KR101869639B1 - 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개병풍(Astilboides tabularis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 개병풍 추출물 및 이의 분획물은 암세포주의 세포사멸을 유도하고, 산화질소의 생성, 타이로시나아제 또는 엘라스테이즈 활성 및, 지방전구세포의 분화를 억제함으로써, 항암, 항염증, 항비만 또는 피부개선용 조성물로 사용될 수 있다.

Description

개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도{Composition comprising Astilboides tabularis extracts or fraction thereof as an active ingredient and use thereof}
본 발명은 개병풍(Astilboides tabularis ) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
개병풍은 피자식물문(Angiospermae), 장미목(Rosales), 범의귀과(Saxifragaceae)에 속하는(Lee, 2003a) 다년생 초본식물로서, 환경부의 멸종위기 야생식물 II급으로 지정되어 있는 북방계식물이다(National Institute of Environmental Research, 2014). 개병풍은 한반도 북부 및 강원도 지역의 석회암지대와 중국의 길림성과 랴오닝 지역에 제한적으로 자생한다(Fu and Hong, 1998; Korea National Arboretum, 2012).
또한, 개병풍의 근경을 산하엽(山荷葉)이라 부르며 복통치료, 장염치료 또는 지사에 효과가 있고 어린잎은 식용으로 이용한다(Ahn, 2003; Lee, 2006a). 개병풍에 대한 연구는 이의 유전다양성(Lee, 2007), 13개 개체군의 생태적 특성(Ku, 2006) 및 이의 유전적 특성을 밝힌 것이 전부이다. 한편, 국제적으로는 개병풍 잎에서 퀘르시트린, 캠퍼롤-3-O-L-람노사이드, 퀘르세틴-3-O-β-D-갈락토사이드, 갈릭산, 베르게닌 및 퀘르세틴 등의 6개 화합물을 분리하였다는 보고가 있다.
대기중 포함되는 산소는 21%로서, 대부분의 생명체에 필수적인 원소이다. 그러나, 산소가 활성산소(ROS)로 전환되면 치명적인 독성을 유발한다(Yoo, 2011). 따라서, 세포의 구성성분인 지질, 단백질, 당, DNA등이 비가역적 손상을 입음으로서 암, 염증, 뇌졸중, 자가 면역 질환 등 각종 질병과 노화를 일으킨다(Enrique et al., 2001).
한편, 항산화제는 활성산소로 인해 우리 몸이 노화되고 손상되는 것을 막아주는 물질이다. 이의 예로는, 수퍼옥사이드 디스무타아제(SOD), 글루타시온, 페록시다제 등의 효소와 같은 천연 항산화제와 플라보노이드, 폴리페놀과 같은 합성 항산화제가 있다. 현재는 합성 항산화제인 부틸히드록시톨루엔(BHT), 부틸히드록시아니솔(BHA)을 많이 사용한다. 그러나, 합성 항산화제의 독성에 대한 부작용이 보고되면서 소비자들이 이를 기피하고 있다(Branen, 1975; Pokorny, 2007).
염증은 감염이나, 생체 내 대사산물의 자극에 의한 인체의 방어 기전이다(Rocca et al., 2012). 대식세포의 NF-kB는 iNOS 및 COX-2와 같은 염증인자를 발현시키는데 중요한 역할을 한다(O' Connell et al., 1998). 따라서, 대식세포의 활성과 연관된 염증 인자들을 억제하는 물질은 다양한 염증연구 및 치료에 유용하게 쓰일 수 있다. 현재 염증의 치료제로서 다양한 스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제가 사용되고 있다.
