KR101876753B1 - 저콜레스테롤혈증제로서 락토바실러스 플란타룸 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528, 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성되는 그룹으로부터 선택된 균주 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이들 새로운 균주는 양호한 프로바이오틱 특징을 가지고 심장혈관계 질환의 예방 또는 치료, 또는 둘 다에 유용하다.
Description
본 출원은 2009년 10월 09일에 출원된 유럽 특허 출원 제 09172613.3호 및 2009년 11월 30일에 출원된 미국 가특허출원 제 61/265,095호의 이점을 청구한다.
본 발명은 약물, 미생물학 및 영양 분야에 관한 것으로, 특히, 콜레스테롤의 저감 용도로서의 신규한 락토바실러스 플란타룸의 프로바이오틱 균주에 관한 것이다.
비정상적으로 높은 콜레스테롤 레벨(고콜레스테롤혈증)은 동맥에서의 아테롬의 성장을 촉진하기 때문에 심장혈관계 질병과 강하게 연관된다.
잠재적 저콜레스테롤혈증 약제 및 식료품은 비정상적으로 높은 레벨을 갖는 개인의 혈청 콜레스테롤을 조절하기 위해 지속적으로 개발되고 있다. 이들 약제들은 담즙산염의 장간 순환(enterohepatic circulation; EHC)의 방해에 근거할 수 있다. 담즙산염 신진대사 및 콜레스테롤 신진대사는 밀접하게 연관된다. 담즙산염은 콜레스테롤의 수용성 배설 최종-생성물이고, 소화관에서의 지방의 유화에 중요하다. 그들은 글리코- 또는 타우로-접합체로서 주로 간에서 합성된다. 담즙산염은 십이지장에서 하루에 여러 번(평균 여섯 번) 분비되고, 공장을 통해 회장으로 통과한다. 장내 수송 동안, 담즙산염의 대부분은 간문맥을 통해 간으로 돌아가도록 재흡수된다. 적은 비율이 대변 내에서 소실되고 이러한 소실은 간에서의 내인성 콜레스테롤로부터 새롭게 합성되게 한다. 대변 내에서 소실되는 담즙산염의 양의 증가는 콜레스테롤의 증가된 네오합성(neosynthesis)을 초래하고, 따라서 내인성 콜레스테롤 풀을 효과적으로 저감시킨다. 수지(resins)로 명명된 현재 사용되는 저콜레스테롤혈증 약물의 그룹(콜레스티라민, 콜레스티폴, 콜레세베람(colesevelam))은 이러한 작용 메커니즘을 통해 활성이다.
EHC의 방해를 통해 혈청 콜레스테롤 레벨을 낮추기 위한 약학적 또는 수술적 시도와는 별도로, 특정 세균 세포의 섭취 역시 콜레스테롤 레벨에 역할을 미칠 수 있다는 것이 제안되었다. 장내 세균은 세균막에서 음식물로부터의 외인성 콜레스테롤의 흡수를 통해 또는 담즙산염 비접합(deconjugation)을 통해 콜레스테롤 레벨에 영향을 미칠 수 있다. 장내 수송 동안, 담즙산염은 많은 세균 트랜스포메이션을 겪고, 그 가운데 가장 중요한 것이 담즙산염 비접합이다. 담즙산염을 비접합시키는(가수분해하는) 능력은 일부 장내 락트산균(LAB) 종에서 발견되나, 다른 속(genera)에서도 발견된다. 담즙산염 비접합 시에, 글리신 또는 타우린이 분자의 스테로이드 모이어티로부터 리버레이팅되고, 유리(비접합된) 담즙산염의 형성을 초래한다. 유리 담즙산염은 낮은 pH에서 더 용이하게 침전된다. 그들은 또한 그들의 접합된 카운터파트보다 덜 효율적으로 재흡수된다. 그러므로 비접합된 담즙산염은 담즙산염이 접합된 대변 내에서 더 용이하게 배설된다. 담즙산염 비접합은 담즙산염의 배설을 증가시키는 것에 의해 EHC에 영향을 미치고 외인성 콜레스테롤의 미미한 보유보다 혈중 콜레스테롤의 저감에 훨씬 더 효과적인 것으로 인정된다.
EHC 동안 담즙산염 비접합의 원인이 되는 효소인 담즙산염 가수분해효소(BSH)는 위장관에 고유한 여러 LAB 종에서 검출되었다. Tanaka 등("Screening of Lactic Acid Bacteria for Bile Salt Hydrolase Activity", Journal of Dairy Science 1999, vol. 82, p. 2530-35 참조)은 비피도박테리움 속 및 락토바실러 속과 락토코쿠스 락티스 종, 류코노스톡 메센테로이데스 종, 및 스트렙토코쿠스 서모필러스 종으로부터 300개 이상의 LAB 균주를 스크리닝했다. 273개의 균주에 대해 얻어진 결과는 BSH 활성이 다른 종들 사이에서 이종으로 분포된다는 것을 나타냈다. 이 연구에 따르면, 거의 모든 비피도박테리아 균주는 BSH 활성을 가지고, 반면에 이러한 활성은 락토바실러스의 선택된 균주에서만 발견될 수 있다.
락토바실러스 플란타룸은 혐기성 식물 물질은 물론 많은 발효된 식료품에서 흔히 발견되는 그램-양성 내기성 LAB이다. 그것은 또한 (그것이 처음으로 분리된) 타액에 존재한다. L. 플란타룸 균주는 높은 산성화 프로파일 및 양호한 감각수용성 특성은 물론, 산업 공정 및 보존 기간을 통한 양호한 생존률 덕분에 발효된 식료품의 산업적 제조에 특히 적합하다. L. 플란타룸의 일부 균주는 또한 프로바이오틱스로 간주된다. 프로바이오틱스는 살아있는 미생물이고, 적합한 양으로 투여될 때, 숙주에게 건강상의 이익을 준다. 프로바이오틱으로 명명되기 위해서는, 박테리아는 다른 것들 가운데, 유독성의 저감, 하부 위장관(GIT)에 도달시 생존성 및 장점막에의 점착력과 관련된 몇몇 요구사항을 충족해야만 한다. 대개의 프로바이오틱 박테리아는 LAB 그룹에 속하나, 그럼에도 불구하고, 프로바이오틱 특징 및 이점은 동일한 종의 LAB 가운데에서조차 매우 균주-의존적인 것으로 일반적으로 알려져 있다.
상업적 L. 플란타룸 299v 균주는 프로바이오틱으로 일반적으로 간주되고 프로바이오틱 드링크의 형태로 섭취될 때 혈청에서의 피브리노겐 및 콜레스테롤 레벨을 저감시키는 것으로 설명되어 왔다(Bukowska 등, "Decrease in fibriogen and LDL-cholesterol levels upon supplementation of diet with Lactobacillus plantarum in subject with moderately elevated cholesterol" Atherosclerosis 1998, vol. 137, p.437-38 참조). 그러나 이들 연구에서 LDL-콜레스테롤 저감은 매우 온건하고 HDL-콜레스테롤의 온화한 저감을 유사하게 동반했다. L. 플라타룸 299v의 BSHA와 관련된 어떠한 데이터도 공개되지 않았다.
그러므로 저콜레스테롤혈증제로서 사용될 새로운 개선된 프로바이오틱 균주를 제공하는 것이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 혈중 콜레스테롤의 저감을 위한, 그리고 결과적으로, 심장혈관계 질병의 예방 및 치료를 위한 새로운 개선된 프로바이오틱 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 1 측면은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528, 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성된 그룹으로부터 선택되는 균주들 또는 그들의 돌연변이 균주들 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 돌연변이 균주가 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어지고, 돌연변이 균주는 모균주의 콜레스테롤 저하 활성을 유지하거나 또는 더 개선한다. 소정 실시예에서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528, 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 균주의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, L. 플란타룸 CECT 7528, 및 L. 플란타룸 CECT 7529 또는 그들의 돌연변이 균주의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 균주들은 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어지고, 돌연변이 균주들은 모균주들의 콜레스테롤 저하 활성을 유지하거나 또는 더 개선한다. 소정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 유효량의 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, L. 플란타룸 CECT 7528, 및 L. 플란타룸 CECT 7529를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 예방제 또는 치료제, 또는 둘 다로서의 용도를 위한 본 발명의 균주, 또는 그들의 돌연변이 균주 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 조성물에 관련된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 동물에서 심장혈관계 질환의 예방 또는 치료에서의 용도를 위한 것이다. 또 다른 바람직한 실시예에서 본 발명은 심장혈관계 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위해 위에서 설명된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 이것은 인간을 포함하는, 동물에서 심장혈관계 질환의 예방 또는 치료, 또는 둘 다를 위한 방법으로서 대안적으로 제제화될 수 있고, 본 발명의 조성물의 유효량을 필요로 하는 언급된 동물에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 저콜레스테롤혈증제로서 사용된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 콜레스테롤의 저감을 위한 약제의 제조를 위해 위에서 설명된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 이것은 인간을 포함하는 동물에서 콜레스테롤의 저감을 위한 방법으로서 대안적으로 제제화될 수 있고, 본 발명의 조성물의 유효량을 필요로 하는 언급된 동물에 투여하는 것을 포함한다.
