KR101869400B1 - Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism - Google Patents

Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism Download PDF

Info

Publication number
KR101869400B1
KR101869400B1 KR1020140091849A KR20140091849A KR101869400B1 KR 101869400 B1 KR101869400 B1 KR 101869400B1 KR 1020140091849 A KR1020140091849 A KR 1020140091849A KR 20140091849 A KR20140091849 A KR 20140091849A KR 101869400 B1 KR101869400 B1 KR 101869400B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
smn
compound
pharmaceutical composition
sma
protein
Prior art date
Application number
KR1020140091849A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20160010994A (en
Inventor
홍영수
조성찬
최광만
이재경
장재혁
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020140091849A priority Critical patent/KR101869400B1/en
Publication of KR20160010994A publication Critical patent/KR20160010994A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101869400B1 publication Critical patent/KR101869400B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/426—1,3-Thiazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은, 화학식 1의 화합물, 이를 유효성분으로 함유하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA)을 치료하기 위한 미생물 유래의 천연 활성물질에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 천연물(미생물)에서 분리된 2차 대사산물을 활용하기 때문에 임상에서의 효율성 및 안정성을 높여, 척수성 근위축, 루게릭병, 뒤시엔느 근위축증, 또는 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)과 같은 다양한 신경근육질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a compound represented by the formula (1) and a pharmaceutical composition for preventing or treating neuromuscular diseases containing the same as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating spinal muscular atrophy (SMA) ≪ / RTI > According to the present invention, since the secondary metabolites isolated from natural products (microorganisms) are utilized, the efficiency and stability in clinical practice can be improved, and it is possible to provide a method for treating Myelonic Dystrophy, And the like.

Description

미생물 유래의 척수성 근위축증 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism}[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating spinal muscular atrophy derived from a microorganism,

본 발명은, 화학식 1의 화합물, 이를 유효성분으로 함유하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA)을 치료하기 위한 미생물 유래의 천연 활성물질에 관한 것이다.The present invention relates to a compound represented by the formula (1) and a pharmaceutical composition for preventing or treating neuromuscular diseases containing the same as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating spinal muscular atrophy (SMA) ≪ / RTI >

척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA)은 대표적인 신경근육질환으로서 희귀병으로 분류되지만, 신생아 6,000명에 1명꼴로 발병하여 그 발병빈도가 높고 유전병에 의한 영유아 사망률 1위를 보이는 치명적인 유전질환이다. 비슷한 신경근육질환 중에 일반인에게 좀 더 익숙한 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)이 있는데, 루게릭병이 주로 성인에게 증상이 나타나기 시작하는 것과는 달리, 척수성 근위축증은 영유아부터 증상을 보여서 더 심각한 질병으로 간주된다. Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a typical neuromuscular disease that is classified as a rare disease, but it is a fatal genetic disease with one out of every 6,000 newborn infants with a high incidence of this disease and the highest rate of infant mortality due to genetic diseases. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), which is more familiar to the general public, is a similar neuromuscular disease. Unlike Lou Gehrig's disease, which begins to manifest mainly in adults, spinal muscular atrophy is regarded as a more serious disease do.

SMA 환자는 척수에 있는 motor neuron을 서서히 잃게 되면서 운동근육으로 정상적인 신호가 전달되지 못하고, 결국 근육이 점차 위축되고 퇴화되는 증상을 보인다. 증상 정도에 따라 크게 3단계(I, II, III)로 분류되고, 가장 심한 SMA type I의 경우 보통 태어난지 6개월 이내에 발병하고 일단 병이 진행되면 6개월 이내에 사망한다.SMA patients slowly lose motor neurons in the spinal cord and fail to deliver normal signals to the motor muscles, eventually causing the muscles to gradually contract and degenerate. It is classified into three stages (I, II, III) according to the symptom severity. The most severe SMA type I usually develops within 6 months of birth and once within 6 months of disease progression.

인간에게는 특이하게 2개의 SMN(Survival of Motor Neuron) 유전자인 SMN1과 SMN2가 존재하는데, 대부분의 SMA 환자는(96%) SMN1이 결손되어 있고 SMN2를 통해서만 단백질이 발현된다(도 1 참조). 그러나, SMN2 유전자에서 전사되는 80% 이상의 대부분의 mRNA는 splicing의 결함으로 인해서 exon 7이 결핍된 형태로 만들어지고, 그 산물인 단백질은 정상적인 SMN과는 달리 C-말단이 짧아진 SMN 7의 형태를 가지는데 대단히 불안정해서 세포 내에서 쉽게 분해되고, 결국 SMA 환자에서는 SMN2 유전자로부터 발현되는 소량의(정상인의 20%) 정상적인 SMN 단백질만이 존재하게 된다. There are two SMN1 and SMN2 genes specifically in humans. SMN1 and SMN2 are present in most of the SMA patients (96%). SMN1 is defective and protein is expressed only through SMN2 (see FIG. 1). However, most mRNAs of over 80% transcribed from SMN2 are deficient in exon 7 due to defects in splicing, and the resulting protein is a form of SMN 7 in which the C-terminal is shortened, unlike normal SMN , Which is very unstable and is easily degraded in the cell, resulting in only a small amount of normal SMN protein (20% of normal) expressed from SMN2 gene in SMA patients.

SMN 단백질의 양과 SMA 질병의 증상 사이에는 뚜렷한 역상관관계가 존재한다. 실제로 SMA 환자는 각자가 다른 SMN2의 사본수(copy number)를 가지는데, SMN2의 사본수가 증가함에 따라 SMN의 발현양이 증가되면서 증상이 완화되므로, 가장 확실한 SMA 치료접근법은 환자세포에 남아있는 backup 유전자인 SMN2에서 발현되는 SMN 단백질의 양을 증가시키는 것이다.There is a pronounced inverse correlation between the amount of SMN protein and the symptoms of SMA disease. In fact, SMA patients have a different copy number of SMN2. As the number of SMN2 copies increases, the expression of SMN is increased and the symptoms are alleviated. Therefore, the most obvious SMA treatment approach is the backup And increase the amount of SMN protein expressed in the SMN2 gene.

따라서, SMA 환자의 SMN2 유전자로부터 발현되는 단백질의 양을 증가시키기 위하여 SMN2 유전자의 전사활성 증가, SMN2의 splicing 결함(exon7 skipping) 교정 등에서 나아가, 번역단계에서의 발현조절, 단백질 안정성, 단백질 인산화, mRNA의 안정성 등을 기초로 한 접근법 등이 요망된다(도 2 참조). Therefore, in order to increase the amount of protein expressed from the SMN2 gene in SMA patients, it is necessary to increase the transcriptional activity of the SMN2 gene, to correct the splicing defect of SMN2 (exon7 skipping), to control the expression level in the translation step, (See Fig. 2).

또한, SMA 환자에서 주로 발현되는 SMN△7 단백질은 세포내에서 대단히 불안정하지만 실제로는 SMN 단백질과 유사한 활성을 갖고 있기 때문에, 어떠한 방식으로든 SMN△7 단백질의 양도 늘려주면 SMA의 치료에 유익할 수 있음을 시사한다. 이러한 점들은 기존의 단일기전 기반의 활성물질 스크리닝 대신 특정기전에 제약받지 않는 포괄적 개념의 스크리닝법을 통해 어떤 방식으로든 기전에 상관없이 세포내에서 SMN과 SMN△7 단백질의 양을 증가시키는 물질을 발굴할 필요가 있음을 의미한다.In addition, since the SMN △ 7 protein, which is mainly expressed in SMA patients, is extremely unstable in the cell but actually has an activity similar to the SMN protein, increasing the amount of the SMN △ 7 protein in any way may be beneficial for the treatment of SMA . These findings suggest that a comprehensive conceptual screening method that is not restricted by a specific mechanism, instead of screening the existing single mechanism-based active substance, can be used to discover substances that increase the amount of SMN and SMNΔ7 protein in the cell, It is necessary to do so.

