KR101873179B1 - Ｔ－세포 도움을 유도하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 부분적으로, MHC II 결합 펩티드를 포함하는 조성물 및 관련 방법에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 MHC II 결합 펩티드는 천연 HLA-DP 결합 펩티드, HLA-DQ 결합 펩티드 또는 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함한다.

Description

Ｔ－세포 도움을 유도하는 조성물{COMPOSITIONS THAT INDUCE T CELL HELP}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C §119에 따라 2009년 8월 26일 출원된 미국 가출원 제61/237,147호 및 2010년 1월 6일 출원된 미국 가출원 제61/335,611호의 우선권의 이익을 주장하며, 각각의 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
임의의 백신의 활성은 T-세포 도움(T cell help)의 부수적인 제공에 의해 증가할 수 있다. T-세포 도움은 MHC II와 복합체를 형성할 수 있는 임의의 펩티드 항원의 제시를 통하여 유도될 수 있다. 이때 필요한 것은 백신 반응에 대한 개선된 T-세포 도움을 유도할 수 있는 조성물과 방법이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며; 식 중, x는 링커를 포함하거나 포함하지 않으며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며; 식 중, x는 링커를 포함하거나 포함하지 않으며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며; 식 중, x는 링커를 포함하거나 포함하지 않으며; A는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, A━x━B, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며; 식 중, x는 링커를 포함하거나 포함하지 않으며; A는 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며; 식 중, x는 아미드 링커, 이황화물 링커, 황화물 링커, 1,4-이치환 1,2,3-트리아졸 링커, 티올 에스테르 링커, 하이드라지드 링커, 이민 링커, 티오우레아 링커, 아미딘 링커 또는 아민 링커를 포함하는 링커를 포함하며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며; 식 중, x는 펩티드 서열, 리소좀 프로테아제 절단 위치, 생분해성 중합체, 치환 또는 비치환 알칸, 알켄, 방향족 또는 헤테로시클릭 링커, pH 감수성 중합체, 이종 2작용성 링커 또는 올리고머 글리콜 스페이서를 포함하는 링커를 포함하며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 분리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 분리된 핵산은 함께 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하고, 식 중, x는 링커를 포함하지 않거나, 아미드 링커 또는 펩티드 링커를 포함하며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 분리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 분리된 핵산은 함께 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하고, 식 중, x는 아미드 링커이거나, 링커가 아니거나 또는 펩티드 링커이며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 분리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 분리된 핵산은 함께 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하고, 식 중, x는 아미드 링커이거나, 링커가 아니거나 또는 펩티드 링커이며; A는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 분리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 분리된 핵산은 함께 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하고, 식 중, x는 아미드 링커이거나, 링커가 아니거나 또는 펩티드 링커이며; A는 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 분리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 분리된 핵산은 함께 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하고, 식 중, x는 아미드 링커이며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 분리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 분리된 핵산은 함께 A━x━B를 포함하는 조성물을 암호화하고, 식 중, x는 리소좀 프로테아제 절단 위치를 포함하는 펩티드 링커이며; A는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고; B는 천연 HLA-DP 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드, 또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 1~46에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와의 동일성이 적어도 75%인 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 1~46에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와의 동일성이 적어도 75%인 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 분리된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 분리된 핵산의 서열은 서열 번호 47~68에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나와의 동일성이 적어도 60%인 핵산 서열을 포함한다.
도 1은 펩티드 자극 CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포 내에서 IFN- γ의 발현을 나타내는 유동성 혈구 계측 데이터의 대표적인 예를 나타낸다.
도 2는 비 자극 CD4+/CD45RA중/CD62L고/IFN-γ+ T-세포에 대해 정규화한 핵심 기억 T-세포 %를 나타낸다. 제II군 펩티드 키메라는 강력한 CD4 기억 T-세포의 회상 반응(recall response)을 일으킨다. 펩티드는 4μM의 최종 농도로 첨가한다. 음성 및 양성 PBMC 대조군은 각각 자극하지 않았거나 또는 5개의 펩티드 풀(5PP)로 자극하였다. 유동성 혈구 계측 분석을 실시하기 이전에, 세포를 CD4-FITC, CD45RA-PE 및 CD62LCy7PE로 염색하였다. 이후, 세포를 침투화시키고, 고정하여 IFN-γ로 염색하였다. 핵심 기억 T-세포는 CD4+/CD45RA중/CD62L고/IFN-γ+이다. 나타낸 수치는 CD4+/CD62L 게이트에서 발견된 CD62L+/IFN-γ+ 세포의 %이다. 이 수치는 각각의 공여자에 대한 비 자극 대조군 수치를 공제함으로써 정규화하였다.
도 3은 펩티드에 반응하는 기억 T-세포에 양성인 공여자 수(20명의 공여자 중 양성인 자의 수)를 나타낸다. 만일 수치가 CD4+CD45RA저 모집단 중 핵심 기억 T-세포에 대응하여 0.08% 초과라면, 공여자는 양성인 것으로 간주하였다.
도 4는 펩티드 특이 CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포 내에서 TNF-α 및 IFN-γ 발현을 보여주는 유동성 혈구 계측 데이터의 대표적인 예를 나타낸다. 제II군 펩티드 키메라는 강력한 수지상 세포/CD4 핵심 기억 T-세포 회상 반응을 일으킨다. 단핵구를 자성 비드 음성 선택법에 의해 PBMC로부터 분리한 후, IL-4 및 GM-CSF 중에서 1주일 동안 생장시켜, 수지상 세포(DC) 분화를 유도하였다. 자가 조직 CD4+ 세포를 냉동보존된 PBMC로부터 분리한 후, 펩티드의 존재 또는 부재 하에서 DC와 함께 배양하였다. 핵심 기억 T-세포 중에서 TNF-α 및 IFN-γ 발현의 검출은 전술한 바와 같았다. 미성숙 핵심 기억 T-세포는 IFN-γ/ TNF-α 및 IL-2를 발현하고; 위탁된 효과기 기억 T-세포는 IL-4 또는 IFN-γ 만을 발현한다.
도 5는 펩티드 특이 CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포 내 IL-4, TNF-α 및 IFN-γ의 발현%를 나타낸다. 펩티드의 존재 하 또는 부재 하에서의 수지상 세포/자가 조직 CD4 T-세포 공동 배양물 내의 시토킨 발현을 나타낸다. 유동성 혈구 계측법에 의해 수집한 75,000회 자극 당 시토킨 양성 기억 T-세포의 수(비 자극된 경우에 대해 정규화함)를 나타낸다.
도 6은 펩티드 특이 CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포 내 TNF-α + IFN-γ 또는 TNF-α + IL-4의 공동 발현%를 나타낸다. 펩티드의 존재 또는 부재 하에서 수지상 세포/자가 조직 CD4 T-세포 공동 배양물 내의 시토킨 공동 발현을 나타낸다.
도 7은 TT830pDTt 변이체(각각 서열 번호 13, 108~113, 126, 114~118)를 나타낸다.
도 8은 CD4+/CD45RA저 내 CD62L+/IFN-γ+ 핵심 기억 T-세포 %를 나타낸다(4명의 공여자). 제II군 펩티드 키메라는 강력한 CD4 기억 T-세포 회상 반응을 일으킨다. 핵심 기억 T-세포는 CD4+/CD45RA저/CD62L+/IFN-γ+이다. 나타낸 수치는 CD4+/CD62L 게이트에서 발견된 CD62L+/IFN-γ+ 세포의 %이다.
도 9는 아데노바이러스 에피토프를 포함하는 키메라 펩티드를 사용하여, CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포 %를 나타낸다(16명의 공여자). 제II군 펩티드 키메라는 강력한 CD4 기억 T-세포 회상 반응을 일으킨다. 핵심 기억 T-세포는 CD4+/CD45RA저/CD62L+/IFN-γ+이다. 나타낸 수치는 CD4+/CD62L 게이트에서 발견된 CD62L+/IFN-γ+ 세포의 %이다. 각각 서열 번호 13, 17, 19 및 20을 나타낸다.
도 10은 아데노바이러스 AdVkDTt 변이체 내 CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포의 %를 나타낸다(16명의 공여자). 변형된 AdVkDTt 펩티드 키메라는 강력한 CD4 기억 T-세포 회상 반응을 일으킨다. 핵심 기억 T-세포는 CD4+/CD45RA저/CD62L+/IFN-γ+이다. 나타낸 수치는 CD4+/CD62L 게이트에서 발견된 CD62L+/IFN-γ+ 세포의 %이다. 각각 서열 번호 71~73 및 127~129를 나타낸다.
도 11은 고도로 보존된 팬 HLA-DR 프로필(pan HLA-DR profile)에 대해 선택된 인플루엔자의 키메라 에피토프를 나타낸다. 각각 서열 번호 39~44, 32 및 93~98를 나타낸다.
도 12는 키메라 보존 인플루엔자 에피토프 내 CD4+/CD45RA저/CD62L고 핵심 기억 T-세포의 %를 나타낸다(5명의 공여자). 고도로 보존된 변형 인플루엔자 펩티드 키메라는 강력한 CD4 기억 T-세포 회상 반응을 일으킨다. 핵심 기억 T-세포는 CD4+/CD45RA저/CD62L+/IFN-γ+이다. 나타낸 수치는 CD4+/CD62L 게이트에서 발견된 CD62L+/IFN-γ+ 세포의 %이다. 각각 서열 번호 101~106을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 조성물과 합성 나노담체를 사용하여 생성된 항 니코틴 역가를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 조성물과 합성 나노담체를 사용하여 생성된 항 니코틴 역가를 나타낸다.
도 15는 면역 에피토프 데이터베이스*(IEDB) T-세포 에피토프 예측 프로그램을 이용한 키메라 에피토프 선택을 나타낸다. 각각의 펩티드에 있어서, 3가지 방법들(ARB, SMM_정렬법 및 스터니올로(Sturniolo))을 각각 이용한 백분위 점수는 스위스프로트(SWISSPROT) 데이터베이스로부터 선택된 무작위 15머 5백만개의 스코어에 대하여 펩티드 스코어를 비교함으로써 구하였다. 이후, 상기 3가지 방법에 대한 백분위 점수는 컨센서스 방법(consensus method)에 대한 점수를 구하는데 이용하였다. 작은 숫자의 백분위 점수는 높은 친화도를 나타낸다. 예측된 높은 친화도 결합(상위 백분위 3 미만)을 굵은 글씨로 나타내었다. 대립 유전자 분포는 유럽인 모집단(불가리아, 크로아티아, 쿠바(Eu), 체코, 핀란드, 그루지아, 아일랜드, 북미(Eu) 및 슬로베니아 인)을 대상으로 구하였다.
도 16은 단일 및 키메라 에피토프 프로젝트 HLA-DR 모집단 포함률(population coverage)(유럽인)을 나타낸다.
도 17은 인플루엔자 A에 대한 개별적인 제II군 에피토프의 예측된 결합 분석을 나타낸다. 서열 번호 78~82를 표의 첫번째 컬럼에 표시하였다.
도 18은 인플루엔자 A에 대한 키메라 에피토프의 예측된 결합 분석을 나타낸다.
도 19는 인플루엔자 A+B에 대한 보존된 팬-제II군 PB1 키메라 펩티드를 나타낸다. 서열 번호 101~106을 표의 첫번째 컬럼에 표시하였다.
도 20은 제II군에 대한 예측된 결합 친화도를 상실시키지 않는 아미노산 치환을 나타낸다. 각각 서열 번호 2, 120~122, 3 및 123~125를 나타낸다.
본 발명을 상세하게 기술하기 전에, 본 발명이 특별히 예시된 물질이나 공정 파라미터에 제한되지 않으며, 물론 그 자체를 변형할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 내에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 구체예를 기술하기 위함이며, 본 발명을 기술하는 대체 용어의 사용을 제한하고자 함이 아님을 또한 이해해야 한다.
상기 또는 하기에서 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
명세서 및 부가된 청구항에 사용된, 단수형("a," "an" 및 "the")은 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, "중합체(a polymer)" 에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 분자의 혼합물을 포함하고, "용매(a solvent)"에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 용매의 혼합물을 포함하며, “접착제(an adhesive)”는 둘 이상의 그러한 물질의 혼합물을 포함한다.
A. 서론
본 발명자는 뜻밖에 그리고 놀랍게도, 전술한 문제점들과 한계들은 본원에 개시된 발명을 수행함으로써 극복될 수 있다는 것을 알아냈다. 특히, 본 발명자들은 예상외로 당업계의 문제점들과 한계들을 해결해주는 본 발명의 조성물과 관련 방법들을 제공할 수 있다는 것을 알아냈다.
백신에 대한 면역 반응은 백신에 제II군 결합 기억 에피토프를 포함시켜 더욱 강력한 항체 반응을 일으키도록 유리하게 증강될 수 있다. 그러나, 제II군은 3개의 상이한 유전자 세트(HLA-DR, DP 및 DQ)로 이루어져 있는데, 이 세트는 각각 에피토프 결합 친화도가 상이하다. 뿐만 아니라, 이들 유전자는 각각 모집단 내에서 발견될 수 있는 대립 유전자를 여러개 가져서, 에피토프 결합 능력이 가변적인 단백질을 생산하므로, 각각의 T-세포 에피토프는 제II군 대립 유전자가 제한되어 있다. 그러므로, 에피토프의 제II군에 제한이 있을 경우, 에피토프의 모집단 포함률에 제한이 따르게 된다는 문제가 있다. 모집단 포함률을 늘리기 위해서는, DP, DQ 및 DR에 대해 무작위적이고 비 선택적이 되도록 펩티드를 디자인해야 할 것이다. 이러한 문제점은 대부분의 모집단이 노출된 항원과, HLA 제II군 대립 유전자를 포괄하여 활성이 광범위하게 나타나는 항원에 특이적이도록 펩티드를 디자인함으로써 해결할 수 있다. 광범위하지만 제한된 활성을 가지는 개별적인 에피토프는, 예를 들어 파상풍 독소(TT) 및 디프테리아 독소(DT)와 같은 일반적인 백신에서 발견되는 에피토프를 포함한다. 추가적으로, 대부분의 모집단이 노출되어 활성 항체 역가를 가지게 된 아데노바이러스(AdV)와 같은 천연 생성 바이러스에서 발견되는 에피토프는 모집단 포함률이 클 수 있다. 이상적으로, 디자인된 펩티드는 우성 DP4 대립 유전자에 대한 고 친화도 에피토프(DPA1*01/DPB1*401 및 DPA1*0103/DPB1*0402), 및/또는 모집단 내에서 반응성이 광범위하게 나타나는 HLA-DQ 또는 HLA-DR 대립 유전자에 대한 고 친화도 에피토프를 가질 것이다. 모집단 포함률이 큰 제II군 펩티드를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 예측된 HLA 제II군 친화도를 바탕으로 키메라 에피토프를 디자인해서 테스트하였다.
실시예에 기술한 바와 같이, 예측된 HLA 제II군 친화도를 바탕으로 디자인된 본 발명의 펩티드는 사람에서 복수의 HLA 제II군 DP, DQ 및 DR 대립 유전자들에 걸쳐서 광범위한 포함률을 제공하고, 강력한 기억 T-세포 활성화를 제공한다. 이들 신규 펩티드는 여러 개의 제II군 대립 유전자에 걸쳐서 광범위한 포함률, 및 CD4+ 기억 T-세포 회상 반응을 생성하는데 상당한 개선을 나타낸다.
실시예 1~4는 본 발명의 일반적인 접근 방법을 예시한다. 실시예 5 및 6은 인플루엔자 바이러스로부터 얻거나 유래하는 본 발명의 조성물과 펩티드의 물리적 특성 변형을 예시한다. 실시예 7~13은 본 발명의 조성물의 다양한 응용을 예시한다.
이제, 본 발명을 더욱 자세히 기술할 것이다.
B. 정의
“애쥬반트”란, 특이적 항원을 구성하지 않되, 공동 투여된 항원에 대한 면역 반응의 세기와 지속 기간을 증가시키는 제제를 의미한다. 이와 같은 애쥬반트로서는 패턴 인지 수용체(pattern recognition receptor), 예를 들어 톨 유사 수용체(Toll-like receptor), RIG-1 및 NOD 유사 수용체(NLR)의 자극제, 무기 염, 예를 들어 백반, 엔테로박테리아, 예를 들어 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 쉬겔라 플렉스너리(Shigella flexneri)의 모노포스포릴 지질(MPL) A, 또는 특히 MPL®(AS04), 전술한 박테리아들의 MPL A 각각과 합하여진 백반, 사포닌, 예를 들어, QS-21, 퀼(Quil)-A, 이스콤(ISCOM), 이스코매트릭스(ISCOMATRIX)™, 에멀젼, 예를 들어 MF59™, 몬타나이드(Montanide)® ISA 51 및 ISA 720, AS02(QS21 + 스쿠알렌 + MPL®), 리포좀 및 리포좀 제형, 예를 들어 AS01, 합성 또는 특별히 제조된 미소 입자 및 미소 담체, 예를 들어 엔.고노리아애(N. gonorrheae) 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 등의 박테리아 유래 외막 소포(OMV), 또는 키토산 입자, 데포 형성 제제, 예를 들어 플루로닉(Pluronic)® 블록 공중합체, 특별히 변형하였거나 제조한 펩티드, 예를 들어 뮤라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코사미나이드 4-포스페이트, 예를 들어 RC529, 또는 단백질, 예를 들어 박테리아 변성 독소 또는 독소 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체예에서, 애쥬반트는 패턴 인지 수용체(PRR), 예를 들어, 톨 유사 수용체(TLR) 특히, TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 및/또는 이것들의 조합(이에 한정되는 것은 아님)에 대한 작용제를 포함한다. 다른 구체예에서, 애쥬반트는 톨 유사 수용체 3에 대한 작용제, 톨 유사 수용체 7 및 8에 대한 작용제, 또는 톨 유사 수용체 9에 대한 작용제를 포함하며; 바람직하게, 상기 언급한 애쥬반트는 이미다조퀴놀린, 예를 들어 R848; 아데닌 유도체, 예를 들어 미국 특허 제6,329,381호(스미토모 파마슈티컬 컴퍼니(Sumitomo Pharmaceutical Company))에 개시된 유도체; 면역 자극성 DNA; 또는 면역 자극성 RNA를 포함한다. 특정 구체예에서, 합성 나노담체는 톨 유사 수용체(TLR) 7 및 8에 대한 작용제인 애쥬반트 화합물(“TLR 7/8 작용제”)을 포함한다. 미국 특허 제6,696,076호(Tomai et al.)에 개시된 TLR 7/8 작용제 화합물, 예를 들어 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민 및 1,2-가교 이미다조퀴놀린 아민(이에 한정되는 것은 아님)이 유용하다. 바람직한 애쥬반트는 이미퀴모드 및 레시퀴모드(R848이라고도 알려짐)를 포함한다. 특정 구체예에서, 애쥬반트는 DC 표면 분자 CD40에 대한 작용제일 수 있다. 임의의 구체예에서, 관용성(tolerance) 보다 면역성을 자극하기 위해서, 합성 나노담체는, DC 성숙을 촉진하고(비변형 T-세포를 프라이밍(priming)하는데 필요함), 항체 면역 반응을 촉진하는 시토킨, 예를 들어 제I형 인터페론의 생산을 촉진하는 애쥬반트를 포함한다. 구체예에서, 애쥬반트는 또한 면역 자극성 RNA 분자, 예를 들어 dsRNA 또는 폴리 I:C(TLR3 자극제), 및/또는 문헌[F. Heil et al., “Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8” Science 303(5663), 1526-1529 (2004); J. Vollmer et al., “Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides” WO 2008033432호 A2; A. Forsbach et al., “Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway” WO 2007062107호 A2; E. Uhlmann et al., “Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity” 미국 특허출원공개 US 2006241076호; G. Lipford et al., “Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections” WO 2005097993호 A2; G. Lipford et al., “Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides, compositions, and screening methods” WO 2003086280호 A2]에 개시된 분자(이에 한정되는 것은 아님)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 애쥬반트는 TLR-4 작용제, 예를 들어 박테리아 리포다당류(LPS), VSV-G 및/또는 HMGB-1일 수 있다. 일부 구체예에서, 애쥬반트는 TLR-5 작용제, 예를 들어 플라젤린, 또는 이의 일부 또는 유도체, 예를 들어 미국 특허 제6,130,082호, 제6,585,980호 및 제7,192,725호에 개시된 것들(이에 한정되는 것은 아님)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 합성 나노담체는 톨 유사 수용체(TLR)-9에 대한 리간드, 예를 들어 CpG를 포함하여, 제I형 인터페론 분비를 유도하고, T 및 B-세포 활성화를 촉진하여 항체 생산과 세포 독성 T-세포 반응을 증가시키는 면역 자극성 DNA 분자를 포함한다(Krieg et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 1995. 374:546-549; Chu et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J. Exp. Med. 1997. 186:1623-1631; Lipford et al. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:2340-2344; Roman et al. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. Nat. Med. 1997. 3:849-854; Davis et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998. 160:870-876; Lipford et al., Bacterial DNA as immune cell activator. Trends Microbiol. 1998. 6:496-500; 미국 특허 제6,207,646호, Krieg et al.; 미국 특허 제7,223,398, Tuck et al.; 미국 특허 제7,250,403호, Van Nest et al.; 또는 미국 특허 제7,566,703호, Krieg et al.).