암은 현재 한국에서 사망원인 1위인 질병으로서 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 간암, 전립선암의 순으로 많이 발생한다. 암의 치료는 수술, 방사선 및 약물치료 등의 방법이 사용된다. 약물치료를 위한 항암제는 대부분 세포내 DNA의 복제나, 전사과정을 억제함으로써 종양의 성장을 억제하기 위해 세포 생존에 필수적인 단백질의 작용을 방해한다. 그러나 이는 암세포 뿐만 아니라 정상 세포에도 세포 독성을 유발하며 구토, 탈모, 설사, 면역력 저하 등의 부작용을 발생시킨다(Hofman, 2004; Kang and Liang 1997; Park et al., 1995).
피부는 자외선으로 인하여 발생하는 피부세포의 손상을 억제하기 위해 멜라닌을 증가시킨다. 멜라닌은 타이로시나아제(tyrosinase), TRP-1 및 TRP-2에 의해 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)를 거쳐 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환되고, 도파퀴논에서 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬(dopachrome)을 거쳐 생성된다(Alaluf et al., 2001). 따라서, 미백과 관련된 제품 개발에 있어 타이로시나아제, TRP-1 및 TRP-2 등과 같은 효소의 활성 억제 실험이 일차 평가방법으로 사용되고 있다(Curto et al., 1999).
현재 사용되고있는 미백성분으로는 코직산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin)과 같이 타이로시나아제의 활성을 억제하는 물질과 하이드로퀴논, 비타민 C등이 있으나, 이들 물질은 분해, 착색, 부착용, 이취, 불안정성 등의 안정성 문제로 사용이 제한되고 있다(Choung et al., 2013).
비만은 당뇨, 고혈압, 고지혈증 및 심혈관질환과 같은 성인병 발생을 증가시킨다(Spiegelman and Flier, 2001). 현재 사용되고 있는 비만 치료제는 두통, 우울중, 지방변 및 인지능력 저하 등의 다양한 부작용이 있다고 보고 되었으며(Ballinger and Peikin, 2002; Lee, 2013), 이러한 부작용을 줄이기 위하여 안정성이 검증된 천연물을 이용한 항비만 소재개발 연구가 다수 진행되고 있다(Jeon et al., 2014; Choi et al., 2013; Shon et al., 2013)
이에, 본 발명자들은 안정성이 우수한 천연물을 이용한 치료제 개발을 위해 노력하던 중, 개병풍 추출물이 항암 및 항비만 활성뿐 아니라, 피부개선 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 피부 외용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항비만제를 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 피부외용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 건강기능식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 개병풍 추출물 및 이의 분획물은 암세포주의 세포사멸을 유도하고, 산화질소의 생성, 타이로시나아제 또는 엘라스테이즈 활성 및, 지방전구세포의 분화를 억제함으로써, 항암, 항염증, 항비만 또는 피부개선용 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 환원력을 확인한 그래프이다:
M: 메탄올 추출물;
H: n-헥산 분획물;
E: 에틸아세테이트 분획물;
W: 물 분획물;
B: n-부탄올 분획물; 및
A : 아스코르브산
도 2는 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 산화질소 생성 억제 활성을 확인한 그래프이다:
M: 메탄올 추출물;
H: n-헥산 분획물;
E: 에틸아세테이트 분획물;
B: n-부탄올 분획물; 및
W: 물 분획물.
도 3은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 타이로시나아제 저해 활성을 확인한 그래프이다:
M: 메탄올 추출물;
H: n-헥산 분획물;
E: 에틸아세테이트 분획물;
W: 물 분획물;
B: n-부탄올 분획물; 및
K: 코직산.
도 4는 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 엘라스테이즈 저해 활성을 확인한 그래프이다:
M: 메탄올 추출물;
H: n-헥산 분획물;
E: 에틸아세테이트 분획물;
B: n-부탄올 분획물;
W: 물 분획물; 및
U.A: 우르솔산.
도 5는 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 암 세포에 대한 세포독성을 확인한 그래프이다:
M: 메탄올 추출물;
H: n-헥산 분획물;
E: 에틸아세테이트 분획물;
B: n-부탄올 분획물; 및
W: 물 분획물.
