의 제조방법에 의해 제조된다:The silk fibroin of step (a) is prepared by a process for preparing a silk fibroin composition for a hydrogel comprising the steps of:
(c) 실크 피브로인(silk fibroin)을 금속염 수용액에 용해시키는 단계;(c) dissolving silk fibroin in an aqueous metal salt solution;
(d) 상기 단계 (c)의 용해물에 염기성 수용액을 첨가하여 실크 피브로인을 가수분해하는 단계; 및(d) hydrolyzing silk fibroin by adding a basic aqueous solution to the melt of step (c); And
(e) 상기 단계 (d)의 가수분해물을 전기투석하여 염을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 수득하는 단계.(e) electrodialysis of the hydrolyzate of step (d) to remove salts to obtain a silk fibroin aqueous solution.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 광가교성 실크 피브로인 조성물의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing a photocurable silk fibroin composition comprising the steps of:
(a) (i) 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물; 및 (ii) 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계; 및 (a) (i) a methacrylate compound comprising a double bond functional group for photocrosslinking; And (ii) silk fibroin to introduce a double bond functional group into the silk fibroin; And
(b) 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가하여 광가교성 실크 피브로인 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 광가교성 실크 피브로인 조성물에 자외선 또는 가시광선을 조사시 상기 실크 피브로인이 광가교되며;(b) adding a photoinitiator to the silk fibroin to which the double bond is introduced to prepare a photo-crosslinkable silk fibroin composition, wherein when the photo-crosslinkable silk fibroin composition is irradiated with ultraviolet light or visible light, the silk fibroin is photo- ;
상기 단계 (a)의 실크 피브로인(silk fibroin)은 다음 단계를 포함하는 하이드로젤용 실크 피브로인 조성물의 제조방법에 의해 제조된다:The silk fibroin of step (a) is prepared by a process for preparing a silk fibroin composition for a hydrogel comprising the steps of:
(c) 실크 피브로인(silk fibroin)을 금속염 수용액에 용해시키는 단계;(c) dissolving silk fibroin in an aqueous metal salt solution;
(d) 상기 단계 (c)의 용해물에 염기성 수용액을 첨가하여 실크 피브로인을 가수분해하는 단계; 및(d) hydrolyzing silk fibroin by adding a basic aqueous solution to the melt of step (c); And
(e) 상기 단계 (d)의 가수분해물을 전기투석하여 염을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 수득하는 단계.(e) electrodialysis of the hydrolyzate of step (d) to remove salts to obtain a silk fibroin aqueous solution.
[실크 피브로인 조성물의 제조][Preparation of silk fibroin composition]
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 하이드로젤용 실크 피브로인 조성물의 제조방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing a silk fibroin composition for hydrogel comprising the steps of:
(a) 실크 피브로인(silk fibroin)을 금속염 수용액에 용해시키는 단계;(a) dissolving silk fibroin in an aqueous metal salt solution;
(b) 상기 단계 (a)의 용해물에 염기성 수용액을 첨가하여 실크 피브로인을 가수분해하는 단계; 및(b) hydrolyzing silk fibroin by adding a basic aqueous solution to the melt of step (a); And
(c) 상기 단계 (b)의 가수분해물을 전기투석하여 염을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 수득하는 단계.(c) electrodialysis of the hydrolyzate of step (b) to remove salts to obtain a silk fibroin aqueous solution.
본 발명자들은 조직공학용 하이드로젤 제조를 위한 수용성 실크 피브로인을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 부잠사(silk waste) 용해시 사용되는 용해액의 종류와 농도를 조절하고, 용해된 부잠사를 염기 가수분해 함으로써 하이드로젤 투명도 및 점도 조절이 용이한 수용성 실크 피브로인(silk fibroin)을 개발하게 되었다. 본 발명의 수용성 실크 피브로인의 제조방법에서는 용해액의 종류와 농도를 조절하여 실크의 용해효율을 향상시킬 수 있으며, 실크를 가수분해하여 수용성을 부여함으로써 하이드로젤 투명도를 조절할 수 있다. The present inventors sought to develop water-soluble silk fibroin for the hydrogel production of tissue engineering. As a result, the present inventors have found that, by controlling the type and concentration of the dissolution liquid used for dissolving silk waste and hydrolyzing the dissolved subtilis, the hydrogels can be used as a water soluble silk fibroin ). In the method for producing water-soluble silk fibroin of the present invention, the dissolution efficiency of silk can be improved by controlling the type and concentration of the dissolving solution, and the transparency of the hydrogel can be controlled by hydrolyzing silk and imparting water solubility.
본 발명의 방법에서는 ①고온의 물을 이용하여 부잠사를 정련하고 ②정련된 부잠사를 금속염으로 용해하며, 이때 용해액의 종류와 농도를 조절함으로써 실크의 용해효율을 향상할 수 있으며, ③용해 후 염기로 가수분해함으로써 수용성을 가져 투명도가 조절된다.In the method of the present invention, (1) refinement of subalpine using high-temperature water and (2) dissolution of refined subalpine as metal salt, the dissolution efficiency of silk can be improved by controlling the type and concentration of the solution, Hydrolysis with post-base gives water solubility and transparency is controlled.
이하, 본 발명의 제조방법에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the production method of the present invention will be described in detail.
단계 (a): 실크 피브로인 용해공정Step (a): Silk fibroin dissolution step
우선, 실크 피브로인(silk fibroin)을 금속염 수용액에 넣어 용해시킨다. First, silk fibroin is dissolved in an aqueous metal salt solution.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 금속염은 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염이다. 예컨대, 상기 금속염은 탄산칼슘, 또는 수산화칼슘이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 금속염으로서 탄산칼슘을 이용하였을 때, 실크 피브로인이 가장 잘 용해되었으며, 가수분해 처리시에도 짧은 시간이내에 수용성 실크 조성물이 형성되었다(하기 실시예의 표 2 참조).According to one embodiment of the present invention, the metal salt of step (a) is an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt. For example, the metal salt is calcium carbonate or calcium hydroxide. According to a specific embodiment of the present invention, when calcium carbonate is used as the metal salt, silk fibroin is most soluble, and a water-soluble silk composition is formed within a short time even during the hydrolysis treatment (see Table 2 in the following examples).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 30-70 wt% 금속염 수용액을 사용하여 5분-30분동안 실크 피브로인을 용해하는 공정으로 수행될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 40-60 wt% 금속염 수용액을 사용하여 5분-30분동안 실크 피브로인을 용해하는 공정으로 수행될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the step (a) may be performed by dissolving silk fibroin for 5 minutes to 30 minutes using a 30-70 wt% aqueous metal salt solution. According to another embodiment of the present invention, a process of dissolving silk fibroin for 5 minutes to 30 minutes using a 40-60 wt% aqueous metal salt solution can be performed.