일부 구체예에서, 애쥬반트는 괴사 세포로부터 방출되는 전염증 자극 물질(예를 들어, 요산염 결정)일 수 있다. 일부 구체예에서, 애쥬반트는 보체 캐스케이드의 활성화된 성분(예를 들어, CD21 및 CD35 등)일 수 있다. 일부 구체예에서, 애쥬반트는 면역 복합체의 활성화된 성분일 수 있다. 애쥬반트는 또한 보체 수용체 작용제, 예를 들어 CD21 또는 CD35와 결합하는 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 보체 수용체 작용제는 합성 나노담체의 내인성 보체 옵소닌화(endogenous complement opsonization)를 유도한다. 일부 구체예에서, 애쥬반트는 세포에 의해 방출되는 소형 단백질 또는 생물 인자(분자량 범위 = 5kD~20kD)이며, 세포-세포 상호 작용, 기타 세포들과의 소통 그리고 이 세포들의 행동에 특이적인 효과를 부여하는 시토킨이다. 일부 구체예에서, 시토킨 수용체 작용제는 소형 분자, 항체, 융합 단백질 또는 앱타머이다.
구체예에서, 애쥬반트 투여형의 적어도 일부분은 합성 나노담체와 커플링될 수 있으며, 바람직하게 애쥬반트 투여형 전부는 합성 나노담체와 커플링된다. 다른 구체예에서, 애쥬반트 투여형의 적어도 일부분은 합성 나노담체와 커플링되지 않는다. 구체예에서, 애쥬반트의 투여형은 2가지 이상의 종류의 애쥬반트를 포함한다. 예를 들어(한정적인 것은 아님), 상이한 TLR 수용체 상에서 작용하는 애쥬반트들은 서로 결합할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, TLR 7/8 작용제는 TLR 9 작용제와 결합할 수 있다. 다른 구체예에서, TLR 7/8 작용제는 TLR4 작용제와 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, TLR9 작용제는 TLR3 작용제와 결합할 수 있다.
“투여(“administering” 또는 “administration”)”란, 약학적으로 유용한 방식으로 대상체에 약물을 제공하는 것을 의미한다.
“항원”이란, B-세포 항원 또는 T-세포 항원을 의미한다.
“B-세포 항원”이란, B-세포에 의해 인지되어 이 B-세포 내에서 면역 반응을 촉발하는 임의의 항원(예를 들어, B-세포 상에서 B-세포 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 항원)을 의미한다. 일부 구체예에서, T-세포 항원인 항원은 또한 B-세포 항원이기도 하다. 다른 구체예에서, T-세포 항원은 B-세포 항원이 아니기도 하다. B-세포 항원으로서는 단백질, 펩티드, 소형 분자 및 탄수화물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 비 단백질 항원(즉, 단백질 또는 펩티드 항원이 아닌 항원)이다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 감염성 제제와 결합된 탄수화물이다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 감염성 제제와 결합된 당 단백질이거나 당 펩티드이다. 감염성 제제는 박테리아, 바이러스, 진균, 원생 동물 또는 기생체일 수 있다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 면역원성이 떨어지는 항원이다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 남용된 물질 또는 이의 일부이다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 중독 물질 또는 이의 일부이다. 중독 물질로서는 니코틴, 마약, 기침 억제제, 신경 안정제 및 진정제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 독소, 예를 들어 화학 무기 또는 천연 공급원으로부터 유래하는 독소이다. B-세포 항원은 또한 유해 환경 제제일 수도 있다. 일부 구체예에서, B-세포 항원은 자가 항원이다. 다른 구체예에서, B-세포 항원은 동종 항원, 알레르기원, 접촉 감작제(contact sensitizer), 퇴행성 질병 항원, 합텐, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가 면역성 질병 항원, 중독 물질, 이종 항원 또는 대사성 질병 효소 또는 이의 효소 생성물이다.
“커플링” 또는 “커플링된” 또는 “커플링하다”(등)이란, 하나의 실체(entity)(예를 들어, 하나의 부분)이 다른 물질과 화학적으로 결합하는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 커플링은 공유적이다. 비공유적 구체예에 있어서, 비공유적 커플링은 비공유 상호 작용, 예를 들어 전하 상호 작용, 친화성 상호 작용, 금속 배위 결합, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호 작용, 소수성 상호 작용, TT 스택킹 상호 작용(TT stacking interaction), 수소 결합 상호 작용, 반 데르 발스 상호 작용, 자성 상호 작용, 정전기적 상호 작용, 쌍극자-쌍극자 상호 작용 및/또는 이것들의 조합(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 매개된다.
“유래하는”이란, 공급원으로부터 얻어져 실질적으로 변형되는 것을 의미한다. 예를 들어, 천연 펩티드 또는 핵산, 바람직하게는 천연 공통 펩티드 또는 핵산과의 동일성이 50%에 불과한 서열을 포함하는 펩티드 또는 핵산은 천연 펩티드 또는 핵산으로부터 유래한다고 할 것이다. 그러나, 유래된 핵산은 오로지 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 천연 핵산 서열, 바람직하게는 천연 공통 핵산 서열과 동일하지 않은 서열을 가지는 핵산을 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 실질적인 변형은 해당 물질의 화학적 또는 면역학적 특성에 상당한 영향을 주는 변형이다. 유래된 펩티드 및 핵산은 또한 만일 상기 유래된 펩티드 및 핵산이 천연 펩티드 또는 핵산과 비교하였을 때 변형된 화학적 또는 면역학적 특성을 가진다면, 천연 펩티드 또는 핵산 서열과의 동일성이 50% 초과인 서열을 가지는 것들을 포함할 수도 있다. 이와 같은 화학적 또는 면역학적 특성으로서는 친수성, 안정성, MHC II에 대한 결합 친화성, 그리고 담체, 예를 들어 합성 나노담체와 커플링할 수 있는 능력을 포함한다.
"투약 형태(dosage form)"는 대상체에 투여하기에 적합한 매체(medium), 담체(carrier), 운반체(vehicle), 또는 장치 내에 있는 약(drug)을 의미한다.
“캡슐화하다” 또는 “캡슐화된”이란, 합성 나노담체 내에 내포시키는 것, 바람직하게는 합성 나노담체 내에 완전히 내포시키는 것을 의미한다. 캡슐화된 물질의 대부분 또는 전부는 합성 나노담체에 대한 국소 외부 환경에 노출되지 않는다. 캡슐화는 합성 나노담체의 표면 상에 물질의 적어도 일부분이 존재하는 것과 구별되는데, 이는 합성 나노담체에 대한 국소 외부 환경에 물질을 노출된 상태로 둔다. 구체예에서, 물질의 적어도 일부분이 합성 나노담체 표면 상에 존재하게 되는 과정의 일례로서는 흡착이 있다.
“MHC II 결합 펩티드”란, 펩티드/MHC 복합체가 T-세포 상의 T-세포 수용체와 상호 작용할 수 있기에 충분한 친화도로 주요 조직 적합성 복합체 제II군과 결합하는 펩티드를 의미한다. T-세포 상에서의 펩티드/MHC 복합체와 T-세포 수용체 상호 작용은 통상의 기술을 이용하여 시토킨 생산 및/또는 T-세포 증식을 측정함으로써 확립될 수 있다. 구체예에서, MHC II 분자와의 결합에 대한 MHC II 결합 펩티드의 친화도 IC50 수치는 5,000nM 이하, 바람직하게는 500nM 이하, 그리고 더욱 바람직하게는 50nM 이하이다. 구체예에서, 본 발명에 의한 MHC II 결합 펩티드(특히, 예를 들어 제1, 제2 및 제3 MHC II 결합 펩티드 포함)의 길이는 5머 이상이며, 단백질만큼 길 수도 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 의한 MHC II 결합 펩티드(특히, 예를 들어 제1, 제2 및 제3 MHC II 결합 펩티드 포함)의 길이는 5머~50머의 범위, 바람직하게는 5머~40머의 범위, 더욱 바람직하게는 5머~30머의 범위, 그리고 더욱 더 바람직하게는 6머~25머이다.
“동일성”이란, 1차원 서열 배열 내에 동일하게 위치하는 아미노산 또는 잔기 또는 핵산 염기의 백분율을 의미한다. 동일성은 비교 대상인 서열이 얼마나 가깝게 연관되어 있는지를 나타내는 척도이다. 하나의 구체예에서, 2개의 서열 간 동일성은 BESTFIT 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다. 구체예에서, 열거된 MHC II 결합 펩티드(예를 들어, A, B 또는 C)와 천연 HLA-DP 결합 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드 및/또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99%일 수 있다. 구체예에서, A, B 및 C는 서로 100% 동일하지 않으며; 구체예에서, A 및 B는 서로 100% 동일하지 않다. 구체예에서, 열거된 핵산은 천연 HLA-DP 결합 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드 및/또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드를 암호화하거나, 이를 암호화하는 것과 상보성인 핵산 서열과의 동일성이 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99%일 수 있다.
“분리된 핵산”이란, 핵산이 원래 존재하던 환경으로부터 분리되어, 확인 또는 사용이 가능할 정도로 충분한 양으로 존재하게 된 핵산을 의미한다. 분리된 핵산은 (i) 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 시험관 내 증폭되었거나; (ii) 클로닝에 의해 재조합 방식으로 생산되었거나; (iii) 절단 및 겔 분리에 의해 정제되었거나; 또는 (iv) 예를 들어, 화학적 합성법에 의해 합성된 핵산일 수 있다. 분리된 핵산은 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 조작되는 핵산이다. 그러므로, 5' 및 3' 제한 위치가 알려져 있거나 또는 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머 서열이 개시되어 있는 벡터 내에 포함된 뉴클레오티드 서열은 분리된 것으로 간주되지만, 천연 숙주 내에 원래 있던 상태로 존재하는 핵산 서열은 분리된 것으로 간주되지 않는다. 분리된 핵산은 실질적으로 정제될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 내에 분리되어 있는 핵산은 상기 핵산이 존재하는 세포 내에 이 물질을 아주 작은 백분율로만 포함할 수 있다는 점에서 순수하지 않다. 그러나, 이와 같은 핵산은 당업자에게 알려진 표준 기술에 의해 용이하게 조작되므로, 상기 용어가 본원에서 사용될 때 이와 같은 핵산은 분리된 것이다. 본원에 제공된 핵산들 중 임의의 것은 분리될 수 있다.
“분리된 폴리펩티드”란, 폴리펩티드가 원래 존재하던 환경으로부터 분리되어, 확인 또는 사용이 가능할 정도로 충분한 양으로 존재하는 폴리펩티드를 의미한다. 이는, 예를 들어 폴리펩티드가 (i) 발현 클로닝에 의해 선택적으로 생산될 수 있거나, 또는 (ii) 크로마토그래피 또는 전기 영동에 의해 정제될 수 있음을 의미한다. 분리된 단백질 또는 폴리펩티드는 실질적으로 순수할 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 분리된 폴리펩티드는 약학 제제 중에 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합될 수 있으며, 이 폴리펩티드는 제제의 중량을 기준으로 하여 작은 백분율만큼 포함될 수 있다. 그렇더라도, 폴리펩티드는 살아있는 시스템 내에 결합될 수 있는 물질로부터 분리되었다는 점에서(예를 들어, 다른 단백질로부터 분리되었다는 점에서) 분리된 것이다. 본원에 제공된 펩티드 또는 폴리펩티드 중 임의의 것은 분리될 수 있다.
“링커”란, 단일 공유 결합 또는 다수의 공유 결합을 통해서 2개의 화학 성분을 함께 연결하는 부분을 의미한다.
“합성 나노담체의 최대 크기”는 합성 나노담체의 임의의 축을 따라서 측정된 나노담체의 가장 큰 크기를 의미한다. “합성 나노담체의 최소 크기”는 합성 나노담체의 임의의 축을 따라서 측정된 합성 나노담체의 가장 작은 크기를 의미한다. 예를 들어, 회전 타원체의 합성 나노담체에 대해서, 합성 나노담체의 최대 및 최소 크기는 실질적으로 동일할 것이며, 그 직경의 크기일 것이다. 유사하게, 입방형의 합성 나노담체에 대해서는, 합성 나노담체의 최소 크기는 그것의 높이, 폭 또는 길이 중 가장 작은 것이 될 것이며, 한편 합성 나노담체의 최대 크기는 그것의 높이, 폭 또는 길이 중 가장 큰 것이 될 것이다. 하나의 구체예에서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 크기가 100nm 초과이다. 하나의 구체예에서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 크기가 5㎛ 이하이다. 바람직하게 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 크기가 110nm 이상, 더욱 바람직하게는 120nm 이상, 더욱 바람직하게는 130nm 이상, 더욱 더 바람직하게는 150nm 이상이다. 바람직하게 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 크기가 3㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 2㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 1㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 800nm 이하, 더욱 바람직하게는 600nm 이하, 더욱 더 바람직하게는 500nm 이하이다. 바람직한 구체예에서, 시료 내 합성 나노담체의 총수를 기준으로 시료 내 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 크기가 100nm 이상, 더욱 바람직하게는 120nm 이상, 더욱 바람직하게는 130nm 이상, 더욱 바람직하게는 140nm 이상, 더욱 더 바람직하게는 150nm 이상이다. 합성 나노담체 크기의 측정은 합성 나노담체를 액체(통상적으로 수성) 매체에 현탁하고 동적 광 산란(예를 들어 Brookhaven ZetaPALS 기구를 사용)으로 얻어진다.
“천연 HLA-DP 결합 펩티드”란, 천연에서 얻어지거나 유래하는 펩티드로서, 펩티드/HLA-DP 복합체가 T-세포 상의 T-세포 수용체와 상호 작용하는데 충분한 친화도로 MHC 제II군 사람 백혈구 항원 DP에 특이적으로 결합하는 펩티드를 의미한다. 구체예에서, 천연 HLA-DP 결합 펩티드는 MHC 제II군 사람 백혈구 항원 DP에 대한 친화도 IC50 수치가 5000nM 이하, 바람직하게는, 500nM 이하, 더욱 바람직하게는 50nM 이하이다. 구체예에서, 천연 HLA-DP 결합 펩티드는 바이러스, 박테리아 또는 효모, 예를 들어 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), B형 간염 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 백시니아 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 라우스 육종 바이러스(RSV), 거대 세포 바이러스(CMV), 수두-대상 포진 바이러스(VZV), 볼거리 바이러스, 코린박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 사람 아데노바이러스 및/또는 두창 바이러스(이에 한정되는 것은 아님)로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함한다. 제II군 에피토프 예측은 면역 에피토프 데이터베이스*(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/) T-세포 에피토프 예측 도구를 사용하여 수행하였다. 각각의 펩티드에 있어서, 3가지 방법(ARB, SMM_정렬법 및 스터니올로) 각각에 대한 백분위 점수는 스위스프로트 데이터베이스로부터 선택된 무작위 15머 500만개의 스코어와 펩티드 스코어를 비교함으로써 구하였다. 이후, 상기 3가지 방법에 대한 백분위 점수는 컨센서스 방법에 대한 점수를 구하는데 이용하였다.
“천연 HLA-DQ 결합 펩티드”란, 천연에서 얻어지거나 유래하는 펩티드로서, 펩티드/HLA-DQ 복합체가 T-세포 상의 T-세포 수용체와 상호 작용하는데 충분한 친화도로 MHC 제II군 사람 백혈구 항원 DQ에 특이적으로 결합하는 펩티드를 의미한다. 구체예에서, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드는 MHC 제II군 사람 백혈구 항원 DQ에 대한 친화도 IC50 수치가 5000nM 이하, 바람직하게는, 500nM 이하, 그리고 더욱 바람직하게는 50nM 이하이다. 구체예에서, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드는 바이러스, 박테리아 또는 효모, 예를 들어 클로스트리듐 테타니, B형 간염 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 백시니아 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 라우스 육종 바이러스(RSV), 거대 세포 바이러스(CMV), 수두-대상 포진 바이러스(VZV), 볼거리 바이러스, 코린박테리움 디프테리아, 사람 아데노바이러스 및/또는 두창 바이러스(이에 한정되는 것은 아님)로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함한다. 제II군 에피토프 예측은 면역 에피토프 데이터베이스*(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/) T-세포 에피토프 예측 도구를 사용하여 수행하였다. 각각의 펩티드에 있어서, 3가지 방법(ARB, SMM_정렬법 및 스터니올로) 각각에 대한 백분위 점수는 스위스프로트 데이터베이스로부터 선택된 무작위 15머 500만개의 스코어와 펩티드 스코어를 비교함으로써 구하였다. 이후, 상기 3가지 방법에 대한 백분위 점수는 컨센서스 방법에 대한 점수를 구하는데 이용하였다.
“천연 HLA-DR 결합 펩티드”란, 천연에서 얻어지거나 유래하는 펩티드로서, 펩티드/HLA-DR 복합체가 T-세포 상의 T-세포 수용체와 상호 작용하는데 충분한 친화도로 MHC 제II군 사람 백혈구 항원 DR에 특이적으로 결합하는 펩티드를 의미한다. 구체예에서, 천연 HLA-DR 결합 펩티드는 MHC 제II군 사람 백혈구 항원 DR에 대한 친화도 IC50 수치가 5000nM 이하, 바람직하게는 500nM 이하, 그리고 더욱 바람직하게는 50nM 이하이다. 구체예에서, 천연 HLA-DR 결합 펩티드는 바이러스, 박테리아 또는 효모, 예를 들어 클로스트리듐 테타니, B형 간염 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 백시니아 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 라우스 육종 바이러스(RSV), 거대 세포 바이러스(CMV), 수두-대상 포진 바이러스(VZV), 볼거리 바이러스, 코린박테리아 디프테리아, 사람 아데노바이러스 및/또는 두창 바이러스(이에 한정되는 것은 아님)로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함한다. 제II군 에피토프 예측은 면역 에피토프 데이터베이스*(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/) T-세포 에피토프 예측 도구를 사용하여 수행하였다. 각각의 펩티드에 있어서, 3가지 방법(ARB, SMM_정렬법 및 스터니올로) 각각에 대한 백분위 점수는 스위스프로트 데이터베이스로부터 선택된 무작위 15머 500만개의 스코어와 펩티드의 스코어를 비교함으로써 구하였다. 이후, 상기 3가지 방법에 대한 백분위 점수는 컨센서스 방법에 대한 점수를 구하는데 이용하였다.
“얻어진”이란, 실질적인 변형없이 공급원으로부터 취하여진 것을 의미한다. 실질적인 변형은 해당 물질의 화학적 또는 면역학적 특성에 상당한 영향을 주는 변형이다. 예를 들어 비 제한적인 예로서, 천연 펩티드 또는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 천연 공통 펩티드 또는 뉴클레오티드 서열과의 동일성이 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 97% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과, 바람직하게는 100%인 서열을 가지며, 천연 펩티드 또는 핵산과 상당히 상이하지 않은 화학적 특성 및/또는 면역학적 특성을 가지는 펩티드 또는 핵산은 천연 펩티드 또는 뉴클레오티드 서열로부터 얻어진다고 할 것이다. 얻어진 핵산은 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 천연 공통 뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 서열을 가지는 핵산을 포함하도록 의도된다. 이와 같은 핵산은 천연 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 천연 공통 뉴클레오티드 서열과의 동일성이 90% 미만인 서열을 가질 수도 있다. 이와 같은 화학적 특성 또는 면역학적 특성으로서는 친수성, 안정성, MHC II에 대한 결합 친화성, 그리고 담체, 예를 들어 합성 나노담체와 커플링할 수 있는 능력을 포함한다.
“약학적으로 허용 가능한 부형제”란, 본 발명의 조성물, 투여형 및 백신 등을 제조하는 구체예에 있어서, 열거된 펩티드와 함께 사용되는 약리학적으로 불활성인 물질을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제로서는 당업계에 공지된 다수의 물질, 예를 들어 당류(예를 들어, 글루코스 또는 락토스 등), 보존제, 예를 들어 항미생물제, 재구성 보조 물질(reconstitution aid), 발색제, 염수(예를 들어, 인산염 완충 염수), 완충액, 분산제, 안정화제, 본원에 언급된 기타 부형제, 그리고 통상적으로 알려진 기타 물질을 포함한다.
“대상체”는 인간 및 영장류와 같은 온혈 포유류; 조류; 고양이, 개, 양, 염소, 소, 말 및 돼지와 같은 가축 동물 또는 농장 동물; 마우스, 쥐 및 기니아 피그와 같은 실험실 동물; 어류; 파충류; 동물원 및 야생 동물; 등을 포함하는 동물을 의미한다.
“합성 나노담체(들)”란, 천연에서 발견되지 않는 별도의 물질로서, 크기가 5 마이크론 이하인 치수를 하나 이상 가지는 물질을 의미한다. 알부민 나노입자는 일반적으로 합성 나노담체로서 포함되지만, 임의의 구체예에서, 합성 나노담체는 알부민 나노입자를 포함하지 않는다. 구체예에서, 합성 나노담체는 키토산을 포함하지 않는다.