도 6은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 정상세포에 대한 세포독성을 확인한 그래프이다:
M: 메탄올 추출물;
H: n-헥산 분획물;
E: 에틸아세테이트 분획물;
B: n-부탄올 분획물; 및
W: 물 분획물.
도 7a는 개병풍 추출물의 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물의 HCT 116 세포에서의 세포사멸 유도 활성을 확인한 FACS 결과이다.
도 7b는 개병풍 추출물의 부탄올 분획물에 의해 암세포의 세포사멸을 유도 하는 유전자의 발현변화를 확인한 도 및 그래프이다.
도 7c는 개병풍 추출물의 부탄올 분획물에 의해 암세포의 세포사멸을 유도하는 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 8은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 중성지방 억제 활성을 확인한 도 및 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있고, 개병풍의 잎, 줄기, 가지 또는 뿌리를 모두 사용할 수 있다.
상기 개병풍 추출물은 하기 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
1) 개병풍에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C4의 저급 알코올일 수 있고, 구체적으로, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 이때, 추출용매는 건조된 개병풍 중량에 1 내지 10배로 첨가될 수 있다.
또한, 상기 단계 1)의 추출은 진탕추출, Soxhlet 추출, 환류추출, 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출 또는 초음파 추출법을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 추출은 1 내지 5회, 구체적으로, 3회 반복 될 수 있다.
상기 제조방법에서 상기 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있다.
상기 개병풍 추출물의 분획물은 추출물을 순차적으로 유기용매로 추출하여 분획물을 제조하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
구체적으로, 개병풍 추출물의 분획물은 개병풍의 추출물로부터 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 상기 분획물은 n-부탄올, 구체적으로 수포화 n-부탄올 분획물일 수 있다.
상기 암은 대장암, 결장암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 유방암, 자궁경부암 또는 전립선암일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍 메탄올 추출물로부터 개병풍의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 제조하고, 상기 개병풍의 추출물 및 분획물이 암세포주의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 상기 추출물 및 분획물은 세포사멸을 유발하고, 이와 관련된 인자의 발현을 증가시켰다(도 7a 내지 7c 참조).
따라서, 본 발명의 개병풍 추출물 및 분획물은 암의 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 혀탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽ㅈ일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부졍제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 mg/kg, 구체적으로 0.001 내지 10 mg/kg일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 암은 대장암, 결장암, 폐암, 간암, 위암, 체장암, 담도암, 유방암, 자궁경부암 또는 전립선암일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍 추출물과 개병풍의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물이 암세포주의 성장을 억제하고(도 6 참조), 세포사멸을 유발하며, 이와 관련된 인자의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 7a 내지 7c 참조). 따라서, 본 발명의 개병풍 추출물 및 분획물은 암 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다. 건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 염증성 질환은 기관지염, 위염, 관절염, 염증성 장질환, 다발성경화증, 간염, 담낭염, 진균성 감염증, 의궤양, 피부염, 장염, 췌장염, 건염 또는 신장염일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍 추출물과 개병풍의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물이 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 억제하는 것을 확인함으로써, 상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 염증성 질환 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 염증성 질환은 기관지염, 위염, 관절염, 염증성 장질환, 다발성경화증, 간염, 담낭염, 의궤양, 피부염, 장염, 췌장염, 망막염, 건염 또는 신장염일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍 추출물과 개병풍의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물이 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 억제하는 것을 확인함으로써, 상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 염증성 질환의 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 피부 외용제를 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 항염증용 피부외용제는 관절염, 피부염 또는 망막염에 대해 항염증 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍 추출물과 개병풍의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물이 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 억제하는 것을 확인함으로써, 상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 항염증용 피부 외용제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 피부외용제는 화장품학 및 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 피부 외용에 적합한 모든 제형일 수 있고, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형 소낭 분산제의 형태나 크림, 파우더, 연고, 스프레이 등의 형태일 수 있다. 