KR101873978B1

KR101873978B1 - 표고버섯 수확 후의 배지 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101873978B1
Application number: KR1020160158346A
Authority: KR
Inventors: 강희완; 곽아민
Original assignee: 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2018-07-04
Also published as: KR20180059622A

Abstract

본 발명은 표고버섯(Lentinula edodes)을 재배한 후의 배지에서 추출한 추출물의 농축액을 유효성분으로 포함하고, 옥살산(oxalic acid)을 포함하는 식물병에 대한 예방용 또는 방제용으로 사용되는, 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명은 표고버섯을 생산하고 남는 수확 후 배지로부터 조성물을 추출하고, 이를 농축함으로써 옥살산 함량을 증가시켜 항균성을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 별도의 공정시설 없이 간소한 공정으로 방제용 조성물을 제조할 수 있고, 원료에 대한 비용지출이 거의 없고, 농가로부터 쉽게 원료를 조달할 수 있어 생산비를 절감할 수 있으며, 인체에 무해한 친환경 유기 농자재로 활용할 수 있다.

Description

표고버섯 수확 후의 배지 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 그의 제조방법{COMPOSITION FOR PREVENTING PLANT PATHOGENS COMPRISING EXTRACT FROM SPENT SUBSTRATE OF Lentinula edodes AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 표고버섯 수확 후의 배지 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 표고버섯(Lentinula edodes)을 재배한 후의 배지에서 추출한 추출물의 농축액으로 포함하고, 옥살산을 포함하는 식물병에 효과적인 식물병 방제용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

식물병을 일으키는 병원균으로 곰팡이, 세균, 바이러스가 있으며, 그 중 곰팡이, 세균 식물병이 80%이상을 차지한다. 방제방법으로는 대부분 농약을 이용한 화학적 방법에 의존하고 있으며 약제내성과 환경오염의 우려로 효과적인 친환경방법이 요구되고 있다. 친환경적인 방법으로는 길항성 미생물을 이용한 미생물농약과 식물유래 천연물질을 이용한 방제제 개발이 이루어지고 있다. 담자균 204 종 317 균주를 이용하여 세균에 대한 항균효과를 탐색하여 109종이 세균과 곰팡이의 성장을 저해하는 항균활성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 담자균의 자실체 균사체 유래 항균물질이 분리 동정된 바 있으나 인체관련 병원균 연구가 대부분이다. 최근 중국의 Chen 등은 식용버섯 유래 배양 여액이 세균 식물병원 곰팡이와 식물병원세균 성장억제 병 방제에 적용되어 농업적 활용을 모색한 바 있다. 그러나 균사체 배양 여액을 포장에 적용을 위해서는 대량 균 배양 및 추출 시스템 등 부수적인 공정비용이 요구되어 경제적 효율이 저하되는 문제점이 발생할 수 있다.

그 대안으로 식용버섯 수확 후 배지(spent mushroom substrate, SMS)이용이 고려될 수 있다. SMS조성은 밀집한 균사체가 존재하고 다양한 목질분해효소와 2차대사물질 등 매우 다양한 생리활성 물질이 포함되어 있을 것으로 추정된다. SMS는 고체배양 형태로 배양과정 없이 간단한 추출액 첨가과정만으로 유효성분을 분리할 수 있으며 저 비용으로 고부가가치의 유용자원으로 전환 가능하다.

표고버섯은 항암, 면역활성, 항산화기능을 가지며 자실체와 균사체로부터 lenthionine 등의 항균활성 물질이 유용된 바 있다. 우리나라의 표고재배는 원목재배에서 톱밥봉지재배로 급격히 전환되고 있으며 현재 약 50%이상이 톱밥봉지재배로 년간 37,000톤의 표고버섯을 생산하고 있어 표고버섯 수확 후 배지 처리가 문제점으로 부각되고 있다.

고추에 발생되는 고추역병은 파이소프소라 캡사이시(Phythopthora capsici)에 의하여 원인이 되며 고추에 가장 큰 피해를 주는 고질적인 병이다. 유사한 토양전염성 병으로 식물병원세균인 랄스토니아 소라나세룸(Ralstonia solanacearum)에 원인이 되는 토마토 풋마름병이 있다. 이들 식물병원균은 토양에 존재하면서 병을 일으키고 화학농약을 토양에 직접살포 하게 되면 지하수 등 환경오염에 큰 문제가 될 수 있고 한번 발생되면 방제가 매우 힘든 식물병으로 이를 예방 또는 방제할 수 있는 친환경적인 방제제의 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허공보 제10-2013-0134351호 한국공개특허공보 제10-2015-0055650호