합성 나노담체는 이에 제한되지는 않지만, 하나 또는 다수의 지질 기반 나노입자, 중합성 나노입자, 금속성 나노입자, 계면활성제 기반 에멀젼, 덴드리머, 버키볼(buckyball), 나노와이어, 바이러스 유사 입자, 펩티드 또는 단백질 기반 입자(예컨대, 알부민 나노입자) 및/또는 지질 중합체 나노입자와 같은 나노물질의 조합을 사용하여 개발된 나노입자일 수 있다. 합성 나노담체는 다양하게 상이한 형태일 수 있으며, 그 제한되지 않는 예로 구형, 입방형, 피라미드형, 타원형, 원통형, 도넛형 등을 포함한다. 본 발명에 따른 합성 나노담체는 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 발명의 수행에 있어서의 사용을 위하여 조정할 수 있는 예시적인 합성 나노담체는 (1) 미국 특허 제5,543,158호(Gref et al.)에 개시된 생분해성 나노입자, (2) 공개된 미국 특허 출원 제2006/0002852호(Saltzman et al.)의 중합체 나노입자, (3) 공개된 미국 특허 출원 제2009/0028910호(DeSimone et al.)의 리소그래피에 의해 구성된 나노입자, (4) WO 2009/051837호(von Andrian et al.)의 개시 내용, 또는 (5) 공개된 미국 특허 출원 제2008/0145441호(Penades et al.)에 개시된 나노입자를 포함한다. 구체예에서, 합성 나노담체의 종횡비는 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 초과, 또는 1:10 초과일 수 있다.
약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하인 최소 크기를 가지는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체(complement)를 활성화하는 히드록실 기를 갖는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 활성화하는 히드록실 기가 아닌 부분으로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하인 최소 크기를 가지는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체를 실질적으로 활성화하는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 실질적으로 활성화하지 않는 부분으로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하인 최소 크기를 가지는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체를 활성화하는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 활성화하지 않는 부분으로 필수적으로 구성되는 표면을 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 의한 합성 나노담체는 바이러스 유사 입자를 제외한다.
“T-세포 항원”이란, CD4+ T-세포 항원 또는 CD8+ 세포 항원을 의미한다. “CD4+ T-세포 항원”이란, CD4+ T-세포에 의하여 인지되어 CD4+ T-세포 내에서 면역 반응을 촉발하는 임의의 항원, 예를 들어 제II군 주요 조직 적합성 복합체 분자(MHC)에 결합된 항원 또는 항원의 일부를 제시함으로써, CD4+ T-세포 상에 존재하는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 항원을 의미한다. “CD8+ T-세포 항원”이란, CD8+ T-세포에 의하여 인지되어 CD8+ T-세포 내에서 면역 반응을 촉발하는 임의의 항원, 예를 들어 제I군 주요 조직 적합성 복합체 분자(MHC)에 결합된 항원 또는 항원의 일부를 제시함으로써, CD8+ T-세포 상에 존재하는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 항원을 의미한다. 일부 구체예에서, T-세포 항원인 항원은 B-세포 항원이기도 하다. 다른 구체예에서, T-세포 항원은 또한 B-세포 항원이 아니기도 하다. T-세포 항원은 일반적으로 단백질 또는 펩티드이지만, 기타 분자, 예를 들어 지질 및 당지질일 수 있다. T-세포 항원은 CD4+ T-세포 반응 또는 CD8+ T-세포 반응을 자극하는 항원이다.
“백신”이란, 특정 병원체 또는 질병에 대한 면역 반응을 개선하는 물질의 조성물을 의미한다. 백신은 통상적으로 특정 항원을 외래 물질로서 인지하여, 그것을 대상체의 체내에서 제거하는, 대상체의 면역계를 자극하는 인자들을 함유한다. 백신은 또한 면역학적 ‘기억’을 확립하여, 대상체가 다시 항원 공격을 받았을 때 이 항원을 신속하게 인지하고 이에 반응할 것이다. 백신은 예방적 차원의 것(예를 들어, 미래에 임의의 병원체에 의한 감염을 막기 위한 것) 또는 치료적 차원의 것(예를 들어, 암 치료를 위한 것으로서, 종양 특이 항원에 대한 백신)일 수 있다. 본 발명에 의한 백신은 하나 이상의 MHC II 결합 펩티드, 또는 하나 이상의 MHC II 결합 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 암호화하거나, 이 핵산에 상보성인 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다.
C. 본 발명의 펩티드, 이를 제조 및 사용하는 방법
구체예에서, 본 발명의 조성물과 관련 방법은 A━x━B을 포함하며, 식 중, x는 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, A는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고, B는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함한다. 뿐만 아니라 구체예에서, 본 발명의 조성물과 관련 방법은 A━x━B━y━C를 포함하며, 식 중, x는 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, y는 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, A는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, B는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하고, C는 제3 MHC II 결합 펩티드를 포함한다.
임의의 구체예에서, x 및/또는 y(존재하는 경우)는 링커를 포함하지 않을 수 있으며, 이 경우, A, B, C 및 이것들 각각의 다양한 조합체는 본 발명의 조성물 중에 혼합물로서 존재할 수 있다. 혼합물로서 존재할 수 있는 이러한 조합체의 예로서는 A 및 B, A 및 B━y━C, A━x━B 및 C, A 및 B 및 C 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서 “및”은 결합의 부재를 의미하는데 사용되고, “━x━” 또는 “━y━”는 결합의 존재를 의미하는데 사용된다. 이와 같은 혼합물에 대한 접근 방법을 이용하면, 다수의 상이한 MHC II 결합 펩티드를 용이하게 조합하여, 예를 들어, MHC II 결합 펩티드의 잔기들을 함유하는 단일 대형 분자를 생성하는 것에 비하여 합성이 간단해지고/간단해지거나 조합체의 사용이 용이해질 수 있다. 혼합물은 전통적인 약학적 혼합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이와 같은 혼합 방법으로서는 액체-액체 혼합법, 즉 각각 하나 이상의 펩티드 세트를 함유하는 현탁액 2개 이상을 직접 배합하거나, 희석제를 함유하는 용기 하나 이상에서 혼합하는 방법을 포함한다. 펩티드는 분말형으로 생성 또는 보관될 수도 있으므로, 통상의 매질 중에 2개 이상의 분말을 재현탁하는 건조 분말-분말 혼합법을 수행할 수도 있다. 펩티드들의 특성과 이것들의 상호 작용 가능성에 따라서, 하나 또는 또 다른 혼합 경로에 이점이 제공될 수 있다.
혼합물은 통상의 약학적 제조 기술과 화합 기술을 이용하여 유용한 투여형으로 제조될 수 있다. 본 발명을 수행하는데 사용하기 적당한 기술에 관하여는 문헌[Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; and Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone]에서 찾아볼 수 있다. 구체예에서, 펩티드 혼합물을 포함하는 통상적인 본 발명의 조성물은 무기 또는 유기 완충액(예를 들어, 인산염, 탄산염, 아세트산염 또는 시트르산염의 나트륨 또는 칼륨 염) 및 pH 조정제(예를 들어, 염산, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 시트르산염 또는 아세트산염의 염, 아미노산 및 이의 염), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 알파-토코페롤), 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 폴리옥시에틸렌 9-10 노닐 페놀, 데속시콜린산나트륨), 용액 및/또는 냉동/동결 건조 안정화제(예를 들어, 수크로스, 락토스, 만니톨, 트레할로스), 삼투압 조정제(예를 들어, 염 또는 당), 항박테리아 제제(예를 들어, 벤조산, 페놀, 겐타마이신), 소포제(예를 들어, 폴리디메틸실로존), 보존제(예를 들어, 티메로살, 2-페녹시에탄올, EDTA), 중합체 안정화제 및 점도 조정제(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 폴록사머 488, 카복시메틸셀룰로오스) 및 공용매(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올)을 포함할 수 있다.
구체예에서, x 및/또는 y(존재하는 경우)는 링커를 포함할 수 있다. 구체예에서, 링커는 MHC II 결합 펩티드의 일부인 아미노산(천연 아미노산 또는 변형된 아미노산)과 직접 결합할 수 있거나, 아니면 이 링커는 원자, 바람직하게는 다수의 원자를 부가하여 MHC II 결합 펩티드를 결합시킬 수 있다. 링커는 이에 한정되는 것은 아니지만, 다수의 이유, 예를 들어 합성의 용이성과, 화학 절단, MHC II 결합 펩티드 분리, 화학적 반응 위치(예를 들어, 이황화 결합) 및/또는 프로테아제 절단 위치의 삽입의 용이함으로 인해 유용할 수 있다. 링커는 임의의 생리학적 조건 하에서 절단되는 절단성 링커와, 대상체에 투여되었을 때 본 발명의 조성물이 우발적으로 직면하게 되는 통상의 생리학적 조건 하에서 절단이 잘 되지 않는 비절단성 링커를 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, x 및/또는 y(존재하는 경우)는, 아미드 링커, 이황화물 링커, 황화물 링커, 1,4-이치환 1,2,3-트리아졸 링커, 티올 에스테르 링커, 또는 이민 링커를 포함하는 링커를 포함할 수 있다. 본 발명의 수행에 유용한 부가의 링커로서는, 티올과 산으로부터 생성되는 티올 에스테르 링커, 히드라진과 산으로부터 생성되는 하이드라지드 링커, 아민과 알데히드 또는 케톤으로부터 생성되는 이민 링커, 티올과 티오이소시아네이트로부터 생성되는 티오우레아 링커, 아민과 이미데이트 에스테르로부터 생성되는 아미딘 링커, 그리고 아민과 알데히드의 환원성 아민화로부터 생성되는 아민 링커를 포함한다. 구체예에서, x 및/또는 y(존재하는 경우)는, 펩티드 서열, 바람직하게는 리소좀 프로테아제 절단 위치(예를 들어, 카텝신 절단 위치)를 포함하는 서열, 생분해성 중합체, 치환 또는 비치환 알칸, 알켄, 방향족 또는 헤테로시클릭 링커, pH 감수성 중합체, 헤테로 2작용성 링커 또는 올리고머 글리콜 스페이서를 포함하는 서열을 포함하는 링커를 포함할 수 있다.
절단성 링커로서는 펩티드 서열, 바람직하게는 리소좀 프로테아제 절단 위치를 포함하는 펩티드 서열; 생분해성 중합체; pH 분해성 중합체 또는 이황화 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리소좀 프로테아제 절단 위치는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산염 프로테아제, 아연 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 시스테인 프로테아제(AMSH/STAMBP 카텝신 F, 카텝신 3, 카텝신 H, 카텝신 6, 카텝신 L, 카텝신 7/카텝신 1, 카텝신 O, 카텝신 A, 카텝신 S, 카텝신 B, 카텝신 V, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 X/Z/P, 카텝신 D, 레구메인)를 포함하는 리소좀 프로테아제에 의해 절단되는 것으로 특히 알려진 펩티드 서열을 포함한다. 생분해성 중합체는 다수의 생리학적 조건 하에서 분해되는 반면에, pH 분해성 중합체는 저 pH 조건(생리적 pH 미만) 하에서 빠른 속도로 분해된다. 임의의 구체예에서, 링커의 펩티드 서열은 서열 번호 99 또는 서열 번호 119에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
pmglp (서열 번호 99)
skvsvr (서열 번호 119)
부가 정보는 문헌[A. Purcell et al., “More than one reason to rethink the use of peptides in vaccine design.” J.Nat Rev Drug Discov. 2007; 5:404-14; R. Bei et al., “TAA polyepitope DNA-based vaccines: A potential tool for cancer therapy.” J Biomed Biotech. 2010 ; 102785: 1-12; W. Wriggers et al., “Control of protein functional dynamics by peptide linkers.” Biopolymers. 2005;80(6):736-46; J. Timmerman et al., “Carrier protein conjugate vaccines: the "missing link" to improved antibody and CTL responses?” Hum Vaccin. 2009 Mar;5(3):181-3' B. Law et al., “Proteolysis: a biological process adapted in drug delivery, therapy, and imaging.” Bioconjug Chem. 2009 Sep;20(9):1683-95]에서 살펴볼 수 있다.
아미드 링커는 하나의 화학 성분의 카복실기와 제2의 화학 성분 상에 존재하는 아미노기 사이에 생성된 링커이다. 이와 같은 링커들은 적당히 보호된 아미노산 또는 폴리펩티드와 화학 결합을 형성하는 통상의 아미드 링커 중 임의의 것을 이용하여 생성될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 열거한 아미드 링커는 A 및 B(또는 B 및 C 등)의 전체 합성 과정이 진행되는 동안 형성될 수 있으므로, x 및/또는 y를 간단하게 생성할 수 있다. 이와 같은 종류의 화학 결합은 절단성 결합기를 포함하도록 용이하게 배열될 수 있다.
이황화물 링커는, 예를 들어 R1-S-S-R2 형태의 2개의 황 원자 사이에 존재하는 링커이다. 이황화물 링커는 2개의 동일하거나 유사하지 않은 분자, 예를 들어 메르캅탄 치환기(-SH) 함유 펩티드의 산화 커플링 과정에 의하거나, 또는 바람직하게는 예를 들어 H2N-R1-S-S-R2-CO2H 형태(식 중, 아미노 작용기 및/또는 카복실 작용기는 적당히 보호됨)의 미리 생성된 링커를 사용하여 생성될 수 있다. 이와 같은 종류의 화학 결합은 2개의 개별 기억 펩티드를 분리시키게 될 환원 절단에 영향받기 쉽다. 면역학적으로 관심이 집중되는 표적 컴파트먼트(target compartment)인 환원 환경은 리소좀에서 확인될 수 있기 때문에, 이와 같은 특성은 매우 중요하다.
하이드라지드 및 알데히드/케톤과 같은 화학 성분은 링커를 생성하는데 사용될 수 있다. 제1 펩티드 사슬의 말단에 하이드라지드 또는 알데히드/케톤 작용기를 함유하는 제1 펩티드가 생성된다. 제2 펩티드는 이 제2 펩티드 사슬의 말단에, (만일 제1 펩티드가 알데히드/케톤을 함유하면) 하이드라지드를 함유하도록 생성되거나, 또는 (만일 제1 펩티드가 하이드라지드를 함유하면) 알데히드/케톤을 함유하도록 생성된다. 이후, 상기 2개의 펩티드는 서로 반응하여 히드라존 작용기를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 이와 같이 생성된 히드라존 결합은, 예를 들어 리소좀 내에서 확인되는 산성 조건 하에서 절단될 수 있다. 만일 링커의 안정성을 더욱 증가시키고자 한다면, (알데히드 또는 케톤과 아민을 환원적으로 아민화하여 상응하는 알킬아민을 형성하는 것과 유사하게) 히드라존을 환원시켜 상응하는 안정적(비 절단성) 알킬화 하이드라지드를 생성할 수 있다.
비 절단성 링커는 다양한 화학 성분을 이용하여 생성할 수 있으며, 다수의 상이한 물질을 이용하여 생성할 수도 있다. 일반적으로, 링커는 각각의 비 절단성 링커가 리소좀 pH 조건 하에서 12시간 초과 동안 안정적일 때 비 절단성인 것으로 간주한다. 비 절단성 링커의 예로서는 아민, 황화물, 트리아졸, 히드라존, 아미드(에스테르), 및 치환 또는 비치환 알칸, 알켄, 방향족 기 또는 복소환을 함유하는 기; 중합체; 올리고머 글리콜 스페이서; 및/또는 비 천연 아미노산 또는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다음은 몇 가지 통상적인 방법의 예들이다. 나열된 방법들은 결코 완전한 것은 아니며, 기타 다수의 방법도 가능하다.
황화물 링커로서는, 예를 들어 R1-S-R2의 형태이다. 이 링커는 메르캅탄을 알킬화하거나, 또는 마이클 부가 반응을 통해 하나의 분자, 예를 들어 펩티드 상에 존재하는 메르캅탄을, 제2 분자, 예를 들어 펩티드 상에 존재하는 활성화된 알켄에 첨가하거나, 또는 하나의 분자, 예를 들어 펩티드 상에 존재하는 메르캅탄을, 제2 분자, 예를 들어 펩티드 상에 존재하는 알켄에 라디칼 첨가함으로써, 생성될 수 있다. 상기 황화물 링커는 또한, 예를 들어 H2N-R1-S-R2-CO2H(식 중, 아미노 및/또는 카복실 작용기는 적당히 보호됨)로서 미리 생성될 수도 있다. 이러한 종류의 링커는 절단에 저항성이지만, 적당히 치환되어 보호된 2개의 펩티드를 특이적으로 연결시키는데 사용될 수 있다.
트리아졸 링커는 특히
Figure 112017059963925-pat00001
형태의 1,2,3-트리아진(식 중, R1 및 R2는 임의의 화학적 실체(chemical entity)일 수 있음)일 수 있으며, 제1 펩티드에 결합된 아지드를 제2 펩티드에 결합된 말단 알킨에 1,3-쌍극자 첨가함으로써 생성된다. 이와 같은 화학 반응에 관하여는 문헌[Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002)]에 상세히 기술되어 있으며, 이 과정을 종종 “샤프리스 클릭 화학 반응(Sharpless Click chemistry)”이라고도 부른다. 제1 펩티드 사슬 말단에 아지드 또는 알킨 작용기를 함유하는 제1 펩티드가 생성된다. 제2 펩티드는 이 제2 펩티드 사슬의 말단에, (만일 제1 펩티드가 아지드를 함유한다면) 알킨을 함유하도록 생성되거나, 또는 (만일 제1 펩티드가 알킨을 함유한다면) 아지드를 함유하도록 생성된다. 이후, 상기 2개의 펩티드는 1,2,3-트리아진 작용기를 통해 이 2개의 펩티드를 연결시키는 촉매의 존재 또는 부재 하에서, 3 + 2 고리화 첨가 반응을 통해 반응할 수 있다.
황 “클릭” 화학 반응은 링커를 생성하는데 사용될 수 있다. 제1 펩티드 사슬 말단에 메르캅탄 또는 알켄 작용기를 함유하는 제1 펩티드가 생성된다. 제2 펩티드는 이 제2 펩티드 사슬의 말단에 (만일 제1 펩티드가 메르캅탄을 함유한다면) 알켄을 함유하도록 생성되거나, 또는 (만일 제1 펩티드가 알켄을 함유한다면) 메르캅탄을 함유하도록 생성된다. 상기 2개의 펩티드는 황화물 작용기를 통하여 이 2개의 펩티드를 연결시키는 라디칼 공급원 또는 광선의 존재 하에서 반응을 할 수 있다.
마이클 첨가 화학 반응은 링커를 생성하는데 사용될 수 있다. 비록 다양한 마이클 수용체 및 공여체 쌍이 이와 같은 목적으로 사용될 수 있긴 하지만, 이 방법의 바람직한 예로서는 메르캅탄을 마이클 공여체로, 그리고 활성화된 알켄을 마이클 수용체로 사용한다. 이와 같은 화학 반응은 상기 알켄이 전자 결핍되어야 하고 라디칼 촉매 작용이 필요하지 않다는 점에서 상기 황 클릭 화학 반응과는 차이가 있다. 제1 펩티드 사슬 말단에 메르캅탄 또는 알켄 작용기를 함유하는 제1 펩티드가 생성된다. 제2 펩티드는 이 제2 펩티드 사슬의 말단에, (만일 제1 펩티드가 메르캅탄을 함유한다면) 알켄을 함유하도록 생성되거나, 또는 (만일 제1 펩티드가 알켄을 함유한다면) 메르캅탄을 함유하도록 생성된다. 상기 2개의 펩티드는 이 2개의 펩티드를 황화물 작용기를 통해 연결시키는 산 또는 염기의 존재 하에서 반응할 수 있다.
구체예에서, A 및 B; A 및 C, B 및 C, 그리고 A, B 및 C는 각각 상이한 MHC II 결합 레파토리를 가지는 펩티드를 포함한다. DP, DQ 및 DR은 독립적인 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 이계 결혼한 사람의 모집단에는 DP, DQ 및 DR의 변이 유전자(대립 유전자)가 다수 존재하며, 각각의 대립 유전자는 상이한 특징적인 펩티드 결합을 가진다. 예를 들어, 특정 천연 HLA-DP 결합 펩티드는 어떤 DP 대립 유전자와는 결합할 수 있지만, 다른 DP 대립 유전자와는 결합할 수 없다. 펩티드 “결합 레파토리”란, 개별적인 펩티드가 결합하는 DP, DQ 및/또는 DR에서 발견되는 대립 유전자들을 조합한 것을 말한다. 모든 DP, DQ 및/또는 DR 대립 유전자와 결합하여, 사람에서 100%를 포함하여 최대 100%까지의 높은 백분율로 기억 회상 반응을 일으키는 펩티드 및/또는 이것의 조합체를 확인함으로써, 백신의 효능을 개선시키는 수단을 제공한다.