이와 같이, 척수성 근위축증은 SMN 단일 유전자의 결함과 연관되어 있고, 희귀병이면서도 발병빈도가 상대적으로 높으며, 영유아의 생존에 심각한 결과를 초래하기 때문에 Merck, Novartis, Trophos, Repligen, Genzyme 등의 대형 제약회사에서 최적의 질병 타깃으로 삼고 치료제 개발 연구가 활발히 진행중이다. 또한, 척수성 근위축증 연구의 중심축인 미국에서는 대학, 정부연구소 등을 중심으로 한 기초연구, 기업체를 중심으로 한 치료제 개발, SMA foundation이 중심이 된 연구관리가 잘 조화되어 있고, 최근에는 이 질병의 치료제 개발을 앞당기기 위한 SMA treatment accerelation 법안이 통과된 상태이다. 프랑스, 영국을 중심으로 한 유럽권에서도 근육질환 foundation을 중심으로 척수성 근위축증 연구 및 치료제 개발에 막대한 자금을 투자하고 있는 상황이다. As such, spinal muscular atrophy is associated with defects in the SMN single gene, is a rare disease, has a relatively high incidence, and has serious consequences for the survival of infants. Therefore, large pharmaceutical companies such as Merck, Novartis, Trophos, Repligen and Genzyme And the development of therapeutic agents is actively underway. In the USA, which is the central axis of the study of spinal muscular atrophy, basic research centered on universities and government laboratories, development of therapeutic products centering on companies, and research management centered on SMA foundation are well harmonized. The SMA treatment accerelation bill has been passed to accelerate the development of the drug. In France and England, the European countries are investing enormous funds in research and treatment of spinal muscular dystrophy mainly in the foundation of muscle diseases.

그러나, SMA의 치료법으로 stem cell, antisense olionucleotide, AAV-based gene therapy 등 다양한 접근법이 최근에 대두되고 있지만, 면역반응, 약물전달의 효율성, 안전성의 문제 등이 있으며, 특히 가장 앞서 나가던 stem cell 접근법은 임상 1상에서 안정성의 문제로 현재 중지된 상태로 현재까지 근본적인 치료제가 개발지 못하고 있다. 즉, 종래에는, 합병증의 예방, 관리 및 재활에 대한 치료가 주를 이루고 있으며, 저분자 합성물, gene therapy, stem cell therapy를 중심으로 하고 있을 뿐, 천연물을 기반으로 하는 pipeline은 존재하지 않는다. 더욱이, 국내에서의 연구는 서구권과 비교할 때 대단히 미약한 상황인데, 일부 대학병원 연구자들에 의해 SMA 환자의 case report 수준의 연구가 이루어지고 있을 뿐, 기초연구를 바탕으로 한 체계적인 접근이 이루어지고 있지 않은 실정이다. However, various approaches such as stem cell, antisense olionucleotide, and AAV-based gene therapy have recently emerged as a treatment for SMA, but there are problems such as immune response, efficiency of drug delivery and safety, and the most advanced stem cell approach In the first phase of clinical trials, it has been suspended due to its stability. That is, in the past, treatment for prevention, management and rehabilitation of complications is mainly made up, and there are no pipelines based on natural materials, mainly focusing on low-molecular compounds, gene therapy and stem cell therapy. In addition, the research in Korea is very weak compared with the western area. However, some university hospital researchers have been conducting case reports of SMA patients, and a systematic approach based on basic research has been made It is not.

이에, 본 발명은 척수성 근위축증과 같은 신경근육질환 환자에서 감소된 SMN 단백질의 양을 증가시킬 수 있는, 미생물 유래의 천연 활성물질을 발굴하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, it is an object of the present invention to discover natural active substances derived from microorganisms that can increase the amount of reduced SMN protein in neuromuscular diseases such as spinal muscular atrophy.

또한, 본 발명은 SMA 환자 유래의 SMN 단백질의 양을 정량적으로 측정할 수 있는 면역형광법, 및 이를 활용한 high-contents screening 방법을 통하여 활성물질에 대한 구조를 결정하고, 세포수준에서의 다양한 활성기전을 검증하는 것을 목적으로 한다.The present invention also provides a method for quantitatively measuring the amount of SMN protein derived from a patient suffering from SMA and determining the structure of the active substance through a high-contents screening method using the same, And the like.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명은, 하기 화학식 1의 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.The present invention provides a compound represented by the following general formula (I), a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

(화학식 1)(Formula 1)

Figure 112014068233573-pat00001
Figure 112014068233573-pat00001

본 발명의 일 구체예로, 상기 화합물은 스트렙토마이세스 W2233(Streptomyces sp. W2233)(기탁번호 KCTC12618BP) 균주 배양액에서 추출된 것임을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the compound is characterized in that it is extracted from a culture medium of Streptomyces sp. W2233 (accession number KCTC12618BP).

본 발명의 다른 구체예로, 상기 추출은 에틸아세테이트 추출인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, said extraction is ethyl acetate extraction.

또한, 본 발명은 상기 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a neuromuscular disease, which comprises the above compound, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효량의 상기 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경근육질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method of preventing or treating a neuromuscular disease, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the compound, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

또한, 본 발명은 상기 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 신경근육질환의 예방 또는 치료에 이용하는 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides the use of the compound, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preventing or treating a neuromuscular disease.

본 발명의 일 구체예로, 상기 신경근육질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 또는 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the invention, the neuromuscular disease is selected from the group consisting of Spinal Muscular Atrophy (SMA), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Duchenne Muscular Dystrophy, or Mytonic Dystrophy Dystrophy).

본 발명의 다른 구체예로, 상기 신경근육질환은 척수성 근위축증인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the neuromuscular disease is characterized by spinal muscular atrophy.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 화합물은 SMN(survival motor neuron) 단백질을 증가시키는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the compound is characterized by an increase in SMN (survival motor neuron) protein.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 SMN 단백질 증가는 SMN2 pre-mRNA의 스플라이싱(splicing) 결함 교정에 의한 것임을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the SMN protein increase is by splicing defect correction of SMN2 pre-mRNA.

또한, 본 발명은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA) 환자 유래 세포에 후보약물을 처리하여 SMN(survival motor neuron) 단백질의 양을 면역형광표지법(fluorescence-based assay)으로 정량하는 단계를 포함하는, 척수성 근위축증(SMA)의 예방 또는 치료용 후보 약물 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes a step of treating a candidate-mediated cell with Spinal Muscular Atrophy (SMA) patient-derived cells to quantify the amount of SMN (survival motor neuron) protein by a fluorescence-based assay , And a candidate drug screening method for the prevention or treatment of spinal muscular atrophy (SMA).

본 발명의 일 구체예로, 상기 면역형광표지법은 SMN 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 단일클론 항체를 SMA 환자 유래 세포에 처리한 후, 형광물질이 중합된 2차 항체로 증폭된 형광신호를 정량화하는 것임을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the immunofluorescent labeling method comprises treating a primary monoclonal antibody that specifically binds to an SMN protein to an SMA patient-derived cell, and then measuring a fluorescence signal amplified by the secondary antibody polymerized with the fluorescent substance Thereby quantifying the quantity.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 후보 약물은 하기 화학식 1의 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the candidate drug is a compound of the following formula 1, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

(화학식 1)(Formula 1)

Figure 112014068233573-pat00002
Figure 112014068233573-pat00002

본 발명에 의하면, 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 또는 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)과 같은 신경근육질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분을 제공할 수 있다.According to the present invention, neuromuscular diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Duchenne Muscular Dystrophy, or Mytonic Dystrophy are effectively To provide an effective ingredient that can be prevented or treated.