기탁된 균주, 또는 그들의 돌연변이 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 식용, 약학적 또는 수의학적 제품으로 제조될 수 있고, 여기서 언급된 균주는 단독 활성제제이거나 또는 하나 이상의 다른 활성제제와 혼합되고, 그리고/또는 (약학적 또는 수의학적 제품의 경우에) 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 첨가제 또는 (식용 제품의 경우에) 적합한 첨가제가 혼합된다. 본 발명의 소정 실시예에서, 제품은 하나 이상의 또 다른 활성제제를 부가적으로 포함한다. 바람직하게, 부가적인 활성제제 또는 제제들은 다른 프로바이오틱 박테리아이다. 제형에 따라서, 균주는 정제된 박테리아로서, 박테리아 배양물로서, 박테리아 배양물의 일부로서, 후-처리된 박테리아 배양물로서, 그리고 적합한 캐리어 또는 성분과 함께 또는 단독으로 첨가될 수 있다. 프리바이오틱스 역시 첨가될 수 있고, 그것은 s 공생 조성물을 초래한다. 소정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 프락토올리고당 및 갈락토올리고당으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 프리바이오틱을 부가적으로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 첨가제의 적합한 양과 함께 기탁된 균주, 또는 그들의 돌연변이 균주 중 적어도 하나를 포함하는 조성물의 유효량을 포함하는 약학적 제품 또는 수의학적 제품, 또는 둘 다를 제공한다. 이러한 관점에서, 약학적 제품은 정제, 알약, 캡슐, 마이크로캡슐, 그래뉼, 현탁, 시럽, 냉동-건조된 파우더, 액상 제제 등의 형태로 경구 투여되도록 제조될 수 있다. 소정 목적의 관점에서 조성물의 제조를 위한 가장 적합한 방법 및 첨가제의 선택은 약학적 기술의 분야에서 통상의 기술자의 범위 내에 있다. 경구 투여가 바람직함에도, 주사, 직장 또는 국부와 같은 다른 형태도 가능하다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 식용 성분의 적합한 양과 함께 본 발명의 조성물을 포함하는 식용 제품이 제공된다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 식이 보충제이다.
본 발명의 또 다른 측면은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성되는 그룹, 또는 그들의 돌연변이 균주들로부터 선택된 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공하고, 여기서 돌연변이 균주는 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어지고, 돌연변이 균주는 모균주의 콜레스테롤 저하 활성을 유지하거나 또는 더 개선한다. 특정 실시예에서, 균주는 기탁된 균주 중 하나로부터 선택된다.
본 발명의 새로운 균주는 양호한 프로바이오틱 특징을 가지고 심장혈관계 질환의 예방과 치료에 유용하다.
도 1은 1, 락토바실러스 플란타룸 299v; 2, F2099; 3, F3147; 4, 락토바실러스 플란타룸 VSL#3; 5, F3276의 Sma-I(A) 및 Sfi-I(B) 제한된 게놈 DNA의 펄스된 필드 전기영동(Pulsed field electrophoresis) 패턴이다.
본 발명은 혈중 콜레스테롤의 저감을 위한, 그리고 결과적으로, 심장혈관계 질병의 예방 및 치료를 위한 새로운 개선된 프로바이오틱 균주를 제공한다.
인간 얼굴에서 분리된 세개의 새로운 프로바이오틱 락토바실러스 플란타룸 균주가 본 발명자들에 의해 제공된다. 균주는 놀랍게도 높은 BSH 활성을 가지는 것으로 판명되었다. 위에서 언급된 바와 같이, 높은 박테리아 BSH 활성과 콜레스테롤의 저감 사이에 존재하는 밀접한 관계는 저콜레스테롤혈증제로서 유용한 본 균주를 만든다. 하기하는 활성 실시예들은 이들 균주가 상업적 프로바이오틱-혼합물 VSL#3에 존재하는 L. 플란타룸 299v 또는 L. 플란타룸 균주와 같은, 상업적으로 이용가능한 L. 플란타룸 균주와 관련하여 비교할 때 상당히 더 높은 BSH 활성을 가진다는 것을 입증한다. 그것은 또한 본 발명의 균주가 배지를 포함하는 가용성 콜레스테롤로부터의 배양 콜레스테롤의 저감에 효과적이라는 것을 나타낸다. 새로운 균주 각각은 자력으로 공지의 균주에 대해서 이점을 나타냄에도, 이들 이점은 세개의 균주가 함께 사용될 때 확대되고, 따라서 시너지 활성을 나타낸다.
본 발명의 균주의 콜레스테롤-저하 활성은 또한 인 비보로 입증한다. 하기하는 실시예는 본 발명의 프로바이오틱 균주를 포함하는 제품이 고콜레스테롤혈증 환자에 투여될 때에 콜레스테롤의 저감에 특히 효과적인 것을 입증한다.
따라서, 본 발명의 제 1 측면은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528, 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성된 그룹으로부터 선택되는 균주들 또는 그들의 돌연변이 균주들 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 돌연변이 균주가 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어지고, 돌연변이 균주는 모균주의 콜레스테롤 저하 활성을 유지하거나 또는 더 개선한다. 소정 실시예에서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528, 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 균주의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
여기서 사용된 용어 "유효량"은 의학적 판단의 범위 내에서 심각한 부작용을 회피하기에 충분히 낮으나, 바람직한 이점을 전달하기에 충분히 높은 활성제제의 양을 의미한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, L. 플란타룸 CECT 7528, 및 L. 플란타룸 CECT 7529 또는 그들의 돌연변이 균주들의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 돌연변이 균주들은 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어지고, 돌연변이 균주들은 모균주들의 콜레스테롤 저하 활성을 유지하거나 또는 더 개선한다. 소정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 유효량의 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, L. 플란타룸 CECT 7528, 및 L. 플란타룸 CECT 7529를 포함한다.
출발 물질로서 기탁된 균주들을 사용함으로써, 해당 기술분야의 통상의 기술자가 공지의 돌연변이생성 또는 재-분리 기법에 의해, 여기서 설명된 관련된 특징 및 이점을 보유하는 또 다른 그것의 돌연변이 또는 유도체를 관용적으로 얻을 수 있다는 것은 명백하다. 따라서 용어 "그들의 돌연변이"는 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어진 돌연변이 균주들에 관한 것이고, 언급된 돌연변이 균주는 모균주의 콜레스테롤 저하 특징을 유지하거나 또는 향상시킨다. 해당 기술분야의 통상의 기술자는 균주의 콜레스테롤 저하 활성을 결정하기 위해 사용될 적합한 방법을 결정할 수 있다. 이러한 활성을 측정하기 위한 가능한 방법의 실시예가 하기하는 실시예들에 나타난다.
본 발명의 균주는 프로바이오틱스로서 특히 유용하다는 이점을 가진다. 위에서 언급된 바와 같이, 프로바이오틱 박테리아는 유독성의 저감, 생존력, 점착력 및 유익한 효과와 관련된 여러 요구사항을 충족시켜야만 한다. 이들 프로바이오틱 특징은 동일한 종의 박테리아 가운데서조차 균주-의존적이다. 그러므로 모든 프로바이오틱 요구사항에서 더 나은 성과를 가지는 균주를 발견하는 것은 중요하다. 하기하는 실시예는 본 균주가 탁월한 프로바이오틱 특징을 가진다는 것을 보여준다.
본 발명의 균주는 포유동물의 위장 환경의 조건(산성 환경, 높은 리소자임, 담즙산염 및 과산화물 농도)에 대해 매우 내성이 있고, 따라서 GIT를 통한 경로에서 생존할 수 있음을 나타낸다. 균주는 또한 장 상피에 대해 양호한 점착력을 가져서, 그들이 장관에 남아서 그들의 프로바이오틱 효과를 나타내는 것을 허용한다. 다른 상업적 균주와 비교할 때, 본 발명의 균주는 GIT 조건에 대한 더 양호한 내성 및 더 높은 점착 능력을 나타낸다. 부가적으로, 그들은 또한 어떠한 독성 효과도 가지지 않고, LAB의 전위 증가를 유발하지 않으며, 숙주 포유동물에서 장내세균의 전위도 용이하게 하지 않기 때문에 안전하다는 것을 보여준다.