본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로, 표고버섯을 생산하고 남는 수확 후 배지로부터 고추역병 등의 곰팡이의 일종인 파이소프소라 캡사이시 유래의 식물병, 또는 토마토 풋마름병 등의 랄스토니아 소라나세룸 유래의 세균성 식물병에 대한 방제와 식물의 생장을 촉진시키는 조성물을 추출함으로써 별도의 공정시설 없이 간소한 공정으로 방제용 조성물을 대량생산 하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 목적은 표고 수확 후 남은 배지를 추출한 추출물을 농축하여 제조함으로써 옥살산의 함량을 높여 식물병에 대한 항균성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 목적은 표고 수확 후 남은 배지를 원료로 사용하여 원료에 대한 비용지출이 거의 없고, 농가로부터 쉽게 원료를 조달할 수 있어 식물 역병의 방제용 조성물의 생산비를 절감하도록 하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 또 하나의 목적은 식용버섯의 부산물을 원료로 식물 역병의 방제용 조성물을 제조함으로써 인체에 무해한 친환경 유기 농자재로 활용하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

옥살산(oxalic acid)을 포함하는 표고버섯(Lentinula edodes)을 재배한 후의 배지에서 추출한 추출물의 농축액을 유효성분으로 포함하고 식물병에 대한 예방용 또는 방제용으로 사용되는, 식물병 방제용 조성물이 제공된다.

상기 추출물은 열수 추출에 의한 추출물일 수 있다.

상기 추출물의 농축액에 포함된 옥살산 함량은 0.6 내지 2.0mg/㎖일 수 있다.

상기 식물병은 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 또는 랄스토니아 소라나세룸(Ralstonia solanacearum)유래의 식물병일 수 있다.

상기 파이토프소라 캡사이시 유래의 식물병 또는 상기 랄스토니아 소라나세룸 유래의 식물병은 가지과(Solanaceae) 식물, 박과(Cucurbitaceae) 식물 및 콩과(Fabaceae) 식물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 대한 식물병일 수 있다.

상기 파이토프소라 캡사이시 유래의 식물병은 고추역병이고, 상기 랄스토니아 소라나세룸 유래의 식물병은 토마토 풋마름병일 수 있다.

상기 식물병 방제용 조성물은 방부제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방부제는 소르빈산칼륨(Potassium Sorbate), 소르빈산(Sorbic Acid), 프로필갈레이트(Propyl Gallate), 뷰틸레이트하이드록시톨루엔(Butylated Hydroxy Toluene) 및 뷰틸하이드록시아니솔(Butylated Hydroxy Anisole)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

a) 표고버섯을 재배한 후 남은 배지를 준비하는 단계; b) 상기 배지를 파쇄하여 파쇄된 배지를 제조하는 단계; c) 상기 파쇄된 배지를 열수 추출하여 옥살산(oxalic acid)을 포함하는 열수 추출물을 제조하는 단계; 및 d) 상기 열수 추출물을 농축하여 상기 열수 추출물 보다 옥살산의 함량이 증가된 농축액을 제조하는 단계;를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 농축액은 상기 열수 추출물을 15 내지 25배로 농축하여 제조할 수 있다.

단계 d) 이후, e) 상기 농축액에 방부제를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

단계 c)는 열수 추출기에 상기 파쇄된 배지를 투입하고 물을 첨가하여 70 내지 90℃에서 1 내지 3시간 동안 열수 추출하여 열수 추출물을 제조할 수 있다.

단계 c)의 열수 추출물은 옥살산 함량이 0.3 내지 0.7mg/㎖ 일 수 있다.

단계 c)에서 파쇄된 배지와 물의 중량비는 1:5 내지 1:10 일 수 있다.

상기 표고버섯을 재배한 후 남은 배지는 고체배지(solid state fermentation)에서 표고버섯을 재배한 후 남은 배지일 수 있다.

상기 고체배지는 톱밥 및 영양원을 포함하고, 상기 영양원은 미강, 밀기울, 비트펄프, 콘코브, 면실박, 면실피 및 케이폭박 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 표고버섯을 재배한 후 남은 배지는 상기 고체배지에서 표고버섯을 4회 내지 8회 채취한 후 남은 배지일 수 있다.

본 발명은 표고버섯을 생산하고 남는 수확 후 배지로부터, 표고버섯을 생산하고 남는 수확 후 배지로부터 고추역병 등의 곰팡이의 일종인 파이소프소라 캡사이시 유래의 식물병, 또는 토마토 풋마름병 등의 랄스토니아 소라나세룸 유래의 세균성 식물병에 대한 방제와 식물의 생장을 촉진시키는 조성물을 추출하여 농축함으로써 별도의 공정시설 없이 간소한 공정으로 방제용 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 표고버섯(Lentinula edodes)을 재배한 후의 배지에서 추출한 추출물을 농축하여 제조함으로써 옥살산의 함량을 높여 식물병에 대한 항균성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 표고 수확 후 남은 배지를 원료로 사용하여 원료에 대한 비용지출이 거의 없고, 농가로부터 쉽게 원료를 조달할 수 있어 식물 역병의 방제용 조성물의 생산비를 절감할 수 있다.