본 발명의 유효성분은, 천연물(미생물)에서 분리된 2차 대사산물을 활용하였기 때문에 임상에서의 효율성 및 안정성을 높일 수 있다.Since the active ingredient of the present invention utilizes a secondary metabolite isolated from a natural product (microorganism), the efficiency and stability in clinical use can be enhanced.

또한, 본 발명에 의하면 SMA 환자 유래의 SMN 단백질의 양을 정량적으로 측정할 수 있는 면역형광법, 및 이를 활용한 high-contents screening 방법을 제공할 수 있다.In addition, according to the present invention, it is possible to provide an immunofluorescence method capable of quantitatively measuring the amount of SMN protein derived from an SMA patient, and a high-contents screening method using the same.

도 1은 정상인과 SMA 환자 간의 SMN 유전자 발현 차이를 나타내는 모식도이다.
도 2는 SMA 환자세포에서 SMN 단백질 양을 증가시키기 위한 타겟 기전들을 나타내는 모식도이다.
도 3은 면역형광표지법을 이용하여 SMN 단백질을 증가시키는 활성물질의 분획물을 스크리닝한 결과이다.
도 4는 스크리닝된 분획물에 대하여 SMN 단백질의 발현양 증가효과를 더욱 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅(A 및 B) 및 RT-PCR(C)을 실시한 결과이다.
도 5는 동일한 조건에서 hnRNP A1, hnRNP E1, tubulin, actin 단백질의 발현양 증가효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과이다.
도 6은 Streptomyces W2233 균주 배양액을 에틸아세테이트 추출한 후 얻어진 #7 분획물의 HPLC 프로파일 결과이다.
도 7은 활성 화합물 L2-15(화학식 1)의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 8은 활성 화합물 L2-15의 1H NMR 데이터이다.
도 9는 활성 화합물 L2-15의 13C NMR 데이터이다.
도 10은 활성 화합물 L2-15에 의한 SMN 단백질 증가 효과를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 결과(A), 및 L2-15의 세포독성 확인 결과(B)이다.
도 11은 활성 화합물 L2-15에 의한 SMN mRNA 증가 기전이 splicing correction에 의한 것임을 확인하기 위한 RT-PCR 결과이다.
도 12는 SMN1, SMN2 유전자 각각에 대한 splicing reporter를 이용하여 활성 화합물 L2-15에 의한 splicing 조절효과를 확인한 결과이다.
도 13은 활성 화합물 L2-15에 의한 SMN 유전자의 전사활성 효과를 확인한 결과이다.FIG. 1 is a schematic diagram showing the difference in SMN gene expression between a normal person and a SMA patient.
2 is a schematic diagram showing target mechanisms for increasing the amount of SMN protein in SMA patient cells.
FIG. 3 shows the result of screening the fractions of the active substance that increase the SMN protein using immunofluorescence.
FIG. 4 shows results of Western blotting (A and B) and RT-PCR (C) performed to further confirm the effect of increasing the amount of expression of SMN protein in the screened fractions.
FIG. 5 shows Western blotting results to confirm the effect of increasing expression of hnRNP A1, hnRNP E1, tubulin and actin protein under the same conditions.
6 shows the HPLC profile of the fraction # 7 obtained after the extraction of the culture of Streptomyces W2233 strain with ethyl acetate.
7 shows the HRESIMS spectrum of the active compound L2-15 (Formula 1).
Figure 8 is 1 H NMR data of the active compound L2-15.
9 is 13 C NMR data of the active compound L2-15.
10 is a Western blotting result (A) and a cytotoxicity confirmation result (B) of L2-15 for confirming the effect of increasing the SMN protein by the active compound L2-15.
Figure 11 shows RT-PCR results to confirm that the mechanism of SMN mRNA increase by the active compound L2-15 is due to splicing correction.
12 shows the results of confirming the splicing control effect of the active compound L2-15 by using a splicing reporter for SMN1 and SMN2 genes, respectively.
Fig. 13 shows the result of confirming the transcription activity of the SMN gene by the active compound L2-15.

본 발명은, 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 또는 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)과 같은 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위하여, 유효성분으로서 구조적 다양성이 높은 천연물(미생물)에서 분리된 2차 대사산물을 활용함으로써 임상에서의 효율성 및 안정성을 높이고자 하였다.The present invention relates to the prophylaxis or treatment of neuromuscular disorders such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Duchenne Muscular Dystrophy, or Mytonic Dystrophy, In order to provide a therapeutic pharmaceutical composition, the secondary metabolite isolated from a natural product (microorganism) having a high structural diversity as an active ingredient was utilized to improve the efficiency and stability in clinical practice.

종래의 약물 스크리닝 방법에서는, 주로 SMA 세포와 관련 없는 암세포에서 스크리닝을 진행하였기 때문에 발굴된 유효물질이 SMA 세포에서는 활성을 보이지 않는 경우가 많았으나, 본 발명에서는 SMA 환자 유래 세포를 사용하여 최대한 질병과 생리적 환경이 유사하도록 하였다. In the conventional drug screening method, since screening was performed mainly on cancer cells not related to SMA cells, the active substance that was excavated often did not show activity in SMA cells. In the present invention, however, the SMA patient- The physiological environment was similar.

또한, 기존의 약물 스크리닝 방법은 외부에서 유래한 luciferase나 GFP 등의 reporter를 사용함으로써 예상치 못한 많은 오류(false positive)가 발생하여 후속 작업의 어려움이 있었으나, 본 발명에서는 이러한 문제점들을 최소화하기 위해서 세포내에 존재하는 SMN 단백질(SMN + SMN7)을 특이적인 항체를 통해 직접 표지하고 2차 항체로 신호를 증폭하는 방식으로, 오류 인자를 배제하고 SMN 신호만을 정량화하는 차별화된 기법을 사용하였다.In addition, the conventional drug screening method has a difficulty in subsequent work due to the occurrence of an unexpectedly large number of false positives by using an exogenous reporter such as luciferase or GFP. However, in order to minimize such problems, A differentiated technique was used in which existing SMN protein (SMN + SMN7) was directly labeled with a specific antibody and the signal was amplified with a secondary antibody, thereby excluding the error factor and quantifying only the SMN signal.

구체적으로, SMA 환자에서 유래된 세포내에 존재하는 SMN 단백질의 양을 정량적으로 측정할 수 있는 어세이법으로 면역형광표지법(fluorescence-based assay)을 확립하였는데, SMN 특이적 1차 항체로 표지하고 형광물질이 중합된 2차 항체로 증폭된 형광신호를 얻어내었다. 2종류의 SMA 세포에서는 정상 세포에 비해 현저하게 감소된 SMN 신호가 확인되었고, 단백질 분해기구인 proteasome의 억제물질인 MG132를 처리했을 때 SMN 신호가 뚜렷이 증가함을 확인하였는 바, 이는 SMA 환자세포가 SMN 단백질 증가물질 발굴에 적합한 스크리닝 시스템으로 사용될 수 있음을 의미하는 것이다.Specifically, a fluorescence-based assay was established by quantitative determination of the amount of SMN protein present in the cells derived from SMA patients, which was labeled with an SMN-specific primary antibody, A fluorescent signal amplified with a secondary antibody polymerized in the material was obtained. Significantly decreased SMN signal was observed in the two types of SMA cells and SMN signal was significantly increased when treated with MG132, an inhibitor of the proteasome protease, This means that it can be used as a screening system suitable for finding protein-increasing substances.