또한 본 균주는 숙주에서 여러 유익한 효과를 가진다. 콜레스테롤 저하 활성에 더해서, 그들의 길항 활성 때문에 장내 마이크로바이오타 균형에 유익하다. 용어 "길항 활성"은 프로바이오틱 박테리아의 활성에 의한 위장의 유익하지 않은 박테리아의 성장 억제를 의미한다. 부적합한 위장의 미생물 균형을 갖는 조건은 디스바이오시스(disbiosis)로 알려져 있고 인간의 웰빙에 복합적이고 부정적인 결과를 가진다. 본 균주를 다른 상업적인 L. 플란타룸 균주들과 비교할 때 병원 균주의 성장을 억제하기에 더 높은 능력을 가진다는 것이 아래에서 보여질 것이다.
균주는 또한 다량의 단쇄지방산(SCFA)을 생성한다. 소화불가한 화이버로부터의 SCFA의 생성은 흥미로운 프로바이오틱 능력이다. 생성된 SCFA가 숙주에서 여러 유익한 특징을 나타내기 때문에, 이 능력은 프로바이오틱에서 요구된다(Wong J., "Colonic health: fermentation and short chain fatty acids", J Clin Gastroenterol 2006, vol. 40, p. 235-43 참조). SCFA 중에서, 프로피온산 및 부티르산 생성은 본 발명의 범위에 있어서 더 큰 관심분야이다. 첫번째는 전신성 염증을 저감시키기에 유용한, 항-염증 효과를 가진다. 전신성 염증은 아테롬발생에서 영향범위를 가지고, 가장 중요한 심장혈관계 위험 인자 중 하나이다(Naruszewicz M., "Potential parapharmaceuticals in the traditional Polish diet" 2005, Journal of Physiology and Pharmacology, vol. 56, suppl 1, p.69-78 참조). 부티르산은 결장 세포의 주요한 에너지원이기 때문에, 결장 상피에 유익한 것으로 일반적으로 알려져 있다.
인간 숙주에 여러 유익한 효과를 나타내는데 있어서, 이들 프로바이오틱 박테리아는 치료제 또는 예방제로서 유용하다. 특히, 본 발명의 균주는 혈중 콜레스테롤 레벨을 저감시키는데 효과적이다. 위에서 설명된 바와 같이, 높은 콜레스테롤 레벨은 동맥에서 아테롬의 성장을 촉진시키기 때문에 심장혈관계 질병과 강하게 연관된다. 따라서 본 발명의 균주는 심장혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
따라서 본 발명의 또 다른 측면은 예방제와 치료제 중 하나 이상으로서의 사용을 위한 본 발명의 균주, 또는 그들의 돌연변이 균주 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 조성물에 관련된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 동물에서 심장혈관계 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 것이다. 또 다른 바람직한 실시예에서 본 발명은 심장혈관계 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위해 위에서 설명된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 이것은 인간을 포함하는, 동물에서 심장혈관계 질환의 예방 또는 치료, 또는 둘 다를 위한 방법으로서 대안적으로 제제화될 수 있고, 본 발명의 조성물의 유효량을 필요로 하는 언급된 동물에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 저콜레스테롤혈증제로서 사용된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 콜레스테롤의 저감을 위한 약제의 제조를 위해 위에서 설명된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 이것은 인간을 포함하는 동물에서 콜레스테롤의 저감을 위한 방법으로서 대안적으로 제제화될 수 있고, 본 발명의 조성물의 유효량을 필요로 하는 언급된 동물에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 관상동맥 질환을 겪고 있는 환자는 물론 건강한 피실험자에게도 투여될 수 있다. 소정 실시예에서 본 발명의 조성물을 섭취하는 피실험자는 고콜레스테롤혈증을 겪고 있다.
본 발명의 프로바이오틱 조성물은 식물성 스테롤에 의해 나타나는 부작용이 나타나지 않는 또 다른 장점을 가지고, 스테롤 하이퍼압소번트(hyperabsorbent) 피실험자에게 스타틴과 조합해서 사용을 금지하는 것으로 설명된다. 최근의 증거는 스타틴 모노테라피로 나타난 남아있는 관상동맥 위험의 일부가 식물성 스테롤을 포함하는 스테롤의 하이퍼압소버인 환자에서 관상동맥의 위험을 실제로 증가시키는 스타틴의 결과임을 나타낸다. 스테롤 하이퍼압소번트 환자는 인구의 25%에 이르고 그들 중 대다수는 카세트(ABC) 하프-트랜스포터 ABCG8을 결합하는 아데노신-5'-트리포스페이트(ATP)에서 다형성을 포함하는 것으로 나타난다(Goldstein M 등, "Statins, plant sterol absorption, and increased coronary risk". Journal of Clinical Lipidology, 2008, vol. 2, p. 304-305). 또한, 식이 식물성 스테롤 강화 및 스타틴 치료의 효과가 혈액 및 조직 식물성 스테롤 레벨을 상승시키는데 더해지고, 이것은 스테롤 하이퍼압소버에서 특히 명백하다는 것이 제시된다. 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 이들 결점을 가지지 않고 임의 인구에 그리고 스타틴 또는 임의 다른 콜레스테롤-저하 약물과 조합해서 투여될 수 있다.
따라서 소정 실시예에서 본 발명의 조성물은 스테롤 하이퍼압소번트 피실험자에게 투여된다. 또 다른 소정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 스타틴과 조합해서 투여된다.
본 발명의 균주는 또한 장 점막으로부터 개선된 사이토카인 패턴을 유도하기 때문에, 숙주에서 면역조절 효과를 촉진시킨다. 이러한 면역조절 효과는 질병 저항의 개선 및 알레르기 위험의 저감을 얻도록 돕기 때문에 숙주에게 유익하다. GIT에 사는 그램 음성 박테리아는 그들의 세포 표면에 분자 LPS(리포다당류)를 나타내고, 장 점막 세포로부터 염증성 마커의 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 프로바이오틱 보충은 이 상황을 더 나은 생태학적 건강을 갖거나 일부 그램 음성 미생물에 대해 길항 특징을 가져서 (락트산 박테리아 그룹에서 그룹핑되는) GIT에서의 그램 양성 박테리아의 하나의 더 큰 존재(one greater presence)에 유리하도록 변화시킬 수 있고, 따라서 장점막에서 LPS의 존재를 저감시킨다. 그럼에도 일부 프로바이오틱 미생물은 사이토카인의 생성을 그 자체로 조절하는 능력을 나타내고, 신체에서 염증 및 면역 반응을 조절하는 메신저 분자이다. 특히, 일부 프로바이오틱 박테리아는 (그램 음성 박테리아의 수를 저감시키지 않고) 장 점막에서 향/항-염증성 시그널링 사이에 더 나은 균형화된 패턴을 유도한다. 위에서 언급된 바와 같이, 이러한 박테리아에 의해 자극되는 면역조절 역시 항죽상경화 효과를 가진다.
아래에서 설명하는 바와 같이, 본 발명의 균주가 염증성 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 레벨의 저감 및 장점막 세포에 의해 생성된 항-염증성 인터류킨 10(IL-10) 레벨의 증가를 그 자체로 촉진시키기 때문에 장점막으로부터 개선된 사이토카인 패턴을 유도하는 것이 발견되었다. 이러한 면역조절 효과는 GIT에서 병원성 그램 음성 박테리아의 존재를 저감시키고, 장점막에서 LPS의 양을 저감시키면서 균주의 길항 특징들에 의해 보완된다.
기탁된 균주, 또는 그들의 돌연변이 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 식용, 약제학적 또는 수의학적 제품으로 제조될 수 있고, 여기서 언급된 균주는 단독 활성제제이거나 또는 하나 이상의 다른 활성제제와 혼합되고, 그리고/또는 (약학적 또는 수의학적 제품의 경우에) 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 첨가제 또는 (식용 제품의 경우에) 적합한 첨가제가 혼합된다. 본 발명의 소정 실시예에서, 제품은 하나 이상의 또 다른 활성제제를 부가적으로 포함한다. 바람직하게, 부가적인 활성제제 또는 제제들은 다른 프로바이오틱 박테리아이다. 제형에 따라서, 균주는 정제된 박테리아로서, 박테리아 배양물로서, 박테리아 배양물의 일부로서, 후-처리된 박테리아 배양물로서, 그리고 적합한 캐리어 또는 성분과 함께 또는 단독으로 첨가될 수 있다. 프리바이오틱스 역시 첨가될 수 있고, 그것은 s 공생 조성물을 초래한다. 소정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 프락토올리고당 및 갈락토올리고당으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 프리바이오틱을 부가적으로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 첨가제의 적합한 양과 함께 기탁된 균주, 또는 그들의 돌연변이 균주 중 적어도 하나를 포함하는 조성물의 유효량을 포함하는 약학적 제품 또는 수의학적 제품, 또는 둘 다를 제공한다. 이러한 관점에서, 약학적 제품은 정제, 알약, 캡슐, 마이크로캡슐, 그래뉼, 현탁, 시럽, 냉동-건조된 파우더, 액상 제제 등의 형태로 경구 투여되도록 제조될 수 있다. 소정 목적의 관점에서 조성물의 제조를 위한 가장 적합한 방법 및 첨가제의 선택은 약학적 기술의 분야에서 통상의 기술자의 범위 내에 있다. 경구 투여가 바람직함에도, 주사, 직장 또는 국부와 같은 다른 형태도 가능하다.