또한, 본 발명은 식용버섯의 부산물을 원료로 식물 역병의 방제용 조성물을 제조함으로써 인체에 무해한 친환경 유기 농자재로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 식물 역병 방제용 조성물의 제조방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 식물 역병 방제용 조성물의 제조방법을 나타낸 공정도이다.
도 3은 시험예 1에 따른 분석결과로서 고추역병균 균사체 성장 억제 효과를 배양일수에 따른 성장곡선으로 나타낸 것이다.
도 4는 시험예 1에 따른 분석결과를 사진으로 나타낸 것이다.
도 5는 시험예 1에 따른 토마토 풋마름병균의 항균활성 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 시험예 3에 따른 고추역병균 접종원의 최초 접종일로부터 7일 경과시까지 병 발생 정도를 나타낸 결과이다.
도 7은 시험예 3에 따른 실시예 1의 조성물 처리구와 물 처리구의 고추역병균 접종 후 6일이 된 시점에서 촬영한 사진이다.
도 8은 시험예 3에 따라 토마토 풋마름병균을 처리한 후 10일 된 시점에서 촬영한 사진이다.
도 9 내지 도 11은 시험예 4에 따른 표고버섯 수확 후 배지의 유기산 분석결과를 나타낸 것이다.
도 12는 시험예 4에 따른 실시예 1의 추출물과 비교예 1의 추출물 내의 옥살산 함량을 나타낸 것이다.
도 13은 시험예 5에 따른 고추역병에 대한 항균 활성 정도를 조사한 결과이다.
도 14는 시험예 5에 따른 고추역병에 대한 항균 활성 정도를 조사한 사진에 의한 결과이다.
도 15는 시험예 5에 따른 토마토 풋마름병에 대한 항균 활성 정도를 조사한 결과이다.
도 16은 식물병 저항성 유도 매커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 17은 시험예 6에 따른 고추역병 저항성 유전자 관련 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 하며, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

이하, 본 발명의 식물병 방제용 조성물에 대해 설명하도록 한다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 옥살산(oxalic acid)을 포함하는 표고버섯(Lentinula edodes)을 재배한 후의 배지에서 추출한 추출물의 농축액을 유효성분으로 포함하고, 식물병에 대한 예방용 또는 방제용으로 사용될 수 있다.

상기 추출물은 열수 추출에 의한 추출물인 것이 바람직하다.

추출물을 농축시킴으로써 옥살산의 함량을 높여 식물병의 항균성을 향상시킬 수 있다.

상기 파이토프소라 캡사이시 유래의 식물병 또는 상기 랄스토니아 소라나세룸 유래의 식물병은 가지과(Solanaceae) 식물, 박과(Cucurbitaceae) 식물, 콩과(Fabaceae) 식물 등에 대한 역병일 수 있으나, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 주로 고추역병에 대해 더욱 효과적이다.

상기 파이토프소라 캡사이시 유래의 식물병은 고추역병이고, 상기 랄스토니아 소라나세룸 유래의 식물병은 토마토 풋마름병 일 수 있다.

상기 방부제는 친환경적인 방부제인 것이 바람직하고, 통상적으로 식품 첨가물로 사용될 수 있는 방부제를 적용하는 것이 더욱 바람직하다.

구체적인 예로서, 상기 방부제는 소르빈산칼륨(Potassium Sorbate), 소르빈산(Sorbic Acid), 프로필갈레이트(Propyl Gallate), 뷰틸레이트하이드록시톨루엔(Butylated Hydroxy Toluene), 뷰틸하이드록시아니솔(Butylated Hydroxy Anisole) 등일 수 있다.

도 1은 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 제조방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다. 도 1을 참조하여 식물병 방제용 조성물의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.

먼저, 표고버섯을 재배한 후 남은 배지를 준비한다(단계 a).

상기 표고버섯을 재배한 후 남은 배지는 고체배지(solid state fermentation)에서 표고버섯을 재배한 후 남은 배지인 것이 바람직하다.

상기 고체배지는 톱밥 및 영양원을 포함하고, 상기 영양원은 미강, 밀기울, 비트펄프, 콘코브, 면실박, 면실피, 케이폭박 등을 포함할 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않는다.

상기 표고버섯을 재배한 후 남은 배지는 상기 고체배지에서 표고버섯을 4회 내지 8회 채취한 후 남은 배지일 수 있다. 더욱 바람직하게는 4회 내지 6회 채취 후 남은 배지를 사용할 수 있다.

예를 들어, 약 1kg의 톱밥 배지의 경우, 배양기간 80 내지 100일에 버섯발생 및 채취회수 3회(90일)로 하면, 1대 재배기간은 170 내지 190일이 소요된다. 따라서 표고버섯 톱밥배지는 균사체가 성장하는 영양세대와 자실체가 생산되는 생식세대 동안에 자일나아제(xylanase), 셀룰라아제(cellulase), 리그니나아제(ligninase) 등 목질분해효소를 다량 분비하여 톱밥의 주성분인 목질섬유소를 수용성 저분자량의 당으로 분해하여 균사체의 영양 흡수과정을 거처 생체 내에서 생명 유지에 필요한 에너지원으로 이용할 수 있다.

따라서, 식용버섯인 표고버섯 유래 항균활성 유효성분 추출과 병 방제의 이용은 인체유해성을 사전에 차단하고 친환경 식물병 방제소재로 매우 유용성이 높다고 하겠다. 표고버섯 재배 후 남은 배지는 고체배지의 특성을 보유하면서, 배지내에 높은 활성의 항균활성 유효성분 등 다양한 대사물질이 잔존할 수 있다.

다음으로, 상기 배지를 파쇄하여 파쇄된 배지를 제조한다(단계 b).

상기 파쇄는 파쇄기를 통해 잘게 파쇄하며 부직포 등에 충전하여 원료를 준비한다.

이후, 상기 파쇄된 배지를 열수 추출하여 옥살산( oxalic acid )을 포함하는 열수 추출물을 제조한다(단계 c).

상기 열수 추출은 도시된 바와 같이 통상적으로 열수 수출에 사용되는 열수 추출기를 사용할 수 있다. 이와 같은 대용량 열수 추출기를 사용함으로써 단시간 동안 대량의 조성물을 제조할 수 있는 이점이 있다.

상기 열수 추출기의 추출용기에 상기 파쇄된 배지를 투입하고, 물을 첨가하여 70 내지 90℃에서 1 내지 3시간 동안 열수 추출하여 열수 추출물을 제조하는 것이 바람직하다.

이때, 파쇄된 배지와 물의 중량비는 물의 중량비는 1:5 내지 1:10으로 하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1:8 내지 1:10으로 할 수 있다.

다음으로, 상기 열수 추출물을 농축하여 상기 열수 추출물 보다 옥살산의 함량이 증가된 농축액을 제조한다(단계 d).

상기 농축액은 상기 열수 추출물을 15 내지 25배로 농축하여 제조하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 18 내지 20배로 농축할 수 있다.

이에 따라, 옥살산의 함량을 증가시킴으로써 식물병에 대한 항균성을 극대화할 수 있으며, 농축액의 옥살산 최종함량은 상기 열수 추출물에서의 함량에 비해 2배 이상 증가시켜 0.6 내지 2.0mg/㎖가 되도록 하는 것이 바람직하다.

농축액으로 제조하는 것은 보관상 부피를 줄일 수 있고, 사용시 적절한 농도로 희석하여 사용할 수 있다.

마지막으로, 상기 농축액에 방부제를 첨가한다(단계 e).

상기 방부제의 종류는 상술한 식물병 방제용 조성물에서 설명한 바와 동일하므로 구체적인 내용은 그 부분을 참조하기로 한다.

[실시예]

실시예 1

도 2는 본 발명의 실시예 1의 공정을 나타낸 공정도이다. 도 2를 참조하여 이하 실시예 1에 대해 설명하도록 한다.

수목톱밥 80%와 미강 20%로 이루어진 배지를 준비하고, 상기 배지를 2시간 이상 고압살균하고 냉각한 후, 종균을 접종하는 단계와 60일 이상의 균사생장 영양생식단계 및 배지 갈변화 단계, 및 마지막으로 표고버섯 자실체 형성 생육 단계를 거쳐 전체적으로 약 90일 동안 재배하여 수확하였으며, 4회 내지 8회 이와 같이 수확하고 남은 배지를 준비하였다.

이와 같이 준비된 표고버섯 수확 후 배지 50kg을 파쇄기에서 잘게 파쇄하여 파쇄된 배지를 제조하고 부직포에 충전하였다. 이후, 도시된 바와 같은 대용량 열수 추출기 내의 추출용기에 파쇄된 배지를 넣고 450L의 물을 첨가하고, 80?에서 2시간 동안 열수 추출하여 열수 추출물을 제조하였다. 다음으로, 열수 추출물을 20배로 농축하여 50L의 액상 제형인 식물병 방제용 조성물 농축액을 제조하였다. 최종적으로, 제조된 식물병 방제용 조성물에 유기농 자재로 사용되는 방부제 0.2%의 솔빈산칼륨을 첨가하여 부패가 방지되도록 하였다.

비교예 1

표고버섯 재배 후 배지 대신에 표고버섯 원배지, 즉 표고버섯을 재배하지 않은 톱밥배지를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 조성물 농축액을 제조하였다.

[시험예]

시험예 1: 표고버섯 수확 후 배지 열수추출물의 항균 효과

실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 조성물 농축액을 각각 10배 희석하여 희석액을 준비하였다. 희석된 실시예 1 및 비교예 1의 각각의 조성물 100㎖에 감자즙 배지(PDA; potato dextrose agar) 분말을 3.9g 첨가하여 121℃에서 20분간 고압살균 하고 페트리디쉬에 분주하였다.

상기 페트리디쉬 중앙에 직경 5mm의 미리 성장한 균사체 절편을 접종한 후, 1일부터 7일까지 균사성장률을 조사하였다. 그 결과로서, 균사체 접종 후 경과일수에 따른 균사체 직경의 변화를 나타낸 그래프를 도 3에 나타내었고, 7일 경과 시점에서의 균사체가 성장된 모습을 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4에 따르면, 실시예 1의 조성물이 비교예 1의 조성물에 비하여 접종 초기부터 60% 이상 고추역병균의 균사체 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 7일이 경과되었을 때, 비교예 1의 조성물이 처리된 페트리디쉬에서 고추역병균의 균사체가 9cm 성장한 반면, 실시예 1의 조성물이 처리된 페트리디쉬에서는 직경 3.5cm로 균사체 성장이 62% 억제된 것을 확인할 수 있었다.

식물병원세균인 토마토 풋마름병균(랄스토니아 솔라나세럼)의 항균활성은 페이퍼 디스크(paper disk) 검정방법을 사용하였으며 그 결과를 도 5에 나타내었다. 구체적으로, 기본배지는 NA(nutrient agar) 배지로 하였으며 도말 배지로는 0.8%의 agar를 포함한 NB (Nutrient Broth)에 토마토 풋마름병균의 세포현탁액 2 X 10⁶을 첨가하여 NA배지에 도말하였다.

이후, 표고 수확 후 배지의 상온수 추출물(디스크 1), 표고 수확 후 배지의 70% 메틸알코올 추출물(디스크 2), 수확 후 배지의 열수 추출물(디스크 3), 원 배지의 열수 추출물(디스크 4)을 각각 50㎕씩 올려놓아 3일 후에 페이퍼 디스크 주변에 형성된 클리어 존(clear zone)의 크기로 항균활성 정도를 측정하였다. 이때, 디스크 1의 상기 상온수 추출물은 상온에서 물로 1시간 추출한 것이고, 디스크 3과 4의 열수 추출물은 80℃에서 1시간 동안 배지를 추출한 것이다.

도 5에 따르면, 원 배지의 열수 추출물(디스크 2번)과 수확 후 배지의 70% 메틸알코올 추출물 (디스크 3번)은 클리어 존이 거의 형성하지 않았으나, 수확 후 배지의 상온수 추출물(디스크 1번)과 수확 후 배지의 열수 추출물(디스크3번)에서는 20mm이상의 명확한 클리어 존을 형성하는 것으로 나타나 항균효과가 좋음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조성물은 곰팡이병균에 의한 고추역병과 세균병인 토마토 풋마름병균에서 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다.

시험예 2: 고추생육촉진효과 분석

고추종자를 원예상토가 들어 있는 40구공 포트에 파종하여 3주 동안 유묘로 성장시키고, 다시 포트(직경 10cm)에 들어 있는 원예상토에 이식하여 10배 희석한 실시예 1의 조성물, 비교예 1의 조성물 및 물 50㎖를 각각 관주하고 20일 후 초장, 엽장, 엽폭, 엽수, 및 지상부와 뿌리의 생체량을 측정하였다. 그 결과는 아래의 표 1에 나타내었다.

표 1에 따르면, 실시예 1의 조성물 처리구는 물 처리구에 비하여 초장 40%, 엽수 42%, 지상부생체량 70%, 뿌리생체량은 50%이상 증가 되었음을 확인할 수 있으며, 원배지인 비교예 처리구와 비교하여도 초장 24%, 엽수 14%, 지상부생체량 58%, 뿌리생체량 50%이상으로 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조성물은 고추역병의 방제뿐 아니라, 고추생육을 촉진하는 유용한 성분도 포함되어 있는 것으로 판단된다. 버섯배지에서 버섯균사체가 자일나아제(xylanase), 셀룰라아제(cellulase), 리그니나아제(ligninase)와 같은 목질분해 효소를 다량 분비되고, 목질 섬유소 분해산물인 당을 흡수하여 에너지원으로 이용하는 과정에서 재배 후 배지에는 다량의 분해산물이 잔존해 있을 것으로 판단되고, 아미노산, 질소 등 버섯균사체가 생산하는 다양한 영양원이 포함되어 있어 식물성장에 필요한 탄소원과 질소원으로 이용될 수 있다고 생각된다.

시험예 3: 고추역병과 토마토 풋마름병 방제효과 분석

고추식물체에 병을 발생시키기 위하여 유주자를 생산하여 고추식물체에 역병을 방생시키기 위한 접종원으로 사용하였다. 고추역병 유주자를 생산하기 위하여, 마켓에서 구입한 V8 주스 10%를 포함하고 Agar 2.0%를 포함하는 배지 상의 5개 지점에 작은 고추역병균 균사체 절편(5x5mm)을 동일한 거리에 접종하였다. 이를 24℃ 암 조건에서 5일 동안 배양하고 살균칼로 균사체를 절편(10X10mm)하고 10개의 균사체 절편을 페트리디쉬에 놓고, 살균수 20㎖를 첨가하여 형광 빛 조사 하에서 24℃의 온도로 3일간 배양하였다. 이때에 균사절단면에 발생한 유주자낭을 고배율(X400) 광학현미경(Zeiss Axio imager)으로 확인하였다. 유주자낭에 존재하는 유주자를 유출시키기 위해서 4? 냉장고에 60분간 넣었다가 상온에 30분간 두고 고배율(X400) 광학현미경에서 유주자 유출을 확인하고, 헤머사이토미터를 사용하여 10⁵㎖^-1의 유주자 밀도로 개체수를 조절하여 고추역병균의 접종원으로 사용하였다.

고추식물체는 고추역병에 대한 감수성 품종으로 알려진 “부광"을 사용하였으며, 파종 후 40일 성장시킨 고추유묘를 대상으로 하였다.

시험방법은 실시예 1의 방제용 조성물을 10배 희석한 희석액과 물을 고추유묘 포트에 각각 50㎖ 관주하고, 3일 후 고추역병균 접종원 1㎖를 고추식물체 뿌리 측면에 접종하여 고추역병의 발병을 관찰하는 방법으로 하였다.

고추역병균 접종원의 최초 접종일로부터 7일 경과시까지 병 발생 정도를 관찰하여 도 6에 나타내었다. 이때, 병 발생 정도는 1 내지 5의 상대적인 값(1: 5-10% 잎이 약간 시들기 시작함, 2: 20-30% 식물체가 시듦, 3: 40-50% 식물체가 시듦, 4: 60-70% 식물체가 시듦, 5: 식물체전체가 시들고 기저부에 회갈색으로 줄기가 썩음)으로 표시하였다.

방제율은 아래의 식 1로 산출하였다.

[식 1]

방제율(%)=100(1-x/y)

여기서, x는 처리구로 y는 비처리구임

도 6에 따르면, 고추역병균 접종 후 2일 후부터 물 처리구에서는 발병 정도가 2로 높게 나타났으며, 실시예 1의 조성물 처리구는 발병 정도가 0.35로 관찰되어 82% 이상의 방제율을 나타내었다. 시간이 경과함에 따라 실시예 1의 조성물 처리구에서도 역병이 진전되었으며, 접종 후 8일 후에는 물 처리구에 비하여 방제율이 50% 정도 감소되는 것으로 나타났다.

도 7은 실시예 1의 조성물 처리구와 물 처리구의 고추역병균 접종 후 6일이 된 시점에서 촬영한 사진이다. 도 7에 따르면, 물 처리구는 식물체 전체가 시드는 고추역병균의 고유 병징을 나타낸 것에 반해, 실시예 1의 조성물 처리구는 건강하게 성장하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 8은 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 것으로 토마토 풋마름병균을 처리하고 10일 된 시점에서 촬영한 사진이다. 도 8에 따르면 물 처리구는 토마토 식물체가 시들었으나 실시예 1의 조성물 처리구는 건강히 생존해 있는 것을 확인되었다.

시험예 4: 표고버섯 수확 후 배지에서 유기산 분석

표고버섯 균사체를 Potato Dextrose Broth (PDB) 액체배지 1000㎖에 접종하고 25℃에서 30일 동안 진탕배양한 후 추가적으로 20일 동안 정치배양 하였다. pH 측정기로 측정한 결과 pH 3.9로서 산성용액임을 알 수 있었고, 유기산 분석을 실시하여 그 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다.

유기산 분석을 위한 HPLC 분석조건은 Aminex HPX-87 column 4.6 (I. D.) x 300 mm, 유량(flow rate) 0.6 ㎖/min, 4 mM H₂SO₄, Detector UV 215 nm으로 하였다. 도 9에 따르면, 유기산 분석결과 피트산(phytic acid), 옥살산(oxalic acid), 말산(malic acid), 말론산(malonic acid), 락트산(lactic acid), 포름산(formic acid), 푸마르산(fumaric acid), 뷰티르산(butyric acid), 이소뷰티르산(isobutylic acid) 등 9종류의 유기산이 검출되었다.

또한, 옥살산을 정량하기 위하여 옥살산 표준품(Sigma사, 순도 99%)를 구매하여 옥살산의 다양한 농도별 (200, 500, 1000, 2000 ppm) 산출선을 만들고 HPLC로 측정된 피크 영역(peak area) 결과에 따라 작성된 산출선을 통해 옥살산의 상관계수(R²) 값을 확인하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 따르면, 직선성(R²>0.9982, 이 값은 99.82%의 정확성을 표시함)을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

또한, 표고 버섯 배양액(1L) 내에 함유된 옥살산의 농도를 도 11에 나타내었다. 도 11에 따르면, 표고 버섯 배양액(1L) 내에 함유된 옥살산의 농도는 708.711 ppm으로 나타났다. 또한, 아래의 식 1로 옥살산 함량을 계산한 결과 0.07%로 나타내었다. 즉 표고 버섯 배양액에 0.7 mg/㎖의 옥살산이 함유되어 있음을 알 수 있었다.

[식 1]

한편, 실시예 1의 조성물 농축액과 비교예 1의 조성물 농축액 내의 옥살산 함량을 비교한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 따르면, 실시예 1과 비교예 1에서 피트산(phytic acid) 함량은 겹쳤으나, 실시예 1에서는 옥살산을 나타내는 6.62 minute에서의 단일 피크가 검출되었으며 1.5mg/㎖로 균사체 배양 여액보다 옥살산이 2배 이상 증가되었음을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 농축에 의해 옥살산의 함량을 증가시켜 항균성을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 반면에 비교예 1에서는 옥살산이 검출되지 않았다.

시험예 5: 항균효과 분석

먼저, 실시예 1에 따라 제조된 조성물 농축액과 옥살산을 포함하는 PDA(Potato dextrose agar)배지의 고추역병에 대한 항균 활성 정도를 조사하여 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. 구체적으로, 고추역병의 균사체를 옥살산(시그마 사)이 최종 농도 0, 100, 150, 250, 300, 400ppm 포함되는 PDA(Potato dextrose agar)배지에 접종하고 7일 후에 고추역병의 균사 생장률을 조사하였다. 도 13 및 도 14에 따르면, 접종 후 7일 후에 고추역병의 균사 생장이 옥살산 처리 농도별로 22%에서 55%까지 억제되는 것을 확인할 수 있었으며 실시예 1에 따라 제조된 조성물 농축액은 70%까지 균사성장이 억제되어 고추역병에 대한 항균 활성이 현저히 높은 것으로 나타났다.

다음으로, 옥살산 농도에 따른 토마토 풋마름병에 대한 항균 활성 정도를 조사하여 그 결과를 도 15에 나타내었다. 구체적으로, 토마토 풋마름병균의 옥살산에 대한 억제효과조사를 위하여 Nutrient 액체배지 5㎖ 내에 옥살산을 최종농도 5000 ppm에서 100ppm까지 달리하여 최초로 토마토 풋마름병균 밀도를 5 X 10³ 로 하고 18시간 배양한 후 세균성장여부를 확인 한 결과 옥살산 250 내지 5000ppm이 포함된 경우는 세균생장 억제 효과가 있었으나 그보다 적은 함량이 포함된 경우에는 균이 대조구인 물 처리구와 유사하게 성장하여 항균효과가 나타나지 않았다.

시험예 6: 식물병 저항성 유도 효과 검정

식물병 저항성 유도 매커니즘을 도 16에 개략적으로 나타내었다. 도 16에 따르면, 병 저항성 유도체(elicitor)는 기주 세포 내의 수용체에 인식되고 살리실산(salicylic acid, SA)이나 재스몬산(jasmonic acid, JA)와 같은 병 저항성 유도 신호전달물질을 자극하여 병 저항성 유전자 발현을 유도할 수 있다. 유도저항성은 전신획득저항 (systemic acquired resistance, SAR)과 유발전신저항(induced systemic resistance, ISR)이 있으며, SAR은 SA 의존적으로 PR-1a, PR-4를 포함하는 pathogenesis-related(PR) 유전자의 발현을 유도하며 ISR은 재스몬산과 에틸렌(ET) 의존적인 신호전달체계로 식물 디펜신(plant defensin 1.2)과 같은 다른 PR 유전자를 유도하는 것으로 알려져 있다.

실시예 1의 조성물 농축액의 고추역병 저항성 반응과의 관련성을 조사하였다. 구체적으로, 고추역병 저항성 반응 조사는 실시예1의 조성물 50㎖를 고추 유묘에 처리하고 96시간 후에 total RNA를 분리하고, 하기 표 2의 고추역병 저항성 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 qRT-PCR 분석을 수행하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.

고추저항 유전자	프라이머 염기서열
CaPR1	F:5’-ACTTGCAATTATGATCCACC-3’ R:5’-ACTCCAGTTACTGCACCATT-3’
CaBGLU	F:5’-TAAAAGGGGAAGTCCAAGAAGG-3’ R:5’-TCAGCAAAAATGTCCAAAAATC-3’
CaPR4	F:5’-AACTGGGATTTGAGAACTGCCAGC-3’ R:5’-ATCCAAGGTACATATAGAGCTTCC-3’
CaPR10,	F:5’-ATGTTGAAGGTGATGGTGGTGCTG-3’ R:5’-TCCCTTAGAAGAACTGATACAACC-3’
CaActin	F:5’-TTGGACTCTGGTGATGGTGTG-3’ R:5’-AACATGGTTGAGCCACCACTG-3’

PCR 반응혼합 조성액(2 X SYBR Green 1 master mixtures (Roche), cDNA, qRT-PCR 프라이머 10 pmol)을 최종 20㎕로 하였다. 상기의 반응조성액을 LightCycler® 96 System (Roche, USA)에서 95℃, 15분, 58℃, 30초, 72℃, 30초로 PCR증폭 조건을 설정하여 실시하였으며 유전자발현정량은 Roche사에서 제공된 소프트웨어 프로그램에 의해서 결정되었다.