또한, 확립된 SMN 면역형광표지법을 이용하여, 39종의 미생물 대사체 분획물을 스크리닝한 결과, 2종에서 유의한 수준의 SMN 증가 효과(20% 이상)를 확인하였다. 환자세포 수준에서 이들 분획물의 효과를 SMN 단백질의 웨스턴 블롯팅을 통하여 재검증한 결과 뚜렷한 SMN 증가 효과가 재확인되었다. 즉, 스트렙토마이세스 균주 W2233 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 후 플레쉬 칼럼크로마토그래피(FPLC)에 의한 분획물 #7의 경우 EC50이 400ng/ml로 대단히 효능이 뛰어난 반면, 세포독성은 거의 나타나지 않았다. 또한, 동일한 조건에서 hnRNP A1, hnRNP E1, tubulin, actin 등에는 거의 증감 효과가 나타나지 않았다. In addition, screening of 39 microbial metabolite fractions using the established SMN immunofluorescent labeling method revealed significant increase of SMN (20% or more) in the two species. The effect of these fractions at the patient cell level was reaffirmed by western blotting of SMN protein, which clearly confirmed the effect of increasing SMN. That is, in the case of fraction # 7 obtained by extracting the Streptomyces strain W2233 with ethyl acetate and subjected to flash column chromatography (FPLC), the EC50 was very excellent at 400 ng / ml, whereas the cytotoxicity was hardly observed. In addition, hnRNP A1, hnRNP E1, tubulin, actin and the like showed almost no increase or decrease effect under the same conditions.

이에, 분획물 #7을 SMA 환자세포에 농도를 증가시키면서 처리한 후 RT-PCR을 통해서 SMN2로부터 발현되는 mRNA를 분석한 결과, SMN△7 mRNA가 감소하면서 SMN mRNA가 증가하는 splicing correction이 일어남을 확인하였다. 이는 분획물 #7의 SMN 단백질 증가 효과가 SMN2 pre-mRNA의 splicing 결함을 정상적인 방향으로 전환시킴으로써 일어나는 것임을 증명하는 결과이다.Therefore, it was confirmed by RT-PCR that SMN △ 7 mRNA decreased and splicing correction, in which SMN mRNA increased, by fractionation # 7 treated with increasing concentration in SMA patient cells Respectively. This is a result of demonstrating that the effect of SMN protein increase in fraction # 7 is due to the normal direction of splicing defects of SMN2 pre-mRNA.

따라서, 분획물 #7에서 고속액체크로마토그래피를 이용하여 활성 화합물을 분리한 후 HRESIMS 및 NMR 분석을 실시한 결과, 하기의 화학식 1의 구조식을 갖는 화합물(5-thiazolecarboxylic acid, 2-[2-(methylamino)phenyl]-, methyl ester)임을 확인하였다. Thus, the active compound was isolated from fraction # 7 by high performance liquid chromatography and then subjected to HRESIMS and NMR analysis. As a result, it was found that 5-thiazolecarboxylic acid, 2- [2- (methylamino) phenyl] -, methyl ester).

(화학식 1)(Formula 1)

Figure 112014068233573-pat00003

Figure 112014068233573-pat00003

본 발명에 따른 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.The compounds according to the invention can be used in the form of pharmaceutically acceptable salts. The salt is preferably an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and the free acid may be an organic acid or an inorganic acid. The organic acids include, but are not limited to, citric, acetic, lactic, tartaric, maleic, fumaric, formic, propionic, oxalic, trifluroacetic, benzoic, gluconic, methosulfonic, glycolic, succinic, Glutamic acid and aspartic acid. The inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid.

또한, 본 발명에 따른 상기 화합물은 에스테르, 전구체, 용매화물, 수화물 혹은 유도체의 형태로 사용될 수 있다.The compounds according to the present invention may also be used in the form of esters, precursors, solvates, hydrates or derivatives.

또한, 본 발명의 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.In addition, the composition of the present invention may further comprise components such as conventional therapeutically active ingredients, other adjuvants, pharmaceutically acceptable carriers, and the like. The pharmaceutically acceptable carrier includes saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다. The term "individual" as used herein refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically refers to a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, It means mammals.

본 발명에서 "약학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다."Pharmaceutically effective amount" in the present invention means the amount and type of disease to be administered, the age and sex of the patient, sensitivity to the drug, administration time, administration route and rate of release, And can be easily determined by those skilled in the art in such an amount that the maximum effect can be obtained without any adverse effect considering all of the factors.

본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 "투여방법"에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.The composition of the present invention is not limited as long as it can reach the target tissues. For example, oral administration, arterial injection, intravenous injection, percutaneous injection, intranasal administration, transbronchial administration, or intramuscular administration. The daily dose is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, and is preferably administered once a day or divided into several times a day.

본 발명의 조성물은 척수성 근위축증의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.
The composition of the present invention may be used in various forms such as medicines, foods and beverages for preventing and improving spinal muscular atrophy, and may be used in powder, granule, tablet, capsule or beverage form.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예Example 1. 후보 약물(천연 활성물질) 스크리닝 Screening candidate drugs (natural active substances)

1-1: 1-1: 면역형광염색법Immunofluorescent staining

SMA 환자에서 유래된 세포내에 존재하는 SMN 단백질의 양을 정량적으로 측정할 수 있는 어세이법으로 면역형광염색법을 이용하였다. Immunofluorescence staining was used as an assay to quantitatively measure the amount of SMN protein present in cells derived from SMA patients.

구체적으로, 바닥이 투명한 black 96-well plate에 정상세포 GM08333 (Coriell cell repositories; USA)와 SMA 환자세포 GM00232 및 GM09677를 각각 씨딩(seeding)하고, 24시간 후에 후보 약물로서 39종의 미생물 대사체 분획물을 24시간 처리하고 세포배양 배지를 제거한 후 4% 포르말린으로 고정하였다. PBS로 3회 세척 후 0.5% triton X-100을 사용하여 permeabilization한 후, PBS로 3회 세척하고 1% BSA로 블록킹하였다. 이후, 세포내에 존재하는 SMN 단백질을 특이적으로 인식하는 SMN 1차 단일클론항체(monoclonal antibody)로 표지하고, 형광물질이 중합된 2차 항체로 증폭된 형광신호를 cellomics로 측정하여, SMN 단백질의 양을 증가시키는 천연 활성물질을 초고속 스크리닝법으로 발굴하였다.Specifically, seeds of normal cell GM08333 (Coriell cell repositories; USA) and SMA patient cells GM00232 and GM09677 were seeded on a bottom-transparent black 96-well plate, and after 24 hours, 39 kinds of microbial metabolite fractions For 24 hours, and the cell culture medium was removed and fixed with 4% formalin. After washing three times with PBS, the cells were permeabilized with 0.5% triton X-100, washed three times with PBS, and blocked with 1% BSA. After that, the SMN protein present in the cells was labeled with a SMN primary monoclonal antibody, and the fluorescence signal amplified by the secondary antibody polymerized with the fluorescent material was measured by cellomics, and the SMN protein The natural active materials that increase the amount were excavated by high speed screening method.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 2종의 분획물(#6 및 #7)에서 단백질 분해기구인 proteasome을 억제하는 물질(MG132)을 처리했을 때 SMN 신호가 약 20% 이상 증가함을 알 수 있었다. 이때 대조군 화합물로는 DMSO를 사용하였다.
As a result, as shown in Fig. 3, when the protease-inhibiting substance (MG132) was treated in the two fractions (# 6 and # 7), the SMN signal was increased by about 20% or more . DMSO was used as a control compound.

1-2: 1-2: 웨스턴Western 블롯팅Blotting 및  And RTRT -- PCRPCR

상기 실시예 1-1에서 스크리닝된 2종의 분획물(#6 및 #7)에 대하여 SMA 환자세포에서 SMN 단백질의 발현양 증가효과를 더욱 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯팅 및 RT-PCR을 실시하였다. 이때 대조군 화합물로는 DMSO를 사용하였다.Western blotting and RT-PCR were performed to further confirm the effect of increasing the expression level of SMN protein in SMA patient cells for the two fractions screened in Example 1-1 (# 6 and # 7). DMSO was used as a control compound.