상기 피부외용제는 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 피부 외용제는 거품의 형태 또는 압축된 추친제를 더 함유하는 에어로졸 형태로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 외용제는 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같이 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 관절염, 피부염 또는 망막염에 대해 항염증 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍 추출물과 개병풍의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물이 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 억제하는 것을 확인함으로써, 상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 항염증성 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이새도 등을 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 개병풍 또는 이의 분획물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같이 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항비만제를 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍의 n-부탄올 분획물이 농도 의존적으로 지방구의 형성을 억제시킴으로써(도 8참조) 상기 개병풍의 n-부탄올 분획물이 항비만용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 피부 외용제를 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 피부외용제는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍의 n-부탄올 분획물이 농도 의존적으로 지방구의 형성을 억제시킴으로써(도 8참조) 상기 개병풍의 n-부탄올 분획물이 항비만용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항비만용 건강기능식품을 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍의 n-부탄올 분획물이 농도 의존적으로 지방구의 형성을 억제시킴으로써(도 8참조) 상기 개병풍의 n-부탄올 분획물이 항비만용 건강기능식품으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명은 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 개병풍은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물을 제조하기 위한 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는, 건조된 개병풍 중량의 1 내지 10배로 첨가될 수 있다. 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물로 순차적으로 분획된 분획물일 수 있으며, 구체적으로, 수포화 n-부탄올로 분획된 분획물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개병풍의 분획물이 타이로시나아제의 활성을 저해하고(도 3 참조), 농도의존적으로 엘라스테이즈의 활성을 저해함으로써(도 4 참조), 상기 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 피부 개선용 화장료 조성물로 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 개병풍 추출물의 분획물의 제조
본 발명자들은 강원도 자연환경연구원에서 메탄올 조추출물(crude extract)을 제공받아 개병풍 조추출물의 분획물을 제조하였다.
구체적으로, 메탄올 조추출물 113 g을 증류수에 현탁한 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올(수포화) 및 물로 순차적 용매 분획하였다. 동일한 방법으로 3회 이상 처리하여 용매의 색이 투명해질 때까지 반복하였으며, 그 결과, 27.4g의 n-헥산 분획물(24.2%), 37.6g의 에틸아세테이트 분획물(33.3%), 26.6g의 n-부탄올 분획물(23.5%) 및 21.4g의 물 분획물(19%)을 얻었다.
< 시험예 1> 개병풍의 항산화 활성확인
실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 항산화능은 DPPH 자유 라디칼 소거법으로 확인하였다.
구체적으로, 96웰 플레이트에 100 ㎕의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 1, 5, 또는 10 ug/ml의 농도로 분주한 뒤, 100 ㎕의 0.15 mM DPPH 용액을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 515 nm에서 UV/VIS 분광광도계(V530, Jasco Co, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이때, RC50은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 화합물의 농도이다. 대조군으로서는 항산화제인 아스코르브산, α-토코페롤, tert-부틸히드록시아니솔(BHA)을 사용하였다.

시료		 DPPH 라디칼
소거활성
IC50 (㎍/㎖)		 총 페놀 함량
(mg GAE/g)		 총 플라보노이드 함량
(mg QE/g)
메탄올 추출물 7.03±0.09 c 466.9±0.83 b 102.04±3.88 b
헥산 분획물 9.40±0.13 d 302.38±5.39 d 62.07±3.35 c
에틸아세테이트
분획물		 2.90±0.08 a 549.70±2.72 a 154.58±1.04 a
부탄올 분획물 4.80±0.07 b 419.15±1.91 c 24.75±0.34 d
물 분획물 21.63±0.26 e 78.04±2016 e 13.69±0.06 e
BHA 6.12±0.27 - -
α-토코페롤 10.60±0.40 - -
아스코르브산 2.19±0.06 - -
a : p-value 평균 값 P<0.05
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, 개병풍의 에틸아세테이트 분획물이 2.9 ㎍/㎖의 RC50 값을 나타내었다, 이는 강력한 항산화제인 아스코르브산(2.19㎍/㎖)과 비슷하였고, 알파-토코페롤 및 BHA보다 높았다(표 1.)