한편, 상기 (a) 단계 이전에 누에고치와 증류수를 100-150℃의 온도에서 15분-90분 동안 가열한 후 세리신(sericin)을 제거하여 실크 피브로인을 수득하는 정련단계를 추가적으로 실시할 수 있다. 상기 정련단계는 누에고치 또는 부잠사에서 세리신을 제거하고 실크 피브로인을 분리하기 위한 공정이다. Meanwhile, a refining step may be further performed by heating silkworm cocoons and distilled water at a temperature of 100 to 150 ° C for 15 to 90 minutes before the step (a), and then removing sericin to obtain silk fibroin . The refining step is a step for removing sericin and separating silk fibroin from the cocoon or sub silence.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고압멸균기에 누에고치 또는 부잠사, 및 물(증류수)를 투입하고, 100-150℃의 온도에서 15분-90분 동안 가열하여 세리신을 제거한다. 이후 누에고치 또는 부잠사를 차가운 물에 수차례 세척하여 남은 세리신을 완전히 제거한다. 이후 40-60 ℃ 오븐에서 하루동안 건조하여 실크 피브로인을 수득한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 정련단계는 100-140℃ 또는 100-130℃ 의 온도에서 가열하여 실시할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 정련단계는 20분-80분 또는 30분-70분 동안 가열하여 실시할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, silkworm is removed by putting silkworm or sub-silk and water (distilled water) into a high-pressure sterilizer and heating at a temperature of 100 to 150 ° C for 15 to 90 minutes. Thereafter, the cocoon or the mulberry is washed several times in cold water to completely remove the remaining sericin. And then dried in an oven at 40-60 DEG C for one day to obtain silk fibroin. According to another embodiment of the present invention, the refining step may be performed by heating at a temperature of 100-140 ° C or 100-130 ° C. According to another embodiment of the present invention, the refining step may be performed by heating for 20 minutes to 80 minutes or 30 minutes to 70 minutes.
단계 (b): 실크 피브로인 가수분해공정Step (b): Silk fibroin hydrolysis step
이어, 상기 단계 (a)의 용해물에 염기성 수용액을 첨가하여 실크 피브로인을 가수분해한다.Next, a basic aqueous solution is added to the melt of step (a) to hydrolyze the silk fibroin.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 염기성 수용액은 수산화칼륨 또는 탄산수소암모늄이다. According to one embodiment of the present invention, the basic aqueous solution of step (b) is potassium hydroxide or ammonium hydrogencarbonate.
본 발명에 따르면, 상기 가수분해공정은 0분 이상 100분 이하의 시간 범위로 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 실크 피브로인의 가수분해 처리는 5분 내지 100분 동안 실시할 수 있다. 또는 상기 가수분해 처리는 10분 내지 100분 동안 실시할 수 있다. 또는 상기 가수분해 처리는 20분 내지 100분 동안 실시할 수 있다.According to the present invention, the hydrolysis step can be carried out within a time range of from 0 minutes to 100 minutes. According to one embodiment of the present invention, the hydrolysis treatment of the silk fibroin can be carried out for 5 minutes to 100 minutes. Alternatively, the hydrolysis treatment may be carried out for 10 minutes to 100 minutes. Alternatively, the hydrolysis treatment may be carried out for 20 minutes to 100 minutes.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 가수분해 처리는 5분 내지 80분, 5분 내지 60분, 5분 내지 40분, 5분 내지 20분; 10분 내지 80분, 10분 내지 60분, 10분 내지 40분, 10분 내지 20분; 20분 내지 80분, 20분 내지 60분, 또는 20분 내지 40분 동안 실시할 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the hydrolysis treatment is performed for 5 to 80 minutes, 5 to 60 minutes, 5 to 40 minutes, 5 to 20 minutes; 10 minutes to 80 minutes, 10 minutes to 60 minutes, 10 minutes to 40 minutes, 10 minutes to 20 minutes; 20 minutes to 80 minutes, 20 minutes to 60 minutes, or 20 minutes to 40 minutes.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 가수분해 처리시간이 60분 이상인 경우 투과도에 큰 변화가 없어 60분 이후부터는 가수분해가 더 이상 진행되지 않는 것으로 판단하였으며, 실크 피브로인의 가수분해 처리시간이 20분 내지 60분 인 경우 하이드로젤이 우수한 물성을 나타내었다. According to a specific embodiment of the present invention, when the hydrolysis treatment time is 60 minutes or longer, there is no significant change in the permeability, and it is judged that the hydrolysis does not progress from 60 minutes onwards. When the hydrolysis time of silk fibroin is 20 Minute to 60 minutes, the hydrogel exhibited excellent physical properties.
가수분해공정에서 상기 염기성 수용액은 최종농도 0.05 M 이상으로 첨가될 수 있다. 또는 가수분해공정에서 상기 염기성 수용액은 최종농도 0.1 M 이상으로 첨가될 수 있다. In the hydrolysis step, the basic aqueous solution may be added at a final concentration of 0.05 M or more. Or in the hydrolysis step, the basic aqueous solution may be added at a final concentration of 0.1 M or more.
본 발명에 따르면, 가수분해 처리는 염기성 수용액을 첨가한 후 일정 시간동안 가열 및 교반하여 실시한다. 교반 시 가열온도는 60-100℃의 범위이며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 가열온도는 70-90℃ 일 수 있다. According to the present invention, the hydrolysis treatment is carried out by adding a basic aqueous solution and then heating and stirring for a certain period of time. The heating temperature during stirring is in the range of 60-100 ° C, and according to one embodiment of the present invention, the heating temperature may be 70-90 ° C.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 0.1 M - 1 M농도의 염기성 수용액을 첨가하여 5분-100분동안 가열 및 교반하여 실시할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the step (b) can be performed by adding a basic aqueous solution having a concentration of 0.1 M - 1 M and heating and stirring for 5 minutes to 100 minutes.
본 발명에서는 가수분해한 실크피브로인 입자크기를 확인하기 위하여 본 발명의 실크 피브로인으로 제조된 하이드로젤의 투명도를 측정하였다. 그 결과, 가수분해 처리시간에 따라 투명도가 달라졌고, 그에 따라 실크피브로인 입자 크기가 달라지는 것을 확인할 수 있으며, 입자크기에 따라 점탄성적 물성이 달라짐을 확인하였다.In the present invention, the transparency of the hydrogel prepared with the silk fibroin of the present invention was measured to confirm the particle size of the hydrolyzed silk fibroin. As a result, it was confirmed that the transparency was changed according to the hydrolysis treatment time, and thus, the particle size of silk fibroin was varied, and that the viscoelastic properties varied depending on the particle size.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 가수분해 처리시간이 길어질수록 하이드로젤의 투명도가 높아졌다. 즉, 가수분해로 인해 고분자의 실크피브로인 분자량이 감소함으로써 하이드로젤을 구성하는 실크피브로인 입자 크기가 작아져 투명도가 높아졌다. 이러한 투과도 차이는 긴 파장대의 빛에서 더욱 분명하게 나타났다(도3a-3b 참조).According to one embodiment of the present invention, the longer the hydrolysis treatment time, the higher the transparency of the hydrogel. That is, due to the hydrolysis, the molecular weight of the silk fibroin of the polymer is decreased, so that the size of the silk fibroin constituting the hydrogel is reduced and the transparency is increased. This difference in transmittance is more evident in the light of the long wavelength band (see Figs. 3A-3B).