그 결과, 특히 분획물 #7(Cmpd No. 7)의 경우 SMN 단백질양이 현저히 증가하였으며(도 4A 및 4B), SMN△7 mRNA는 줄어든 반면 FL SMN mRNA는 현저히 증가하였다(도 4C). As a result, the amount of SMN protein significantly increased in fraction # 7 (Cmpd No. 7) (FIGS. 4A and 4B), while the SMNΔ7 mRNA decreased while the FL SMN mRNA increased significantly (FIG. 4C).

또한, 동일한 조건에서 hnRNP A1, hnRNP E1, tubulin, actin 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과, 이들 단백질은 거의 증감 효과가 나타나지 않았음을 확인하였다(도 5).
Further, Western blotting of hnRNP A1, hnRNP E1, tubulin and actin proteins under the same conditions confirmed that these proteins showed almost no sensitizing effect (FIG. 5).

실시예Example 2. 균주의 분리 및 동정 2. Isolation and Identification of Strain

상기 실시예 1의 결과를 바탕으로, 분획물 #7에서 유효성분으로 단일화합물(single compound) 분리하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
Based on the results of Example 1 above, the following experiment was carried out to isolate a single compound as an active ingredient in fraction # 7.

2-1: 균주 분리2-1: Strain isolation

본 실험에 사용한 균주는 한국생명공학연구원 인근 토양시료로부터 분리하여 사용하였다. 채집한 토양시료는 멸균된 증류수를 이용하여 10배 희석한 후 희석액 1mL를 스크리닝용 배지에 도말하였다. 이때, 스크리닝용 배지로서 soluble starch 10g, 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 1g, 황산마그네슘(magnesium sulfate) 1g, 염화나트륨(sodium chloride) 2g, 황산암모늄(ammonium sulfate) 2g, 탄산칼슘(calcium carbonate) 2g, 황산철(ferrous sulfate) 0.001g, 염화마그네슘(manganous chloride) 0.001g, 황산아연(zinc sulfate) 0.001g, 아가(agar) 20g / 1L 을 제조하여 사용하였고, 28℃에서 7일간 배양하여 나타난 콜로니를 순수분리하였다.
The strains used in this experiment were isolated from soil samples near the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. The collected soil samples were diluted 10 times with sterilized distilled water and 1 mL of the diluted solution was applied to the screening medium. At this time, 10 g of soluble starch, 1 g of dipotassium phosphate, 1 g of magnesium sulfate, 2 g of sodium chloride, 2 g of ammonium sulfate, 2 g of calcium carbonate, 0.001 g of ferrous sulfate, 0.001 g of manganous chloride, 0.001 g of zinc sulfate and 20 g of 1 L of agar were used and cultured at 28 ° C. for 7 days to obtain colonies Pure separation.

2-2: 균주의 동정2-2: Identification of the strain

순수 분리된 균주의 16S rRNA 서열 분석을 수행한 결과, Streptomyces rimosus subsp. rimosus strain JCM 4667, Streptomyces yogyakartensis strain NBRC 100779, Streptomyces violaceusniger strain NBRC 13459 등과 97% 동일성을 보였기 때문에, 신규의 Streptomyces 종인 것으로 추정되어 'Streptomyces sp. W2233'으로 명명하였고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2014년 7월 8일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC12618BP).
As a result of 16S rRNA sequencing of pure isolates, Streptomyces rimosus subsp. Streptomyces sp. strain JCM 4667, Streptomyces yogyakartensis strain NBRC 100779, Streptomyces violaceus niger strain NBRC 13459 and the like. Therefore, it is presumed to be a novel Streptomyces sp. W2233 ', deposited at the Microbiological Resource Center of the Korea Biotechnology Research Institute on July 8, 2014 (Accession No. KCTC12618BP).

실시예 3. Streptomyces sp. W2233 균주의 배양 및 분획물 제조Example 3 Streptomyces sp. Culture and fractionation of W2233 strain

3-1: 균주의 배양3-1: Culture of the strain

Streptomyces sp. W2233 균주를 배양하기 위하여, M2 배지(yeast extract 4g, glucose 5g, glycerol 25 mL, soytone 4g, calcium carbonate 0.03g/ 1L)를 사용하였다. 상기 배지 300 mL가 담긴 1000 mL 용량의 배플 삼각플라스크(Baffle flask)를 121℃에서 20분간 멸균한 후, Streptomyces sp. W2233 균주의 보관 플레이트로부터 백금이 접종하여 3일간 진탕배양하여 종배양으로 하였다. 본 배양을 위하여 8L의 생산배지를 1000 mL 용량의 배플 삼각플라스크에 300 mL씩 분주하여 멸균한 후, 각각의 플라스크에 종배양액 접종하여 28℃, 교반속도 150rpm의 조건으로 7일간 배양하였다.
Streptomyces sp. M2 culture medium (yeast extract 4 g, glucose 5 g, glycerol 25 mL, soytone 4 g, calcium carbonate 0.03 g / l) was used to culture W2233 strain. A 1000 mL baffled flask containing 300 mL of the medium was sterilized at 121 DEG C for 20 minutes, and then Streptomyces sp. Platinum was inoculated from a storage plate of strain W2233 and shake cultured for 3 days to obtain seed culture. For the cultivation, 8 L of the production medium was dispensed into 300 mL of a 1000 mL baffled Erlenmeyer flask and sterilized. Each flask was inoculated with seed culture medium and cultured at 28 DEG C and a stirring speed of 150 rpm for 7 days.

3-2: 배양액의 3-2: 분획물Fraction 제조 Produce

실시예 3-1에서 얻어진 Streptomyces sp. W2233 균주의 배양액 (8L)을 동량의 에틸아세테이트으로 2회 추출하고, 수득된 에틸아세테이트 추출액을 감압건조기를 이용하여 감압증발 방법으로 농축하였다. 이 에틸아세테이트 농축액을 ODS RP C18 컬럼 (12nm S-75um YMC gel ODS-A)을 이용하여 플래쉬 컬럼크로마토그래피(FPLC, TELEDYNE ISCO, Combi Flash)를 실시하였다. 이때 메탄올/물(1:9, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도 (1:9-10, v/v)를 증가시키면서 용출하였으며, 활성분획 #7은 80% 메탄올에서 용출되었다.Streptomyces sp. The culture (8 L) of the strain W2233 was extracted twice with the same amount of ethyl acetate, and the obtained ethyl acetate extract was concentrated by reduced pressure evaporation using a vacuum dryer. This ethyl acetate concentrate was subjected to flash column chromatography (FPLC, TELEDYNE ISCO, Combi Flash) using an ODS RP C18 column (12 nm S-75um YMC gel ODS-A). The active fraction # 7 was eluted with 80% methanol by increasing the methanol concentration (1: 9-10, v / v) stepwise with methanol / water (1: 9, v / v) .

실시예 4. 활성 화합물 L2-15의 분리 및 구조분석Example 4. Isolation and structural analysis of the active compound L2-15

4-1: 활성 화합물 4-1: active compound L2L2 -15의 분리-15 separation

실시예 3에서 얻어진 활성분획 #7을 감압 농축한 후, 고속액체크로마토그래피(칼럼: YMC J'sphere ODS-H80 C18, 길이 250 mm, 직경 10mm)를 이용하여 60%의 아세토나이트릴로부터 100% 아세토나이트릴의 용매 조건과, 용출 유속 3mL/min 조건으로 용출하여 223.8nm, 285.2nm 및 385.1nm의 UV 흡수 피크로 검출된 활성 화합물 L2-15(머무름시간 15분)을 분리하였다(도 6 참조).
The active fraction # 7 obtained in Example 3 was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by chromatography on a column of 60% acetonitrile using a high performance liquid chromatography (column: YMC J'sphere ODS-H80 C18, 250 mm in length, 10 mm in diameter) Acetonitrile and the eluent flow rate of 3 mL / min to separate the active compound L2-15 (retention time 15 minutes) detected with UV absorption peaks at 223.8 nm, 285.2 nm, and 385.1 nm (see FIG. 6) ).