< 시험예 2> 개병풍의 페놀 및 플라보노이드 함량 확인
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 페놀 및 플라보노이드의 함량은 Folin Ciocalteu(1996)의 방법으로 측정하였다.
먼저, 100 ㎕ 개병풍 또는 이의 분획물에 50 ㎕의 Folin Ciocalteu(Sigma Aldrich, USA)를 가하고 상온에서 5분간 안정화시킨 후, 300 ㎕의 20% 탄산나트륨을 가하였다. 이를 다시 상온에서 15분간 안정화시키고 1 ml의 증류수를 넣고 UV/VIS 분광광도계를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 페놀의 함량은 표준물질인 갈릭산을 이용하여 검량선을 작성한 뒤 정량하여 GAE(gallic acid equivalents)로 나타내었다.
한편, 플라보노이드함량을 측정하기 위해 100 ㎕의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물에 20 ㎕의 10% 질산알루미늄, 20 ㎕의 1M 아세트산칼륨, 860 ㎕의 80% 에탄올 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분 동안 안정화시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 퀘르세틴(quercetin)을 표준물질로 이용하여 검량선을 작성한 다음 QE(quercetin equivalents)로 나타내었다.
그 결과, 상기 표 2에서와 같이 개병풍의 전체 페놀 함량은 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높게 나타났으며, 메탄올, n-부탄올, n-헥산 및 물 분획물 순으로 높았다. 한편, 플라보노이드 함량도 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높게 나타났다(표 2).
< 시험예 3> 개병풍의 환원력 증가 효과
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 환원력은 Oyaize(1996)의 방법을 변형하여 측정하였다.
구체적으로 100 ㎕의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 각각 10, 50 또는 100 ㎍/ml의 농도로, 100 ㎕의 0.2 M 인산 나트륨 완충액(pH 6.6) 및 100 ㎕의 1% 페리시안화칼륨과 혼합하여 20℃에서 20분간 반응시켰다. 여기에 100 ㎕의 10% 트리클로아세틱산, 400 ㎕의 증류수 및 10 ㎕의 0.1% 염화 제2철을 순차적으로 가하여 혼합하였다. 상기 혼합물의 흡광도를 700 nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 개병풍 또는 이의 분획물의 농도의존적으로 환원력이 증가하였다. 특히 에틸아세테이트 분획물과 메탄올 분획물에서 높은 환원력을 나타내었으며, 100 ㎕/㎖ 농도의 에틸아세테이트 분획물은 양성대조군인 아스코르브산과 활성이 유사하였다(도 1).
< 시험예 4> 개병풍의 항염 활성 확인
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 항염활성은 산화질소의 생성억제활성을 측정하여 확인하였다.
구체적으로, RAW264.7 세포를 5 X 105 cells/well로 96웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 100, 200, 또는 500 ㎍/㎖ 농도로 개병풍 또는 이의 분획물을 처리하였으며, 30분 후 100 ng/㎖의 LPS를 처리하였다. 이를 다시 24시간 배양하고 50 ㎕의 그리스(Griess) 시약과 50 ㎕의 배양 상층액을 혼합하여 ELISA 마이크로플레이트 리더기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 처리군에서 농도 의존적으로 산화질소의 생성이 억제되었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수한 효과를 나타내었다(도 2).
< 시험예 5> 개병풍의 피부개선 효과 확인
<5-1> 피부 미백효과 확인
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 미백효과를 타이로시나아제 저해 활성측정을 통해 확인하였다.