여기서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 지나친 독성, 염증, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 환자(예. 인간)의 조직과 접촉해서 사용하기에 적합하고, 타당한 이점/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물과 제형 중 하나 이상에 관련된다. 각각의 캐리어, 첨가제 등은 또한 제형의 다른 성분과 호환가능하다는 관점에서 "허용가능"해야만 한다. 적합한 캐리어, 첨가제 등은 표준 약학적 텍스트에서 발견될 수 있다. 유사하게, 용어 "수의학적으로 허용가능한"은 비-인간 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 것을 의미한다.
본 발명의 균주는 또한 유제품, 요구르트, 커드, 치즈(예. 쿠아르크, 크림, 가공, 연질 및 경질 치즈), 발효유, 분유, 우유에 기반한 발효 제품, 아이스-크림, 발효된 시리얼에 기반한 제품, 우유에 기반한 파우더, 음료, 드레싱, 및 애완동물 사료와 같은 다양한 식용 제품에 포함될 수 있다. 용어 "식용 제품"은 제시의 임의 형태로 제품의 임의 형태를 포함하는 광범위한 의미로 여기서 사용되고, 동물에 의해 섭취될 수 있으나, 약학적 및 수의학적 제품을 제외한다. 다른 식용 제품의 예는 육류 제품(예. 리버 페이스트, 프랑크푸르트 및 살라미 소시지 또는 미트 스프레드), 초콜렛 스프레드, 필링(예. 트뤼플, 크림) 및 프로스팅, 초콜렛, 과자류(예. 카라멜, 퐁당 또는 토피), 구운 제품(케익, 패스트리), 소시지 및 수프, 과일 주스 및 커피 화이트너가 있다. 특히 흥미로운 식용 제품은 식이 보충제 및 유아용 조제분유이다. 본 발명의 관점에서, 식이 보충제 역시 기능식품을 포함하고, 그것은 인간 건강에 의학적 효과를 가지는 식품의 추출물인 것으로 알려져 있다. 동물 식품용 사료 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 조성물은 또한 다른 식료품에 일 성분으로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 관점에서, 식용 성분의 적합한 양과 함께 본 발명의 조성물을 포함하는 식용 제품이 제공된다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 식이 보충제이다.
조성물에서 각각의 균주에 대한 집락 형성 단위(cfu)의 유효량은 해당 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 것이고 최종 제형에 따를 것이다. 예를 들어, 식용 제품에서, 균주 또는 균주들은 현재의 법률에 따르면, 105cfu/g에서 1012cfu/g까지의 양으로, 바람직하게 107cfu/g에서 1012cfu/g까지의 양으로 존재한다. 용어 "집락 형성 단위"("cfu")는 한천 평판 상의 미생물의 카운트에 의해 드러나는 바와 같이 박테리아 세포의 수로서 정의된다.
식이 보충제는 일반적으로 107 내지 1012cfu/g 범위인 양으로 프로바이오틱 균주를 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 기탁된 균주의 109-1011cfu/g 사이, 바람직하게 1011cfu/g를 포함하는 식이 보충제이다. 또 다른 실시예에서, 식이 보충제는 본 발명의 균주 또는 균주들 109cfu를 포함한다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여 요법은 해당 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확립될 수 있다. 본 발명의 조성물은 하루에 한번, 한 주에 한번, 한 주에 여러 날 또는 하루에 여러 번 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 일일 투여량은 본 발명의 균주 또는 균주들 109cfu를 포함한다.
본 발명의 균주는 적합한 배지에서 그리고 적합한 조건 하에서 박테리아를 배양함으로써 생산된다. 균주는 순수 배양물을 형성하도록 단독으로, 또는 다른 미생물과 함께 혼합된 배양물로, 또는 다른 유형의 박테리아를 분리해서 배양하고 그런 후에 그들을 원하는 비율로 결합시켜 배양될 수 있다. 배양 후에, 세포 현탁액은 회수되어 그대로 사용되거나 또는 약학적 또는 식용 제품의 제조에서 더 사용되도록 예를 들어, 농축시키거나 냉동-건조시키는 바와 같은 적합한 방법으로 처리된다. 때때로 프로바이오틱 제조는 보존 기한을 개선하기 위해 고정 또는 캡슐화 공정을 거친다. 박테리아의 고정 또는 캡슐화를 위한 여러 기법이 해당 기술분야에 알려져 있다(Kailasapathy 등, "Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applications", Curr Issues Intest Microbiol 2002, vol. 3, p. 39-48 참조).
본 발명에 따른 조성물이 식이 보충제로서 사용된다면, 그것은 그대로 투여될 수 있고, 물, 요구르트, 우유 또는 과일 주스와 같은 적합한 음용가능한 액체와 혼합될 수 있고, 또는 고형 또는 액상 식품과 혼합될 수 있다. 이 문맥에서 식이 보충제는 정제, 알약, 캡슐, 그래뉼, 파우더, 현탁, 사쉐, 캔디, 스위트, 바, 시럽 및 대응하는 투여 형태의 형태로, 일반적으로 1회 투여량의 형태로 있을 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 시럽 또는 알약의 형태로 투여되고, 약학적 제품을 제조하는 공지의 공정으로 제조된다.
하기하는 실시예에서 나타나는 바와 같이, 제공되는 균주 각각은 L. 플란타룸 299v 또는 L. 플란타룸 VSL#3와 같은 상업적으로 이용가능한 L. 플란타룸 균주와 비교할 때 개선된 특징을 가진다. 특히, 세 개의 균주는 매우 높은 BSH 활성으로 인해 개선된 저콜레스테롤혈증 효과를 가진다. 그러므로 균주 각각은 단독으로 또는 본 발명의 다른 균주와 조합해서 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 또는 식용 성분, 보존제 등과 함께 L. 플란타룸 균주 CECT 7527의 유효량을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제, 또는 식용 성분, 보존제 등과 함께 L. 플란타룸 균주 CECT 7528과 L. 플란타룸 균주 CECT 7529 중 하나 이상을 조합한 L. 플란타룸 균주 CECT 7527의 유효량을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성되는 그룹, 또는 그들의 돌연변이 균주들로부터 선택된 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공하고, 여기서 돌연변이 균주는 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함으로써 얻어지고, 돌연변이 균주는 모균주의 콜레스테롤 저하 활성을 유지하거나 또는 더 개선한다. 특정 실시예에서, 균주는 기탁된 균주 중 하나로부터 선택된다.
다음으로 본 발명의 균주의 면역 체계에 대한 효과를 포함하는 분류학적 특성 및 특정 프로바이오틱 특징은 물론, 저콜레스테롤혈증 능력을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 얻어진 결과는 본 발명의 균주가 상업적 L. 플란타룸 299v 균주와 비교할 때 개선된 프로바이오틱 특징을 가지는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명의 균주를 포함하는 조성물이 식물성 스테롤-함유 제제보다 더 양호한 인 비보 콜레스테롤-저하 활성을 가지는 것을 나타낸다.
달리 정의되지 않는다면, 여기서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 여기서 설명된 이들과 유사한 또는 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
설명 및 청구항에 걸쳐 단어 "포함하다" 및 그것의 변형은 다른 기술적 특징, 첨가제, 구성성분, 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 부가적인 목적, 이점 및 특징은 설명의 시험 시에 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이고 또는 본 발명의 실시에 의해 습득될 수 있다. 다음의 실시예 및 도면은 도시의 방법에 의해 제공되고, 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 또한 본 발명은 여기서 설명된 특정 그리고 바람직한 실시예의 모든 가능한 조합을 포함한다.
실시예
1. 새로운 균주의 인 비트로
저콜레스테롤혈증
활성
본 발명의 균주는 유아의 대변으로부터 분리되었고 아래에 설명된 방법에 의해 담즙산염 가수분해효소(BSH) 활성에 대한 스크리닝에서 높은 성과를 위해 다른 500개의 박테리아 균주 가운데 선택되었다. 선택된 균주는 바실러스 형태학은 물론 뚜렷한 Gram+ 스테이닝을 나타냈고 비-아포-형성이었다. 균주는 CECT(Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia, Edificio de investigacion, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia)에서의 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 대응하는 생존증명서가 제공되었고 균주는 다음의 기탁 번호를 받았다: 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527(본 명세서에서 또한 F2099로 명명됨), 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528(본 명세서에서 또한 F3147로 명명됨), 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529(본 명세서에서 또한 F3276으로 명명됨). CECT로의 진입 날짜는 균주 F3276 및 F2099는 2009년 05월 07일이고, 균주 F3147은 2009년 07월 15일이었다.