4-2: 활성 화합물 4-2: active compound L2L2 -15의 구조분석-15 Structural Analysis

분리된 활성 화합물 L2-15의 분자량 및 분자식을 결정하기 위하여, ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 이용하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석을 통하여 1H NMR, 13C NMR, COSY(Correlation Spectroscopy), HMQC(1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고, 화합물의 분자구조를 결정하였다. In order to determine the molecular weight and molecular formula of the separated active compound L2-15, an ESI mass spectrometer (ESI) was used. Further, 1 H NMR, 13 C NMR, COZY (Correlation Spectroscopy), HMQC (1H-Detected heteronuclear multiple-quantum coherence), Heteronuclear Multiple-Bond Coherence (HMBC), and Distortionless Enhancement (DEPT) were carried out through nuclear magnetic resonance by Polarization) spectra were obtained and the molecular structure of the compounds was determined.

그 결과, 도 7 내지 9에 나타낸 바와 같이, 분자량이 248이고, 분자식이 C12H12N2O2S인 화합물로서 하기 화학식 1과 같은 6-5원 고리가 차례로 연결된 티아졸릭카르복실(5-thiazolecarboxylic) 형태의 신규한 골격의 화합물(미황색 분말)로서 '5-thiazolecarboxylic acid, 2-[2-(methylamino)phenyl]-, methyl ester'로 동정하였다; [α]D +87 (c 0.5, MeOH); UV(MeOH) λmax (log ε) 228 (2.34), 285(2.36), 385.1(2.11); 1H, 13C NMR 데이터는 하기 표 1 및 도 8-9에 나타내었음; HRESIMS m/z 249.07 [M+H]+ (calcd for C12H12N2O2S, 249.07)(도 7 참조). As a result, as shown in Figs. 7 to 9, thiazolicarboxyl (5) having a molecular weight of 248 and a molecular formula of C 12 H 12 N 2 O 2 S, 5-thiazolecarboxylic acid, 2- [2- (methylamino) phenyl] -, methyl ester 'as a novel skeletal compound (yellowish powder) [?] D +87 (c 0.5, MeOH); UV (MeOH)? Max (log?) 228 (2.34), 285 (2.36), 385.1 (2.11); 1 H, < 13 > C NMR data are shown in Table 1 and Fig. 8-9 below; HRESIMS m / z 249.07 [M + H] + (calcd for C 12 H 12 N 2 O 2 S, 249.07) (see FIG. 7).

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112014068233573-pat00004

Figure 112014068233573-pat00004

[표 1] 활성 화합물 L2-15의 1H 과 13C NMR 데이터(DMSO-d 6 중 측정)[Table 1] 1 H and 13 C NMR data of active compound L2-15 (measured in DMSO- d 6 )

Figure 112014068233573-pat00005

Figure 112014068233573-pat00005

실시예 5. L2-15의 SMN 단백질 증가활성 및 분자기전 분석Example 5. SMN protein increase activity and molecular mechanism of L2-15

5-1: 5-1: WesternWestern blottingblotting

실시예 4에서 동정된 활성 화합물 L2-15에 대하여 SMN 단백질 증가 활성 효능을 western blotting을 통해 SMA 환자세포 수준에서 재검증하였다.The activity of increasing the SMN protein in the active compound L2-15 identified in Example 4 was re-verified at the SMA patient cell level by western blotting.

구체적으로, 활성물질을 SMA 환자유래 세포에 dose-dependent 처리한 후 PBS를 사용하여 2회 세척하고, 세포 침전물은 100mM Tris-HCl(pH 6.8), 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol, 2% β-mercaptoethanol을 혼합하여 제조된 lysis buffer에 재부유하였다. 부유된 세포를 Sonicator ultrasonic processor (Misonix, NY, USA)를 이용하여 얼음에서 0.2초에 5회 초음파 분쇄한 뒤 4℃, 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액(세포 용해질)을 얻었다. 세포 용해질 20μL을 SDS-PAGE한 뒤, polyvinylidene difluoride(Armersham International plc, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)에 옮겨 블롯팅하였다. Specifically, the active substance was subjected to dose-dependent treatment with SMA patient-derived cells, followed by washing twice with PBS. The cell suspension was washed with 100 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol , And 2% β-mercaptoethanol. The suspended cells were sonicated 5 times in 0.2 sec on ice using a sonicator ultrasonic processor (Misonix, NY, USA) and centrifuged at 13,000 rpm for 10 min at 4 ° C to obtain supernatant (cell lysate). After 20 μL of the cell lysate was subjected to SDS-PAGE, it was transferred to polyvinylidene difluoride (Armersham International plc, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) and blotted.

이때, 1차 항체는 Mouse monoclonal antibody anti-SMN(Gideon dreyfuss)(1:2000)를 이용하고, horseradish peroxidase를 표지한 2차 항체를 사용하여 WEST-ZOL®Plus Chemiluminescence Substrate(iNtRON Biotechnology, SungNam, Kyoung-Ki, KOREA)를 이용하여 형광 발색하였다. LAS-4000 imaging system (Fujifilm)을 이용하여 형광 신호를 이미지화하고, ImageJ (NIH, USA.gov)을 보정 값(nomalization)으로 α-tubulin(음성 대조군)을 사용하여 정량적으로 densitometry 분석을 하였다.The primary antibody was prepared using a mouse monoclonal antibody anti-SMN (Gideon dreyfuss) (1: 2000) and a secondary antibody labeled with horseradish peroxidase using a WEST-ZOL ® Plus Chemiluminescence Substrate (iNtRON Biotechnology, SungNam, Kyoung -Ki, KOREA). Fluorescence signals were imaged using a LAS-4000 imaging system (Fujifilm) and quantitative densitometry analysis was performed using α-tubulin (negative control) with ImageJ (NIH, USA.gov) as the nomalization.

그 결과, 도 10의 A에 나타낸 바와 같이, 농도가 증가함에 따라 SMN 단백질의 양이 뚜렷하게 증가하였으며 EC50가 13.9μM로 나타났다. As a result, as shown in Fig. 10A, the amount of SMN protein was markedly increased as the concentration was increased, and the EC50 was 13.9 μM.

또한, 도 10의 B에 나타낸 바와 같이, 동일한 조건에서 Cell-titer Glo를 이용한 viability 평가에서 세포독성은 거의 나타나지 않았다.
In addition, as shown in Fig. 10B, there was almost no cytotoxicity in the viability evaluation using Cell-titer Glo under the same conditions.

5-2: 5-2: RTRT -- PCRPCR 을 이용한 기전 분석Mechanism analysis using

활성 화합물 L2-15의 작용기전을 분석하기 위하여, 화합물의 농도를 증가시키면서 처리한 후 RT-PCR을 통해서 SMN2로부터 발현되는 mRNA량의 변화를 분석하였다.In order to analyze the mechanism of action of the active compound L2-15, the amount of mRNA expressed from SMN2 was analyzed by RT-PCR after treatment with increasing compound concentration.