구체적으로, 67 mM 인산나트륨용액(pH 6.8)을 완충액으로 사용하여 120 ㎕의 8.3 mM L-DOPA, 50 ㎕의 타이로시나아제(125 U) 및 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 농도별(10, 50 또는 100 ㎕/㎖)로 희석한 시료를 제조하였다. 상기 제조된 시료 40 ㎕를 96웰 플레이트에 분주한 뒤, 37℃에서 30분 동안 반응시키고 ELISA 리더기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 DOPA크롬을 정량하였다. 이때 대조군은 시료대신 완충액을 첨가하였고, 양성 대조군으로는 코직산(kojic acid)을 이용하였다. 타이로시나아제 저해율은 하기 수학식1을 이용하여 계산하였다.
<수학식 1>
저해율(%)=(1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) X 100
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 코직산을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리한 군은 약 62%, 개병풍의 에틸아세테이트 분획물을 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 군은 약 51%의 타이로시나아제 저해율을 나타내었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물을 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 군은 77.9%의 높은 저해율을 나타내어 우수한 미백 효과가 있음을 확인하였다(도 3).
<5-2> 주름 및 탄력 개선 효과 확인
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물의 주름 및 탄력개선 효과를 하기와 같은 방법으로 측정하였다.
구체적으로, <실시예 5-1>과 동일한 방법으로 200, 500 또는 1,000 ㎍/㎖의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 시료를 준비하였다. 여기에 0.25 ㎍/㎖로 돼지 이자 엘라스타아제가 용해된 100 mM tris-HCl 완충액(pH 8.6) 및 0.25 U/㎖의 농도로 N-숙시닐-(L-알라)-3-P-니트로아닐라이드(N-succinyl-(L-Ala)-3-P-nitroanilide)가 용해된 100 mM tris-HCl 완충액(pH 8.6)을 첨가하였다. 이를 37℃에서 20분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-니트로아닐린의 생성량을 415 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 엘라스타아제의 저해율은 상기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 개병풍의 에틸아세테이트 분획물은 효과가 거의 없었으나, 다른 분획물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 엘라스타아제 저해 활성을 나타내었다. 이는 양성대조군인 우르솔산(ursolic acid)과 유사하였다(도 4).
<시험예 6> 개병풍의 항암활성 확인
<6-1> 암세포의 성장억제 효과 확인
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 암세포의 성장을 억제하는지 여부를 WST(water-soluble tetrazolium salt)-1 분석법으로 확인하였다.
구체적으로, 암 세포로서 인체 위암세포인 AGS, 대장암 세포인 CoLo 205, 자궁경부암 세포인 HeLa, 유방암 세포인 MCF 7, 전립선암 세포인 PC 4 및 결장암 세포인 HCT 116는 한국세포주은행으로부터 분양받았다. 상기 세포는 10% 소태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM 또는 RPMI 1640 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 계대 배양하여 준비하였다. 배양된 암세포주를 0.25% 트립신-EDTA용액을 이용하여 회수하고 이를 계수하여, 최종 세포의 농도가 3 X 104 cells/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 각 웰당 100 ㎕씩 분주하였다. 이를 상기와 동일한 조건에서 24시간 동안 더 배양한 후, 개병풍 추출물 또는 이의 분획물을 10, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 다시 24시간 배양한 후 세포증식 정도를 측정하였다. 이때 대조군으로서는 HEK 293 세포주를 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 200 ㎍/㎖ 농도의 개병풍 n-부탄올 분획물을 처리하였을 때 모든 암세포에서 높은 세포사멸률을 나타내었다. 특히, 상기 농도에서 결장암 세포주인 HCT 116이 14.1%의 생존율을 보임으로써, 개병풍 추출물의 n-부탄올 분획물이 결장암 세포주에 대한 성장억제 효과가 매우 우수함을 확인하였다(도 5). 한편, 정상세포에 대해서는, 고농도(500 또는 1,000 ㎍/㎖)로 에틸아세테이트 분획물을 첨가한 경우를 제외하고는 성장 억제효과를 나타내지 않았다(도 6).