균주의 저콜레스테롤혈증 활성이 인 비트로로 더 조사되고 상업적 대조 균주 L. 플란타룸 299v 균주(이제부터 Lp 299v) 및 상업적 VSL#3 배양물에 포함된 L. 플란타룸 균주(이제부터 Lp VSL#3)와 비교되었다. 위에서 언급되었듯이, 두개의 메커니즘이 락트산 박테리아에 의해 야기되는 콜레스테롤 레벨의 저하에 대해, 즉 담즙산염의 비접합에 의해 야기되는 콜레스테롤 네오-합성에 의해 그리고 식품으로부터의 외인성 콜레스테롤의 동화를 통해 설명된다. 따라서 모든 균주는 BSH 활성 분석 및 배양 콜레스테롤 저하 테스트를 거쳤다. 부가적으로 새로운 균주의 다른 조합을 포함하는 혼합된 배양물들이, 시너지 효과가 BSH 및 배지 콜레스테롤 저하 활성과 관련해서 균주 사이에 존재하는지 여부를 확인하도록 분석되었다. 실험 절차가 약간의 수정과 함께 임형준 등에 의해 설명된 바와 같이 수행되었다("Isolation of cholesterol lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use", J Vet Sci 2004, vol. 5, p. 391-5 참조).
1.1.
담즙산염
가수분해효소 활성
균주를 5% CO2를 포함하는 분위기 하 30℃의 MRS 배지(pH 6.4)에서 밤새 배양했다. 배양 후에, 배양물을 108cfu/ml으로 표준화했고 다음의 혼합된 배양물을 제조했다: F2099+F3147, F2099+F3276, F3147+F3276, F2099+F3147+F3276. 혼합된 배양물은 단일-균주 배양물과 동일한 총 박테리아 농도 및 구성성분 균주 각각의 동일한 양을 포함했다. 단일-균주 배양물과 혼합된 배양물 모두를 BSH 활성에 대해 분석했다. 배양물이 4%(w/v) 소듐 솔트의 타우로디옥시콜산(TDCA, Sigma, USA) 및 0.37 g/l CaCl2로 보충된 MRS 한천 평판 상의 멸균된 페이퍼 디스크 주위에 가득 스며들게 했다. 평판을 72시간 동안 37℃에서 산소 결핍에 의해 배양했고 디스크 주위의 침전 부분의 직경을 측정했다. 그런 후에 식 GI=(IZD-DD)/2에 따라 BSH 활성을 억제 부분 직경(IZD)에서 디스크 직경(DD)을 감산하고 2로 이 차이를 나누는 것에 의해 계산했다(표 1 참조).
이들 결과는 본 발명의 균주가 높은 담즙산염 비접합 활성을 가진다는 것을 나타낸다. 또한, 단일 균주 F2099, F3147 및 F3276의 각각의 BSH 활성은 상업적인 균주 Lp299v 및 Lp VSL#3의 것보다 더 높고, 최고 활성은 균주 F3276에 대응한다. 또한, 균주가 혼합된 배양물에서 결합될 때, 혼합된 배양물의 BSA 활성은 동일한 총 박테리아 농도에 대해 단일-균주 배양물의 것보다 더 높다. BSH 활성은 세 개의 균주가 결합될 때 특히 증가하고, Lp 299v의 것에 크게 두 배인 BSH 활성을 초래한다. 따라서 BSH 활성과 관련해서 본 발명의 균주 사이에 시너지 효과가 있음을 나타낸다.
1.2. 배지 콜레스테롤 저하 능력
콜레스테롤 저하 테스트를 가용성 콜레스테롤 MRS 브로스를 사용하여 수행했다. 단일-균주 및 혼합된 배양물을 위에서 설명된 바와 같이 제조했다. 가용성 콜레스테롤(폴리옥시에탄일콜레스테롤 세바케이트, Sigma, USA)을 0.45㎛ 밀리포어를 통해 여과시키고 최종 농도 300mg/ml로 오토클레이브된, 0.05% L-시스테인-함유 MRS 브로스에 보충했다. 접종(inoculation) 부피는 1ml 콜레스테롤-MRS 브로스 당 위에서 얻어진 바와 같은 (108cfu/ml) 박테리아 배양액 15㎕이었고, 그것을 24시간 동안 37℃에서 산소 결핍에 의해서 배양했다. 비접종된 MRS 브로스 역시 동일한 조건에서 배양시켰다. 배양에 이어서, 박테리아 세포를 원심분리법에 의해 제거했고, 그런 후에 L. 플란타룸 배양 상청액 및 비접종된 대조군을 자동 분석기(Olympus AU400)에서 그들이 보유한 콜레스테롤 함량에 대해 분석했다. 이 최종 조합이 장내 환경에 더 밀접하게 유사하기 때문에 동일한 실험을 1% w/v 담즙산염-함유 MRS 브로스(SIGMA C4951로부터의 담즙산염)에서 수행했다. 이들 분석의 결과를 표 2에 나타내었으며, 비접종된 대조군에 대해서 콜레스테롤 저감 %로서 표현된다.
다시, 위 결과는 본 발명의 균주가 잘 알려진 상업적 Lp 299v 및 균주 Lp VSL#3과 비교할 때 더 양호한 저콜레스테롤혈증 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 부가적으로, 콜레스테롤 저하 효과는 혼합된 배양물에서 본 발명의 세 개의 균주를 결합시킬 때 더 양호하다는 것을 나타낸다.
2. 균주의 분류학상 특성
분류학상 특성에 있어서, 본 발명의 균주를 5% CO2를 포함하는 분위기 하 30℃의 MRS 배지(pH 6.4)에서 밤새 성장시켰다. 박테리아를 더 회수하고, 세정하고 프리-라이시스 완충제(480㎕ EDTA 50mM pH 8.0; 120㎕ 리소자임 10mg/ml)에서 재현탁하고, 60분 동안 37℃에서 더 배양시켰다. DNA를 위자드 게놈 DNA 정제 키트(Promega)를 사용하여 추출했다. 상청액을 제거하기 위해 2분 동안 14000g에서 전-처리된 박테리아의 원심분리 후에, 프로메가의 프로토콜을 따랐다. 요약해서, 박테리아를 뉴클레이 라이시스 솔루션에서 재현탁하고 5분 동안 80℃에서 배양시키고, 그런 후에 실내 온도로 냉각시켰다. 세포 용해물을 60분 동안 37℃에서 RN아제 솔루션에서 배양시켰고 단백질을 단백질 침전 용액을 첨가하고 고속으로 와류시키는 것에 의해 침전시켰다. 표본을 냉각시키고 3분 동안 15000g에서 원심분리시켰다. DNA를 포함하는 상청액을 깨끗한 1.5ml 미세분리 튜브로 옮기고 반전에 의해 이소프로판올 600㎕와 혼합시켰다. DNA를 2분 동안 15000g에서 원심분리에 의해 수집하고 상청액을 조심스럽게 제거했다. 튜브를 여러 번 부드럽게 반전시키는 것에 의해 DNA 샘플을 70% 에탄올 600㎕로 세정했다. 2분 동안 15000g에서 원심분리 후에, 에탄올을 흡입에 의해 제거했다. 최종적으로, DNA 펠릿을 1시간 동안 65℃에서 배양시키는 것에 의해 재수화 용액 100㎕에서 재현탁시켰다. 표본을 2-8℃에서 저장했다.
2.1. 속과 종의 유전학적 동정
16S rRNA를 유니버셜 프라이머 Eub27f 및 Eub 1492r을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰고, 16S의 거의 완전한-시퀀스의 프래그먼트를 생성했다(1000개 이상의 뉴클레오티드)(표 3). 그런 후에, 위에서 설명된 바와 같이 얻어진 DNA를 키트 Quiaquick(Quiagene)을 사용하여 세정했다.
네 개의 연속적인 시퀀싱 반응을 표 3에 나타낸 프라이머를 사용하여 BigDye 키트 v.31을 사용하여 유전 분석기 3130(Applied Biosystems)에서 각각의 샘플에 대해 수행했다. 데이터 수집 및 크로마토그램을 DNA 시퀀스 분석 v.5.2 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 확립하고 Chromas(Technelysium Pty Ltd.) 및 BioEdit(Ibis Biosciences)로 시각 분석에 의해 확인했다.
균속 동정(genus identification)을 리보솜 데이터베이스 프로젝트 툴을 사용하여 실행했다(Q. Wang 등, "Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy", Appl. Environ. Microbiol. 2007, vol. 73, p. 5261-7). 균종 동정을 BLASTN을 사용하여 RefSeq 데이터 베이스(http://www.ncbi.nlm.gov/RefSeq/), 그리고 리보솜 데이터베이스 프로젝트(http://rdp.cme.msu.edu/, J.R. Cole 등, "The Ribosomal Database Project(RDP-Ⅱ): introducing myRDP space and quality controlled public data" Nucl. Acids Res. 2007, vol. 35, p. 169-72) 둘 모두로부터 공지의 유기체의 16S 시퀀스와 얻어진 시퀀스의 비교에 의해 수행하였다. RDP 툴은 세 개의 균주 F2099, F3147 및 F3276을 락토바실러스 플란타룸 종에 속하는 것으로 동정했다.
2.2. 균주
지노타이핑
캐릭터리제이션이 게놈 다이제스쳔(digestion) 및 PFGE(pulsed-field gel electrophoresis)에 의해 수행하였다. F2099, F3147 및 F3276 균주는 앞서 설명된 프로토콜을 따르게 했다(A.M. Rodas 등, "Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications", Int J Syst Evol Microbiol 2005, vol. 55, p.197-207). Lp VSL#3 및 Lp299v 역시 대조 균주로서 분석에 포함되었다. 모든 균주를 MRS 한천 평판 상에 성장시키고 18시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양시켰다. 세포를 회수하고, 8ml PET(10mM Tris pH 7.6, 1 M NaCl)에서 3회 세정하고, 그런 후에 10분 동안 6000rpm에서 원심분리시켰다. 펠릿을 700㎕ 라이시스 완충제(6mM Tris, 1M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.5% SLS, 0.2% 디옥시콜산; 1mg/ml 리소자임; 40 U/ml 뮤타놀리신; 20(g/ml RN아제)에서 재현탁시켰다. 1.6% 저 용융점 아가로스(FMC BioProducts, Rockland, ME, USA)의 동일한 부피를 재현탁된 세포에 첨가하고 1시간 동안 4℃에서 응고시켰다. 삽입물을 2ml 라이시스 완충제 Ⅱ(0.5M EDTA pH 9.2, 1% N-라우릴 사카로신 및 1mg/ml 프로나아제)로 옮기고 48시간 동안 50℃에서 배양시켰다. 그런 후에 삽입물을 TE 완충제(10mM Tris, 1mM EDTA pH 8.0)로 실내 온도에서 세정했다. 총 DNA 다이제스쳔이 Sfi-Ⅰ 및 Sma-Ⅰ 제한 효소(Roche Diagnostics)에 의해 수행했다.
펄스-필드 전기영동법을 CHEF DRⅢ 장치(BioRad Laboratories)를 사용하여 실행했다. 삽입물을 1% 아가로스 겔(SeaKem ME agarose, FMC BioProducts, ME, USA)에 부하했다. 표 4는 각각의 효소에 대한 전기영동 조건을 설명한다. DNA MW 마커는 람바다 래더 PFG 마커 및 로우 랭지 PFG 마커였다(New England Biolabs). 전기영동 후에, 겔을 GelDoc 시스템(BioRad)을 사용하여 에티듐 브로마이드 및 UV로 스테이닝했다.
도 1에서 나타나는 바와 같이, 펄스된 필드 전기영동 Sfi-Ⅰ및 Sma-Ⅰ 제한 패턴은 F2099, F3147 및 F3276 균주에 대해 달랐고, 따라서 그들이 세 개의 다른 균주에 속한다는 것이 확인되었다. 예상대로, 패턴 역시 Lp299v 및 Lp VSL#3 균주에 대한 것들과 달랐다. 문헌에서, 다른 락토바실러스와 달리, L. 플란타룸 종은 높은 유전적 이질성을 나타낸다는 것이 설명되어 있다(I. Sanchez 등, "Polyphasic study of the genetic diversity of lactobacilli associated with 'Almagro' eggplants spontaneous fermentation, based on combined numerical analysis of randomly amplified polymorphic DNA and pulsed-field gel electrophoresis patterns" Journal of Applied Microbiology 2004, vol. 97, p.446-58). 그들의 PFGE에 의해 나타난 바와 같이, 균주 F2099, F3147 및 F3276는 유전학적으로 매우 밀접하게 연관된 것으로 보이고, 그래서 그들은 동일한 클론 기원으로부터 유래할 수도 있다(F.C. Tenover 등, "Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-filed gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing" J Clin Microbiol 1995, vol.33, p.2233-9).
3. 위장 환경에 대한 내성
GIT를 통한 수송에 대해 F2099, F3147 및 F3276 균주의 내성을 평가하기 위해서 분석을 포유동물의 위장 환경을 모방하는 조건 하에서 수행하였다. 따라서, 리소자임, 과산화물, 산성 환경 및 담즙산염으로 처리한 후의 생존을 수치화했다. 결과를 Lp 299v 및 Lp VSL#3에 대해 얻어진 것들과 비교했다.
3.1. 리소자임에 대한 내성 : 37℃의 MRS에서 밤새 성장된 각각의 박테리아 균주 배양물의 20㎕ 부분 표본을 96-웰 플레이트에 놓고 100, 200 또는 300㎍/ml 리소자임(Sigma)으로 보충된 200㎕ 배지를 첨가했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양했다. 박테리아 성장을 0시간과 6시간의 배양 시간 사이에 ELISA 리더에서 620nm에서 광학 밀도의 증가를 측정하는 것에 의해 수치화했다. 결과가 대조군 대 % 로 표현되었고, 그것은 리소자임 보충이 없는 MRS 브로스에서 각각의 균주의 최대 성장이다(표 5).
3.2. 과산화물에 대한 내성 : 37℃의 MRS에서 밤새 성장된 각각의 균주 배양물의 20㎕ 부분 표본을 96-웰 플레이트에 놓았다. 10, 20 및 30㎍/ml H2O2로 보충된 MRS 200㎕를 웰에 첨가하고 플레이트를 0시간과 6시간의 배양 시간 후에 620nm에서 판독되기 전에 37℃에서 30분 배양시켰다(표 6).
3.3. 산성 환경에 대한 내성 : 37℃의 MRS에서 밤새 성장된 각각의 균주 배양물의 20㎕ 부분 표본을 96-웰 플레이트에 넣고, 그런 후에 HCl로 다른 pH 값으로 조절된 MRS 배지의 200㎕ 부분 표본을 웰을 포함하는 박테리아 위에 두었다. 그런 후에 플레이트를 42℃에서 유지시키고 광학 밀도의 증가를 0시간과 6시간 사이에 620nm에서 분광광도계에서 판독했다. 결과를 대조군 대 %로 표현했고, 그것은 pH7.2에서 MRS 브로스에서 각각의 균주의 최대 성장이다(표 7).
3.4. 담즙산염에 대한 내성 : 37℃의 MRS에서 밤새 성장된 각각의 박테리아 균주 배양물의 20㎕ 부분 표본을 96-웰 플레이트에 위치시켰다. 0.3%, 0.5% 및 0.1%(w/v) 담즙산염으로 보충된 200㎕(SIGMA B8756-10G, 096K1213)를 웰에 첨가하고 pH3으로 조절했다. 표본 역시 pH 조절 없이 0.3% (w/v) 담즙산염 MRS의 200㎕에서 분석했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 유지시키고 620nm에서의 분광광도계에서 0시간과 6시간에 판독했다(표 8).
이들 결과는 본 발명의 균주가 위장 환경을 모방한 조건에 놓일 때 양호한 생존력 성과를 가진다는 것을 나타낸다. 표 5 및 표 6은 균주가 구강 내에 존재하는 고농도의 살균제(리소자임 및 과산화물)에 내성이 있다는 것을 나타낸다. 균주 생존력은 생리학적 조건 위의 농도(30㎍/ml 리소자임 및 10㎍/ml H2O2)에서조차 매우 양호하다. 위의 산성 조건을 고려할 때, 균주의 생존력 역시 만족스럽다. 또한 일반적으로 위의 공복이 발생한 경우와 같이, 산성 pH와 결합해서조차, 본 발명의 균주는 담즙산염에 대해 현저하게 내성이 있다(표 8). 전체적으로, 결과는 본 발명의 균주가 GIT를 통한 경로 후에 생존이 가능하다는 것을 나타낸다. 게다가, 결과는 본 발명의 균주가 분석된 조건에서 상업적 균주 Lp 799v 및 Lp VSL#3보다 더 나은 성과를 가진다는 것을 나타낸다.
4. 장에의 점착력
4.1. 점액에의 점착력
F2099, F3147 및 F3276 균주의 점착 능력을 상업적 균주 Lp 299v의 것과 비교했다.
점액을 PBS pH 7.4 젤라틴 0.01% 및 프로테아제 억제제(Complete®, Sigma)로 장을 세정함으로써 얻었다. 점막을 스크랩해서 완충제 10 mM HEPES-Hank's 솔트 pH7.4 및 동일한 억제제로 수용주에 침전(deposite)시켰다. 그런 후에 점액을 동일한 완충제로 10분 동안 13000rpm에서 원심분리에 의해 세정했다. 상청액을 회수하고 점액 내용물을 Bradford 프로토콜에 의해 평가했다.
트리튬-라벨링된 배양물이 다음과 같이 제조되었다. 미생물의 각각의 무균 배양물의 150㎕를 트리튬-라벨링된 티미딘(MRS의 3ml에서 5㎕)으로 보충된 MRS 배지에 놓고 30℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 준비된 것들을 원심분리하고 펠릿을 108cfu/ml의 농도로 PBS 완충제에서 재현탁했다. 미생물에 병합된 트리튬 신호를 최초 트리튬 신호(배지에 첨가된 트리튬-라벨링된 티민의 ㎕) 및 상청액 신호로부터 계산했다. 이 수(바이오매스에 병합된 신호)와 배양물에서 미생물의 총 수 사이의 비율이 dpm/cfu(신호/박테리아)를 초래한다.
점착력 분석 전 24시간, 점액 용액 0.5mg/ml의 1ml를 ELISA 플레이트의 웰에서 배양시켰다. 세정 후에, 1×108 cfu/ml 트리튬-라벨링된 미생물 조제용 물질을 웰에 첨가하고 37℃에서 60분 동안 배양시켰다. 각각의 웰의 상청액을 제거하고, 웰을 MEM Alpha 배지(Gibco)로 세정하고 웰로부터 점액-미생물을 릴리스하도록 스크랩했다. 균주의 점착력을 웰에서의 점액-미생물 조제용 물질의 신틸레이션 리더(Wallac 1410)에서 트리튬 신호를 카운팅하고 위에서 얻어진 바와 같이 dpm/cfu로 나눔으로써 계산한다. 결과는 점액 영역의 단위 당 점착된 박테리아의 수이다. 각각, 균주 F2099, F3147 및 F3276의 6.80×105cfu, 6.58×106cfu 및 7.31×106cfu가 장내 점액의 2cm2에 결합할 수 있다. Lp 299v 상업적 균주와 비교할 때, 본 발명의 균주는 훨씬 더 양호한 점착 능력을 가진다.
4.2.
Caco
-2 세포에의 점착력
Caco-2 ECACC N0: 86010202 세포를 미국 표준균주 배양 수록보존소(ATCC)로부터 얻었다. Caco-2 세포 영역의 단위 당 점착하는 박테리아의 수를 얻기 위한 실험 절차는 점액에의 점착력에 대해 위에서 설명된 바와 특히 동일하다. 결과는 각각 균주 F2099, F3147 및 F3276의 3.12×106cfu, 2.11×106cfu 및 5.19×105cfu가 caco-2 세포의 2cm2에 결합할 수 있음을 보여줄 수 있다. 다시 말해서, 상업적 균주 Lp 299v와 비교될 때, 본 발명의 균주는 더 양호한 점착 능력을 가진다.
5. 유독성 분석
F2099, F3147 및 F3276 균주의 미리-고정된 혼합된 배양물(이렇게 혼합된 배양물은 이제부터 AB-LIFE로 불릴 것이다)이 1011cfu/kg의 총 투여량으로 이틀 연속으로 여섯 마리의 9 주된 Wistar 쥐(수컷 및 암컷)에 PBS에서 5×1010cfu/kg로 투여되었다. 동물에게 임의로 사료(Teklacd 2014)와 물을 먹였다. 동물을 만복으로 먹인 후에 오로-가스트릭(oro-gastric) 튜브의 도움을 받게 했다. 동일한 사육 방법을 6마리의 대조 쥐에 적용했고, PBS만 투여했다. 이틀마다, 동물 웰빙을 무게, 행동 및 자극에 대한 반응과 같은 파라미터에 대한 값을 할당함으로써 결정했다. 각각의 파라미터에서 얻어진 값의 합을 총점으로 했다: 무게+행동+자극에 대한 반응. 전체적으로, 동물 웰-빙에 대한 어떠한 부정적인 영향도 연구 동안 발견되지 않았다.
동물을 CO2 흡입에 의해 7일째 되는 날에 희생시켰다. 전체적 부검을 육안으로 보이는 기관 손상을 발견하기 위해 실시했다. 박테리아 전위에 대해 분석하기 위해 장간막 림프 절 및 간의 샘플을 취했다. 각각의 샘플 5mg을 1ml 0.01% 젤라틴 PBS에서 균질화시켰다. 이 균질액 100㎕을 McConkey 플레이트 또는 MRS 플레이트 중 하나에 플레이트했다. 콜로니를 48시간 동안 37℃에서 배양 후에 카운팅했다. 결과를 표 9 및 표 10에 나타내었다. LAB의 정상 기저 전위에 대응하는 AB-LIFE-사육 동물들 및 대조 동물들로부터 MRS 플레이트에서 관찰되는 몇몇 LAB 콜로니가 있었다(J.S. Zhou 등, "Acute oral toxicity and bacterial translation studies on potentially probiotic strains of lactic acid bacteria", Food Chem Toxicol 2000, vol. 38, p. 153-61).
결론적으로, 결과는 AB-LIFE 배양물의 경구 투여가 LAB의 전위에서 증가를 유도하지도 않고 장내 세균의 전위를 용이하게도 하지 않기 때문에 안전하다는 것을 나타낸다. 모든 동물은 연구에 따른 유사한 체중 증가를 보였다. 어떠한 중요한 차이도 사료와 물 소비에서 관찰되지 않았다. 임상적 증상이나 동물의 웰빙의 변화 역시 발견되지 않았다. 어떠한 기관에서도 육안으로 보이는 손상 및 캐비티가 병리조직학적 시험 동안 관찰되지 않았다.
6. 길항 특징
균주 F2099, F3147 및 F3276이 길항적 활성을 나타냈는지 여부를 평가하기 위해서, Campbell 프로토콜을 Oxoid 배지에서 박테리아 병원균으로 접종된 아가 플레이트를 사용하여 수행했다. 본 연구에 사용된 병원균은 인간의 위장관에 공통으로 존재하는 것들 가운데 선택했다(표 11 참조). 플레이트들을 균일하게 표본화하고 5% CO2 배양기에서 적합한 온도로 융합 성장시켰다. 그런 후에, 균일하게 접종된 융합 F2099, F3147 또는 F3276 아가 플레이트의 실린더 섹션을 병원균 플레이트 위에 론-투-론 위치시키고 37℃에서 밤새 배양시켰다.
다음 날, 억제 부분을 플랫 룰 위에 아가 플레이트를 위치시켜 측정하였다. 그런 후에 성장 억제 활성을 식 GI=(IZD-CD)/2에 따라 억제 부분 직경(IZD)에서 실린더 직경(CD)을 감산하고 2로 이 차이를 나눔으로써 계산했다. 본 발명의 균주의 억제 능력을 상업적 균주 Lp299v 및 Lp VSL#3의 것과 비교했다.
F2099, F3147 및 F3276 균주는 표 11에 나타난 병원 균주 대부분의 성장을 억제시켰다. 따라서, 그들은 병원 균주의 성장을 억제시키는 능력 때문에 장내 마이크로바이오타 균형에 유익하다. 본 발명의 균주는 상업적 대조 균주와 비교할 때 일반적으로 더 양호한 길항 특징을 가졌다.
7. 장내 점막 모델에서
사이토킨
생성의 면역조절 능력의 인 비트로 평가.
선택된 점막 모델은 LPS와 같은 박테리아 성분에 대한 감수성 때문에 그리고 항-염증성 사이토킨 패턴의 생성 유도에 적합한 배지에 분자들이 있을 때 사이토킨 생성을 조절하는 감수성 때문에 단핵백혈구 세포 라인 THP-1이다.
ATCC로부터 얻어진 THP-1 세포를 106 단핵백혈구/웰의 최종 농도로 24-웰 ELISA 플레이트 내의 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포를 박테리아 균주를 첨가하기 전에 2.5시간 동안 10ng/ml LPS로 자극시켰다. F2099, F3147, F3276 및 Lp 299v 균주를 5% CO2 분위기에서 37℃의 MRS 배지에서 밤새 미리 배양시켰다. 배양 후에, 미생물 농도를 노이바우어-카운팅(Neubauer-counting) 챔버를 사용하여 계산하고 THP-1 세포로 ELISA-웰 내의 DMEM 500㎕에서 최종 비율 25:1 (2.5×107)cfu/단핵백혈구를 얻도록 적합하게 희석시켰다. 각각의 희석액을 젠타마이신(50㎍/ml), 암피실린(10㎍/ml) 및 클로란페니콜(12㎍/ml)로 보충된 DMEM 배지로 만들었다.
L. 플란타룸 균주와 THP-1 세포의 공동-배양은 24시간이었고, 6시간 때 그리고 실험의 끝에서 또 다른 분석 동안 부분 표본을 취했다. 부분 표본을 원심분리시키고 상청액을 제조자의 지시에 따라서 상업적 키트 휴먼 솔루블 프로테인 마스터 버퍼(BD Cytometric Bead Array)를 사용하여 유동 세포분석법에 의해 TNF-α 및 IL-10에 대해 분석했다.
얻어진 결과의 해석을 위해, 6시간과 24시간에서 얻어진 값 사이의 경사도를 얻고 정규화했다. 정규화된 경사도를 제조자에 의해 제공되는 다음의 식으로 계산했다:
NS=((1-IL value 24h/IL value 6h)/24)×100;
여기서 NS는 정규화된 경사도이고, IL(또는 TNF-α) 값은 6시간 또는 24시간에서 IL-10 또는 TNF-α의 농도이다. 결과를 pg/ml로 표현했다.
이 방법을 선택한 이유는 사이토킨 농도의 전개가 그들의 절대 값(pg/ml)보다 더 흥미롭기 때문에, 실험(표 12) 사이의 횡 비교를 허용하는 표준 값을 얻기 위해서이다. 6시간에서 얻어진 값에서, THP-1 세포는 여전히 LPS의 유도 하에 있고; 이후에, TNF-α의 농도가 상승되고 IL-10이 저감된다. 24시간에서 사이토킨 생성 프로파일의 반전을 관찰하는 것이 가능하다(TNF-α의 저감 및 IL-10의 증가).
표 12에 나타나는 바와 같이, LPS-유도된 THP-1 세포는 L. 플란타룸 균주의 존재 하에서 IL-10의 생성을 유도하고, IL-10 유도는 균주 F3276의 존재 하에서 특히 높다. 부가적으로, F2099, F3147 및 F3276은 상업적 Lp 299v와 비교될 때 염증성 TNF-α 생성에 대해 더 높은 억제 활성을 가진다.
8. 단쇄지방산 생성
프로피온산 및 부티르산 생성을 분석하기 위해서, 본 발명의 균주들 및 대조 균주들을 다음의 화이버: 이눌린(SIGMA 12255), 펙틴(SIGMA 76282) 및 프락토올리고당(FOS)(SIGMA F8052)의 각각의 1% w/v로 보충된 기저 배지 상에 성장시켰고, 위의 화이버들은 매일의 식사에 흔히 존재하는 화이버이다. 기저 배지의 조성물이 표 13에 보여질 수 있다. 배지를 혐기성 분위기 하에서 12시간 동안 미리 배양시켰다. 각각의 Lp 균주로 접종 후에, 배지를 혐기성 조건 하에서 37℃에서 밤새 배양시켰다. 그런 후에 밤새 배양된 것을 원심분리하고 상청액을 빠르게 액체 질소 냉각시키고 이어서 Tracer Extasil ODS2(3㎛, 15×0.4cm) 역 위상 칼럼을 사용하여 Agilent 1100 크로마토그래프에서 HPLC 분석을 했다. 표본에서 프로피온산 및 부티르산 농도에 대한 결과가 표 14에 보여질 수 있다.
위의 결과로부터 본 발명의 균주가 다량의 프로피온산 및 부티르산을 생성하고, 따라서 숙주 기관에 유익한 효과를 미친다고 결론지어질 수 있다.
9. 인 비보
저콜레스테롤혈증
활성
고콜레스테롤혈증 환자에서 본 발명의 프로바이오틱 조성물의 콜레스테롤-저하 효과가 무작위 추출된, 이중-맹검의, 평행 임상 시험으로 조사되었다. 본 연구는 프로바이오틱 조성물의 내성 및 그것의 감각수용적 특징은 물론, 또 다른 심장혈관-관련된 파라미터를 추가적으로 심사숙고했다.
18세와 65세 사이의 60명의 고콜레스테롤혈증 환자가 본 연구에 참여했다. 참가자의 체질량 지수(BMI)는 19Kg/m2와 30Kg/m2 사이, 총 혈청 콜레스테롤(총-C)은 200mg/dl과 300mg/dl 사이 그리고 저밀도 콜레스테롤(LDL-C)은, LDL-C가 100mg/dl과 190mg/dl 사이에 포함되는 두개 이상의 심장혈관계 위험 인자가 존재하는 피시험자를 제외하고, 130mg/dl과 190mg/dl 사이에 있었다. 참가자 중 누구도 연구를 진행하는 4주 동안 임의 종류의 저콜레스테롤혈증 치료를 받지 않았다. 350mg/dl보다 높은 고콜레스테롤혈증을 갖는 또는 본 연구의 시작까지 6개월 내에 심혈관 이스케믹 에피소드(cardiovascular isquemic episode)를 겪고 있는 피시험자는 제외되었다. 임산부 또는 수유중인 여성 및 조성물의 성분 중 어느 하나에 알레르기가 있는 피시험자 역시 제외되었다. 남성과 여성 참가자 사이의 차이는 20%보다 높지 않았다. 모든 참가자는 참여를 위해 서면으로 고지에 입각한 동의서를 제공했고 연구 프로토콜은 독립적인 윤리 위원회에 의해 검토되고 승인되었다.
12주 동안 참가자는 대조 조성물(플라세보) 또는 본 발명 F2099, F3147 및 F3276의 세 개의 균주의 동일한 비율의 혼합된 배양물의 1.2*109cfu를 포함하는 프로바이오틱 조성물(AB-LIFE2) 중 하나의 단독 경구 일일 투여량을 받았다. 플라세보 및 AB-LIFE 조성물의 제형이 표 15에 보여질 수 있다. 두 조성물 모두 식물성 젤라틴 캡슐의 형태로 투여했다. 피험자의 LDL-C, 총-C, LDL/HDL, LDL-산화, 트리글리세리드, 동맥 텐션, 기저 혈당증, 체중, 허리/엉덩이 인덱스, 체지방 및 웰빙을 연구를 통해 모니터했다. 또한 조성물의 감각수용 특징 및 내성을 평가했다. AB-LIFE2 프로바이오틱 그룹과 플라세보 그룹 모두에 대해 측정된 값을 SPSS 프로그램을 사용하여 통계적으로 분석했다.
임상 시험의 결과가 표 16 및 표 17에 나타난다. 플라세보 그룹과 프로바이오틱 그룹 모두를 위한 치료 전과 후의 총-C, LDL-C 및 LDL-산화에 대한 평균 값과 표준 편차가 표 16에서 관찰될 수 있다. 저감율(percentage of reduction) 및 인트라-그룹 통계 분석이 표 17에 나타난다. 그러므로 AB-LIFE 2가 효과적인 저콜레스테롤혈증제라고 결론지어진다. 게다가 식물성 스테롤과 같은 유사한 인디케이션의 제품과 비교될 때, AB-LIFE 2에 의해 가해지는 총-C 저감이 더 높다(Plana N. 등, "Plant sterol-enriched fermented milk enhances the attainment of LDL-cholesterol goal in hypercolesterolemic subjects", Eur J Nutr., 2008, vol. 47, p.32-39).
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- 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 이루어진 군으로부터 선택된 균주 중 적어도 하나의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물.
- 제 1항에 있어서,
락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529 균주의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물. - 제 1항 또는 제 2항에 따른 프로바이오틱 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장혈관계 질환 예방 치료제.
- 제 1항 또는 제 2항에 따른 프로바이오틱 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 저콜레스테롤혈증제.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
균주와 조합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물. - 삭제
- 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께, 제 1항 또는 제 2항에 따른 프로바이오틱 조성물의 유효량을 포함하여, 심장혈관계 질환 예방 치료 또는 저콜레스테롤혈증제로 사용하기 위한 약학적 제품.
- 수의학적으로 허용가능한 첨가제와 함께, 제 1항 또는 제 2항에 따른 조성물의 유효량을 포함하여, 심장혈관계 질환 예방 치료 또는 저콜레스테롤혈증제로 사용하기 위한 수의학적 제품.
- 다른 식용 성분과 함께, 제 1항 또는 제 2항에 따는 조성물의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장혈관계 질환 예방 치료 또는 저콜레스테롤혈증제로 사용하기 위한 식품.
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유제품 또는 육류제품인 것을 특징으로 하는 식품. - 삭제
- 락토바실러스 플란타룸 CECT 7527, 락토바실러스 플란타룸 CECT 7528 및 락토바실러스 플란타룸 CECT 7529로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸의 균주.
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