도 17에 따르면, 실시예 1 처리구(WESMS)는 물 처리구에 비하여 저항성유전자 CaPR1, CaPR4, CaBGU, CaPR10 가 4배에서 15배 이상의 발현량이 증가한 것으로 나타났다. CaPR1, CaPR4, CaPR10 저항성 유전자의 경우는 저항성 유전자 발현 유도체로 알려진 상용화된 DL-β-aminobutyric acid(BABA, 0.5%)보다 높게 저항성 유전자 발현을 유도하였다. 이는 실시예 1의 조성물이 병 저항성 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다.

CaPR1, CaPR4는 살리실산 의존적인 전신획득성 저항성을 나타내고, 이때 살리실산이 식물체에 축적할 수 있다. 따라서 실시예 1의 조성물을 처리하였을 때 고추 식물체 내에 살리실산 함량이 증가되는지 여부를 액체 크로마토그래프 질량분석기(LCMS8050)로 분석하여 확인하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

처리구	살리실산 함량(ng/㎖)
처리구	48시간	96시간	120시간
실시예 1	12.77 ±1.34	12.79 ±1.65	18.68 ±0.41
DL-β-aminobutyric acid (BABA, 0.5%)	26.06 ±1.62	31.62 ±1.92	14.85 ±1.90
물처리구	5.24 ±1.27	3.49 ±0.71	5.97 ±1.73

표 3에 따르면, 실시예 1의 조성물을 처리한 후 48시간부터 물처리구의 5.24mg/㎖ 보다 살리실산 함량이 12.7 mg/㎖로 약 2.5배 증가하였으며, 120시간 경과 후에는 3배 이상 증가되는 것으로 나타났다. 따라서, 실시예 1의 조성물을 고추식물체에 처리하면 살리실산을 생성하게 하여 병 저항성 유전자 발현을 유도하는 유도체로서 기능을 하는 것으로 판단된다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims

옥살산(oxalic acid)을 포함하는 표고버섯(Lentinula edodes)을 재배한 후의 배지에서 추출한 추출물의 농축액을 유효성분으로 포함하고, 식물병에 대한 예방용 또는 방제용으로 사용되고,
상기 식물병은 파이토프소라 캡사이시 유래의 식물병은 고추역병 또는 랄스토니아 소라나세룸 유래의 식물병은 토마토 풋마름병이고,
상기 추출물의 농축액에 포함된 옥살산 함량은 250 내지 5000ppm인, 식물병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 열수 추출에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 식물병 방제용 조성물은 방부제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 방부제는 소르빈산칼륨(Potassium Sorbate), 소르빈산(Sorbic Acid), 프로필갈레이트(Propyl Gallate), 뷰틸레이트하이드록시톨루엔(Butylated Hydroxy Toluene) 및 뷰틸하이드록시아니솔(Butylated Hydroxy Anisole)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
a) 표고버섯을 재배한 후 남은 배지를 준비하는 단계;
b) 상기 배지를 파쇄하여 파쇄된 배지를 제조하는 단계;
c) 상기 파쇄된 배지를 열수 추출하여 옥살산(oxalic acid)을 포함하는 열수 추출물을 제조하는 단계; 및
d) 상기 열수 추출물을 농축하여 상기 열수 추출물 보다 옥살산의 함량이 증가된 농축액을 제조하는 단계;를 포함하고,
상기 단계 c)는 열수 추출기에 상기 파쇄된 배지를 투입하고 물을 첨가하여 70 내지 90℃에서 1 내지 3시간 동안 열수 추출하여 열수 추출물을 제조하고,
상기 단계 d)는 상기 농축액의 옥살산 함량이 250 내지 5000ppm이 되도록 농축하여 식물병 방제용 조성물을 제조하는 것이고,
상기 식물병은 파이토프소라 캡사이시 유래의 식물병은 고추역병 또는 랄스토니아 소라나세룸 유래의 식물병은 토마토 풋마름병인, 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
삭제
제9항에 있어서,
단계 d) 이후,
e) 상기 농축액에 방부제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
삭제
삭제
제9항에 있어서,
단계 c)에서 파쇄된 배지와 물의 중량비는 1:5 내지 1:10인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 표고버섯을 재배한 후 남은 배지는 고체배지(solid state fermentation)에서 표고버섯을 재배한 후 남은 배지인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 고체배지는 톱밥 및 영양원을 포함하고,
상기 영양원은 미강, 밀기울, 비트펄프, 콘코브, 면실박, 면실피 및 케이폭박 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 표고버섯을 재배한 후 남은 배지는 상기 고체배지에서 표고버섯을 4회 내지 8회 채취한 후 남은 배지인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법.