구체예에서, A와 B는 각각 상이한 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 서열을 포함한다. 구체예에서, A, B 및 C는 각각 상이한 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드의 서열을 포함한다. 구체예에서, 바람직한 펩티드 서열은 T-세포에 의해 인지될 수 있는 단백질 에피토프 또는 펩티드 서열일 수 있다. 바람직한 펩티드 서열로서는 클로스트리듐 테타니, B형 간염 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 백시니아 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 라우스 육종 바이러스(RSV), 거대 세포 바이러스(CMV), 수두-대상 포진 바이러스(VZV), 볼거리 바이러스, 코린박테리움 디프테리아, 사람 아데노바이러스, 두창 바이러스, 및/또는 사람을 감염시켜 감염을 개시함으로써 이 감염된 감염성 유기체에 특이적인 사람 CD4+ 기억 세포를 생성시킬 수 있는 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 MHC II 결합 펩티드를 포함한다. 구체예에서, MHC II 결합 펩티드는, 클로스트리듐 테타니, B형 간염 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 백시니아 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 라우스 육종 바이러스(RSV), 거대 세포 바이러스(CMV), 수두-대상 포진 바이러스(VZV), 볼거리 바이러스, 코린박테리아 디프테리아, 사람 아데노바이러스, 두창 바이러스, 및/또는 사람을 감염시켜 감염을 개시함으로써 이 감염된 감염성 유기체에 특이적인 사람 CD4+ 기억 세포를 생성시킬 수 있는 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 천연 HLA-DP 결합 펩티드, 천연 HLA-DQ 결합 펩티드 및/또는 천연 HLA-DR 결합 펩티드와의 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99%인 펩티드를 포함한다. 구체예에서, A, B 및 C는, 이하 실시예 1~6에 개략적으로 기술된 일반적인 기법을 이용하여 최적의 면역 반응을 제공하도록 선택된다.
임의의 구체예에서, 생물계 내에서의 가공 및 제조의 용이성을 제공하고/제공하거나, 전달능을 개선하기 위한 목적으로, MHC II 결합 펩티드의 수용성을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이를 위해서, 친수성 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산을 부가하거나, 결합 위치들 간에 아미노산 서열을 부가하거나 이 위치들 간에 존재하는 아미노산 서열을 변형시키거나, 또는 결합 위치 아미노산을 치환함으로써 친수성을 증가시킬 수 있다. 친수성이 증가하였는지 여부는, 예를 들어 저차원 그라비 반응(lower GRAVY), 소수성 분석에 관한 그랜드 평균(Grand Average of Hydropathy), 스코어를 통하여 확인할 수 있다. 가능한 경우, 결합 친화도에 미칠 수 있는 잠재적인 부정적인 효과를 피하거나 제한하도록, 가망있는 변법 디자인을 변경할 수 있다.
한가지 잠재적인 변형 경로로서는, 특히, 측접하는 아미노산이 펩티드의 평균 친수성 또는 국소 친수성을 증가시키는 경우, 결합 위치 에피토프에 인접한 아미노산에 비 결합 위치 아미노산을 부가하는 것이 있다. 즉, 만일 천연의 상태에서 연장된 서열 내 결합 위치 에피토프에 친수성 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단쪽 방향으로 측접하면, 펩티드 내 측접 친수성 아미노산 중 일부를 보존함으로써 수용성을 증가시킬 수 있다. 용해도를 증가시킬 측접 서열의 부재시, 또는 친수성을 더욱 증가시키기를 원하는 경우, 천연 서열에 대한 유사성을 바탕으로 하여 비 천연 부가 반응을 이상적으로 수행할 수 있다. 아미노산의 유사성은 블러섬 45(Blosum 45) 또는 팸 250 매트릭스(PAM 250 matrix)와 같은 지수나 기타 당업계에 공지된 수단으로 판단할 수 있다. 예를 들어, 만일 에피토프의 그라비 스코어가 -1.0이고, 이 에피토프가 N-말단에서 천연 아미노산 서열 EASF(그라비 = 0.075)가 앞에 존재한다면, EASF를 포함하도록 펩티드를 연장시킬 경우 그라비 스코어가 낮아질 것이다. 대안적으로, 상기 EASF에 대한 하나 이상의 치환을 통하여, A가 S로, S가 N으로, 또는 F가 Y로 치환된(예를 들어, 이지(EASY), 그라비 = -0.95인) 서열이 생성되거나, 아니면 절단과 치환(예를 들어, NY, 그라비 = -2.4)을 통하여 친수성을 증가시킬 수도 있다.
일부 경우에 있어서, 예를 들어 소수성 담체 매트릭스 내 포집률을 개선하기 위하여, 펩티드의 수용성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 경우, 전술한 바와 유사하되 친수성은 감소시키는 첨가 및 치환 반응이 진행될 수 있다.
하나 이상의 pH 값에서 순 펩티드 전하를 조절는 것 또한 유리할 수도 있다. 예를 들어, 펩티드의 pI(등전 pH)에서 최소 용해도가 관찰될 수 있다. pH 7.4에서의 용해도를 감소시키고, pH 3.0에서의 용해도를 증가시키기를 원한다면, pI를 7.4로 만들고, pH 3.0에서 상당 수준으로 순 양전하를 띠도록 만들기 위하여 아미노산 서열을 대상으로 변형 또는 부가 반응을 수행할 수 있다. 염기성 펩티드의 경우에는, 산성 잔기, 예를 들어 E 또는 D를 부가하거나, 또는 K를 E로 치환하는 것이 pI를 감소시킬 수 있는 변형예이다.
펩티드의 생물학적 또는 화학적 안정성은 또한 당업계에 공지된 기술을 이용하여 아미노산 또는 말단 변형기를 부가하거나 치환함으로써 개선될 수도 있다. 그 예로서는 아미드화 및 아세틸화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 치환, 예를 들어 C-말단 Q(Gln)를, 재배열에 영향을 덜 받는 기타 아미노산 또는 L로 치환하는 것을 포함할 수도 있다.
구체예에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 폴리펩티드의 서열에 포함되는 아미노산 서열은 서열 번호 1~46에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와의 동일성이 적어도 75%이고, 바람직하게 상기 폴리펩티드는 본원의 다른 곳에 기술되어 있는 바와 같은 MHC II 분자와 결합한다:
NNFTVSFWLRVPKVSASHLET (서열 번호 1) (21, TT317557(950-969));
TLLYVLFEV (서열 번호 2) (9, AdVhex64950(913-921));
ILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 3) (15, TT27213(830-841));
QSIALSSLMVAQAIPLVGEL (서열 번호 4) (20, DT 52336(331-350));
TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET (서열 번호 5) (30, AdVTT950);
TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 6) (24, AdVTT830);
ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL (서열 번호 7) (35, TT830DT);
QSIALSSLMVAQAIPLVGELILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 8) (35, DTTT830);
ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ (서열 번호 9) (27, TT830DTtrunc);
QSIALSSLMVAQAIILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 10) (29, DTtruncTT830);
TLLYVLFEVPMGLPILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 11) (29, AdVpmglpiTT830);
TLLYVLFEVKVSVRILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 12) (29, AdVkvsvrTT830);
ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ (서열 번호 13) (32, TT830pmglpDTTrunc 또는 TT830pDTt);
ILMQYIKANSKFIGIKVSVRQSIALSSLMVAQ (서열 번호 14) (32, TT830kvsvrDTTrunc1);
TLLYVLFEVQSIALSSLMVAQ (서열 번호 15) (21, AdVDTt);
TLLYVLFEVpmglpQSIALSSLMVAQ (서열 번호 16) (26, AdVpDTt);
TLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQ (서열 번호 17) (26, AdVkDTt);
TLLYVLFEVpmglp NNFTVSFWLRVPKVSASHLET (서열 번호 18) (35, AdVpTT950);
TLLYVLFEVkvsvr NNFTVSFWLRVPKVSASHLET (서열 번호 19) (35, AdVkTT950);
ILMQYIKANSKFIGI QSIALSSLMVAQTLLYVLFEV (서열 번호 20) (36, TT830DTtAdV);
TLLYVLFEV ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ (서열 번호 21) (36, AdVTT830DTt);
QSIALSSLMVAQAIPLV (서열 번호 22) (17, DTt-3);
IDKISDVSTIVPYIGPALNI (서열 번호 23) (20, TT632)
QSIALSSLMVAQAIPLVIDKISDVSTIVPYIGPALNI (서열 번호 24) (37, DTt-3TT632);
IDKISDVSTIVPYIGPALNIQSIALSSLMVAQAIPLV (서열 번호 25) (37, TT632DTt-3);
QSIALSSLMVAQAIPLVpmglpIDKISDVSTIVPYIGPALNI (서열 번호 26) (43, DTt-3pTT632);
IDKISDVSTIVPYIGPALNIpmglpQSIALSSLMVAQAIPLV (서열 번호 27) (43, TT632pDTt-3);
YVKQNTLKLAT (서열 번호 28) (11, minX);
CYPYDVPDYASLRSLVASS (서열 번호 29) (19, 7430);
NAELLVALENQHTI (서열 번호 30) (14, 31201t);
TSLYVRASGRVTVSTK (서열 번호 31) (16, 66325);
EKIVLLFAIVSLVKSDQICI (서열 번호 32) (20, ABW1);
QILSIYSTVASSLALAIMVA (서열 번호 33) (20, ABW2);
MVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSI (서열 번호 34) (24, ABP);
EDLIFLARSALILRGSV (서열 번호 35) (17, AAT);
CSQRSKFLLMDALKLSIED (서열 번호 36) (19, AAW);
IRGFVYFVETLARSICE (서열 번호 37) (14, IRG);
TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (서열 번호 38) (21, TFE);
LIFLARSALILRkvsvrNAELLVALENQHTI (서열 번호 39) (31, AATk3120t);
NAELLVALENQHTIkvsvrLIFLARSALILR (서열 번호 40) (31, 3120tkAAT);
ILSIYSTVASSLALAIkvsvrLIFLARSALILR (서열 번호 41) (33, ABW2kAAT);
LIFLARSALILRkvsvrILSIYSTVASSLALAI (서열 번호 42) (33, AATkABW2);
LIFLARSALILRkvsvrCSQRSKFLLMDALKL (서열 번호 43) (32, AATkAAW);
CSQRSKFLLMDALKLkvsvrLIFLARSALILR (서열 번호 44) (32, AAWkAAT);
TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL IRGFVYFVETLARSICE (서열 번호 45) (38, TFEIRG) (서열 번호 103); 또는
IRGFVYFVETLARSICE TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (서열 번호 46) (38, IRGTFE) (서열 번호 104).
본 발명에 의한 펩티드, 특히 MHC II 결합 펩티드는 다양한 통상의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 임의의 구체예에서, 펩티드는 표준적인 방법, 예를 들어 메리필드 수지(Merrifield's resin) 또는 이와 유사한 수지를 사용하는 고형 지지체 상에서의 합성법으로 합성에 의해 제조될 수 있다. 펩티드는 상기와 같은 합성법에 사용하도록 디자인한 기계를 사용하거나 사용하지 않고도 제조할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 본 발명에 의한 펩티드, 특히 MHC II 결합 펩티드를 발현시키기 위해 재조합 기술을 사용할 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 전체 펩티드 서열(그리고, 가능하다면 링커 서열)을 암호화하는 핵산은 세포주에 형질 감염시 전사될 발현 벡터에 클로닝될 것이다. 구체예에서, 발현 벡터는 특히 플라스미드, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 등을 포함할 수 있다. 상기 펩티드(그리고, 만일 존재한다면, 결합기)의 DNA는 표준적인 분자생물학적 접근 방법, 예를 들어 중합 효소 연쇄 반응을 통해 분리되어 DNA 단편을 생성할 수 있는데, 이후 이 DNA 단편은 정제되어, 발현 벡터에 클로닝되거나 세포주에 형질 감염된다. 본 발명의 수행에 유용한 부가의 기술에 관하여는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology 2007 by John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Cold Spring Harbor]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 재조합 펩티드는 상이한 유기체들로부터 유래하는 세포, 예를 들어 CHO 세포, 곤충 세포(예를 들어, 바큘로바이러스 발현용), 이.콜라이 등을 사용하는 몇 가지 방법을 통해 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 단백질을 최적으로 번역하기 위해서, 핵산 서열은 세포가 유래하는 유기체에서 일반적으로 사용되는 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다. 서열 번호 1~46은 파상풍 변성 독소, 디프테리아 독소 및 아데노바이러스 펩티드로부터 얻어지거나 유래하는 서열의 예를 포함하고, 서열 번호 47~68은 사람 및 이.콜라이에서 선호되는 코돈 선호도(codon usage)를 바탕으로 하는 균등 DNA 서열을 포함한다. 특정 종에서의 코돈 선호도에 대해 최적화된 DNA를 사용하면, 최적의 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 코돈 출현 빈도(codon frequency)는, 예를 들어 다양한 코돈 선호도 기록으로부터 입수할 수 있는 출현 빈도 데이터를 이용하여, 사람에서 사용할 수 있도록 최적화할 수 있다. 이와 같은 기록 중 하나가 코돈 선호도 데이터베이스(Codon Usage Database)이다(Y. Nakamura et al., “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.” Nucl. Acids Res. 28, 292 (2000)).
구체예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 제공된 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 이와 같은 핵산은 A, B 또는 C, 아니면 이것들의 조합체를 암호화할 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA, 예를 들어 mRNA일 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상보체, 예를 들어 전장 상보체, 또는 본원에 제공된 핵산 중 임의의 것의 (유전자 암호의 축퇴성으로 인한) 축퇴체를 포함한다.
구체예에서, 핵산은 A━x━B를 암호화하며, 식 중 x는 아미드 링커 또는 펩티드 링커이고, A는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, B는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함한다. 뿐만 아니라, 구체예에서 핵산은 A━x━B━y━C를 암호화하며, 식 중 x는 아미드 링커 또는 펩티드 링커이고, y는 아미드 링커 또는 펩티드 링커이며, A는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하고, B는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하며, C는 제3 MHC II 결합 펩티드를 포함한다.
관심의 대상인 임의의 서열을 이하에 나열하였다. 천연 서열은 조성물 1(C1)이다. 사람의 코돈 선호도에 따른 출현 빈도를 바탕으로 하여 합성한 최선의 사람 서열은 조성물 2(C2)이다. 전환 과정은 서열 조작 슈트(The Sequence Manipulation Suite)(단백질과 DNA 서열의 분석 및 포맷용인 자바 스크립트(JavaScript) 프로그램(Biotechniques 28:1102-1104. http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html))를 이용하여 수행하였다.
TT950: NNFTVSFWLRVPKVSASHLET (서열 번호 1)
C1: aataattttaccgttagcttttggttgagggttcctaaagtatctgctagtcatttagaa (서열 번호 47) AF154828 250-309
C2(사람):
aacaacttcaccgtgagcttctggctgagagtgcccaaggtgagcgccagccacctggagacc (서열 번호 48)
AdV: TLLYVLFEV (서열 번호 2)
C1: acgcttctctatgttctgttcgaagt (서열 번호 49)
FJ025931 20891-20917
C2(사람):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtg (서열 번호 50)
TT830: ILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 3)
C1: attttaatgcagtatataaaagcaaattctaaatttataggtata (서열 번호 51)
X06214 2800-2844
C2(사람):
Atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (서열 번호 52)
DT: QSIALSSLMVAQAIPLVGEL (서열 번호 4)
C1: caatcgatagctttatcgtctttaatggttgctcaagctataccattggtaggagagcta (서열 번호 53)
FJ858272 1066-1125
C2(사람):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg (서열 번호 54)
키메라 에피토프:
AdVTT950: TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET (서열 번호 5)
C2(사람):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaacaacttcaccgtgagcttctggctgagagtg
cccaaggtgagcgccagccacctggagacc (서열 번호 55)
AdVTT830: TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 6)
C2(사람):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaag
ttcatcggcatc (서열 번호 56)
TT830 DT: ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL (서열 번호 7)
C2(사람):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccctg
agcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg (서열 번호 57)
DT TT830: QSIALSSLMVAQAIPLVGELILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 8)
C2(사람):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc (서열 번호 58)
TT830DTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ (서열 번호 9)
C2(사람):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccctg
agcagcctgatggtggcccag (서열 번호 59)
DT trunc TT830: QSIALSSLMVAQAIILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 10)
C2(사람):
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatcatcctgatgcagtacatc
aaggccaacagcaagttcatcggcatc (서열 번호 60)
예측된 키메라 카텝신 절단 보편 에피토프
AdVpmglpTT830: TLLYVLFEVPMG.LPILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 11)
C1 (이.콜라이):
accctgctgtatgtgctgtttgaagtgccgatgggcctgccgattctgatgcagtatatt
aaagcgaacagcaaatttattggcatt (서열 번호 61)
C2(사람):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgcccatgggcctgcccatcctgatgcagtacatc
aaggccaacagcaagttcatcggcatc (서열 번호 62)
AdVkvsvrTT830: TLLYVLFEVKVS.VRILMQYIKANSKFIGI (서열 번호 12)
C1 (이.콜라이):
accctgctgtatgtgctgtttgaagtgaaagtgagcgtgcgcattctgatgcagtatatt
aaagcgaacagcaaatttattggcatt (서열 번호 63)
C2(사람):
accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaaggtgagcgtgagaatcctgatgcagtacatc
aaggccaacagcaagttcatcggcatc (서열 번호 64)
TT830pmglpDTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIPMG.LPQSIALSSLMVAQ (서열 번호 13)
C1(이.콜라이):
attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattccgatgggcctgccg
cagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag (서열 번호 65)
C2(사람):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccccatgggcctgccc
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag (서열 번호 66)
TT830kvsvrDTtrunc: ILMQYIKANSKFIGIKVS.VRQSIALSSLMVAQ (서열 번호 14)
C1(이.콜라이):
attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattaaagtgagcgtgcgc
cagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag (서열 번호 67)
C2(사람):
atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatcaaggtgagcgtgaga
cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag (서열 번호 68)
구체예에서, 펩티드 링커는 리소좀 프로테아제 절단 위치(예를 들어, 카텝신 절단 위치)를 포함한다. 임의의 구체예에서, 펩티드 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 69 또는 70에 제시한 핵산 서열, 이의 축퇴체 또는 상보체를 포함한다.
ccgatgggcctacca (서열 번호 69)
aaggtctcagtgagaac (서열 번호 70)
구체예에서, 본 발명의 핵산에 의해 암호화된 A, B 및/또는 C의 천연 HLA-DP, HLA-DQ 또는 HLA-DR 결합 펩티드에 대한 동일성은 적어도 70%이다. 임의의 구체예에서, 핵산에 의해 암호화된 A, B 및/또는 C의 천연 HLA-DP, HLA-DQ 또는 HLA-DR 결합 펩티드에 대한 동일성은, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99%이다. 이와 같은 핵산은 제II군 MHC 분자와 결합하는 펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다.
그러므로 구체예에서, 핵산은 천연 HLA-DP, HLA-DQ 또는 HLA-DR 결합 펩티드를 암호화하는 핵산 서열과의 동일성이 적어도 60%인 핵산 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 천연 HLA-DP, HLA-DQ 또는 HLA-DR 결합 펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 대한 핵산의 동일성은, 바람직하게는 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99%이다.
인터넷(ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/)을 통하여 입수할 수 있는 소프트웨어 도구로서 NCBI(미국 매릴랜드 베데스다 소재)에 의해 개발된, 공중이 이용 가능한 다수의 소프트웨어 도구를 사용하여 동일성 %를 계산할 수 있다. 대표적인 도구로서는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능한 BLAST 시스템을 포함한다. 맥벡터(MacVector) 서열 분석 소프트웨어(Oxford Molecular Group)를 이용하여, 2쌍 정렬 결과 및 클러스탈 W(Clustal W) 정렬 결과[블러섬 30 매트릭스 세팅], 그리고 카이트-두리틀 소수성 분석 결과를 얻을 수 있다. 또한 전술한 핵산의 왓슨-크릭 상보체(전장 상보체 포함)도 본 발명에 포함된다.
뿐만 아니라, 본원에는 본원에 제공된 핵산 중 임의의 것에 혼성화되는 핵산이 제공된다. 표준적인 핵산 혼성화 방법을 사용하여, 선택된 동일성 %를 가지는 관련 핵산 서열들을 확인할 수 있다. 본원에 사용된 “엄중한 조건(stringent condition)”이란 용어는, 당업자에게 알려진 매개 변수를 의미한다. 이와 같은 매개 변수로서는 염, 온도, 프로브 길이 등을 포함한다. 생성된 염기가 혼성화될 때의 미스 매칭률은 거의 0%(“고 엄중도(high stringency)”)에서부터 약 30%(“저 엄중도(low stringency)”)의 범위일 수 있다. 고 엄중도 조건의 일례로서는 혼성화 완충액(3.5X SSC, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5mM NaH2PO4(pH7), 0.5% SDS, 2mM EDTA) 중 65℃에서 혼성화하는 것이 있다. SSC는 0.15M 염화나트륨/0.015M 시트르산나트륨(pH7)이고; SDS는 소듐 도데실 설페이트이며; EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산이다. 혼성화 이후, 핵산이 옮겨간 막을, 예를 들어 2X SSC 중에서 세정한 다음(실온), 0.1~0.5X SSC/0.1X SDS에서 세정한다(68℃ 이하).
구체예에서, 핵산은 프로모터와 작동 가능하도록 결합될 수 있다. 원핵 생물 조절 부위를 사용하여 원핵 생물 숙주 내에서 발현을 진행시킬 수 있다. 진핵 생물 숙주 내에서의 발현은 진핵 생물 조절 부위를 사용하여 진행될 수 있다. 일반적으로, 상기와 같은 부위는 RNA 합성을 개시하기에 충분한 프로모터 부위를 포함할 것이다. 구체예에서, 핵산은 숙주의 성질에 따라서 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열을 추가로 포함할 수도 있다. 전사 조절 신호 및 번역 조절 신호는 바이러스 공급원, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 유인원 바이러스 등으로부터 얻을 수 있거나 유래할 수 있다.
구체예에서, 핵산은 원하는 서열을 숙주 세포 염색체에 통합시킬 수 있는 벡터에 삽입된다. mRNA를 최적으로 합성하기 위해서는 또한 부가 요소가 필요할 수도 있다. 이와 같은 요소로서는 스플라이싱 신호와, 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
구체예에서, 핵산은 수용체 숙주 내에서 자율 복제할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 통합된다. 다양한 벡터 중 임의의 것, 예를 들어 원핵 생물 벡터 및 진핵 생물 벡터가 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있다. 상기 진핵 생물 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터로서는 수두 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 다수의 레트로바이러스 벡터 중 임의의 것을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 바이러스 벡터는 삽입된 DNA 또는 삽입된 RNA를 발현시키는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스를 포함한다.
벡터 또는 기타 구조물은 다수의 적당한 수단 중 임의의 것, 즉 형질 전환, 형질 감염, 컨쥬게이트화, 원형질체 융합, 전기 천공, 인산칼슘 침전법 또는 직접 미세 주입법 등에 의해 적당한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 뿐만 아니라, DNA 또는 RNA는 세포에 직접 주입될 수 있거나, 아니면 미세 입자 또는 나노입자, 예를 들어 본원에 제공된 합성 나노담체에 부착된 이후에 세포 막을 통과할 수 있다.
D. 본 발명의 펩티드의 용도: 조성물 및 방법
본 발명의 조성물은 임의의 적당한 방식으로 제조될 수 있으며, 본 발명은 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조될 수 있는 조성물에 제한되는 것은 아니라는 사실을 이해해야 할 것이다. 적당한 방법을 선택함에 있어서는 결합할 특정 부위들의 특성에 주의를 기울여야 할 것이다.
본 발명의 조성물은 다수의 투여 경로, 예를 들어 비경구 투여 경로(예를 들어, 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 피 내); 구강; 비강 내, 점막 내, 직장; 눈 또는 경피 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본원에 기술된 조성물과 방법은, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 사용할 수 있다. 본원에 기술된 조성물과 방법은 병태, 예를 들어 암, 감염성 질병, 대사성 질병, 퇴행성 질병, 자가 면역성 질병, 염증성 질병, 면역학적 질병 또는 기타 질환 및/또는 병태를 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조성물과 방법은 또한 중독증, 예를 들어 니코틴 중독증 또는 마약 중독증을 치료하는데 사용될 수도 있다. 본원에 기술된 조성물과 방법은 또한 독소, 유해 물질, 환경 독소 또는 기타 유해 제제에 노출됨으로 인해 유발되는 병태를 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수도 있다. 본원에 기술된 조성물과 방법은 또한 예를 들어 본원에 제공된 조성물이 생체 내 또는 시험관 내에서 T-세포와 접촉하게 될 때, T-세포 증식 또는 시토킨 생성을 유도하거나 증강시키는데 사용될 수도 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 컨쥬게이트 또는 비 컨쥬게이트 또는 백신과 함께 투여될 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 조성물은 담체 펩티드 또는 단백질이나, 하나 이상의 항원에 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 유용한 담체로서는 컨쥬게이트 백신에 유용한 것으로 알려진 담체 단백질, 예를 들어 파상풍 변성 독소(TT), 디프테리아 변성 독소(DT), 디프테리아 독소의 무독성 돌연 변이체, CRM197, B군 엔. 뇌수막염으로부터 유래하는 외막 단백질 복합체, 그리고 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 포함한다. 기타 담체는 본원의 다른 곳에 기술되어 있는 합성 나노담체와, 통상적으로 알려져 있는 기타 담체를 포함할 수 있다.
컨쥬게이트화는 통상의 공유 또는 비공유 컨쥬게이트화 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 이와 같이 컨쥬게이트화된 백신 또는 종래의 백신에 본 발명의 조성물을 사용함에 있어서 유용한 기술로서는 문헌[MD Lairmore et al., “Human T-lymphotropic virus type 1 peptides in chimeric and multivalent constructs with promiscuous T-cell epitopes enhance immunogenicity and overcome genetic restriction.” J Virol. Oct;69(10):6077-89 (1995); CW Rittershause et al., “Vaccine-induced antibodies inhibit CETP activity in vivo and reduce aortic lesions in a rabbit model of atherosclerosis.” Arterioscler Thromb Vasc Biol. Sep;20(9):2106-12 (2000); MV Chengalvala et al., “Enhanced immunogenicity of hepatitis B surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid.” Vaccine. Mar 5;17(9-10):1035-41 (1999). NK Dakappagari et al., “A chimeric multi-human epidermal growth factor receptor-2 B cell epitope peptide vaccine mediates superior antitumor responses.” J Immunol. Apr 15;170(8):4242-53 (2003); JT Garrett et al. “Novel engineered trastuzumab conformational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu.” J Immunol. Jun 1;178(11):7120-31 (2007)]에 일반적으로 기재된 기술들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 비이클 중에서 항원이나 통상의 백신과 혼합되어 주사 혼합물로 제조될 수 있다. 이 혼합물은 유용한 투여형으로 제형화하는 통상의 약학적 제조 기술 및 화합 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명을 수행하는데 사용하기 적당한 기술에 관하여는 다수의 문헌[M.F. Powell et al., Vaccine Design, 1995 Springer-Verlag publ.; or L. C. Paoletti et al. eds., Vaccines: from Concept to Clinic. A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccines for Human Use 1999 CRC Press publ.]에서 살펴볼 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체예에서, 본 발명의 조성물은 합성 나노담체와 함께 사용될 수 있다. 광범위한 합성 나노담체를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 구체 또는 회전 타원체이다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 평평하거나 또는 플레이트 모양이다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 입방체 또는 입방형이다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 타원형(oval) 또는 타원(ellipse)이다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 원통, 원뿔, 또는 피라미드이다.
크기, 모양, 및/또는 조성의 관점에서 상대적으로 균일한 합성 나노담체의 개체군을 사용하여 각 합성 나노담체가 유사한 특징을 갖는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 합성 나노담체의 총 수를 기준으로 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 합성 나노담체의 평균 직경 또는 평균 크기의 5%, 10%, 또는 20%의 범위 내에 최소 크기 또는 최대 크기를 가질 것이다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체의 개체군은 크기, 모양, 및/또는 조성에 대하여 이질적일 수 있다.
합성 나노담체는 고체이거나 또는 속이 비었을 수 있고 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 각 층은 다른 층(들)과 비교해 고유한 조성 및 고유한 특성을 가진다. 한 가지 예를 들자면, 합성 나노담체는 코어/쉘 구조를 가질 수 있고, 여기에서 코어는 일 층(예를 들어, 중합성 코어)이고 쉘은 제 2층(예를 들어, 지질 이중층 또는 단분자층)이다. 합성 나노담체는 다수의 상이한 층을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 합성 나노담체는 선택적으로 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 리포좀을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 지질 단분자층을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 미셀(micelle)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 지질층(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)으로 둘러싸인 중합성 매트릭스를 포함하는 코어를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 지질층(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)으로 둘러싸인 비중합성 코어(예를 들어, 금속 입자, 양자점(quantum dot), 세라믹 입자, 뼈 물질, 바이러스성 입자, 단백질, 핵산, 탄수화물 등)를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 합성 나노담체는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 그러한 중합체는 코팅층(예를 들어, 리포좀, 지질 단분자층, 미셀 등)으로 둘러싸일 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체의 다양한 요소는 중합체와 결합할 수 있다.
일부 구체예에서, 면역특징 표면, 표적화 부분, 올리고뉴클레오티드 및/또는 다른 요소는 중합성 매트릭스와 공유 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 공유 결합은 링커에 의해 매개된다. 일부 구체예에서, 면역특징 표면, 표적화 부분, 올리고뉴클레오티드 및/또는 다른 요소는 비공유적으로 중합성 매트릭스와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 면역특징 표면, 표적화 부분, 올리고뉴클레오티드 및/또는 다른 요소는 중합성 매트릭스내에 캡슐화되거나, 중합성 매트릭스로 둘러싸이거나, 또는 중합성 매트릭스에서 분산될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 면역특징 표면, 표적화 부분, 올리고뉴클레오티드 및/또는 다른 요소는 소수성 상호작용, 전하 상호작용, 반데르발스 힘 등에 의해 중합성 매트릭스와 회합할 수 있다.
광범위하게 다양한 중합체와 그 중합체로부터 중합성 매트릭스를 형성하는 방법이 통상적으로 알려져 있다. 일반적으로, 중합성 매트릭스는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 중합체는 천연 또는 비천연(합성) 중합체일 수 있다. 중합체는 단일중합체 또는 둘 이상의 단량체를 포함하는 공중합체일 수 있다. 시퀀스의 관점에서, 공중합체는 랜덤, 블록일 수 있거나 또는 랜덤 및 블록 시퀀스의 조합을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 중합체는 유기 중합체이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 중합체의 예는, 그 제한되지 않는 예로 폴리에틸렌, 폴리카보네이트(예를 들어, 폴리(1,3-디옥산-2온)), 폴리안하이드라이드(예를 들어, 폴리(세바식 안하이드라이드)(poly(sebacic anhydride)), 폴리프로필퓨메레이트(polypropylfumerate), 폴리아미드(예를 들어, 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시산(예를 들어, 폴리(β-하이드록시알카노에이트))), 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 및 폴리아민, 폴리리신, 폴리리신-PEG 공중합체, 및 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌이민)-PEG 공중합체을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 중합체는 21 C.F.R. § 177.2600 하에서 미국 FDA(U.S. Food and Drug Administration(FDA))가 인간에 사용하는 것을 승인한 중합체를 포함하며, 그 제한되지 않는 예로 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락트산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리(1,3-디옥산-2온)); 폴리안하이드라이드(예를 들어, 폴리(세바식 안하이드라이드)); 폴리에테르(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜); 폴리우레탄; 폴리메타크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 중합체는 친수성일 수 있다. 예를 들어, 중합체는 음이온기(예를 들어, 포스페이트기, 설페이트기, 카르복실레이트기); 양이온기 (예를 들어, 4급 아민기); 또는 극성기(예를 들어, 히드록실기, 티올기, 아민기)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 친수성 중합성 매트릭스를 포함하는 합성 나노담체는 합성 나노담체 내에 친수성 환경을 생성한다. 일부 구체예에서, 중합체는 소수성일 수 있다. 일부 구체예에서, 소수성 중합성 매트릭스를 포함하는 합성 나노담체는 합성 나노담체 내에 소수성 환경을 생성한다. 중합체의 친수성 또는 소수성의 선택은 합성 나노담체 내에 포함된(예를 들어, 커플링된) 물질의 성질에 영향을 줄 수 있다.
일부 구체예에서, 중합체는 하나 이상의 부분 및/또는 작용기(functional group)로 개질될 수 있다. 다양한 부분 또는 작용기가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 탄수화물, 및/또는 폴리사카라이드로부터 유도된 비고리형 폴리아세탈로 개질될 수 있다(Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). 임의의 구체예는 미국 특허 제5,543,158호(Gref et al.) 또는 WO 공보 WO 2009/051837호(Von Andrian et al.)의 일반적인 교시 사항을 이용하여 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, 중합체는 지질 또는 지방산 기로 개질될 수 있다. 일부 구체예에서, 지방산 기는 부티르산(butyric acid), 카프로산(caproic acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프릭산(capric acid), 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 베헨산(behenic acid), 또는 리그노세르산(lignoceric acid) 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구체예에서, 지방산 기는 팔미톨레산(palmitoleic acid), 올레산(oleic acid), 바크센산(vaccenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀레산(alpha-linoleic acid), 감마-리놀레산(gamma-linoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 가돌레산(gadoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), 또는 에루스산(erucic acid) 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구체예에서, 중합체는 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)와 같이 본원에서 집합적으로 “PLGA”로 칭해지는 락트산 및 글리콜산 단위를 포함하는 공중합체; 및 본원에서 “PGA”로 칭해지는 글리콜산 단위를 포함하는 단일중합체 및 본원에서 집합적으로“PLA”로 칭해지는 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락타이드, 폴리-D-락타이드 및 폴리-D, L-락타이드와 같은 락트산 단위를 포함하는 단일중합체를 포함하는 폴리에스테르일 수 있다. 일부 구체예에서, 예시적인 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리하이드록시산; PEG 공중합체 및 락타이드와 글리콜라이드의 공중합체(예를 들어, PLA-PEG 공중합체, PGA-PEG 공중합체, PLGA-PEG 공중합체, 및 이의 유도체)를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-PEG 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-L-리신), 폴리(세린 에스테르), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 및 이의 유도체를 포함한다.
일부 구체예에서, 중합체는 PLGA일 수 있다. PLGA는 락트산과 글리콜산의 생체적합성 및 생분해성 공중합체이며, PLGA의 다양한 형태는 락트산:글리콜산의 비율로 특징지워진다. 락트산은 L-락트산, D-락트산, 또는 D,L-락트산일 수 있다. PLGA의 분해속도는 락트산:글리콜산 비율을 변경함으로써 조정할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라서 사용되는 PLGA는 대략 85:15, 대략 75:25, 대략 60:40, 대략 50:50, 대략 40:60, 대략 25:75, 또는 대략 15:85의 락트산:글리콜산의 비율로 특징지워진다.
일부 구체예에서, 중합체는 하나 이상의 아크릴성 폴리머일 수 있다. 임의의 구체예에서, 아크릴성 폴리머는, 예를 들어 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴산 안하이드라이드), 메틸 메타크릴레이트, 폴리 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체, 폴리시아노아크릴레이트, 및 전술한 중합체의 하나 이상을 포함하는 조합을 포함한다. 아크릴성 중합체는 4급 암모늄기를 저함량 포함하는 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 완전히 중합된 공중합체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 중합체는 양이온성 중합체일 수 있다. 일반적으로, 양이온성 중합체는 핵산(예를 들어, DNA 또는 이의 유도체)의 음으로 하전된 가닥을 축합 및/또는 보호할 수 있다. 폴리(리신)(Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; 및 Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), 폴리(에틸렌 이민)(PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297), 및 폴리(아미도아민) 덴드리머(Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; 및 Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372)와 같은 아민 함유 중합체는 생리적 pH에서 양으로 하전되고, 핵산과 이온쌍을 형성하며, 다양한 세포주의 형질 감염을 매개한다. 구체예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 양이온성 중합체를 포함하지 않을 수 있다(또는 배제할 수 있다).
일부 구체예에서, 중합체는 양이온성 측쇄를 포함한 생분해성 폴리에스테르일 수 있다(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; 및 Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). 이러한 폴리에스테르의 예는 폴리(L-락타이드-코-L-리신)(Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), 폴리(세린 에스테르)(Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633), 및 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633)를 포함한다.
이러한 중합체와 다른 중합체의 특성 및 이를 제조하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져있다(예를 들어, 미국 특허 제6,123,727호; 제5,804,178호; 제5,770,417호; 제5,736,372호; 제5,716,404호; 제6,095,148호; 제5,837,752호; 제5,902,599호; 제5,696,175호; 제5,514,378호; 제5,512,600호; 제5,399,665호; 제5,019,379호; 제5,010,167호; 제4,806,621호; 제4,638,045호; 및 제4,946,929호; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; 및 Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181 참조). 더욱 일반적으로, 임의의 적합한 중합체를 합성하는 다양한 방법이 Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; 및 미국 특허 제6,506,577호, 제6,632,922호, 제6,686,446호 및 제6,818,732호에 기재되어 있다.
일부 구체예에서, 중합체는 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 덴드리머일 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 실질적으로 서로 교차결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 실질적으로 전혀 교차결합되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라서 중합체는 교차결합 단계없이 사용될 수 있다. 본 발명의 합성 나노담체가 임의의 전술한 중합체 및 다른 중합체의 블록 공중합체, 그래프트 공중합체, 블렌드, 혼합물 및 또는 부가생성물을 포함할 수 있음이 추가로 이해되어야 한다. 이 기술분야의 당업자는 본원에 열거된 중합체는 예시적인 것으로, 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 중합체의 목록을 다 포함한 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, 합성 나노담체는 중합성 성분을 포함하지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 합성 나노담체는 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 비중합성 합성 나노담체는 금속 원자(예를 들어, 금 원자)의 집합체(aggregate)와 같은 비중합성 성분의 집합체이다.
일부 구체예에서, 합성 나노담체는 선택적으로 하나 이상의 양친매성 실체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 양친매성 실체는 증가된 안정성, 개선된 균일성, 또는 증가된 점도로 합성 나노담체의 생산을 촉진할 수 있다. 일부 구체예에서, 양친매성 실체는 지질 막(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단분자층 등)의 내부 표면과 회합할 수 있다. 본 발명에 따른 합성 나노담체를 만드는데 사용하기에 적합한 많은 양친매성 실체가 이 기술분야에 알려져 있다. 그러한 양친매성 실체는, 그 제한되지 않는 예로 포스포글리세라이드; 포스파티딜콜린; 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC); 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE); 디올레일옥시프로필트리에틸암모늄(DOTMA); 디올레오일 포스파티딜콜린; 콜레스테롤; 콜레스테롤 에스테르; 디아실글리세롤; 디아실글리세롤숙시네이트; 디포스파티딜 글리세롤(DPPG); 헥산데칸올; 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 지방산 알코올; 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 팔미트산 또는 올레산과 같은 표면 활성 지방산; 지방산; 지방산 모노글리세라이드; 지방산 디글리세라이드; 지방산 아미드; 소르비탄 트리올리에이트(Span®85) 글리코콜레이트(glycocholate); 소르비탄 모노라우레이트(Span®20); 폴리솔베이트 20(Tween®20); 폴리솔베이트 60(Tween®60); 폴리솔베이트 65(Tween®65); 폴리솔베이트 80(Tween®80); 폴리솔베이트 85(Tween®85); 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트; 설팩틴; 폴록사머; 소르비탄 트리올리에이트와 같은 소르비탄 지방산 에스테르; 레시틴; 리소레시틴; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 스핑고미엘린(sphingomyelin); 포스파티딜에탄올아민(세팔린(cephalin)); 카르디오리핀(cardiolipin); 포스파티드산; 세레브로사이드(cerebroside); 디세틸포스페이트(dicetylphosphate); 디팔미토일 포스파티딜글리세롤; 스테아릴아민; 도데실아민; 헥사데실-아민; 아세틸 팔미테이트; 글리세롤 리시놀리에이트(glycerol ricinoleate); 헥사데실 스테아레이트; 이소프로필 미리스테이트; 틸옥사폴(tyloxapol); 폴리(에틸렌 글리콜)5000-포스파티딜에탄올아민; 폴리(에틸렌글리콜)400-모노스테아레이트; 포스포리피드; 높은 계면활성제 특성을 가진 합성 및/또는 천연 세제; 디옥시콜레이트(deoxycholate); 시클로덱스트린(cyclodextrin); 카오트로픽 염(chaotropic salt); 이온쌍형성제(ion pairing agent); 및 이의 조합을 포함한다. 양친매성 실체 성분은 상이한 양친매성 실체들의 혼합물일 수 있다. 이 기술분야의 당업자는 이것이 예시적이며, 계면활성제 활성을 갖는 물질의 목록을 다 포함한 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 임의의 양친매성 실체가 본 발명에 따라서 사용된 합성 나노담체의 생성에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 합성 나노담체는 선택적으로 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물은 천연 또는 합성일 수 있다. 탄수화물은 유도화된 천연 탄수화물일 수 있다. 임의의 구체예에서, 탄수화물은 모노사카라이드 또는 디사카라이드를 포함하며, 그 제한되지 않는 예로 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 리보스, 락토스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 셀비오스(cellbiose), 만노스, 크실로오스, 아라비노스, 글루코론산, 갈락토론산(galactoronic acid), 만누론산, 글루코사민, 갈라토사민 및 뉴라믹산(neuramic acid)을 포함한다. 임의의 구체예에서, 탄수화물은 폴리사카라이드이며, 그 제한되지 않는 예로 풀루란, 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 하이드록시셀룰로오스(HC), 메틸셀룰로오스(MC), 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 하이드록시에틸 전분, 카라기난, 글리콘, 아밀로스, 키토산, N,O-카르복실 메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 전분, 키틴, 이눌린, 곤약(konjac), 글루코만난, 푸스툴란(pustulan), 헤파린, 히알루론산, 커드란(curdlan) 및 크산탄을 포함한다. 구체예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 탄수화물, 예를 들어 다당류를 포함하지 않는다(또는 특별히 배제한다). 임의의 구체예에서, 탄수화물은 탄수화물 유도체, 예를 들어 당알콜 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨 및 락티톨(이에 한정되는 것은 아님)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 본 발명의 합성 나노담체 또는 백신 구조체를 포함할 수 있다. 조성물은 종래의 약학 제조 및 합성 기술을 사용하여 유용한 투약 형태로 만들어질 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 보존제와 함께 주입을 위해 무균 식염수에 현탁되어 있다. 구체예에서, 본 발명의 통상적인 조성물은 무기 및 유기 완충액(예를 들어, 인산염, 탄산염, 아세트산염 또는 시트르산염의 나트륨 염 또는 칼륨 염)과 pH 조정제(예를 들어, 염산, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 시트르산염 또는 아세트산염의 염, 아미노산 및 이의 염), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 알파-토코페롤), 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 폴리옥시에틸렌 9-10 노닐 페놀, 디옥시콜레이트), 용액 및/또는 냉동/동결 건조 안정화제(예를 들어, 수크로스, 락토스, 만니톨, 트레할로스), 삼투압 조정제(예를 들어, 염 또는 당), 항박테리아 제제(예를 들어, 벤조산, 페놀, 겐타마이신), 소포제(예를 들어, 폴리디메틸실로존), 보존제(예를 들어, 티메로살, 2-페녹시에탄올, EDTA), 중합체 안정화제 및 점도 조정제(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 폴록사머 488, 카복시메틸셀룰로오스) 및 공용매(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올)을 포함하는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 MHC II 결합 펩티드는 이에 한정되는 것은 아니지만, 다수의 방법, 예를 들어 문헌[C. Astete et al., “Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles” J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247 289 (2006); K. Avgoustakis “Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery” Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., “Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles” Nanomedicine 2:8-21 (2006)]에 기술된 방법을 이용하여 합성 나노담체에 캡슐화될 수 있다. 물질, 예를 들어 펩티드를 합성 나노담체에 캡슐화하는데 적당한 기타 방법, 예를 들어 미국 특허 제6,632,671호(Unger, 2003년 10월 14일)에 개시된 방법(이에 한정되는 것은 아님)도 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, MHC II 결합 펩티드는 일반적으로 문헌[M. Singh et al., “Anionic microparticles are a potent delivery system for recombinant antigens from Neisseria meningitidis serotype B.”J Pharm Sci. Feb;93(2):273-82 (2004)]에 기재된 바와 같이 합성 나노담체의 표현에 흡착될 수 있다.
구체예에서, 본 발명에 의한 조성물은 항원 및/또는 애쥬반트를 포함할 수 있다. 구체예에서, 본 발명에 의한 백신은 항원 및/또는 애쥬반트와 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 수행에 유용한 항원 및/또는 애쥬반트로서 다양한 종류의 것이 본원의 다른 곳에 언급되어 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물을 이루는 MHC II 결합 펩티드는 항원 및/또는 애쥬반트에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링될 수 있거나, 또는 항원 및/또는 애쥬반트와 혼합될 수 있다. 물질을 커플링 또는 혼합하는 일반적인 기술에 관하여는 본원에 기술되어 있는데; 이러한 기술은, 본 발명의 조성물을 이루는 MHC II 결합 펩티드를 항원 및/또는 애쥬반트와 커플링 또는 혼합하도록 조정할 수 있다. 이용 가능한 공유 컨쥬게이트화 방법의 상세한 설명은 문헌[Hermanson G T “Bioconjugate Techniques”, 2nd Edition Published by Academic Press, Inc., 2008]을 참조한다. 공유 결합 이외에도, 커플링은 예비 합성 담체, 예를 들어 합성 나노담체와의 흡착, 또는 담체, 예를 들어 합성 나노담체 제조시 진행되는 캡슐화에 의해 이루어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물을 이루는 MHC II 결합 펩티드는 항원 및/또는 애쥬반트와도 커플링된 합성 나노담체에 커플링된다.
합성 나노담체는 이 기술분야에 알려진 광범위하게 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 합성 나노담체는 나노침전(nanoprecipitation), 유체성 채널(fluidic channel)을 사용한 플로우 포커싱(flow focusing), 스프레이 건조(spray drying), 단일 및 이중 에멀젼 용매 증발(single and double emulsion solvent evaporation), 용매추출(solvent extraction), 상 분리(phase separation), 밀링(milling), 마이크로에멀젼 절차, 미세제작(microfabrication), 나노제작(nanofabrication), 희생층(sacrificial layer), 단순 및 복잡 코아세르베이션(simple and complex coacervation), 및 이 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 다른 방법과 같은 방법으로 형성할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로는, 단분산성 반도체(monodisperse semiconductor), 전도성, 자성, 유기성 및 다른 나노물질의 수성 및 유기 용매 합성이 기재되어 있다(Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; 및 Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). 추가적인 방법이 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Doubrow, Ed., “Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,” CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; and Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755, 및 또한 미국 특허 제5578325호 및 제6007845호 참조).
이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 문헌[C. Astete et al., “Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles” J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006); K. Avgoustakis “Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery” Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., “Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles” Nanomedicine 2:8-21 (2006)]에 개시된 다양한 방법을 이용하여 원하는 대로 합성 나노담체에 캡슐화함으로써 다수의 물질을 커플링할 수 있다. 물질, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 합성 나노담체에 캡슐화하는데 적당한 기타 방법, 예를 들어 미국 특허 제6,632,671호(Unger; 2003년 10월 14일)에 개시된 방법(이제 한정되지 않음)을 사용할 수 있다.
임의의 구체예에서, 합성 나노담체는 나노침전 공정 또는 스프레이 건조로 제조된다. 합성 나노담체를 제조하는데 사용된 조건은 원하는 크기 또는 특징(예를 들어, 소수성, 친수성, 외부 모폴로지, “끈적임(stickiness)”, 형태 등)의 입자를 생성하도록 변경될 수 있다. 사용될 합성 나노담체를 제조하는 방법과 조건(예를 들어, 용매, 온도, 농도, 공기 흐름 속도 등)은 합성 나노담체 및/또는 중합체 매트릭스의 조성물에 커플링될 물질에 따라 좌우될 수 있다.
상기한 임의의 방법으로 제조된 입자가 원하는 범위 밖의 크기 범위를 가진다면, 입자는 예를 들어 체를 사용하여 크기 조정을 할 수 있다.
본 발명의 조성물이 임의의 적당한 방식으로 제조될 수 있고, 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 조성물로 본 발명을 제한하고자 함이 아님이 이해되어야 한다. 회합된 특정 부분의 특성에 주목하여 적절한 방법의 선택이 필요할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 무균 조건 하에서 제조되거나 또는 마지막에 살균된다. 이는 결과 조성물이 무균이며 비감염성임을 보증할 수 있어서, 비무균 조성물과 비교시 안전이 개선될 수 있다. 이것은 특히 합성 나노담체를 투여받는 대상체가 면역 결함이 있고, 감염을 앓고 있으며, 및/또는 감염에 민감할 때 유용한 안전한 수단을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 합성 나노담체는 동결건조되어 활성을 잃지 않으면서 장기간에 걸친 기간 동안의 제형 기술에 따라서 현탁액 또는 동결건조 파우더로써 보관할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 투여 경로로 투여할 수 있으며, 그 제한되지 않는 예로 비경구(예를 들어, 피하, 근육 내, 정맥 내, 또는 피 내); 경구; 비강 내, 점막 내, 직장; 눈, 또는 피 내를 포함한다.
E. 실시예
본 발명은, 본 발명을 제한하는 것이 아닌, 오로지 본 발명의 임의의 측면들과 구체예들을 예시하기 위해 포함된 이하 실시예를 참고로 하여 더욱 용이하게 이해될 것이다.
당업자는 본 발명의 범위와 사상에서 벗어나지 않고 전술한 구체예들에 다양한 변경 및 변형을 가할 수 있음을 이해하게 될 것이다. 당업계에 알려진 기타 적당한 기술과 방법은 본원에 기술된 본 발명의 상세한 설명에 비추어 당업자에 의해 다수의 특정 방식으로 적용할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 본원에 구체적으로 기술된 바 이외의 양상으로 수행될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 전술한 상세한 설명은 예시를 위해서 제공한 것으로서 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 전술한 상세한 설명을 검토한다면 다수의 기타 구체예들도 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명의 범위는, 표제를 한정하고 있는 청구항의 균등 범위 전체와 함께, 첨부된 청구항을 참고로 하여 한정하여야 할 것이다.
실시예 1: 보편적 기억 펩티드의 제조
카메라 펩티드를 제조하기 위해서, 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/) T-세포 에피토프 예측 도구를 이용하여 제II군 에피토프 예측을 수행하였다. 각각의 펩티드에 대해서, 상기 예측 도구는 3가지 방법(ARB, SMM_정렬법 및 스터니올로) 각각에 대한 백분위 점수를 구하였다. 순위는, 스위스프로트 데이터베이스로부터 선택된 무작위 15머 5백만개의 스코어에 대해 펩티드 스코어를 비교하여 매겼다. 이후, 상기 3가지 방법에 대한 백분위 점수의 중앙값을 사용하여, 컨센서스 방법에 대한 점수를 매겼다. 컨센서스 방법을 사용하여 평가할 펩티드는, 다양한 공급원 예를 들어, 사람을 감염시켜 감염을 개시함으로써 이 감염성 유기체에 특이적인 사람 CD4+ 기억 세포를 생성할 수 있는 감염성 유기체로부터 얻어졌거나 유래한 서열을 사용하여 합성할 수 있다. 이와 같은 감염성 유기체의 예에 관하여는 본원에서 언급한 바 있다.
특정 구체예에서, 별도 단백질 및 펩티드 에피토프는 파상풍 독소, 디프테리아 독소 또는 아데노바이러스로부터 선택되고, 이를 분석하여 예측 HLA-DR 및 HLA-DP 에피토프를 확인하였다. 전 단백질 분석을 위해, 공통으로 순위를 매긴 결과(예측 고 친화성 결합제)와, HLA-DR 대립 유전자 간 포함률이 크다는 사실을 바탕으로, HLA-DR 예측 에피토프를 선택하였다. 뿐만 아니라, HLA-DP0401 및 HLA-DP0402에 대한 예측 고 친화성 결합제인 에피토프를 선택하였다. 이와 같은 DP에 대한 2개의 대립 형질은 북미인 모집단에서 높은 %로 발견되기 때문에(약 75%) 상기 대립 형질들을 선택하였다. 임의의 구체예에서, 개별 에피토프로부터 얻어진 결과들을 바탕으로 하여, 예측 포함률이 가장 크고, 고 친화도로 결합하는 키메라 펩티드를 제조하였다. 도 15 및 도 16을 참조하면, 도 15에 나타낸 바와 같이, A 또는 B만을 가지고 둘다를 동시에 가지지는 않는 조성물보다 예측 포함률이 크고 이보다 높은 친화도로 결합하며, 화학식 A━x━B를 포함하는 조성물을 제조할 수 있었다.
일부 경우에 있어서, 카텝신 절단 위치는 펩티드 접합부에 삽입하였다. 키메라 펩티드를 합성하여(진스크립트(GenScript)) 이를 물에 재현탁해 사용하였다.
상기 언급한 특정 구체예는 HLA-DR 및 HLA-DP 결합 펩티드를 포함하여 최적화된 조성물을 제조하는데 사용하였으며, 또한 이와 동일한 기술을 사용하여 HLA-DQ 결합 펩티드를 포함하여 최적화된 조성물을 제조할 수 있었다.
실시예 2: 코어 아미노산 서열 평가
HLA-DP 및 HLA-DR에 특이적인 에피토프 둘 다를, 절두 분석법(truncation analysis)을 통해 코어 결합 에피토프에 대해서 평가하였다(1,2). 특이적 제II군 HLA-단백질에 선택적인 코어 아미노산 서열은 일부 에피토프에서 공통적으로 발견되었다. 이와 같은 서열의 예로서는 HLA-DP4에 대한 펩티드 결합 특이성의 수퍼 타입(supertype)을 이루는 것으로 확인된 공통의 코어 결합 구조가 있다(3). 이와 같은 코어 아미노산은 고 친화도 결합이 가능한 구조상 배열을 유지하는 것으로 생각된다. 결과적으로, 제II군에 결합하는 능력을 무기력화하지 않고서도 화학적 특성이 유사한 비-코어 부위 아미노산을 치환할 수 있었다(4). 이는, 치환 분석법 수행후 에피토프 결합 예측 프로그램을 이용하여 실험을 통해 확인할 수 있었다. 분석을 수행하기 위하여, 별도 아미노산 치환을 도입하였으며, IEDB T-세포 결합 예측 도구를 이용하여 제II군에 대한 예측 친화도 결합율을 측정하였다(도 20 참조).
이와 관련하여 2가지 예를 나타냈는데, 파트 A의 경우, 아데노바이러스 에피토프의 70% 이하가 치환되면 DP4와의 결합 친화도를 떨어뜨리지 않았다. 파트 B는, 파상풍 변성 독소 에피토프의 70% 이하가 치환되면 HLA DR 0101 또는 HLA DR 0404 (즉, DR 대립 유전자의 대표예)와의 예측 결합률이 저하되지 않았음을 보여주는 것이다. 따라서, 아미노산 서열을 변형시킴으로써 HLA 포함률이 큰 고 친화도 키메라 펩티드를 생산하면, 펩티드가 MHC II와 결합하는 능력이 저하되지 않았다. 뿐만 아니라, 본 실시예에 예시한 바와 같이 아미노산을 치환함으로써 펩티드의 예측 친화도를 개선할 수 있었다.
전술한 특정 구체예는 HLA-DR 또는 HLA-DP 결합 펩티드를 포함하는 최적화 조성물을 예시하기 위한 것으로서, HLA-DQ 결합 펩티드를 포함하는 최적화 조성물도 동일한 기술을 사용하여 제조할 수 있었다.
참고 문헌:
1. Truncation analysis of several DR binding epitopes. O'Sullivan D, Sidney J, Del Guercio MF, Colon SM, Sette A. J Immunol. 1991 Feb 15;146(4):1240-6.
2. Adenovirus hexon T-cell epitope is recognized by most adults and is restricted by HLA DP4, the most common class II allele. Tang J, Olive M, Champagne K, Flomenberg N, Eisenlohr L, Hsu S, Flomenberg P. Gene Ther. 2004 Sep;11(18):1408-15.
3. HLA-DP4, the most frequent HLA II molecule, defines a new supertype of peptide-binding specificity.Castelli FA, Buhot C, Sanson A, Zarour H, Pouvelle-Moratille S, Nonn C, Gahery-Segard H, Guillet JG, Menez A, Georges B, Maillere B. J Immunol. 2002 Dec 15;169(12):6928-34.
4. Prediction of CD4(+) T cell epitopes restricted to HLA-DP4 molecules. Busson M, Castelli FA, Wang XF, Cohen WM, Charron D, Menez A, Maillere B. J Immunol Methods. 2006 Dec 20;317(1-2):144-51
실시예 3: 펩티드 평가
키메라 에피토프 펩티드를 포함하는 본 발명의 조성물을 대상으로 하여, (1) 회상 반응에 관한 잠재성; (2) 무작위 모집단 샘플 군집(N = 20)에서 회상 반응이 일어나는 빈도; 그리고 (3) 개체(N = 20) 중 항원-특이적 기억 T-세포가 출현하는 빈도에 대해 평가하였다.
시험관 내에서 24시간 동안 사람 PBMC를 펩티드로 자극한 다음, 유동성 혈구 계측법으로 세포를 분석하여, 단일 에피토프 및 키메라 에피토프의 잠재성을 평가하였다. 활성화된 CD4 핵심 기억 T-세포는 다음과 같은 표현형을 가졌다: CD4+ CD45RA저 CD62L+ IFN-γ+. 모집단 내에서 선택된 에피토프에 특이적인 회상 반응이 일어나는 빈도를 평가하기 위하여, 20명의 말초 혈액 공여자를 대상으로 시토킨 발현이 유도되었는지에 대해 평가하였다.
간단히 말해서, 리서치 블러드 컴포넌트(Research Blood Components)(캠브리지)로부터 전혈을 입수하였다. 이 혈액을 인산염 완충 염수(PBS) 중에 1:1로 희석한 다음, 50㎖들이 튜브에 담긴 피콜-파크 프리미엄(ficoll-paque premium)(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 12㎖의 상층에 상기 희석한 혈액 35㎖를 덮었다. 이 튜브를 1400rpm에서 30분 동안 회전시킨 후, 전이 상 PBMC를 수집하여, 이를 10% 소 태아 혈청(FCS)을 포함하는 PBS 중에 희석한 다음, 10분 동안 1200rpm에서 원심 분리하였다. 세포를 세포 동결 매질(시그마(Sigma)) 중에 재현탁한 직후, 밤새도록 -80℃로 동결시켰다. 장기 보관을 위해서, 세포를 액체 질소에 넣었다. 필요에 따라서 세포를 해동(37℃ 수조)한 후 10% FCS를 포함하는 PBS 중에 재현탁한 후 원심 분리하고, 이를, 5%의 열 불활성화 사람 혈청(시그마), I-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지(RPMI[셀그로]) 중에 세포가 배양 배지 1㎖ 당 5X106개가 될 때까지 재현탁하였다.
기억 T-세포 회상 반응 검정을 위하여, 본 발명에 의한 펩티드(진스크립트로부터 입수) 4 μM을 함유하는 24웰 평판 중에서 세포를 배양하였다(37℃, 5% CO2, 2시간). 이후, 배양 배지 1㎖ 당 브레펠딘 A(Brefeldin A)(Golgiplug, BD) 1㎕를 첨가한 다음, 세포를 37℃의 항온 처리기에 다시 넣었다(4~6시간). 이후, 세포를 저온(27℃) 항온 처리기(5% CO2)에 넣은 다음(밤새도록), 이를 유동성 혈구 계측 분석용으로 처리하였다. 세포를 CD4-FITC, CD45RA-PE, CD62L-Cy7PE (BD)와 함께 항온 처리한 후, 막 투과법을 수행한 다음 고정시켜(BD), 활성화된 기억 T-세포를 검출하였다. 인터페론-감마-APC 모노클로날(바이오레전드(BioLegend))을 사용하여 인터페론-감마의 세포 내 발현을 검출하였다. 이후, FACS캘리버 유동성 혈구 계측기와 셀퀘스트 소프트웨어(Cellquest software)를 사용하여 200,000~500,000개의 세포를 분석하였다. 만일 세포가 CD4+, CD45RA중, CD62L고 및 IFN-감마 양성이면, 세포에 양의 스코어를 매겼다.
키메라 펩티드에 의한 활성화를 보여주는 유동성 혈구 계측 데이터의 대표예를 도 1에 도시하였으며, 데이터 전부를 요약하여 도 2에 나타내었다.
데이터를 통해 다음과 같은 사실들을 알 수 있었다: (1) 본 발명에 의한 키메라 펩티드는 별도 펩티드를 단독으로 투여하였을 경우에 비하여 더 많은 핵심 기억 T-세포를 활성화하였으며, 키메라 펩티드 TT830pmglpDTt(카텝신 절단 위치 포함)가 이 반응을 가장 많이 촉진하였다. (2) 본 발명의 키메라 펩티드는 별도 펩티드를 투여한 경우에 비하여 더욱 많은 수의 사람들에서 회상 반응을 일으켰다[이 경우, TT830pmglpDTt는 20명의 공여자 중 20명 모두에 존재](도 3). (3) 카텝신 절단 위치를 포함하는 키메라 펩티드 TT830pmglpDTt는 개별 성분(즉, TT830 및 DT)을 단독으로 투여하였을 경우에 비하여 활성이 더욱 컸으며, 절단 위치를 포함하지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 펩티드(TT830DT)보다 효능이 우수하였는데, 이는 곧, 본 발명의 키메라 펩티드에 카텝신 절단 위치를 부가하면 회상 반응이 증가할 수 있음을 말해주는 것이다. (4) 이 데이터를 통하여 도 15에 도시한 T-세포 에피토프 예측 분석 결과를 확인할 수 있었다. 이 분석을 통하여, TT830과 DT 에피토프 둘 다로 이루어지는 키메라 펩티드(TT830DTt)는 광범위한 HLA-DR 대립 유전자를 포괄하여 결합 친화도가 가장 높으며, 카텝신 절단 위치를 포함시키면(TT830pmglpDTt) 이 반응이 증강된다는 것을 예측할 수 있다. TT830 또는 TT950을 DP 특이적 에피토프 AdV에 부가하면 AdV 에피토프만이 단독으로 존재하는 경우에 비하여 양성 반응을 나타내는 사람의 수가 증가하지 않았다. AdVTT830의 친화도가 높고 포함률이 큰 것은 AdV와 TT830의 접합부에 신생 에피토프가 생기기 때문이었다. 상기 양성 반응을 나타내는 사람들의 친화도는 높을 것으로 예측되지만, 신생 에피토프는 면역화된 개체 내에서 기억 회상 반응을 유도하지 않을 것이다. 에피토프들 사이에 카텝신 절단 위치를 포함시키면, 신생 에피토프가 생기지 않았다. 일례로, 카텝신 절단 위치를 삽입하면 AdV 에피토프(AdVpTT830)의 활성이 억제되었는데, 이는 아마도 에피토프가 제II군의 결합에 적당하지 않게 된다는 확신에 변화가 일어났기 때문일 것이다.
실시예 4: 펩티드 활성화 기억 T-세포의 테스트
특이적 펩티드로 재활성화할 때 초기의 핵심 기억 세포는 다수의 시토킨(IL-2, TNF-α, IFN-γ)을 발현하였던 반면에, 이에 관여하는 효과기 기억 T-세포는, TH2 관여 효과기 기억에 대해서는 IL-4를, 그리고 TH1 관여 효과기 기억에 대해서는 IFN-γ를 선택적으로 발현하는 것으로 생각된다. 펩티드 활성화 기억 T-세포의 상태는, 수지상 세포/CD4 세포 공동 배양에 관한 다중 발색 세포 내 시토킨 분석을 통하여 테스트하였다.