<6-2> 암세포의 세포사멸 유도효과 확인
상기 실시예 1의 개병풍 추출물 또는 이의 분획물이 암세포의 세포사멸을 유도하는지 여부를 FACS로 확인하였다.
먼저, HCT 116 세포주를 6웰 플레이트에 1 X 105 cells/well의 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 여기에 개병풍의 에틸아세테이트 또는 n-부탄올 분획물을 10, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 다시 24시간 배양하였다. 배양 후, 아넥신 V-FITC 세포사멸 탐지키트(Biovision, UK)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 FACS를 수행하였다. 구체적으로, 5 ㎕의 아넥신과 5 ㎕ 프로피디움 요오드화물(PI)을 첨가하여 세포를 염색하고, FACS Calibur(488 nm laser, 633 nm laser)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 개병풍의 에틸 아세테이트와 n-부탄올 분획물의 농도가 증가할수록 암세포의 사멸이 농도 의존적으로 증가하였다. 특히, 개병풍의 n-부탄올 분획물을 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 74%의 HCT 116 세포가 사멸하였다. 이를 통해, 개병풍의 n-부탄올 분획물이 결장암 세포의 세포사멸 을하는 효과가 우수함을 확인하였다(도 7a).
<6-3> 세포사멸 관련 인자의 발현변화 확인
상기 실시예 1의 개병풍의 분획물에 의해 세포사멸 관련 인자의 유전자 발현 수준이 변화하는지를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 실험으로 확인하였다.
구체적으로, HCT 116 세포를 6웰 플레이트에 3 X 105 cells/well의 농도로 분주하고 여기에 개병풍의 n-부탄올 분획물을 10, 50, 100 또는 200 ppm의 농도로 첨가하였다. 24시간 배양 후, 전체 RNA 추출 키트(Cat.17211, iNtRON, Korea)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA의 흡광도를 260 nm 및 280 nm에서 측정하여 순도(1.7~2.0)를 확인하고 OD260에서 RNA의 농도를 확인하였다. 정량한 RNA를 이용하여 통상적인 방법으로 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 카스파제 3, 카스파제 9 및 p53 유전자를 하기 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 증폭하여 발현변화를 확인하였다.
프라이머 이름 서열 (5'→3') 서열번호
β-actin F 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3' 서열번호 1
β-actin R 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3' 서열번호 2
p53 F 5'-GCGCACAGAGGAAGAGAATC-3' 서열번호 3
p53 R 5'-CTCTCGGAACATCTCGAAGC-3' 서열번호 4
Caspase-3 F 5'-GAACTGGACTGTGGCATTGA-3' 서열번호 5
Caspase-3 R 5'-TGTCGGCATACTGTTTCAGC-3' 서열번호 6
Caspase-9 F 5'-TGGACGACATCTTTGAGCAG-3' 서열번호 7
Caspase-9 R 5'-GCAAGATAAGGCAGGGTGAG-3' 서열번호 8
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 개병풍 n-부탄올 분획물의 농도에 의존적으로 p53 및 카스파제-9 유전자의 발현이 증가하였다(도 7b).
<6-4> 세포사멸유도 단백질의 발현변화 확인
상기 실시예 1의 개병풍의 분획물에 의한 세포사멸유도 단백질의 발현변화를 면역 블롯팅으로 확인하였다.