단계 (c): 탈염공정Step (c): Desalting Process
마지막으로 단계 (b)의 가수분해물을 전기투석(electrodialysis)하여 염을 제거한 후 실크 피브로인 수용액을 수득한다.Finally, the hydrolyzate of step (b) is subjected to electrodialysis to remove salts and an aqueous solution of silk fibroin is obtained.
탈염공정은 전기탈염장치 또는 투석막을 사용하여 실시할 수 있다. 전기투석 공정은 독특한 특성들을 가지는 이온 교환 멤브레인들(ion exchange memberanes)이 물에서 이온들을 선택적으로 분리하기 위해 사용되는 것이며, 물속에서 이온들은 그 이온들을 끌어당기는 양의 직류 전류값(positive direct current)과 음의 직류 전류값(negative direct current)에 의해 이동(migration)된다. 즉, 전?석은 양이온들이 양이온 교환 멤브레인들만을 투과할 수 있게 하고 음이온들이 음이온 교환 멤브레인들만을 투과할 수 있게 하는 특성을 이용하며, 직류 전기장이 형성된 상황에서 물속에 있는 음이온들은 양의 전극을 향해 이동하고 양이온들은 음의 전극을 향해 이동한다. 이에 따라 가수분해물로부터 염을 제거할 수 있다.The desalination process can be carried out using an electrodemetation device or a dialysis membrane. Electrodialysis is the process by which ion exchange membranes with unique properties are used to selectively separate ions from water and ions in the water have a positive direct current value that attracts the ions, And the negative DC current value (negative direct current). That is, the electroplating utilizes the property that the cations can permeate only the cation exchange membranes and allows the anions to permeate only the anion exchange membranes, and in the situation where the DC electric field is formed, the anions in the water are directed toward the positive electrode And the positive ions move toward the negative electrode. Whereby the salt can be removed from the hydrolyzate.
한편, 상기 (c) 단계 이후에 상기 실크 피브로인 수용액을 동결건조하여 파우더화하는 단계를 추가적으로 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 동결건조는 -50℃ 내지 -110℃에서 1일 내지 7일동안 건조하여 실시할 수 있다. 실크 피브로인은 수용액 상태에서 최대 2주 후에는 β 병풍구조가 형성되어 단단한 젤이 형성되어 보관 안정성이 낮다. 따라서 실크 피브로인은 장기간 보관하여 사용하기에는 낮은 활용도를 나타낸다. 본 발명에서는 실크 피브로인의 보관안정성을 높이기 위해 이를 파우더화 하였다. Meanwhile, after the step (c), the silk fibroin aqueous solution may be lyophilized and powdered. For example, the lyophilization can be performed by drying at -50 ° C to -110 ° C for 1 day to 7 days. Silk fibroin is formed in a state of aqueous phase, and after 2 weeks, the structure of β screen is formed and hard gel is formed and storage stability is low. Therefore, silk fibroin has low utility for long-term storage and use. In the present invention, the silk fibroin is pulverized to improve the storage stability of the silk fibroin.
한편, 가수분해 처리를 거친 실크 피브로인 파우더는 가수분해 처리하지 않은 파우더와 비교하여 재용해율이 높다.On the other hand, the silk fibroin powder subjected to the hydrolysis treatment has a higher re-dissolution rate than the powder not subjected to the hydrolysis treatment.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 실크 피브로인 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a silk fibroin composition produced by the above-described production method of the present invention.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 실크 피브로인 조성물을 이용하여 제조된 실크 하이드로젤을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a silk hydrogel prepared using the silk fibroin composition of the present invention.
본 발명의 실크 피브로인 조성물 또는 실크 하이드로젤은 상술한 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 조성물을 이용하므로, 공통된 사항은 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Since the silk fibroin composition or the silk hydrogel of the present invention uses the composition prepared by the manufacturing method of the present invention described above, the description thereof is omitted in order to avoid excessive redundancy of the present specification.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 실크 하이드로젤은 가시광선 영역에서 0-80%사이의 투과도를 가진다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 실크 하이드로젤은 500 nm 내지 700 nm의 범위에서 0%-80%사이의 투과도를 가진다. According to one embodiment of the present invention, the silk hydrogel of the present invention has a transmittance between 0-80% in the visible light region. According to another embodiment of the present invention, the silk hydrogel of the present invention has a transmittance between 0% and 80% in the range of 500 nm to 700 nm.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 실크 하이드로젤은 압축강도가 0-50 kPa이고; 탄성계수가 0 - 3 kPa인 실크 하이드로젤이며; 저장탄성률이 1.0 x 103 Pa - 1.0 x 106 Pa이다. According to one embodiment of the present invention, the silk hydrogel of the present invention has a compressive strength of 0-50 kPa; A silk hydrogel having an elastic modulus of 0 - 3 kPa; The storage elastic modulus is 1.0 x 10 3 Pa - 1.0 x 10 6 Pa.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 광가교성 실크 피브로인 구조체의 제조방법 및 광중합형 3D프린팅용 실크 피브로인 조성물에 관한 것이다.(a) The present invention relates to a process for producing a photocurable silk fibroin structure and a silk fibroin composition for photopolymerization type 3D printing.
(b) 본 발명에서는 실크피브로인에 메타아크릴에이트작용기를 도입하여 이중결합을 가지는 실크피브로인을 제조하였고, 상기 이중결합을 가지는 실크피브로인에 광개시제를 첨가하여 광중합함으로써 하이드로젤을 제조하였다. (b) In the present invention, a silane fibroin having a double bond was prepared by introducing a methacrylate functional group into silk fibroin, and a photoinitiator was added to the silk fibroin having a double bond to prepare a hydrogel.
(c) 본 발명의 제조방법에서는 실크피브로인에 광가교작용기 도입으로 실크피브로인 단독으로 광가교 하이드로젤을 제조 가능하며, UV영역뿐만 아니라 가시광 영역에서도 광가교 하이드로젤 제조 가능하다. (c) In the production method of the present invention, a photocrosslinkable hydrogel can be produced singly by silk fibroin by introducing a photocrosslinking functional group into silk fibroin, and a photocrosslinkable hydrogel can be produced not only in the UV region but also in the visible region.
(d) 또한, 실크피브로인 단독으로 광중합이 가능하여, 특히 세포배양에서 가시광선을 이용한 광중합시 세포독성이 낮다.(d) Silk fibroin alone can be photopolymerized, and cytotoxicity is low particularly when photopolymerization using visible light in cell culture.
(e) 본 발명의 광중합형 3D프린팅용 실크 피브로인 조성물은 SLA 방식의 3D 프린터용 액체 잉크 또는 DLP 방식의 3D 프린터용 광경화성 바이오잉크 소재로서 사용될 수 있다. (e) The photocurable 3D printing silk fibroin composition of the present invention can be used as a liquid ink for a 3D printer of SLA type or as a photo-curable bio ink material for a DLP type 3D printer.
도 1은 탄산칼슘을 이용한 실크 피브로인 용해모습을 나타낸다.
도 2a-2b는 가수분해 처리시간 조절을 통해 가수분해된 실크 피브로인 수용액을 나타낸다. (2a) 투석 전, (2b) 투석 후.
도 3a는 가수분해 처리 시간에 따른 투과도 비교 그래프이다. 도 3b는 각각 무처리 실크 피브로인 하이드로젤(B)과 60분 가수분해 처리된 실크 피브로인 하이드로젤(C)을 나타낸다. 도 3c는 실크 피브로인 가수분해 공정에서 알칼리 농도가 높아짐에 따라 제조된 하이드로젤의 빛에 대한 투과도가 커지는 것을 나타낸다.
도 4는 가수분해 처리시간에 따른 실크 피브로인 분자량분포를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 가수분해 처리시간에 따른 압축강도 응력-변형율 그래프를 나타낸다. 도 5b는 가수분해 처리 시간에 따른 압축강도 탄성계수를 나타낸다. 도 5c-5d는 가수분해 처리시간에 따른 전단변형율에 대한 저장탄성률을 나타낸다.
도 6은 이중결합이 도입된 실크 피브로인을 광개시제와 혼합하여 빛을 조사하였을 때 하이드로젤이 형성되었음을 보여준다. (A) UV영역, (B) 가시광영역
도 7a는 이중결합이 도입된 실크 피브로인의 제조과정을 나타낸다. 도 7b는 본 발명의 이중결합이 도입된 실크 피브로인을 이용한 광가교 하이드로젤의 제조과정을 나타낸다. 도 7c는 젤라틴 메타크릴레이트와 본 발명의 (이중결합이 도입되지 않은) 실크 피브로인을 혼합한 후, 광가교 반응시켜 완성된 하이드로젤을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 이중결합이 도입된 실크 피브로인 조성물을 SLA 또는 DLP방식의 3D프린팅용 바이오잉크로 사용하여 제작가능한 3차원의 구조체를 나타낸다.1 shows a silk fibroin dissolution state using calcium carbonate.
Figures 2a-2b show aqueous solutions of hydrolyzed silk fibroin by hydrolysis treatment time control. (2a) before dialysis, (2b) after dialysis.
FIG. 3A is a graph showing a comparative permeability according to hydrolysis treatment time. FIG. FIG. 3B shows hydrogel (B) which is untreated silk fibroin and hydrogel (C) which is silk fibroin hydrolyzate treated for 60 minutes. FIG. 3C shows that the transmittance of the hydrogel produced through the silk fibroin hydrolysis process increases as the alkali concentration increases.
4 is a graph showing molecular weight distribution of silk fibroin according to hydrolysis treatment time.
5A shows a compressive strength stress-strain graph according to hydrolysis treatment time. Fig. 5B shows the compressive strength modulus according to the hydrolysis treatment time. 5C-5D show the storage elastic modulus with respect to the shear strain according to the hydrolysis treatment time.
FIG. 6 shows that a hydrogel was formed when light was irradiated by mixing a silane fibroin having a double bond introduced therein with a photoinitiator. (A) a UV region, (B) a visible light region
7A shows a manufacturing process of a silk fibroin having a double bond introduced therein. FIG. 7B shows a process for preparing a photo-crosslinked hydrogel using silk fibroin having a double bond according to the present invention. FIG. 7C shows a hydrogel obtained by mixing a gelatin methacrylate and silk fibroin of the present invention (without a double bond introduced therein), followed by photo-crosslinking reaction.
8 shows a three-dimensional structure that can be produced by using the silk fibroin composition having the double bond of the present invention as a bio ink for SLA or DLP type 3D printing.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
[실크 피브로인 조성물의 제조][Preparation of silk fibroin composition]
실험방법Experimental Method
1. 재료 및 시약1. Materials and reagents
실크 피브로인 추출에 사용된 누에고치는 경상북도 잠사곤충사업장(한국)에서 구입하였다. 용해과정에서 이용된 탄산칼슘(CaCO3), 가수분해과정에 이용된 수산화칼륨(KOH)은 준세이(일본)에서 구입하였다.The silkworms used for the silk fibroin extraction were purchased from the Jamsa Insect Business Center in Gyeongbuk Province (Korea). Calcium carbonate (CaCO 3 ) used in the dissolution process and potassium hydroxide (KOH) used in the hydrolysis process were purchased from Junsei (Japan).
2. 실크 정련2. Silk refining
누에고치 50 g을 물 1 L에 넣은 후 고압멸균기에서 125℃에서 50분 동안 가열하여 세리신을 제거하였다. 세리신 제거 후 누에를 찬물에 여러 번 헹궈 남은 세리신을 완전히 제거한 후 50℃ 오븐에서 하루 동안 건조하여 세리신이 제거된 실크 피브로인을 수득하였다.50 g of cocoon was placed in 1 L of water and heated in a high-pressure sterilizer at 125 ° C for 50 minutes to remove sericin. After saccharin removal, silkworms were rinsed several times with cold water to completely remove the remaining sericin, and then dried in an oven at 50 ° C for one day to obtain sericin-free silk fibroin.
3. 실크 피브로인 용해3. Silk Fibroin Fusion
정련된 실크 피브로인 10 g을 50% 탄산칼슘(CaCO3) 수용액 200 ml 에 넣은 후 110℃에서 10분간 교반하여 용해하였다. 추가적으로 금속염 종류에 따른 실크 피브로인의 용해 및 가수분해 효과를 실험하였다(하기 표 2 참조).10 g of refined silk fibroin was placed in 200 ml of a 50% aqueous solution of calcium carbonate (CaCO 3 ) and dissolved by stirring at 110 ° C for 10 minutes. In addition, the dissolution and hydrolysis effects of silk fibroin were tested according to the type of metal salt (see Table 2 below).
4. 실크 피브로인 가수분해 및 탈염4. Silk fibroin hydrolysis and desalination
상기 3. 에서 제조된 실크 피브로인 용해액에 1 M KOH 수용액을 첨가하여 최종농도가 0.1 M이 되도록 한다. KOH 수용액 첨가 후 80℃에서 교반하여 가수분해 정도를 조절하였다. 이때 교반시간을 0분에서 100분까지 20분 간격으로 조절하였다. 가수분해가 끝난 후 miracloth로 실크 피브로인 수용액을 거른 후 전기투석기로 염을 제거하였다. 염 제거 후 투석이 끝난 용액은 동결건조하여 파우더 상태로 보관하였다.A solution of 1 M KOH in the silk fibroin solution prepared in the above step 3 is added to a final concentration of 0.1 M. After addition of aqueous KOH solution, the degree of hydrolysis was controlled by stirring at 80 ° C. At this time, the agitation time was adjusted from 0 minute to 100 minutes at intervals of 20 minutes. After the hydrolysis, the silk fibroin aqueous solution was filtered with miracloth and the salt was removed with an electrodialysis device. After the salt removal, the dialyzed solution was lyophilized and stored in powder form.
5. 실크 피브로인의 가수분해 정도에 따른 물성 평가 (투명도, 분자량, 압축강도, 저장탄성률)5. Evaluation of physical properties according to the degree of hydrolysis of silk fibroin (transparency, molecular weight, compressive strength, storage modulus)
KOH의 가수분해 처리 시간에 따른 투명도는 UV-가시광 분광광도계를 이용하여 500 nm와 700 nm 파장에서 측정하였다. KOH의 가수분해 처리 시간에 따른 분자량은 고속액체크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 가수분해 처리 시간에 따른 하이드로젤의 강도를 평가하기 위해 가수분해처리한 실크 피브로인 용액을 초음파 분쇄기를 이용하여 5분간 90%의 세기로 처리 한 후 슬라이드글라스 사이에 용액을 주입하여 실크 피브로인의 물리적 가교결합이 형성되도록 한다. 하이드로젤 형성된 후 높이 1.6 mm 직경 8 mm의 원통형 디스크 형태로 제작하여 만능재료시험기를 이용하여 압축강도를 평가하였다.The transparency of KOH was measured at 500 nm and 700 nm wavelength using a UV-visible spectrophotometer. The molecular weight according to the hydrolysis treatment time of KOH was measured by high performance liquid chromatography. To evaluate the strength of the hydrogel according to the hydrolysis treatment time, the hydrolyzed silk fibroin solution was treated with an ultrasonic pulverizer for 90 minutes for 5 minutes. Then, the solution was injected between the slide glasses, and the physical crosslinking of the silk fibroin Thereby forming a bond. After the hydrogel was formed, a cylindrical disk having a height of 1.6 mm and a diameter of 8 mm was produced, and the compressive strength was evaluated using a universal testing machine.
실험결과Experiment result
1. 실크 정련1. Silk refining
누에고치에서 얻은 부잠사는 세리신과 실크 피브로인으로 구성되므로, 정련과정을 통해 세리신과 실크 피브로인을 분리 후 사용하여야 한다. “(정련전무게-정련후무게)/정련전무게*100” 의 식으로 연감율을 계산할 수 있으며, 보통 연감율 25%-30%일 때 세리신이 완전히 제거되었다고 판단한다. 본 실험에서 고압멸균기를 이용하여 물로 정련한 결과 평균 28%정도의 연감율을 보였으며, 다른 첨가제 없이 세리신이 충분히 제거되었다고 판단하였다.Since Bomjasa obtained from silkworm consists of sericin and silk fibroin, sericin and silk fibroin should be separated after refining process. It is possible to calculate the annual rate by the expression "(before refining weight - weight after refining) / before refining weight * 100", and judges that sericin has been completely removed when the annual rate is 25% -30%. In this experiment, the water was refined using a high-pressure sterilizer, and the average rate of 28% was obtained. It was judged that sericin was completely removed without any other additives.
2. 실크 피브로인 용해 및 가수분해2. Silk fibroin dissolution and hydrolysis
50% 탄산칼슘수용액을 이용하여 실크 피브로인을 용해했을 때 5분-10분 사이에 빠르게 실크 피브로인이 용해되는 것을 확인하였다(도 1 참조).It was confirmed that when silk fibroin was dissolved by using a 50% aqueous solution of calcium carbonate, silk fibroin dissolved rapidly in 5 to 10 minutes (see FIG. 1).
추가적으로 금속염 종류에 따른 실크 피브로인의 용해 및 가수분해를 실험한 결과, 탄산칼슘 50% 수용액에서 실크의 용액화 효과가 가장 뛰어나고, 이후 KOH로 가수분해 처리했을 때 10분 이내의 짧은 시간이내에 수용성 실크 조성물이 제조되는 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조). 이하 본 발명에서는 CaCO3 50wt% 수용액 및 KOH 을 이용하여 추후 실험을 진행하였다.In addition, dissolution and hydrolysis of silk fibroin according to the type of metal salt was found to be most effective for solving silk in a 50% aqueous solution of calcium carbonate, and after the hydrolysis treatment with KOH, water soluble silk composition (See Table 2). In the present invention, further experiments were conducted using a 50 wt% aqueous solution of CaCO 3 and KOH.
3. 실크 피브로인 탈염3. Silk fibroin desalination
표 3은 전기탈염장치를 이용한 탈염공정시간별 이온전도도를 나타낸 것이다. 전기탈염공정을 이용하였을 때, 투석막으로 염을 제거할 때(표 4 참조)보다 투석효과가 우수한 것을 확인하였으며, 하루 투석만으로 증류수와 유사한 전기전도도 값을 가지는 것을 확인하였다.Table 3 shows the ionic conductivity of the desalination process using the electrodialysis device. It was confirmed that the electrolytic desalination process had better dialysis effect than the salt removal using the dialysis membrane (see Table 4).
4. 동결건조 및 파우더화4. Freeze-drying and powdering
수용성을 가지는 실크 피브로인 가수분해용액을 동결건조하여 파우더화 하여 보관함으로써 실크 피브로인의 보관안정성을 높이고 필요 농도만큼 물에 용해하여 사용할 수 있어 하이드로 젤 제조의 용이성을 높였다.The water-soluble silk fibroin hydrolysis solution was lyophilized and stored in powder form to enhance the storage stability of the silk fibroin and to dissolve it in water to the required concentration, thus enhancing the easiness of hydrogel production.
5. 실크 피브로인 가수분해 처리시간에 따른 투과도 측정 5. Measurement of permeability according to silk fibroin hydrolysis treatment time
가수분해 처리시간 조절을 통해 가수분해된 실크 피브로인 수용액을 관찰하였다. 가수분해 반응이 진행된 직후 시료들은 황갈색은 띠는 것을 확인할 수 있었고 (도 2a), 전기투석을 통해 염이 제거됨에 따라 점차 투명해 지는 것을 확인할 수 있었다 (도 2b).The hydrolyzed silk fibroin aqueous solution was observed by controlling the hydrolysis time. Immediately after the hydrolysis reaction, it was confirmed that the samples were yellowish brown (FIG. 2A), and it became clear that the salt became transparent as the salt was removed through electrodialysis (FIG. 2B).
이어, 가수분해 처리 시간에 따른 투과도를 비교하였다. 무처리 실크 피브로인 하이드로젤과 60분 가수분해 처리된 실크 피브로인 하이드로젤을 비교하였다(도3a-3b).Then, the permeability according to the hydrolysis treatment time was compared. Untreated silk fibroin hydrogels and 60-min hydrolyzed silk fibroin hydrogels were compared (Figs. 3a-3b).
UV-가시광 분광광도계를 이용하여 투과도를 측정한 결과, 가수분해 처리 시간이 증가함에 따라 투명도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 무처리된 실크 피브로인 하이드로젤의 경우 500 nm 파장의 빛은 거의 투과되지 않았으며 700 nm 파장대의 빛은 약 10% 가량 투과하는 것을 확인할 수 있었다(도3a). 뿐만 아니라 더 긴 파장대의 빛에서 투과도의 차이가 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었는데 이러한 차이는 실크 피브로인 입자의 크기에 기인한다. 실크 피브로인 하이드로젤의 투명도는 하이드로젤을 구성하는 실크 피브로인 입자의 크기가 가시광선 파장범위에 비해 작은 경우 높아지며 가수분해처리로 인해 실크피브로인 고분자의 분자량이 작아짐에 따라 입자의 크기가 작아져 투명도가 높아지는 것을 알 수 있다. 가수분해 처리시간이 60분까지 증가함에 따라 700 nm 파장대의 빛에 대한 투과도는 약 80%정도로 매우 높게 나타났음을 확인할 수 있었다.As a result of measuring the transmittance using a UV-visible spectrophotometer, it was confirmed that transparency increases with increasing hydrolysis time. In the case of the untreated silk fibroin hydrogel, light with a wavelength of 500 nm was hardly transmitted, and light with a wavelength of 700 nm was transmitted by about 10% (FIG. 3A). In addition, it was confirmed that the difference in transmittance in the light of the longer wavelength band is large, which is caused by the size of the silk fibroin particles. The transparency of the silk fibroin hydrogel is higher when the size of the silk fibroin particles constituting the hydrogel is smaller than that of the visible light wavelength range. As the molecular weight of the silk fibroin polymer becomes smaller due to the hydrolysis treatment, the particle size becomes smaller, . As the hydrolysis time increased to 60 minutes, the transmittance of light at 700 nm wavelength was very high, about 80%.
한편, 실크 피브로인 가수분해 공정에서 알칼리 농도가 높아짐에 따라 제조된 하이드로젤의 빛에 대한 투과도가 커지는 것을 확인하였다(도3c). 이는 가수분해된 실크 피브로인 입자의 크기가 작아져 생기는 현상으로, 알칼리 농도가 높아짐에 따라 실크 피브로인이 더 작은 입자로 가수분해되는 것을 확인하였다.On the other hand, it was confirmed that as the alkali concentration increases in the silk fibroin hydrolysis process, the transparency of the prepared hydrogel increases to light (FIG. 3C). This is a phenomenon caused by a decrease in the size of hydrolyzed silk fibroin particles, and it has been confirmed that silk fibroin hydrolyzes to smaller particles as the alkali concentration increases.
6. 실크 피브로인 가수분해 처리시간에 따른 분자량 측정 6. Molecular weight measurement according to silk fibroin hydrolysis treatment time
도 4는 가수분해 처리시간에 따른 실크 피브로인 분자량분포를 나타낸 그래프이다. 무처리 실크피브로인의 경우 8.12 ml (443kDa) 부근에서 좁은 단일픽을 보였으나 가수분해 처리 시간이 증가함에따라 9.5 ml (200kDa) 부근에서 픽이 점차 증가하는 결과를 보였다. 80분 이상 가수분해 처리된 실크피브로인은 13.0 ml (17kDa) 부근에서 픽이 지배적으로 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 가수분해 처리시간이 증가함에 따라 실크 피브로인의 분자량이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다.4 is a graph showing molecular weight distribution of silk fibroin according to hydrolysis treatment time. In the case of untreated silk fibroin, a narrow single pick was observed at 8.12 ml (443 kDa), but the peaks gradually increased at around 9.5 ml (200 kDa) as hydrolysis treatment time increased. The silk fibroin hydrolyzed for more than 80 minutes showed a predominant appearance in the vicinity of 13.0 ml (17 kDa). As a result, it was confirmed that the molecular weight of silk fibroin gradually decreased with increasing hydrolysis treatment time.
7. 실크 피브로인 가수분해 처리시간에 따른 압축강도 및 저장탄성률 측정 7. Measurement of compressive strength and storage elastic modulus according to silk fibroin hydrolysis treatment time
도 5a는 가수분해 처리시간에 따른 압축강도 응력-변형율 그래프를 나타낸다. 무처리 실크피브로인 기반 하이드로젤의 경우 40%의 변형율서 약 35 kPa의 높은 압축강도를 보였으나 가수분해 처리된 실크 피브로인 기반 하이드로젤의 경우 압축강도가 현저히 떨어지는 결과를 보였다. 5A shows a compressive strength stress-strain graph according to hydrolysis treatment time. In the untreated silk fibroin-based hydrogel, the compressive strength was 40% and the compressive strength was about 35 kPa. However, the compressive strength of hydrogel-treated silk fibroin-based hydrogel was remarkably decreased.
압축강도 탄성계수를 비교해보았을 때 무처리 실크 피브로인 하이드로젤 대비 7%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5b). 이러한 강도의 감소는 디지털 레오미터를 통한 전단응력시험을 통해서도 확인할 수 있었다. 압축응력 결과와 마찬가지로 하이드로젤의 전단강도 또한 가수분해 처리 시간에 따라 감소하는 경향을 보였다(도 5c-5d). 이러한 실크 피브로인의 가수분해에 따른 기계적 물성의 감소는 가수분해에 따른 분자량의 감소에 기인한다.Comparing the compression modulus of elasticity, it was confirmed that the elastic modulus was reduced by 7% compared to the untreated silk fibroin hydrogel (Fig. 5B). This reduction in strength was also confirmed by a shear stress test through a digital rheometer. Like the compressive stress results, the hydrogel gel shear strength also tended to decrease with the hydrolysis treatment time (Fig. 5c-5d). The decrease in the mechanical properties due to the hydrolysis of silk fibroin is caused by the decrease in molecular weight due to hydrolysis.
결론적으로, 실크 피브로인 가수분해 공정에서 알칼리처리 시간이 길어질수록 실크 피브로인이 더 작은 입자로 가수분해 되는 것을 확인했으며, 가수분해 시간이 길어짐에 따라 압축강도, 탄성률 및 저장탄성률이 낮아지는 것을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the silk fibroin was hydrolyzed to smaller particles as the alkali treatment time was longer in the silk fibroin hydrolysis process, and the compressive strength, elastic modulus and storage elastic modulus were lowered as the hydrolysis time became longer.
[광중합형 3D 프린팅을 이용한 실크 피브로인 구조체의 제조][Production of silk fibroin structure using light-curing 3D printing]
실험방법Experimental Method
1. 재료 및 시약1. Materials and reagents
실크피브로인에 이중결합을 도입하는 반응에 사용된 이소사이아노에틸 메타크릴레이트(isocyanoethyl methacrylate) 및 DMSO는 시그마알드리치(미국)에서 구입하였다. 실크피브로인은 상기 실시예에서 제조한 실크피브로인을 사용하였다.Isocyanoethyl methacrylate and DMSO used in the reaction to introduce a double bond to silk fibroin were purchased from Sigma-Aldrich (USA). The silk fibroin prepared in the above example was used as the silk fibroin.
2. 이중결합이 도입된 실크피브로인 합성2. Synthesis of silk fibroin with double bonds
반응기 내에서 실크피브로인 파우더를 DMSO 에 완전히 용해한 후, 이소사이아노에틸 메타크릴레이트를 첨가하여 가열교반하였다. 합성된 물질(이중결합이 도입된 실크피브로인)은 동결건조하여 파우더로 보관하였다.In the reactor, silk fibroin powder was completely dissolved in DMSO, isocyanatoethyl methacrylate was added, and the mixture was heated and stirred. The synthesized material (silk fibroin with double bonds) was lyophilized and stored as a powder.
3. 광가교를 일으킬 수 있는 실크피브로인 혼합액 제조3. Manufacture of silk fibroin mixture which can cause light bridging
(i) PBS에 이중결합이 도입된 실크피브로인을 녹인 후, 광개시제 이르가큐어(irgacure) 2959를 녹여 UV영역에서 광가교를 일으킬 수 있는 실크피브로인 혼합액을 제조하였다. (ii) PBS에 이중결합이 도입된 실크피브로인을 녹인 후 광개시제 에오신(Eosin Y)와 조개시제를 넣고 녹여 가시광영역에서 광가교를 일으킬 수 있는 실크피브로인 혼합액을 제조하였다.(i) Silk fibroin having a double bond introduced into PBS was dissolved, and a photochromic agent Irgacure 2959 was melted to prepare a silk fibroin mixed solution capable of causing photo-crosslinking in the UV region. (ii) After dissolving silk fibroin with double bond in PBS, Eosin Y and Eosin Y were added to dissolve the photoinitiator and photo-crosslinked silk fibroin mixture was prepared.
4. 실크 피브로인 구조체의 광중합형 3D 프린팅4. Light-curing 3D printing of silk fibroin structure
실크피브로인과 광개시제 (Irgacure 2959 또는 에오신 Y) 혼합액을 DLP프린터에 넣은 후 UV 또는 가시광 파장의 빛을 조사하여 원하는 구조체를 제조하였다.A mixture of silk fibroin and photoinitiator (Irgacure 2959 or Eosin Y) was put in a DLP printer, and then a desired structure was prepared by irradiating light of UV or visible light wavelength.
실험결과Experiment result
1. 광가교를 일으킬 수 있는 실크 피브로인 혼합액 제조1. Manufacture of silk fibroin mixture which can cause photocrosslinking
이중결합이 도입된 실크 피브로인을 광개시제와 혼합하여 빛(UV 또는 가시광)을 조사하였을 때 하이드로젤을 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 6). 그리고, 이중결합이 도입된 실크피브로인에 광개시제(Irgacure 2959 또는 에오신 Y) 를 첨가해 UV 또는 가시광을 조사하는 경우 실크피브로인 단독으로 광가교 하이드로젤이 형성되었다(도 7a-7b 참조).It was confirmed that hydrogels were formed when light (UV or visible light) was irradiated by mixing silk fibroin having double bonds with a photoinitiator (FIG. 6). When UV or visible light was irradiated by adding a photoinitiator (Irgacure 2959 or Eosin Y) to the silk fibroin to which the double bond was introduced, a photo-crosslinked hydrogel was formed singly by silk fibroin (see Figs. 7A and 7B).
한편, 도 7c는 광가교가 잘 일어나는 것으로 알려진 재료(GelMA, gelatin methacrylate)에 일반적인 실크 피브로인(이중결합이 도입되지 않은 실크피브로인)을 혼합한 뒤 UV 영역 빛을 조사하여 하이드로젤을 제조했을 때의 형태를 나타낸다.On the other hand, FIG. 7 (c) is a graph showing the results of mixing a common silk fibroin (silk fibroin having no double bond) with a material (GelMA, gelatin methacrylate) .
2. 실크 피브로인 구조체의 광중합형 3D 프린팅2. Light-curing 3D printing of silk fibroin structure
광가교를 일으킬 수 있는 실크피브로인 혼합액을 DLP프린터의 출력베드에 넣은 후 원하는 이미지를 출력함으로써 광가교된 3D 구조체를 얻을 수 있다. 기존에 DLP프린팅 재료로 유통되는 물질들은 생체적합성이 낮은 물질들이 대부분이고, 생체적합한 소재중에는 GelMA (젤라틴에 이중결합을 도입한 물질)이 많이 사용되지만 투명하여 프린터에서 출력시 상이 양쪽에 맺히는 문제점이 발생하였다. 하지만 이중결합이 도입된 실크 피브로인 구조체의 경우 생체적합할 뿐만 아니라 투명하지 않으므로 상이 양쪽으로 맺히는 현상 없이 DLP프린터에 적용하여 다양한 구조체의 제조가 가능하였다. 이중결합이 도입된 실크피브로인에 광개시제를 첨가한 용액을 SLA 또는 DLP방식의 3D프린팅용 바이오잉크로 사용하여 광가교된 3차원의 구조체가 제조되는 것을 확인하였다(도 8 참조).A light-crosslinked 3D structure can be obtained by placing a silk fibroin mixed liquid capable of causing light crosslinking in an output bed of a DLP printer and outputting a desired image. Conventionally, DLP printing materials are mostly biocompatible materials and GelMA (gelatin-based double bond) materials are mostly used for biocompatible materials. Respectively. However, in the case of a silk fibroin structure having a double bond, it is not only biocompatible but also transparent. Thus, various structures can be manufactured by applying the present invention to a DLP printer without forming the image on both sides. It was confirmed that a photo-crosslinked three-dimensional structure can be prepared by using a solution prepared by adding a photoinitiator to silk fibroin having a double bond introduced thereinto as a bio-ink for SLA or DLP type 3D printing (see FIG. 8).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (18)
(a') 다음 (i) 내지 (iv) 단계를 포함하는 실크 피브로인을 제조하는 단계:
(i) 누에고치와 증류수를 가열한 후 세리신(sericin)을 제거하여 실크 피브로인을 수득하는 정련단계;
(ii) 상기 단계 (i)에서 수득한 실크 피브로인(silk fibroin)을 탄산칼슘 수용액에 용해시키는 단계;
(iii) 상기 단계 (ii)의 용해물에 강염기성 수용액을 첨가하여 실크 피브로인을 가수분해하는 단계; 및
(iv) 상기 단계 (iii)의 가수분해물을 전기투석하여 염을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 수득하는 단계;
(a) (i) 하기 화학식 1로 표시되는 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물, 및 (ii) 상기 단계 (a')에서 제조된 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합 및 교반하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계,
화학식 1
(b) 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가한 후, 자외선 또는 가시광선을 조사하여 광가교성 실크 피브로인 구조체를 형성하는 단계.
A process for producing a light-crosslinkable silk fibroin structure comprising the steps of:
(a ') preparing a silk fibroin comprising the following steps (i) to (iv):
(i) a refining step of heating cocoon and distilled water and removing sericin to obtain silk fibroin;
(ii) dissolving the silk fibroin obtained in step (i) in an aqueous calcium carbonate solution;
(iii) hydrolyzing silk fibroin by adding a strongly basic aqueous solution to the melt of step (ii); And
(iv) electrodialysis of the hydrolyzate of step (iii) to remove salts to obtain an aqueous silk fibroin solution;
(a) a methacrylate compound comprising (i) a double bond functional group for photocrosslinking represented by the following formula (1), and (ii) a silk fibroin prepared in step (a ') Mixing and stirring to introduce a double bond functional group into the silk fibroin,
Formula 1
(b) forming a photo-crosslinkable silk fibroin structure by adding a photoinitiator to the silk fibroin to which the double bond is introduced, and then irradiating ultraviolet light or visible light.
The process according to claim 1, wherein the stirring of step (a) is carried out at 25 ° C-45 ° C for 5-7 hours.
2. The process according to claim 1, wherein (ii) silk fibroin of step (a) is dissolved in dimethylsulfoxide.
The method according to claim 1, wherein the double bond-introduced silk fibroin comprises at least one of a urethane bond, a urea bond and an amide bond.
화학식 3
화학식 4
The method according to claim 1, wherein the photoinitiator is a compound represented by the following formula (3) or (4).
(3)
Formula 4
The method of claim 1, wherein the step (b) comprises the steps of: (i) adding a UV photoinitiator to the aqueous solution of PBS containing 5% to 30% of silk fibroin having the double bond introduced thereto in an amount of 0.1 to 5% , Or (ii) a photoinitiator in a visible light region is added at a concentration of 0.01 mM to 0.03 mM.
The method according to claim 1, wherein the step (b) forms a photocrosslinkable silk fibroin structure by a 3D printing method.
(a') 다음 (i) 내지 (iv) 단계를 포함하는 실크 피브로인을 제조하는 단계:
(i) 누에고치와 증류수를 가열한 후 세리신(sericin)을 제거하여 실크 피브로인을 수득하는 정련단계;
(ii) 상기 단계 (i)에서 수득한 실크 피브로인(silk fibroin)을 탄산칼슘 수용액에 용해시키는 단계;
(iii) 상기 단계 (ii)의 용해물에 강염기성 수용액을 첨가하여 실크 피브로인을 가수분해하는 단계; 및
(iv) 상기 단계 (iii)의 가수분해물을 전기투석하여 염을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 수득하는 단계;
(a) (i) 하기 화학식 1로 표시되는 광가교(photocrosslinking)를 위한 이중결합 작용기를 포함하는 메타크릴레이트 화합물, 및 (ii) 상기 단계 (a')에서 제조된 실크 피브로인(silk fibroin)을 혼합 및 교반하여, 실크 피브로인에 이중결합 작용기를 도입하는 단계,
화학식 1
(b) 상기 이중결합이 도입된 실크 피브로인에 광개시제(photoinitiator)를 첨가하여 광가교성 실크 피브로인 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 광가교성 실크 피브로인 조성물에 자외선 또는 가시광선을 조사시 상기 실크 피브로인이 광가교된다.
A process for preparing a photocurable silk fibroin composition comprising the steps of:
(a ') preparing a silk fibroin comprising the following steps (i) to (iv):
(i) a refining step of heating cocoon and distilled water and removing sericin to obtain silk fibroin;
(ii) dissolving the silk fibroin obtained in step (i) in an aqueous calcium carbonate solution;
(iii) hydrolyzing silk fibroin by adding a strongly basic aqueous solution to the melt of step (ii); And
(iv) electrodialysis of the hydrolyzate of step (iii) to remove salts to obtain an aqueous silk fibroin solution;
(a) a methacrylate compound comprising (i) a double bond functional group for photocrosslinking represented by the following formula (1), and (ii) a silk fibroin prepared in step (a ') Mixing and stirring to introduce a double bond functional group into the silk fibroin,
Formula 1
(b) adding a photoinitiator to the silk fibroin to which the double bond is introduced to prepare a photo-crosslinkable silk fibroin composition, wherein when the photo-crosslinkable silk fibroin composition is irradiated with ultraviolet light or visible light, the silk fibroin is photo- do.
11. The method according to claim 10, wherein the stirring of step (a) is carried out at 25 DEG C to 45 DEG C for 5-7 hours.
11. The process according to claim 10, wherein (ii) silk fibroin of step (a) is dissolved in dimethyl sulfoxide.
11. The method according to claim 10, wherein the silk fibroin having the double bond introduced therein comprises at least one of a urethane bond, a urea bond and an amide bond.
화학식 3
화학식 4
11. The method according to claim 10, wherein the photoinitiator is a compound represented by the following formula (3) or (4).
(3)
Formula 4
11. The method of claim 10, wherein the step (b) comprises: (i) adding a UV photoinitiator to the aqueous solution of PBS containing 5% to 30% of silk fibroin having the double bond introduced thereto in an amount of 0.1-5% , Or (ii) a photoinitiator in a visible light region is added at a concentration of 0.01 mM to 0.03 mM.
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