음성 선택 자성 비드(다이날(Dynal))를 사용하여 사람의 말초 혈액 단핵구를 분리한 다음, 이를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 1주일 동안 배양하여, 수지상 세포로의 분화를 유도하였다. 자성 비드 분리법(다이날)을 사용하여 동종 이계 CD4 T-세포를 분리한 다음, 이를 펩티드의 존재 하 또는 부재 하에서, DC가 존재할 때 공동 배양하였다. 이 시점에서의 자극 및 분석 프로토콜은 상기 실시예 2에 기술한 PBMC에 대한 프로토콜과 동일하다.
펩티드 TT830DT(서열 번호 7) 및 TT830pDTt(TT830pmglpDTTrunc 또는 서열 번호 13)에 의한 자극을 통하여, TNF-α 및 IFN-γ의 발현은 증가하였지만, IL-4는 그렇지 않았다(도 4 및 도 5). 다중 발색 유동성 혈구 계측법을 통하여, TT830DTt 및 TT830pDTt 둘 다로 처리된 PBMC는 펩티드에 의해 TNF-α 및 IFN-γ 가 공동 발현되었지만, TNF-α 및 IL-4는 공동 발현되지 않았는데(도 6), 이를 통하여, 초기 핵심 기억 세포가 활성화되었음을 알 수 있었다.
TT 및 DT로부터 유래하는 HLA-DR 에피토프와 함께, DP4 특이적 아데노바이러스 에피토프로부터 유래하는 서열을 포함하는 일련의 키메라 펩티드를 구성하였다[이 경우, 에피토프 간에는 카텝신 링커가 존재하거나 존재하지 않았음](도 8). 전술한 바와 같이, 세포를 본 발명에 의한 펩티드(진스크립트로부터 입수) 4 μM을 함유하는 24웰 평판 중에서 배양하였다(37℃, 5% CO2, 2시간). 이후, 배양 배지 1㎖ 당 브레펠딘 A(Golgiplug, BD) 1㎕를 첨가한 다음, 세포를 37℃의 항온 처리기에 다시 넣었다(4~6시간). 이후, 세포를 저온(27℃) 항온 처리기(5% CO2)에 넣은 다음(밤새도록), 이를 처리하여 유동성 혈구 계측 분석을 수행하였다. 세포를 CD4-FITC, CD45RA-PE, CD62L-Cy7PE (BD)와 함께 항온 처리한 후, 막 투과법을 수행한 다음 고정시켜(BD), 활성화된 기억 T-세포를 검출하였다. 인터페론-감마-APC 모노클로날(바이오레전드)을 사용하여 인터페론-감마의 세포 내 발현을 검출하였다. 이후, FACS캘리버 유동성 혈구 계측기와 셀퀘스트 소프트웨어를 사용하여 200,000~500,000개의 세포를 분석하였다. 만일 세포가 CD4+, CD45RA중, CD62L고 및 IFN-감마 양성이면, 세포에 양의 스코어를 매겼다. 4명의 공여자를 대상으로 기억 T-세포 회상 반응을 분석한 결과, 각각의 펩티드, 그리고 카텝신 절단 위치가 결여된 이종 이량체 펩티드의 반응은, ‘kvsvr’ 카텝신 절단 위치를 포함하는 이종 삼량체 펩티드(AdVkDTt, AdVkTT950)에 대한 공여자 반응에 비하여 약하였음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, AdV, DT 및 TT 에피토프를 함유하는 이종 삼량체 펩티드(TT830DTAdV)는 또한 4명의 공여자 모두에서 회상 반응을 일으켰다.
실시예 5: 물리적 특성들을 조정하기 위한 MHC II 결합 펩티드 변형
도 7에 나타낸 바와 같이 펩티드 특성을 변성시키기 위하여 일련의 변형 TT830pDTt(서열 번호 13) 서열을 합성하였다. 이와 같은 유형의 변형에 관한 전체 범위와 성질에 관하여는 본원에 기술하였다. 펩티드 변형의 제1 목적은 다음과 같았다: 1) 수용성의 개선(소수성 분석에 관한 저차원 그라비-그랜드 평균), 2) N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 변형에 의한 pI 변경, 3) 내부 결합(Cat S 절단 PMGLP) 변형, 그리고 외부 및 내부 결합 둘 다의 변형, 4) 카텝신 B 절단에 변화를 주거나, 대안적 펩티드 분해 과정을 진행하여, Cat S 결합 위치를 변형함으로써 엔도좀 구획 내 펩티드 가공 과정의 중요성 이해.
뿐만 아니라, 펩티드의 소수성을 변성시키고 pI를 중성에 가까운 pH로 감소시키기 위해 AdVkDT 서열을 변형하였다.
N-말단에 서열을 부가하는 과정은 부분적으로는 AdV-유래 에피토프의 N-말단 앞에 존재하는 천연 아미노산 서열과의 유사성에 의해 가이드되었다:
AdVkDTd1 EESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQK (30), pI = 6.6-7.1
(서열 번호 71)
AdVkDTd2 ESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQKE (30), pI = 6.6-7.1
(서열 번호 72)
AdVkDTd3 KESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQE (30), pI = 6.6-7.1
(서열 번호 73)
AdVkDT의 변이체(서열 번호 71~73)에 대한 결과를 도 10에 도시하였다. 3명의 상이한 공여자를 대상으로 한 모든 실험 결과에 있어서, AdVkDT 변이체(서열 번호 71~73)는 비자극(NS) 대조군에 비하여 강력한 회상 반응을 유도하였다.
실시예 6: 인플루엔자 특이적 기억 펩티드
면역 에피토프 데이터베이스(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/) T-세포 에피토프 예측 도구를 이용하여 제II군 에피토프 예측을 함과 아울러, 국립 보건원(NIH) 블라스트 프로그램 및 뉴클레오티드 데이터베이스(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여, 본 발명에 의한 특이적 단일 병원체 최적화 조성물의 예로서, A형 인플루엔자, A형 및 B형 인플루엔자, 또는 A형, B형 및 C형 인플루엔자 가운데 고도로 보존된 팬 HLA-DR 에피토프를 확인하였다(도 11 및 도 12). 개별 에피토프 및 키메라 에피토프에 대한 T-세포 에피토프 예측 결과를 도 17 내지 도 19에 나타냈으며, 또한 예측 친화도가 높은 키메라 에피토프를 대상으로 하여 기억 T-세포 반응을 일으키는 능력에 대해 테스트하였다. 요약: 펩티드 4 μM을 함유하는 24웰 평판 중에서 PBMC를 배양하였다(37℃, 5% CO2, 2시간). 이후, 브레펠딘 A를 첨가한 다음, 세포를 37℃의 항온 처리기에 다시 넣었다(4~6시간). 이후, 세포를 저온(27℃) 항온 처리기(5% CO2)에 넣은 다음(밤새도록), 이를 유동성 혈구 계측 분석용으로 처리하였다. 세포를 CD4-FITC, CD45RA-PE, CD62L-Cy7PE (BD)와 함께 항온 처리하여 활성화된 기억 T-세포를 검출하였다. 이후, FACS캘리버 유동성 혈구 계측기와 셀퀘스트 소프트웨어를 사용하여 200,000~500,000개의 세포를 분석하였다. 만일 세포가 CD4+, CD45RA중, CD62L고 및 IFN-감마 양성이면, 세포에 양의 스코어를 매겼다.
개별 에피토프:
(minx) YVKQNTLKLAT (서열 번호 74)
7430) CYPYDVPDYASLRSLVASS (서열 번호 75)
(31201t) NAELLVALENQHTI (서열 번호 76)
(66325) TSLYVRASGRVTVSTK (서열 번호 77)
(ABW1) EKIVLLFAIVSLVKSDQICI (서열 번호 78)
(ABW2) QILSIYSTVASSLALAIMVA (서열 번호 79)
(ABP) MVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSI (서열 번호 80)
(AAT) EDLIFLARSALILRGSV (서열 번호 81)
(AAW) CSQRSKFLLMDALKLSIED (서열 번호 82)
(IRG) IRGFVYFVETLARSICE (서열 번호 83)
(TFE) TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (서열 번호 84)
(MMM) MMMGMFNMLSTVLGV (서열 번호 85)
키메라 에피토프:
AATk3120t LIFLARSALILRkvsvrNAELLVALENQHTI (서열 번호 86)
3120tkAAT NAELLVALENQHTIkvsvrLIFLARSALILR (서열 번호 87)
ABW2kAAT ILSIYSTVASSLALAIkvsvrLIFLARSALILR (서열 번호 88)
AATkABW2 LIFLARSALILRkvsvrILSIYSTVASSLALAI (서열 번호 89)
AATkAAW LIFLARSALILRkvsvrCSQRSKFLLMDALKL (서열 번호 90)
AAWkAAT CSQRSKFLLMDALKLkvsvrLIFLARSALILR (서열 번호 91)
ABW9hema EKIVLLFAIVSLVKSDQICI (서열 번호 92)
MMMTFE MMMGMFNMLSTVLGV TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (서열 번호 93)
TFEMMM TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL MMMGMFNMLSTVLGV (서열 번호 94)
TFEIRG TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL IRGFVYFVETLARSICE (서열 번호 95)
IRGTFE IRGFVYFVETLARSICE TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL (서열 번호 96)
MMMkIRG MMMGMFNMLSTVLGV kvsvr IRGFVYFVETLARSICE (서열 번호 97)
IRGkMMM IRGFVYFVETLARSICEkvsvr MMMGMFNMLSTVLGV (서열 번호 98)
키메라 인플루엔자 펩티드 서열을 도 11에 도시하였다. 5명의 PBMC 공여자에서 일어난 T-세포 기억 회상 반응 결과를 도 12에 나타내었다. 기억 T-세포 회상 반응은 키메라 에피토프 AAWkAAT, AATkABW2, 3120tkAAT 및 ABW2kAAT에 대해 양성이었으나, 비-키메라 H5 제한 팬 HLA-DR 에피토프 ABW9에 대해서는 그렇지 않았다. 이와 같은 데이터를 통해, 인플루엔자에 특이적인 펩티드를 함유하는 본 발명의 키메라 보존 에피토프 4개는 기억 회상 반응을 유도함에 있어서 활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
실시예 7: 합성 나노담체 제형(예언적 제형)
거스터(Gerster) 등의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 레시퀴모드(R848이라고도 칭함)를 합성하였다. PLA-PEG-니코틴 컨쥬게이트를 통상의 컨쥬게이트화 기술을 이용하여 셀렉타 바이오사이언시스(Selecta Biosciences)에서 제조하였다. D,L-락타이드(MW = 약 15~18KD)를 사용하는 고리 개환 중합법에 의해 PLA를 제조하였다. PLA 구조는 NMR로 확인하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11~31KD, 85% 가수분해됨)을 VWR 사이언티픽(VWR scientific)으로부터 구입하였다. 이것들을 하기 용액을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 중 레시퀴모드 @ 7.5㎎/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 중 PLA-PEG-니코틴 @ 100mg/㎖
3. 메틸렌 클로라이드 중 PLA @ 100㎎/㎖
4. 물 중 ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ(서열 번호 13) 서열을 가지는 펩티드 @ 10㎎/㎖
5. 물 중 폴리비닐 알코올 @ 50㎎/㎖.
용액 #1(0.4㎖), 용액 #2(0.4㎖), 용액 #3(0.4㎖) 및 용액 #4(0.1㎖)를 작은 바이얼(vial) 안에서 혼합하고, 혼합물은 브랜슨 디지털 소니파이어 250(Branson Digital Sonifier 250)을 사용하여 40초 동안 50% 진폭에서 초음파를 이용하여 분해하였다. 이 에멀젼에 용액 #5(2.0㎖)를 첨가하였고, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 40초 동안 35% 진폭에서의 초음파 분해로 제2 에멀젼을 형성하였다. 이것을 물(30㎖)을 함유한 비이커에 첨가하고 이 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반하여 나노입자를 형성하였다. 나노담체 분산물의 일부(1.0㎖)를 물(14㎖)로 희석시키고, 이것을 막 컷오프가 100KD인 Amicon의 울트라 원심분리 장치(Ultra centrifugal filtration device) 안에서 원심분리로 농축하였다. 부피가 약 250㎕일 때, 물(15㎖)을 첨가하였고, 입자들은 다시 Amicon 장치를 사용하여 약 250㎕까지 농축하였다. 포스페이트 완충 염수(pH = 7.5, 15㎖)로 2차 세척을 동일한 방식으로 행하였고, 최종 농축물은 포스페이트 완충 염수로 총 부피 1.0㎖로 희석하였다. 이것은 농도가 약 2.7mg/㎖인 최종 나노담체 분산액을 제공하는 것으로 예상된다.
실시예 8: 합성 나노담체 제형(예언적 제형)
거스터(Gerster) 등의 미국 특허 제 5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 레시퀴모드(R848이라고도 칭함)를 합성하였다. PLA-PEG-니코틴 컨쥬게이트를 셀렉타 바이오사이언시스에서 제조하였다. D,L-락타이드(MW = 약 15~18KD)를 사용하는 고리 개환 중합법에 의해 PLA를 제조하였다. PLA 구조는 NMR로 확인하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11~31KD, 85% 가수분해됨)을 VWR 사이언티픽으로부터 구입하였다. 이것들을 하기 용액을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 중 PLA-R848 컨쥬게이트 @ 100㎎/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 중 PLA-PEG-니코틴 @ 100㎎/㎖
3. 메틸렌 클로라이드 중 PLA @ 100㎎/㎖
4. 물 중 서열 TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET(서열 번호 5)을 가지는 펩티드 @ 12㎎/㎖
5. 물 중 폴리비닐 알코올 @ 50㎎/㎖.
용액 #1(0.25~0.75㎖), 용액 #2(0.25㎖), 용액 #3(0.25~0.5㎖) 및 용액 #4(0.1㎖)을 작은 바이얼 안에서 혼합하고, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용해 이 혼합물을 40초 동안 50% 진폭에서 초음파 처리하였다. 이 에멀젼에 용액 #5(2.0㎖)를 첨가하고, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용해 40초 동안 35% 진폭에서 초음파 처리하여 제2 에멀젼을 제조하였다. 이를 인산염 완충 용액(30㎖)이 담겨있는 비이커에 첨가하고 나서, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 나노입자를 제조하였다. 이 입자를 세척하기 위해서, 나노입자 분산액 중 일부(7.0㎖)를 원심 분리 튜브에 넣은 후, 1시간 동안 5,300g에서 원심 분리하고 나서, 상청액을 제거하고, 펠릿을 인산염 완충 염수 7.0㎖ 중에 재현탁하였다. 원심 분리 과정을 반복하여 얻어진 펠릿을 인산염 완충 염수 2.2㎖ 중에 재현탁하였다(최종 예측 나노입자 분산액 = 약 10㎎/㎖).
실시예 9: 본 발명의 조성물과 담체 단백질의 컨쥬게이트화 (예언적 컨쥬게이트화)
C-말단 Cys 상에 존재하는 티올기를 통해 담체 단백질 즉, CRM197과의 컨쥬게이트화에 사용할 펩티드의 C-말단에, 부가 Gly-Cys를 부가하여 펩티드(서열 번호 5)를 변형시켰다. CRM197은 자체의 1차 서열 내에 하나의 아미노산 변이가 발생한 디프테리아 독소의 무독성 돌연 변이체이다. 단일 핵산 코돈 변이를 통하여, 분자의 52번 아미노산 위치에 존재하는 글리신을 글루탐산으로 치환하였다. 이와 같은 변이로 인해, 단백질은 ADP-리보실 트랜스퍼라제 활성이 결여되어 무독성이 되었다. 이의 분자량은 58,408Da이었다.
CRM197의 유리 아미노기를 과량의 브롬아세트산 N-하이드로숙신이미드 에스테르(시그마 케미컬 코포레이션(Sigma Chemical Co.); 미주리주 세인트루이스 소재)와의 반응에 의해 브로모아세틸화하였다. 이 CRM197(15㎎)을 1.0M NaHCO3(pH 8.4) 중에 용해한 다음, 얼음으로 냉각하였다. 브로모아세트산 N-하이드로숙신이미드 에스테르 용액(200㎕ 디메틸포름아미드(DMF) 중 15㎎)을 CRM197 용액에 천천히 첨가하고, 이 용액을 실온의 암실에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 이후, 투석법(10 K MWCO 막 사용)을 통한 정용 여과에 의해, 생성된 브로모아세틸화된(활성화된) 단백질을 정제하였다. 활성화된 CRM197 과 시스테인을 반응시킨 다음, 아미노산 분석을 수행하고나서, 생성된 카복시메틸시스테인(CMC)을 정량하여, 브로모아세틸화 정도를 측정하였다.
브로모아세틸화된 CRM197을 1M 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액(pH9.0) 중에 용해하고나서, 이를 아르곤 대기하에 유지시켰다(2~8℃). 1M 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액(pH9.0) 중 펩티드[TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET-G-C (서열 번호 107; 변형된 서열 번호 5)] 용액(10㎎)을 브로모아세틸화된 CRM197 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 15~20시간 동안 2~8℃에서 교반하였다. 이후, 잔류하는 브로모아세틸기를 20배 몰 과량의 N-아세틸시스테아민으로 4~8시간 동안 캡핑하였다(2~8℃). 이후, 0.01M 인산나트륨 완충액/0.9% NaCl(pH 7.0)에 대해 정용 여과하여(10 K MWCO 막 사용), 생성된 펩티드-CRM197 컨쥬게이트를 실온에서 정제하였다. 투석 유물인 펩티드- CRM197 컨쥬게이트를 수집하여, SDS-PAGE 및 아미노산 분석법을 통해 단백질 함량과 마우스 내 면역원성에 대해 분석하였다[로우리 또는 마이크로-BCA 비색 검정법(Lowry or Micro-BCA colorimetric assay)].
실시예 10: 항원을 포함하는 통상의 백신과 본 발명의 조성물 혼합물(예언적 혼합물)
D,L-락타이드(MW = 약 15~18KD)를 사용하는 고리 개환 중합법에 의해 PLA를 제조하였다. PLA 구조는 NMR로 확인하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11~31KD, 87~89% 가수분해됨)을 VWR 사이언티픽으로부터 구입하였다. 이것들을 하기 용액을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 중 PLA @ 100㎎/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 중 PLA-PEG @ 100㎎/㎖
3. 수용액 중 서열 번호 91의 서열을 가지는 펩티드 @ 10㎎/㎖,
4. 물 또는 인산염 완충액 중 폴리비닐 알코올 @ 50㎎/㎖.
용액 #1(0.5~1.0㎖), 용액 #2(0.25~0.5㎖) 및 용액 #3(0.05~0.3㎖)을 유리 가압 튜브 중에서 혼합하고, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 이 혼합물을 40초 동안 50% 진폭에서 초음파 처리하였다. 이 에멀젼에 용액 #4(2.0~3.0㎖)을 첨가하고, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 40~60초 동안 30% 진폭에서 초음파 처리하여 제2 에멀젼을 제조하였다. 이를 인산염 완충 용액(30㎖)이 담겨있는 비이커에 첨가하고 나서, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 나노담체를 제조하였다. 이 입자를 세척하기 위해서, 나노담체 분산액 중 일부(27.0~30.0㎖)를 원심 분리 튜브에 넣은 후, 45분 동안 21,000g에서 원심 분리하고 나서, 상청액을 제거하고, 펠릿을 인산염 완충 염수 30.0㎖ 중에 재현탁하였다. 원심 분리 과정을 반복하여 얻어진 펠릿을 인산염 완충 염수 8.1~9.3㎖ 중에 재현탁하였다.
현탁된 합성 나노담체 분취액 4㎖를 원심 분리하여 합성 나노담체를 침강시켰다. 상청액을 따라내고 플루아릭스(Fluarix)® 3가 인플루엔자 바이러스 백신 현탁액 0.5㎖를 첨가하였다. 조합 백신을 휘저어 나노담체를 재현탁하고 나서, 생성된 현탁액을, 사용 시까지 -20℃에 보관하여두었다.
실시예 11: 본 발명의 조성물과 금 나노담체의 커플링(예언적 커플링)
1 단계: 금 나노담체(AuNC)의 제조: 냉각기가 장착된 1ℓ들이 둥근 바닥 플라스크 내에서, 1mM HAuCl4 수용액 500㎖를 10분 동안 격렬하게 교반하면서 환류 가열하였다. 이후, 40mM 시트르산 삼나트륨 용액 50㎖를 교반중인 용액에 신속히 첨가하였다. 생성된 진한 자주색 용액을 25~30분 동안 환류 상태로 유지시키고, 이로부터 열을 발산시켜 이 용액을 실온으로 냉각하였다. 이후, 상기 용액을 0.8㎛ 막 필터를 통과시켜 AuNC 용액을 제조하였다. 가시 스펙트럼 분석법 및 투과 전자 현미경을 사용하여 AuNC의 특성을 규명하였다. AuNC는 시트르산염으로 지름 20㎚이 되도록 캡핑되었으며, 이 경우, 520㎚에서의 흡광도가 최고였다.