구체적으로, HCT 116 세포주에 50 ㎕의 용해완충액(0.1M의 PMSF가 첨가된 Triton X-100)을 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 이를 4℃, 13,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 단백질의 양은 브래드포드 어세이(bradford assay)를 이용하여 분광광도계로 정량하였다. 정량한 단백질을 100℃에서 5분간 가열하고 12% 소듐 도데실황산나트륨(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, PVDF 막(Bio Rad, USA)으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 5% 탈지유로 전처리하고 1:1000으로 희석한 1차 항체로서 카스파제-3(Cell Signaling Technology, USA), 카스파제-9(Cell Signaling Technology, USA) 또는 폴리-ADP-라이보즈 폴리머라제(PARP, Cell Signaling Technology, USA) 단백질에 대한 항체를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이를, 0.5% 트윈-20이 첨가된 PBS로 10분간 3번 세척하고 1:1000으로 희석한 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 이를 PBS로 10분간 3번 세척하고 ECL(enhanced chemiluminoeseence, Amersham Life Science Corp, USA)용액을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 개병풍의 n-부탄올 분획물의 농도에 의존적으로 절단된 카스파제-9(cleaved caspase-9), 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3) 및 PARP(Poly ADP ribose polymerase)단백질의 발현이 증가하였다. 이는 개병풍의 n-부탄올 분획물에 의해 카스파제-3 효소가 활성화되어 세포의 사멸을 유도함을 나타낸다(도 7c).
< 시험예 7> 개병풍의 항비만 활성 확인
상기 실시예 1의 개병풍의 n-부탄올 분획물의 항비만 활성을 오일 레드 O 염색으로 확인하였다.
구체적으로, 지방전구세포인 3T3-L1세포는 10% 우아혈청(bovine calf serum)과 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 상기세포를 6웰 플레이트에 2 X 104 cells/well의 농도로 분주한 뒤, 100% 융합(confluent)한 상태가 되도록 배양하였다. 한편, 개병풍의 n-부탄올 분획물은 10% 소태아혈청 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)와 분화유도물질로서 10 ㎍/㎖의 인슐린, 1 mM의 DEX(Dexamethasone, Sigma Aldrich, USA) 및 0.5mM의 IBM(Isobutylmethylxanthine, Sigma Aldrich, USA)를 포함하는 DMEM배지에 10, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 현탁하여 준비하였다. 상기 준비된 개병풍의 n-부탄올 분획물을 배양 48시간 후에 상기 세포에 첨가하였다. 이후에는 지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% 소태아혈청 및 10 ㎍/㎖ 인슐린만을 포함한 DMEM 배지를 사용하여 세포를 배양하였다.
분화유도된 3T3-L1 세포에 10% 포르말린(Intron, Korea)을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 완전히 건조시키고, 오일 레드 O 용액을 아이소프로판올에 24시간 용해시켜 제조한 오일 레드 O 시약을 첨가하여 축적된 지방구들을 염색하였다. 염색된 세포를 아이소프로판올에 현탁시키고, 세포 내 염색되어 있는 오일 레드 O를 용출시켜 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 개병풍 추출물의 n-부탄올이 지방구의 형성을 농도 의존적으로 억제시켰다(도 8).
<110> KANGWON PROVINCE KANGWON NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> Composition comprising Astilboides tabularis extracts or fraction thereof as an active ingredient and use thereof <130> 2016P-08-032 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin forward primer <400> 1 tgacggggtc acccacactg tgcccatcta 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin reverse primer <400> 2 ctagaagcat ttgcggtgga cgatggaggg 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 forward primer <400> 3 gcgcacagag gaagagaatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 reverse primer <400> 4 ctctcggaac atctcgaagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-3 forward primer <400> 5 gaactggact gtggcattga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-3 reverse primer <400> 6 tgtcggcata ctgtttcagc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-9 forward primer <400> 7 tggacgacat ctttgagcag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-9 reverse primer <400> 8 gcaagataag gcagggtgag 20

Claims (15)

  1. 개병풍 메탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 분획물이 개병풍 메탄올 추출물을 n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸 아세테이트 분획물 또는 n-부탄올 분획물인, 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 n-부탄올이 수포화 부탄올인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 암이 대장암, 결장암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 유방암, 자궁경부암 또는 전립선암인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 개병풍 메탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 분획물이 개병풍 메탄올 추출물을 n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸 아세테이트 분획물 또는 n-부탄올 분획물인, 건강기능식품.
  7. 삭제
  8. 삭제
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  13. 삭제
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  15. 삭제
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