KR101871572B1 - 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법 - Google Patents

병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지며, 효과적으로 병원균을 검출할 수 있는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명을 통해서 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지며, 효과적으로 병원균을 검출할 수 있는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법이 제공되었다.

Description

병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법{Hybrid nanoparticles for detection of pathogenic bacteria and Manufacturing methods thereof}
본 발명은 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지며, 효과적으로 병원균을 검출할 수 있는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
초상자성을 지니는 자성 나노입자는 자기장의 유무에 따라 용액 내에서 입자의 포집과 재분산이 용이하여 다양한 기능성 물질로 이용되어 왔다. 그 중 Fe3O4 자성 나노입자는 고유의 초상자성과 생체적합성을 가지고 있어 바이오 분야에 응용하기에 적합한 것으로 알려져 있다. 특히, 항체가 결합된 기능성 자성 나노입자는 다성분 용액 내에서도 DNA, 바이오마커 단백질, 균 등의 검출 물질과 선택적으로 결합한 뒤 자기장을 이용하여 포집될 수 있어 바이오 응용소재로 많은 장점을 가지고 있다. 그러나, Fe3O4는 수분이 있을 경우 산화되어 초상자성을 잃는 결정적인 단점을 지닌다.
Fe3O4의 산화를 방지하기 위한 일반적인 방법으로는 실리카(SiO2)와 같은 보호막을 씌우는 것이 있다. 그러나 실리카 피막형성은 반응 조건을 정교하게 조절하지 못할 경우 입자들을 덩어리 상태로 응고되기 쉽고, 실리카의 높은 밀도(2.195 g/cm3)로 인하여 자성 입자의 포화 자화도가 현저히 감소한다. 더불어, 입자 표면의 실리카와 항체를 결합시키기 위하여 실레인(silane) 반응을 이용할 경우, 항체의 배향성을 떨어뜨리고 검출 물질과의 결합 효율을 감소시킨다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지며, 효과적으로 병원균을 검출할 수 있는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지며, 효과적으로 병원균을 검출할 수 있는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자를 이용하여 병원균을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서,
본 발명은 자성 나노입자;
상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 금속유기구조체 피막; 및
상기 피막에 존재하는 금속원자와 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정된 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노입자를 제공한다.
본 발명은 자성 나노입자;
상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 금속유기구조체 피막; 및
상기 피막에 존재하는 불포화 배위 결합 상태의 금속원자에 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 일 측면에서, 자성 나노입자;
상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 금속유기구조체 피막; 및
상기 피막에 존재하는 금속 원자와 싸이올기 간의 결합을 통하여 고정된 항체를 포함하는 병원성 균 포집용 복합 나노 입자를 제공한다.
본 발명은 다른 일 측면에서, 자성 나노입자;
상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 제올라이트 유사 구조체(zeolitic imidazolate frameworks,이하 ZIFs) 피막; 및
상기 피막에 존재하는 불포화 상태로 배위된 금속원자에 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다른 일 측면에서, 자성 나노 입자;
상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 ZIF-8 피막; 및
상기 피막에 배위 결합하는 절단 항체를 제공한다.
본 발명은 다른 일 측면에서 자성 나노입자, 상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 금속유기구조체 피막, 및 상기 피막에 존재하는 금속원자와 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정된 복합 나노입자를 상기 생물학적 기능성 분자체에 결합하는 물질을 포함하는 시료에 투입하는 단계;
자성을 이용하여 복합 나노입자를 분리하는 단계; 및
생물학적 기능성 분자체에 결합된 물질을 검출하는 단계
를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서,
자성 나노 입자를 금속 유기구조체로 둘러싸는 단계; 및
금속 유기 구조체의 금속원자에 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정하는 단계를 포함하는 기능성 자성 나노 입자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 항체의 무거운 사슬 사이의 이황화 결합을 환원시켜 싸이올기를 가지는 반 조각 항체로 분리하는 단계; 및
자성 나노입자의 금속유기구조체 피막에 존재하는 불포화 배위결합 상태의 아연과 반 조각 항체의 싸이올기 간의 아연-황 결합을 형성하여 항체를 고정시키는 단계를 포함하는 기능성 이중층 자성 나노입자를 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자는 자기장에 반응하는 자성을 띤 하나 이상의 미세입자로 이루어진 나노입자로 이해된다.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자의 크기는 1~1000 나노미터이며, 항원이 병원성 균인 경우에는, 하나의 항원이 여러 개의 입자와 결합할 수 있도록 100~500 나노미터 크기를 가지는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 자성 나노입자들은 공지된 방법을 통해서 제조해서 사용하는 것도 가능하며, 상업적으로 구입해서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금속유기구조체는 금속 이온과 유기 분자가 배위결합을 이루는 다공성 구조체로 이해되며, 바람직하게는 금속 이온 또는 금속 이온 클러스터가 유기 리간드와 배위결합을 통해 형성된 결정성 유무기 하이브리드 고분자일 수 있다.