구체적으로, 화합물 L2-15를 SMA 환자유래 세포에 dose-dependent 처리한 후 TRI REAGENT®(RNA/DNA/PROTEIN isolation reagent, KOREA)를 이용하여 RNA를 분리하고, Maxime RT PreMix (Oligo dT primer, iNtRON Biotechnology)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이때, 프라이머는 SMN△7 mRNA가 감소하면서 SMN mRNA가 증가하는 것을 확인할 수 있도록, 즉 splicing 결함이 회복되었는지 여부를 평가할 수 있도록 엑손 7을 포함하는 양방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(Forward primer; 5'-ggaaagccaggtctaaaattcaa-3', Reverse primer; 5'-ctataacgcttcacattccagat-3'). Specifically, the compound L2-15 was subjected to dose-dependent treatment of cells derived from SMA patients, RNA was isolated using TRI REAGENT ® (RNA / DNA / PROTEIN isolation reagent, KOREA), Maxime RT PreMix (Oligo dT primer, iNtRON Biotechnology) was used to synthesize cDNA. At this time, the primer was subjected to PCR using a bidirectional primer containing exon 7 so that SMN? 7 mRNA was decreased and SMN mRNA was increased, that is, whether the splicing defect was restored (Forward primer; 5'-ggaaagccaggtctaaaattcaa-3 ', reverse primer; 5'-ctataacgcttcacattccagat-3').

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 화합물 L2-15의 농도가 증가함에 따라 SMN7 mRNA(SMN△7)가 감소하면서 SMN mRNA(FL SMN)가 증가하는 splicing correction이 일어남을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 11, it was confirmed that as the concentration of compound L2-15 increased, SMN7 mRNA (SMN? 7) decreased and splicing correction was observed in which SMN mRNA (FL SMN) increased.

5-3: 5-3: SMNSMN 스플라이싱Splicing 리포터를 이용한 기전 분석 Mechanism analysis using reporter

상기 실시예 5-2에서 확인된 splicing correction 효과를 더욱 검증하기 위하여, SMN1, SMN2 유전자 각각에 대한 splicing reporter를 이용하여 화합물 L2-15에 의한 splicing 조절효과를 확인하였다. 구체적으로, 스플라이싱 리포터 제작방법은 다음과 같다. In order to further confirm the splicing correction effect confirmed in Example 5-2, splicing reporter for each of SMN1 and SMN2 genes was used to confirm splicing regulation by compound L2-15. Specifically, a splicing reporter fabrication method is as follows.

SMN1-Luc 및 SMN2-Luc의 minigene의 디자인은 SMN 유전자의 splicing에 중요한 역할을 하는 exon 6, intron 6, exon 7, intron 7와 exon 8 부분만을 이용하여 제작하였으며, exon 6에 개시코돈을 포함시키고 exon 7에 존재하는 종결코돈 제거를 위해 뉴클레오티드 1개를 제거하였다. 이때 하나의 뉴클레오티드가 보충되어야 하므로 exon 8에 보충하도록 하여 21개의 뉴클레오티드만 이용하였다. 이렇게 SMN1과 SMN2 유전자를 minigene 형태로 만든 후, C-말단 부분에 발광 표지용 발광 효소로서 널리 이용되어온 반딧불의 발광 효소(firefly luciferase; FLuc)를 클로닝을 통하여 제작하였다. The minigene design of SMN1-Luc and SMN2-Luc was constructed using exon 6, intron 6, exon 7, intron 7 and exon 8 only, which plays an important role in splicing of SMN gene. One nucleotide was removed for termination codon removal present in exon 7. Since only one nucleotide should be supplemented at this time, only 21 nucleotides were used for complement to exon 8. After SMN1 and SMN2 genes were made into minigene form, firefly luciferase (FLuc), which is widely used as a luminescent marker, was cloned into the C-terminal region.

또한, C33A 자궁암 세포에 SMN1-Luc과 SMN2-Luc 유전자가 안정하게 발현될 수 있도록 SMN 스플라이싱 리포터 세포를 제작한 후, 이를 이용하여 SMN 유전자의 exon 7이 포함될 때 luciferase 활성이 증가하도록 어세이 시스템을 구축하였다. C33A 스플라이싱 리포터 세포를 luciferase 전용 96-well plate에 seeding하고 24시간 후에 화합물 L2-15를 농도별로 24시간동안 처리하여 배양하였다. 이 후 동일한 양의 기질(one-glo, promega)을 넣어준 후 luminometer 장비를 이용하여 luciferase 활성을 측정하였다.In addition, SMN splicing reporter cells were prepared to stably express SMN1-Luc and SMN2-Luc genes in C33A uterine cancer cells, and the expression of luciferase activity was increased when exon 7 of SMN gene was included System. C33A splicing reporter cells were seeded in a luciferase-exclusive 96-well plate, and after 24 hours, compound L2-15 was cultured for 24 hours in concentration. After the same amount of one-glo, promega was added, luciferase activity was measured by luminometer.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, SMN2 스플라이싱이 정상으로 회복되면서 나타나는 luciferase 활성의 증가가 뚜렷하게 확인되었다. 이러한 결과는 RT-PCR을 통해 확인된 L2-15 물질의 splicing correction 효과를 재확인한 것으로, 정도의 차이는 있지만 SMN1 유전자의 스플라이싱에서도 증가효과가 나타났다. SMN1 유전자의 스플라이싱은 SMN2 유전자에 비해 스플라이싱 회복에 의한 luciferase 활성 증가가 낮게 나타나는 것이 일반적이다.
As a result, as shown in Fig. 12, an increase in luciferase activity, which is apparent when SMN2 splicing is restored to normal, is clearly confirmed. These results reaffirmed the splicing correction effect of the L2-15 material identified by RT-PCR, and showed an increase in the splicing of SMN1 gene although there was a difference in degree. Splicing of the SMN1 gene is generally lower than that of the SMN2 gene due to a decrease in luciferase activity due to splicing repair.

5-4: 5-4: SMN2SMN2 promoterpromoter 활성 분석 Activity analysis

상기 실시예 5-2 및 5-3을 통하여 화합물 L2-15에 의한 스플라이싱 회복 효과를 확인하였으나, L2-15가 SMN2 유전자의 전사활성도 조절하는지 더욱 확인하기 위하여 SMN2 promoter reporter를 이용한 검증을 실시하였다. The effect of splicing recovery by compound L2-15 was confirmed through the above Examples 5-2 and 5-3. However, in order to further confirm whether L2-15 regulates transcription activity of SMN2 gene, verification using SMN2 promoter reporter was performed Respectively.

즉, 세포 수준에서 SMN2 promoter 활성을 분석하기 위하여, promoter가 존재하지 않고 firefly luciferase 유전자를 포함하는 pGL4.14 vector에 SMN2 유전자 염기서열 중에서 3.4 kb의 SMN2 promoter 부분만 클로닝하여 삽입하였다. 이 클론을 293T 세포에 과발현한 후 동일양의 세포를 luciferase 전용 96-well Plate에 seeding하고 24시간 후에 화합물 L2-15를 농도별로 24시간 처리하여 배양하였다. 이때, 대조약물로서 전사 활성물질로 알려진 sodium butyrate (SB), trichostatin a (TSA)를 처리하여 화합물 L2-15의 SMN2 promoter 활성 정도를 비교하였다. In other words, in order to analyze the activity of SMN2 promoter at the cell level, only 3.4 kb SMN2 promoter part was cloned into the pGL4.14 vector containing the firefly luciferase gene without the promoter. The clone was overexpressed in 293T cells, and the same amount of cells were seeded in a luciferase-exclusive 96-well plate. After 24 hours, the compound L2-15 was cultured for 24 hours in concentration. At this time, sodium butyrate (SB) and trichostatin a (TSA), known as transcription active substances, were treated as control drugs to compare the activity of SMN2 promoter of compound L2-15.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 화합물 L2-15를 10, 20, 40 및 80μM 농도로 처리한 결과 SB, TSA에서 나타나는 것과 유사한 수준의 SMN2 전사활성 증가가 확인되었다.As a result, as shown in Fig. 13, treatment of compound L2-15 at 10, 20, 40 and 80 M concentration showed increase in SMN2 transcription activity similar to that observed in SB and TSA.