2 단계: AuNC와 펩티드의 직접 컨쥬게이트화: 실시예 9의 C-말단 펩티드(C-말단에 시스테인을 함유하는 서열 번호 5의 펩티드)를 다음과 같이 AuNC와 커플링하였다: 펩티드 용액(10mM pH 9.0 탄산염 완충액 중 10μΜ) 145㎕를, 지름 20㎚인 시트르산염-캡핑된 금 나노입자(1.16nM) 1㎖에 첨가하여, 티올 대 금의 몰 비 2500:1이 되도록 만들었다. 이 혼합물을 아르곤 대기 하에서 1시간 동안 교반하여(실온), 금 나노입자 상에 존재하던 시트르산염을 전부 티올로 바꾸었다. 이후, 펩티드-AuNC 컨쥬게이트를 30분 동안 12,000g에서 원심분리시켜 정제하였다. 상청액을 따라내고, 펩티드-AuNC 함유 펠릿을 1㎖ WFI 물에 재현탁하여, 추가 분석법 및 생물 검정법을 수행하였다.
실시예 12: 실시예 5의 변형 조성물을 사용하여 제조된 합성 나노담체
거스터 등의 미국 특허 제5,389,640호의 실시예 99에 제공된 합성 방법에 따라서 레시퀴모드(R848이라고도 칭함)를 합성한 후, 아미드 링커를 사용하여 이를 PLGA와 컨쥬게이트화함으로써 PLGA-R848을 제조하였다. PLGA(IV 0.10dL/g) 및 PLA(IV 0.21dL/g)를 레이크쇼어 바이오매트리얼즈(Lakeshore Biomaterials)로부터 구입하였다. 통상의 컨쥬게이트화 기술에 의해, PLA-PEG-니코틴 컨쥬게이트를 셀렉타 바이오사이언시스에서 제조하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11~31KD, 87~89% 가수분해됨)을 JT 베이커(JT Baker)로부터 구입하였다.
이것들을 하기 용액을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 중 PLGA-R848 @ 100㎎/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 중 PLA-PEG-니코틴 @ 100㎎/㎖
3. 메틸렌 클로라이드 중 PLA @ 100㎎/㎖
4. 10% DMSO, 50% 락트산 USP 및 40% 물로 이루어진 용액 중 펩티드 @ 10㎎/㎖ [상기 펩티드는 다음과 같은 서열을 가짐: EESTLLYVLFEVKVSVRQSIALSSLMVAQK (서열 번호 71)]
5. pH 8 인산염 완충액 중 폴리비닐 알코올 @ 50㎎/㎖
용액 #1(0.5㎖), 용액 #2(0.25㎖) 및 용액 #3(0.25㎖)을 작은 용기 내에서 혼합하고, 여기에 용액 #4(0.25㎖)를 첨가한 다음, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 이 혼합물을 40초 동안 50% 진폭에서 초음파 처리하였다. 이 에멀젼에 용액 #5(2.0㎖)를 첨가하였다. 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 이 혼합물을 40초 동안 30% 진폭에서 초음파 처리하여 제2 에멀젼을 제조하였다. 이후, 이 에멀젼을 인산염 완충 용액(30㎖)(70mM, pH 8)이 담겨있는 50㎖들이 비이커(교반중)에 첨가하고 나서, 실온에서 2시간 동안 교반하여 합성 나노담체를 제조하였다.
이 합성 나노담체를 세척하기 위해서, 합성 나노담체 분산액 중 일부(27.5㎖)를 50㎖들이 원심 분리 튜브에 넣은 후, 1시간 동안 9,500rpm(13,800g)에서 원심 분리하고 나서(4℃), 상청액을 제거하고, 펠릿을 PBS(인산염 완충 염수) 27.5㎖ 중에 재현탁하였다. 원심 분리를 바탕으로 하는 세척 과정을 반복하여 얻어진 펠릿을 인산염 완충 염수 8.5g 중에 재현탁하였다(합성 나노담체 분산액의 명목 농도 = 10㎎/㎖). 농축물의 실제 중량을 측정하고, 이 농축물을 PBS에 첨가하여 농도 5㎎/㎖가 되도록 맞추었다.
C57BL6 마우스를 대상으로 수행하는 접종 연구를 통하여 합성 나노담체 제형의 면역원성을 측정하였다. 스케쥴에 따라서[제0일, 프라이밍(priming) → 제14일~제28일, 부스팅(boosting)], 비변형 C57BL6 마우스(그룹 당 마우스 5마리) 뒷 발바닥에 상기 제형을 피하 접종하였다. 각각의 접종 과정에 있어서, 총 100㎍의 나노담체를 주사하였다(뒷다리 하나당 50㎍). 제26일, 제40일, 제55일 및 제67일 경과시에 혈청을 수집하였다. 혈청에 대한 항-니코틴 항체의 역가를 측정하였다(EC50 수치). 공지의 쥣과 동물 MHC II 결합 펩티드(오브알부민 323~339 아미드)(양성 대조군)와 함께, 또는 어떠한 MHC II 결합 펩티드도 사용하지 않고, 동일한 중합체 제형의 합성 나노담체를 사용하는 방식과 유사한 방식으로 대조군을 접종하였다. 데이터를 도 13에 나타내었다.
실시예 13: 본 발명의 조성물을 사용하여 제조된 합성 나노담체
PLGA(5050 DLG 2.5A, IV 0.25dL/g)를 레이크쇼어 바이오매트리얼즈로부터 구입하였다. 셀렉타 바이오사이언시스에서 PLA-PEG-니코틴 컨쥬게이트를 제조하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11~31 KD, 87~89% 가수 분해됨)을 JT 베이커로부터 구입하였다.
이것들을 다음과 같은 용액을 제조하는데 사용하였다:
1. 메틸렌 클로라이드 중 PLGA @ 100㎎/㎖
2. 메틸렌 클로라이드 중 PLA-PEG-니코틴 @ 100㎎/㎖
3. 물 중 10% DMSO로 이루어진 용매 중 펩티드 @ 4㎎/㎖ [상기 펩티드는 다음과 같은 서열을 가짐: ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ (서열 번호 13)]
4. pH 8 인산염 완충액 중 폴리비닐 알코올 @ 50㎎/㎖
용액 #1(0.375㎖) 및 용액 #3(0.125㎖)을 혼합하고, 0.50㎖의 메틸렌 클로라이드로 희석한 후, 용액 #3(0.25㎖)를 작은 용기 안에 첨가하여, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 이 혼합물을 40초 동안 50% 진폭에서 초음파 처리하였다. 이 에멀젼에 용액 #4(3.0㎖)를 첨가하였다. 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 사용하여 이 혼합물을 60초 동안 30% 진폭에서 초음파 처리하여 제2 에멀젼을 제조하였다. 이 에멀젼을 인산염 완충 용액(30㎖)(70mM, pH 8)이 담겨있는 50㎖들이 비이커(교반중)에 첨가하고 나서, 실온에서 2시간 동안 교반하여 합성 나노담체를 제조하였다.
이 입자를 세척하기 위해서, 합성 나노담체 분산액 일부(29㎖)를 50㎖들이 원심 분리 튜브에 넣은 후, 45분 동안 21,000rcf에서 원심 분리하고 나서(4℃), 상청액을 제거하고, 펠릿을 PBS(인산염 완충 염수) 29㎖ 중에 재현탁하였다. 원심 분리를 바탕으로 하는 세척 과정을 반복하여 얻어진 펠릿을 PBS 4.4g 중에 재현탁하였다(합성 나노담체 분산액의 명목 농도 = 10㎎/㎖). 농축물의 실제 중량을 측정하고, 이 농축물을 PBS 중에 첨가하여 농도 5㎎/㎖가 되도록 맞추었다.
BALB/c 마우스를 대상으로 수행하는 접종 연구를 통하여 합성 나노담체 제형의 면역원성을 측정하였다. 합성 나노담체를 쥣과동물-활성화 CpG 애쥬반트, PS-1826 용액과 혼합한 직후 주사하였다. 스케쥴에 따라서[제0일, 프라이밍(priming) → 제14일~제28일, 부스팅(boosting)], 비변형 BALB/c 마우스(그룹 당 마우스 5마리) 뒷 발바닥에 상기 제형을 피하 접종하였다. 각각의 접종 과정에 있어서, 총 100㎍의 합성 나노담체와 20㎍의 PS-1826을 주사하였다(뒷다리에 고르게 나누어 접종). 제26일 및 제40일 경과시에 혈청을 수집하였다. 혈청에 대한 항-니코틴 항체의 역가를 측정하였다(EC50 수치). 공지의 쥣과 동물 MHC II 결합 펩티드(오브알부민 323~339 아미드)를 포함하는 합성 나노담체(양성 대조군) 및 MHC II 결합 펩티드가 결여된 음성 대조군 나노담체와 함께, 유사한 중합체 제형의 합성 나노담체를 사용하는 방식과 유사한 방식으로 대조군을 접종하였다. 결과를 도 14에 나타내었다.
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Ser 1 5 10 15 Val <210> 82 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 82 Cys Ser Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 Ile Glu Asp <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 83 Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys 1 5 10 15 Glu <210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 84 Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn 1 5 10 15 Phe Ser Met Glu Leu 20 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 85 Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val 1 5 10 15 <210> 86 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 86 Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Lys Val Ser Val 1 5 10 15 Arg Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile 20 25 30 <210> 87 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 87 Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Lys Val 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg 20 25 30 <210> 88 <211> 33 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 88 Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile 1 5 10 15 Lys Val Ser Val Arg Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu 20 25 30 Arg <210> 89 <211> 33 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 89 Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Lys Val Ser Val 1 5 10 15 Arg Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala 20 25 30 Ile <210> 90 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 90 Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Lys Val Ser Val 1 5 10 15 Arg Cys Ser Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu Lys Leu 20 25 30 <210> 91 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 91 Cys Ser Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Val Ser Val Arg Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg 20 25 30 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 92 Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser Asp 1 5 10 15 Gln Ile Cys Ile 20 <210> 93 <211> 36 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 93 Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val Thr 1 5 10 15 Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe 20 25 30 Ser Met Glu Leu 35 <210> 94 <211> 36 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 94 Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn 1 5 10 15 Phe Ser Met Glu Leu Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr 20 25 30 Val Leu Gly Val 35 <210> 95 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 95 Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn 1 5 10 15 Phe Ser Met Glu Leu Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Arg Ser Ile Cys Glu 35 <210> 96 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 96 Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys 1 5 10 15 Glu Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala 20 25 30 Asn Phe Ser Met Glu Leu 35 <210> 97 <211> 37 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 97 Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val Lys 1 5 10 15 Val Ser Val Arg Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr Leu Ala 20 25 30 Arg Ser Ile Cys Glu 35 <210> 98 <211> 37 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 98 Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys 1 5 10 15 Glu Lys Val Ser Val Arg Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser 20 25 30 Thr Val Leu Gly Val 35 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 99 Pro Met Gly Leu Pro 1 5 <210> 100 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 100 Lys Val Ser Val Arg 1 5 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 101 Met Met Met Thr Phe Glu 1 5 <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 102 Thr Phe Glu Met Met Met 1 5 <210> 103 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 103 Thr Phe Glu Ile Arg Gly 1 5 <210> 104 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 104 Ile Arg Gly Thr Phe Glu 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 105 Met Met Met Lys Ile Arg Gly 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 106 Ile Arg Gly Lys Met Met Met 1 5 <210> 107 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 107 Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe 1 5 10 15 Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Thr Gly Cys 20 25 30 <210> 108 <211> 36 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 108 Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile 1 5 10 15 Gly Ile Pro Met Gly Leu Pro Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met 20 25 30 Val Ala Gln Lys 35 <210> 109 <211> 37 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 109 Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile 1 5 10 15 Gly Ile Pro Met Gly Leu Pro Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met 20 25 30 Val Ala Gln Lys Glu 35 <210> 110 <211> 35 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 110 Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 1 5 10 15 Ile Pro Met Gly Leu Pro Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val 20 25 30 Ala Gln Lys 35 <210> 111 <211> 36 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 111 Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 1 5 10 15 Ile Pro Met Gly Leu Pro Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val 20 25 30 Ala Gln Lys Glu 35 <210> 112 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> PEGylation <400> 112 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr 1 5 10 15 Ser Gly Thr Ser Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 30 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 113 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Gly 1 5 10 15 Glu Gly Asp Asp Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 30 <210> 114 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 114 Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 <210> 115 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 115 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Lys 1 5 10 15 Lys Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 <210> 116 <211> 33 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 116 Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 1 5 10 15 Ile Lys Lys Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Lys 20 25 30 Glu <210> 117 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(17) <223> disulfide linker <400> 117 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Cys 1 5 10 15 Cys Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 <210> 118 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(16) <223> hydrazone linker (acidic sensitive cleavage) <400> 118 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Gln 1 5 10 15 Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 <210> 119 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 119 Ser Lys Val Ser Val Arg 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 120 Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Leu 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 121 Thr Leu Leu Tyr Leu Leu Phe Glu Leu 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 122 Thr Leu Leu Phe Leu Leu Phe Glu Leu 1 5 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 123 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 124 Ile Ile Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 125 Ile Ile Met Gln Tyr Ile Arg Ala Asn Ser Arg Phe Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 126 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 126 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Gly 1 5 10 15 Glu Gly Asp Asp Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 30 <210> 127 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 127 Glu Glu His Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Lys Val Ser Val 1 5 10 15 Arg Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 128 Glu His Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Lys Val Ser Val Arg 1 5 10 15 Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Lys Glu 20 25 30 <210> 129 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 129 Lys Glu His Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Lys Val Ser Val 1 5 10 15 Arg Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Glu 20 25 30

Claims (31)

  1. A━x━B; 및
    약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하며,
    식 중, x는 카텝신 절단 위치를 포함하는 펩티드 서열을 포함하는 링커를 포함하고;
    A는 HLA-DP 결합 펩티드, HLA-DQ 결합 펩티드 또는 HLA-DR 결합 펩티드인 펩티드를 포함하는 제1 MHC II 결합 펩티드를 포함하며;
    B는 HLA-DP 결합 펩티드, HLA-DQ 결합 펩티드 또는 HLA-DR 결합 펩티드인 펩티드를 포함하는 제2 MHC II 결합 펩티드를 포함하고,
    여기서 A 및 B는 서로 100% 동일성을 가지지 않는 것인, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은
    A━x━B━y━C; 및
    약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하며,
    식 중, y는 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고;
    C는 HLA-DP 결합 펩티드, HLA-DQ 결합 펩티드 또는 HLA-DR 결합 펩티드인 펩티드를 포함하는 제3 MHC II 결합 펩티드를 포함하며;
    A, B 및 C는 서로 100% 동일성을 가지지 않는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    (a) y는 아미드 링커, 이황화물 링커, 황화물 링커, 1,4-이치환 1,2,3-트리아졸 링커, 티올 에스테르 링커, 하이드라지드 링커, 이민 링커, 티오우레아 링커, 아미딘 링커 또는 아민 링커를 포함하는 링커를 포함하거나; 또는
    (b) y는 펩티드 서열, 리소좀 프로테아제 절단 위치, 생분해성 중합체, 치환 또는 비치환 알칸, 알켄, 방향족 또는 헤테로시클릭 링커, pH 감수성 중합체, 이종 2작용성 링커 또는 올리고머 글리콜 스페이서를 포함하는 링커를 포함하거나; 또는
    (c) y는 링커를 포함하지 않으며, A━x━B 및 C는 상기 조성물에 존재하는 혼합물을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항의 A━x━B 또는 제2항의 A━x━B━y━C를 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산을 포함하며, 여기서 상기 단리된 핵산이 둘 이상 존재할 때, 이 단리된 핵산은 함께 A━x━B 또는 A━x━B━y━C를 암호화하고,
    y는 존재하는 경우 아미드 링커를 포함하거나, 링커를 포함하지 않거나, 또는 펩티드 링커를 포함하는 것인, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 유용한 하나 이상의 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) y는 리소좀 프로테아제 절단 위치를 포함하는 펩티드 링커이며, A━x━B 및 C는 상기 조성물 중 둘 이상의 별도의 단리된 핵산에 의해 또는 상기 조성물 중 동일한 단리된 핵산에 의해 암호화되거나;
    (b) y는 링커가 아니며, A━x━B 및 C는 상기 조성물 중 둘 이상의 별도의 단리된 핵산에 의해 암호화되거나; 또는
    (c) y는 링커가 아니며, A━x━B 및 C는 상기 조성물 중 동일한 단리된 핵산에 의해 암호화되는 것인 조성물.
  6. 제4항의 하나 이상의 단리된 핵산의 전장 상보체인 하나 이상의 단리된 핵산을 포함하는, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 유용한 하나 이상의 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 상기 조성물의 적어도 일부분이 합성 나노담체의 표면상에 존재하거나; (b) 상기 조성물의 적어도 일부분이 합성 나노담체에 의해 캡슐화되거나; 또는 (a) 및 (b) 둘다인 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 합성 나노담체를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, A━x━B가 합성 나노담체에 커플링된 것인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, A━x━B가 합성 나노담체에서 캡슐화된 것인 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카텝신 절단 위치가 아미노산 서열 PMGLP (서열 번호 99) 또는 KVSVR (서열 번호 100)을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 하나 이상의 항원이 A━x━B 또는 A━x━B━y━C에 컨쥬게이트화되어 있지 않은 것인 조성물.
  14. A━x━B를 포함하며, 상기 A━x━B는 서열 번호 11-14, 16-19, 26-27, 및 39-44로 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하기 위한 조성물.
  15. A━x━B를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산을 포함하며, 상기 A━x━B의 서열은 서열 번호 11-14, 16-19, 26-27, 및 39-44로 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 유용한 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물.
  16. 제15항의 단리된 핵산의 전장 상보체인 단리된 핵산을 포함하는, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 유용한 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물.
  17. 단리된 핵산을 포함하며, 상기 단리된 핵산의 서열은 서열 번호 61-68로 제시된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 유용한 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물.
  18. 제17항의 단리된 핵산의 전장 상보체인 단리된 핵산을 포함하는, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하는데 유용한 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물.
  19. 제1항, 제2항 또는 제14항의 조성물을 포함하는 합성 나노담체를 포함하는 제제.
  20. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 백신을 포함하는 제제.
  21. 제20항에 있어서, (i) 항원; (ii) 애쥬반트; (iii) 합성 나노담체; 또는 (iv) 상기 조성물에 컨쥬게이트화된 담체를 추가로 포함하는 제제.
  22. 제1항, 제2항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 유발, 증강, 억제, 유도(direct) 또는 재유도하기 위해 상기 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 제제.
  24. 제20항에 있어서, 상기 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 제제.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 HLA-DP 결합 펩티드, HLA-DQ 결합 펩티드 또는 HLA-DR 결합 펩티드가 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), B형 간염 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 백시니아 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 거대 세포 바이러스, 수두-대상 포진 바이러스, 볼거리 바이러스, 코린박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 사람 아데노바이러스, 두창 바이러스, 또는 사람을 감염시킬 수 있고 감염의 개시 이후에 감염성 유기체에 특이적인 사람 CD4+ 기억 세포를 생성시킬 수 있는 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제1항에 있어서, A 및 B가 각각 (a) 상이한 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함하거나; 또는 (b) 동일한 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함하거나; 또는 (c) 상이한 MHC II 결합 레파토리를 가지는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  27. 제2항에 있어서, A, B 및 C가 각각 (a) 상이한 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함하거나; 또는 (b) 동일한 감염성 유기체로부터 얻어지거나 유래하는 펩티드 서열을 포함하거나; 또는 (c) 상이한 MHC II 결합 레파토리를 가지는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  28. 제1항에 있어서, A, x 또는 B가 A━x━B의 수용성을 증가시키는 서열 변형 또는 화학적 변형을 포함하며, 여기서 상기 서열 변형 또는 화학적 변형으로서는 친수성 N-말단 아미노산의 부가, 친수성 C-말단 아미노산의 부가, 소수성 N-말단 아미노산의 부가, 소수성 C-말단 아미노산의 부가, pI를 7.4로 만들고 pH 3.0에서 순 양전하를 띠도록 만드는 아미노산의 치환, 및 재배열에 영향받기 쉬운 아미노산의 치환 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
  29. 제2항에 있어서, A, x, B, y 또는 C가 A━x━B━y━C의 수용성을 증가시키는 서열 변형 또는 화학적 변형을 포함하며, 여기서 상기 서열 변형 또는 화학적 변형으로서는 친수성 N-말단 아미노산의 부가, 친수성 C-말단 아미노산의 부가, 소수성 N-말단 아미노산의 부가, 소수성 C-말단 아미노산의 부가, pI를 7.4로 만들고 pH 3.0에서 순 양전하를 띠도록 만드는 아미노산의 치환, 및 재배열에 영향받기 쉬운 아미노산의 치환 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 제1 MHC II 결합 펩티드 및 제2 MHC II 결합 펩티드 중 하나 또는 둘다의 길이가 (a) 5개 내지 50개 아미노산의 범위이거나; (b) 5개 내지 30개 아미노산의 범위이거나; 또는 (c) 6개 내지 25개 아미노산의 범위인 조성물.
  31. 제2항에 있어서, 제3 MHC II 결합 펩티드의 길이가 (a) 5개 내지 50개 아미노산의 범위이거나; (b) 5개 내지 30개 아미노산의 범위이거나; 또는 (c) 6개 내지 25개 아미노산의 범위인 조성물.
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