상기 금속유기구조체의 금속 이온은 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합할 수 있는 금속으로서, 철, 구리, 망간, 카드뮴, 팔라듐, 아연 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
상기 금속유기구조체의 유기 분자는 금속 이온과 배위 결합하여 결정성 다공성 구조체를 형성할 수 있는 다양한 유기 분자를 사용할 수 있다. 바람직하게는 수열 안정성을 가질 수 있도록, 제올라이트 형태의 결정성 다공성 구조체를 형성하는유기 리간드를 사용할 수 있다. 유기 리간드는 2-메틸이미다졸에 국한되지 않으며, 옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 프탈산, 테레프탈산, 트리메스산을 포함하는 2개 이상의 카르복실기를 가지는 유기분자와 트리아졸 등의 아졸 화합물 등의 유기 리간드를 모두 포함하며, 나아가 상기 기재 사항에 특히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 금속유기구조체들은 어디에 공지된 방법으로 제조해서 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 금속유기구조체는 zeolitic imidazole frameworks-8 (ZIF-8)일 수 있다. ZIF-8의 경우, 실리카보다 낮은 온도와 짧은 시간 안에 입자 응집 없이 합성이 가능하며, 화학적 및 열적 안정성을 지니고 있다. 또한, ZIF-8의 바깥 표면에 존재하는 아연 원자는 완전한 배위 결합을 형성하지 않아 항체의 싸이올기와 반응하여 아연-황 결합을 형성할 수 있다. 이러한 특성을 이용하면 항체 내에 무작위로 존재하는 아민(amine)기를 이용하여 항체를 고정시키는 실레인 반응과 달리, 항체의 무거운 사슬에 존재하는 싸이올기를 이용하여 배향성 있는 항체 고정이 가능하다. 더불어 ZIF-8의 낮은 밀도(0.35 g/cm3)로 인하여 피막 물질로 쓰일 경우에도 자성 나노입자의 포화 자화도를 크게 감소시키지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 금속유기구조체 표면에 결합되는 기능기는 항체에 국한되지 않는 것으로, 검출 물질과 결합할 수 있는 단백질 리간드 (Ligand), 핵산 (DNA 또는 RNA) 분자 서열을 포함한다. 상기 검출 물질에는 병원성 균에 국한되지 않는 것으로, 상기 기능기와 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파지, 합텐(hapten; DNP), 핵산분야 앱타머(aptamer) 등을 포함하는 생체분자 및 화학적 물질을 모두 포함하는 것으로, 나아가 상기 기재 사항에 특히 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 통해서 우수한 산화방지성과 포화 자화도를 가지며, 효과적으로 병원균을 검출할 수 있는 병원균 검출용 자성 복합 나노 입자 및 그 제조 방법이 제공되었다.
본 발명은 자성 나노입자의 ZIF-8 피막에 배향성을 가지도록 항체를 고정시키는 방법을 제시하여 병원균 포집 효율을 향상시키는 동시에, 금속유기구조체의 면역검출법으로의 응용 가능성을 보여준다.
또한, 본 발명에서는 Fe3O4 자성 나노입자에 ZIF-8 피막을 형성하여 수분에 인한 입자의 산화를 지연시킬 수 있어, 입자의 화학적 안정성 및 보관성을 높이는 점에서 유용하다.
도 1. 본 발명의 방법에 의해 합성된 ZIF-8 피막의 표면을 확대한 모식도
도 2. 본 발명의 방법에 의해 싸이올기를 가지는 항체를 만드는 모식도이다. (a)는 항체의 무거운 사슬 간의 이황화 결합을 환원시켜 항체를 반 조각으로 분리시키는 것을, (b)는 싸이올기가 드러난 반 조각 항체를 나타낸다.
도 3. 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자와 ATP 측정키트를 이용하여 황색포도상구균을 포집 및 검출하는 모식도이다. (1)은 Fe3O4 (2)는 ZIF-8, (3)은 싸이올기를 가지는 항체, (4)는 황색포도상구균을 나타낸다.
도 4. 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자를 이용하여 황색포도상구균을 검출한 결과이다. (a)는 황색포도상구균의 표면에 선택적으로 결합된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자의 사진이다. (b)는 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자를 이용하여 황색포도상구균을 포집한 뒤 ATP 검출 키트를 이용하여 균을 검출한 결과이다.
도 5. 황색포도상구균 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자의 선택성 시험 결과이다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 기재하고 있지만, 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서 정하여짐을 유의하여야 한다.
1. 시약 및 장비
염화철(III)(6수화물)(Iron(III) chloride hexahydrate, FeCl3
Figure 112016037595853-pat00001
Figure 112016037595853-pat00002
6H2O), 구연산나트륨(Sodium citrate), 요소(urea), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PAM, Mw 5,000,000-6,000,000 g/mol), 질산아연(6수화물)(Zinc nitrate hexahydrate, Zn(NO3)2
Figure 112016037595853-pat00003
Figure 112016037595853-pat00004
6H2O), 2-메틸이미다졸(2-Methylimidazole, 2-MIM), 메탄올(methanol), 2-(N-모르폴리노)에테인설폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES), 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, H2KPO4), 제2인산칼륨(potassium phosphate dibasic, HK2PO4), 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TECP), 트윈 20(Tween 20)은 시그마-알드리치 社에서 구매하였다.
황색포도상구균 항체는 Abcam Inc. 社에서 구매하였다.
카제인 가수분해물(Casein hydrolysate)은 MP Biomedicals. 社에서 구매하였다.
아미콘 원심필터(Amicon centrifugal 10K filter)는 Millipore 社에서 구매하였다.
휴대용 광도계와 ATP 검출 키트는 Kikkoman 社에서 구매하였다.
2. Fe3O4 자성 나노입자 클러스터(이하 자성 나노입자) 합성
F3O4 자성 나노입자는 one-pot solvothermal method를 이용하여 합성되었다. 먼저 8 밀리몰의 염화철(III)(6수화물)과 24 밀리몰의 요소 그리고 16 밀리몰의 구연산나트륨을 30 밀리리터의 물에 녹인다. 그 후, 자석막대를 이용하여 계속 섞어주면서 0.6 그램의 폴리아크릴아마이드를 첨가한다. 이렇게 만들어진 반응 용액을 100 밀리리터 부피의 테프론 재질의 오토클레이브 용기에 옮기고 온도를 섭씨 200 도로 12 시간 동안 유지시킴으로써 합성반응을 일으킨다. 그 후 용액을 상온까지 식힌 뒤 합성된 입자들을 자석을 이용하여 모은 뒤 나머지 반응물질들을 버리고 에탄올과 물을 이용하여 수 번 씻어냄으로써 최종적으로 Fe3O4 자성 나노입자를 얻을 수 있다.
3. 자성 나노입자 표면에의 ZIF-8 피막 합성
ZIF-8 피막은 초음파 화학적 방법으로 합성되었다. 먼저 0.8 밀리몰의 질산아연(6수화물)과 0.8 밀리몰의 2-메틸이미다졸을 30 밀리리터 메탄올에 녹인다. 이 용액에 2에서 합성한 0.1 그램의 자성 나노입자를 섞어준 뒤 초음파처리 (sonication)를 하며 섭씨 60 도에서 반응시킨다. 그 후 용액을 상온까지 식힌 뒤 합성된 입자들을 자석을 이용하여 모으고, 메탄올과 물을 이용하여 수 번 씻어냄으로써 최종적으로 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자를 얻을 수 있다. 도 1은 합성된 ZIF-8 피막의 표면을 확대한 모식도를 나타낸다. ZIF-8 최외각 표면의 아연은 2-메틸이미다졸의 질소와 불포화 배위결합을 이루어 또 다른 전자쌍과 추가적인 배위결합을 이룰 수 있는 상태이다.
4. Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자로의 항체 고정
Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자의 표면에 항체를 고정시키기 위하여 항체의 이황화 결합을 환원시켜 싸이올기를 가지는 반 조각 항체로 분리하였다. 먼저 MES 9.76 그램과 염화나트륨 4.5 그램을 500 밀리리터 물에 녹여 MES 완충용액을 만든다. 그 뒤 TCEP 14 마이크로그램과 항체 10 마이크로그램을 400 밀리리터 MES 완충용액에 녹여 잘 섞어준 뒤 반응시킨다. 반응한 항체는 아미콘 원심필터를 이용하여 MES 완충용액으로 정제한 뒤 1.5 밀리그램의 Fe3O4@ZIF-8 나노입자와 섞어 반응시킨다. 그 뒤 항체가 고정된 입자를 카제인 0.07 그램과 트윈 20 0.01 그램과 섞어 비특이적 결합을 방지하고 인산완충액으로 여러 번 씻어준다. 인산완충액은 인산이수소칼륨 0.272 그램과 제2인산칼륨 1.714 그램을 1 리터 물에 녹여 만든다.
도 2는 TCEP가 항체의 무거운 사슬 간의 이황화 결합을 환원시켜 항체를 반 조각으로 분리시키고 싸이올기를 드러나게 하는 모식도를 나타낸다. ZIF-8 최외각 표면의 불포화 배위결합을 이루는 아연은 포화 배위결합을 가지는 아연에 비해 높은 에너지를 가지므로, 에너지를 낮추기 위하여 항체의 싸이올기와 반응할 수 있다. 싸이올기를 통한 입자 표면의 항체 고정은 단일 단계로 이루어지며, 항체가 배향성을 가지고 고정되어 검출 물질과의 결합 효율을 높인다.
5. Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자를 이용한 병원균 검출
본 실험은 황색포도상구균을 대상으로 진행된 실험이다. 도 3은 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자와 ATP 측정키트를 이용하여 황색포도상구균을 포집 및 검출하는 모식도이다. 균이 들어있는 10 밀리리터 우유에 0.1 밀리그램의 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자를 섞어준 뒤 자석으로 분리한다. 인산완충액으로 균-입자 복합체를 여러 번 씻어낸 뒤 100 마이크로리터로 농축시킨다. 농축된 복합체 용액을 ATP 검출 키트에 넣고 흔들어 준 뒤 휴대용 광도계를 이용하여 광도를 측정한다. 도 4는 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자를 이용하여 황색포도상구균을 검출한 결과이다. 도 4의 (a)에서 볼 수 있듯이 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자는 균의 표면과 결합하여 우유 속에서 선택적으로 균을 포집하였다. 균의 농도를 변화시키며 ATP 검출 키트를 통해 발광도를 측정한 결과, 도 4의 (b)에서 균의 농도가 증가함에 따라 발광도가 증가하였고, 검출 민감도는 단위 밀리리터당 300 CFU보다 낮다.
6. Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자의 선택성 시험
항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자의 선택성을 시험하기 위하여 황색포도상구균 이외의 병원성 균 4종에 대하여 검출시험을 하였다. 시험에 사용한 병원성 균으로는 대장균, 쥐티푸스균, 장염비브리오균, 리스테리아균이 있다. 우유 속 106 CFU의 4가지 균을 각각 0.1 밀리그램의 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자와 섞어준 뒤 자석으로 분리한다. 인산완충액으로 균-입자 복합체를 여러 번 씻어낸 뒤 100 마이크로리터로 농축시킨다. 농축된 복합체 용액을 ATP 검출 키트에 넣고 흔들어 준 뒤 휴대용 광도계를 이용하여 광도를 측정한다. 도 5는 황색포도상구균 항체가 고정된 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자의 선택성 시험 결과이다. 다른 종의 균으로부터 나온 ATP 발광도는 검출 목표인 황색포도상구균의 발광도에 비해 낮다. 따라서 Fe3O4@ZIF-8 복합 나노입자에 황색포도상구균의 항체가 잘 고정되었고, 이 입자는 선택적으로 목표 균만을 검출할 수 있다.

Claims (15)

  1. 자성 나노입자;
    상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 금속유기구조체 피막; 및
    상기 금속 유기 구조체 피막에 존재하는 아연 원자와 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정된 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노입자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 기능성 분자체는 항체인 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노 입자.
  5. 제4항에 있어서, 항체는 싸이올기를 가지는 반조각 항체인 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 금속 유기 구조체는 제올라이트 유사 구조체인 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 금속 유기 구조체는 ZIF-8인 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노 입자.
  8. 삭제
  9. 자성 나노입자, 상기 자성 나노 입자를 둘러싸는 금속유기구조체 피막, 및 상기 피막에 존재하는 금속원자와 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정된 복합 나노입자를 상기 생물학적 기능성 분자체에 결합하는 물질을 포함하는 시료에 투입하는 단계;
    자성을 이용하여 복합 나노입자를 분리하는 단계; 및
    생물학적 기능성 분자체에 결합된 물질을 검출하는 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 기능성 분자체는 싸이올기를 가지는 반조각 항체인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생물학적 기능성 분자체에 결합하는 물질은 병원성 균인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 병원성 균은 포도상 구균인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  13. 자성 나노 입자를 금속 유기구조체로 둘러싸는 단계; 및
    금속 유기 구조체의 아연 금속원자에 생물학적 기능성 분자체의 황 원자가 배위 결합으로 고정하는 단계를 포함하는 기능성 자성 나노 입자의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 생물학적 기능성 분자체는 항체의 무거운 사슬 사이의 이황화 결합을 환원시켜 싸이올기를 가지는 반 조각 항체인 것을 특징으로 하는 기능성 자성 나노 입자의 제조 방법.

  15. 삭제
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