이러한 결과는, 본원발명의 화합물 L2-15가, SMA 환자세포에 존재하는 SMN2 유전자의 스플라이싱 결함을 회복시키는 동시에, SMN2 유전자의 전사활성을 증가시키는 방식으로, SMN 단백질의 발현양을 최종 증가시키는 것을 의미하는 것이다.
These results show that the compound L2-15 of the present invention restores the splicing defects of the SMN2 gene present in the SMA patient cells and at the same time increases the expression level of the SMN protein by increasing the transcription activity of the SMN2 gene It means to do.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12618BPKCTC12618BP 2014070820140708

Claims (11)

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
(화학식 1)
Figure 112018044299809-pat00006
Claims 1. Compounds of the general formula (I)
(Formula 1)
Figure 112018044299809-pat00006
 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 스트렙토마이세스 W2233(Streptomyces sp. W2233)(기탁번호 KCTC12618BP) 균주 배양액에서 추출된 것임을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.The compound or a pharmacologically acceptable salt thereof according to claim 1, wherein the compound is extracted from a culture medium of Streptomyces sp. W2233 (Accession No. KCTC12618BP). 제 2 항에 있어서, 상기 추출은 에틸아세테이트 추출인 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.The compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 2, wherein said extraction is ethyl acetate extraction. 제 1 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, SMN(survival motor neuron) 단백질 결핍 관련 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating a neuromuscular disease associated with SMN (survival motor neuron) protein comprising the compound of claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 제 4 항에 있어서, 상기 신경근육질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 또는 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.The method of claim 4, wherein the neuromuscular disease is selected from the group consisting of Spinal Muscular Atrophy (SMA), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Duchenne Muscular Dystrophy, Mytonic Dystrophy, ≪ / RTI > or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 5 항에 있어서, 상기 신경근육질환은 척수성 근위축증인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.6. The pharmaceutical composition according to claim 5, wherein the neuromuscular disease is spinal muscular atrophy. 제 4 항에 있어서, 상기 화합물은 SMN(survival motor neuron) 단백질을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.5. The pharmaceutical composition according to claim 4, wherein the compound increases survival motor neuron (SMN) protein. 제 7 항에 있어서, 상기 SMN 단백질 증가는 SMN2 pre-mRNA의 스플라이싱(splicing) 결함 교정에 의한 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.8. The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein said SMN protein increase is by splicing defect correction of SMN2 pre-mRNA. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
KR1020140091849A 2014-07-21 2014-07-21 Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism KR101869400B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140091849A KR101869400B1 (en) 2014-07-21 2014-07-21 Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140091849A KR101869400B1 (en) 2014-07-21 2014-07-21 Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160010994A KR20160010994A (en) 2016-01-29
KR101869400B1 true KR101869400B1 (en) 2018-06-20

Family

ID=55310105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140091849A KR101869400B1 (en) 2014-07-21 2014-07-21 Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101869400B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102272616B1 (en) 2021-03-25 2021-07-05 주식회사 엔테로바이옴 Pharmaceutical composition for preventing or treating muscular atrophy comprising feacalibacterium prausnitzii strain
KR102329853B1 (en) 2021-03-25 2021-11-23 주식회사 엔테로바이옴 Pharmaceutical composition for preventing or treating muscular atrophy comprising akkermansia muciniphila strain

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090090487A (en) * 2008-02-21 2009-08-26 재단법인서울대학교산학협력재단 Pharmaceutical composition for treating or preventing aneurological brain disease comprising glucocorticoid compounds
KR20150071932A (en) * 2013-12-19 2015-06-29 이화여자대학교 산학협력단 Pharmaceutical composition containing TAZ modulator for mygeonic differentiation and muscle regeneration
KR20150122011A (en) * 2014-04-22 2015-10-30 광주과학기술원 Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Spinal Muscular Atrophy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090090487A (en) * 2008-02-21 2009-08-26 재단법인서울대학교산학협력재단 Pharmaceutical composition for treating or preventing aneurological brain disease comprising glucocorticoid compounds
KR20150071932A (en) * 2013-12-19 2015-06-29 이화여자대학교 산학협력단 Pharmaceutical composition containing TAZ modulator for mygeonic differentiation and muscle regeneration
KR20150122011A (en) * 2014-04-22 2015-10-30 광주과학기술원 Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Spinal Muscular Atrophy

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102272616B1 (en) 2021-03-25 2021-07-05 주식회사 엔테로바이옴 Pharmaceutical composition for preventing or treating muscular atrophy comprising feacalibacterium prausnitzii strain
KR102329853B1 (en) 2021-03-25 2021-11-23 주식회사 엔테로바이옴 Pharmaceutical composition for preventing or treating muscular atrophy comprising akkermansia muciniphila strain

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160010994A (en) 2016-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Borgo et al. Protein kinase CK2: a potential therapeutic target for diverse human diseases
US20200397748A1 (en) Enhancing autophagy or increasing longevity by administration of urolithins or precursors thereof
Basit et al. Susceptibility of the H2-receptor antagonists cimetidine, famotidine and nizatidine, to metabolism by the gastrointestinal microflora
KR100917657B1 (en) Method for Controlling NAD(P)/NAD(P)H Ratio by Oxidoreductase
JP2019501136A (en) Designed bacterial composition
US20090124688A1 (en) Prostaglandin reductase inhibitors
Egusa et al. The small molecule harmine regulates NFATc1 and Id2 expression in osteoclast progenitor cells
Chen et al. The role of CCR5 in the protective effect of Esculin on lipopolysaccharide-induced depressive symptom in mice
US11578032B2 (en) Derivatives of sobetirome
WO2015177469A1 (en) Chemical compounds and use thereof for improving muscular quality
KR101869400B1 (en) Pharmaceutical composition for treating Spinal Muscular Atrophy, originated from microorganism
JP7360106B2 (en) Endoplasmic reticulum stress regulator containing benzothiazoimidazolyl compound
Wang et al. Resistin-like molecule beta (RELM-β) regulates proliferation of human diabetic nephropathy mesangial cells via mitogen-activated protein kinases (MAPK) signaling pathway
US20130177950A1 (en) Process for producing reveromycin a or a synthetic intermediate thereof, process for producing compounds containing a spiroketal ring and novel antineoplastics, fungicides and therapeutic agents for bone disorders
US20100273769A1 (en) Composition and method for the treatment of parkinson's disease
CN106456594A (en) Ppar gamma activating agent
Schäfer et al. Bexarotene prodrugs: Targeting through cleavage by NQO1 (DT-diaphorase)
CN108610409A (en) ETV5 is preparing the application in preventing or treating obesity and correlated metabolism diseases drug
Chen et al. P633H, a novel dual agonist at peroxisome proliferator‐activated receptors α and γ, with different anti‐diabetic effects in db/db and KK‐Ay mice
JP2012184195A (en) Xylogranin a and xylogranin b
KR20230152715A (en) Composition for treatment of EBV-related disease or condition
US11028061B2 (en) Modulators of myocyte lipid accumulation and insulin resistance and methods of use thereof
KR101712184B1 (en) Dimeric Sesquiterpene Compound as Nrf2 Activator and Phamaceutical Composition Conprising the Same
CN113336811B (en) Iridoid glycoside compounds, preparation and application thereof
Chen et al. Tu1206 EFFECT OF BACILLUS SUBTILIS AND ENTEROCOCCUS FAECALIS SUPERNATANT ON SERT EXPRESSION IN ENTEROCYTES AND RAT INTESTINAL TISSUES

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal