KR101868183B1 - 가교된 겔의 제조 공정 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 대상은
a) 적어도 하나 이상의 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제와 함께 적어도 하나 이상의 가교되지 않은 형태의 다당류를 포함하는 수용성 겔을, 35℃이하의 온도에서, 준비하는 단계;
b) a) 단계의 혼합물을 35℃이하의 온도에서 적어도 한시간 이상 동안 유지하는 단계;
c) b) 단계이후에 얻어진 혼합물의 가교 반응을 촉진하는 단계, 및 그리고 필요하다면;
d) 형성된 상기 가교겔을 회수하는 단계로 이루어지는 단계들을 적어도 포함하는 적어도 하나 이상의 다당류 및 이의 염들 중 하나의 가교된 겔의 제조 공정에 관한 것이다.

Description

가교된 겔의 제조 공정{Process of preparing a cross linked gel}
본 발명의 목적은 가교된 다당류(polysaccharide), 바람직하게 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 이의 염들 중 하나를 기초로 하는 하이드로겔(hydrogel)의 제조 공정을 제공하는 것이다.
피부에 자연적으로 존재하는, 히알루론산은 그것의 점탄성(viscoelastic) 특성 및 또한 물을 흡수하는 경향이 매우 크다고 알려져있다. 이것의 특성들은 주로 피부의 탄력을 설명해 준다. 이것의 생체적합성(biocompatibility), 내성(tolernace) 및 독성(toxcity)이 적은 것 때문에 이 분자는 10년이 넘도록 의학분야 및 화장품 분야 및 특히 주름 필링(filling)용로 적용되어 오고 있다. 그러므로, 가교된 다당류 하이드로겔을 치료를 위하여 주름의 진피에 주입하는 것은 국소적으로 쳐지는, 즉 주름을 감소 또는, 심지어 제거까지 시키는 것을 돕는다.
일반적으로, 다당류 및 보다 특히 히알루론산은 가교된 형태가 사용되며, 이것은 이러한 특정한 형태에서 열 및 분해(degradation)에 대한 큰 저항성을 가지기 때문이다.
이러한 가교된 다당류 겔은 다양한 제조 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 두 가지 주요한 단계를 요구하며, 첫번째 단계는 그것을 수용성(aqueous) 겔로 변환시키기 위하여 해당 다당류를 수화시키는 것으로 구성되고, 두번째 단계는 그것의 가교를 일으키기 위한 전형적인 물질의 존재에서 상기 수용성 겔을 가교시키는 것을 돕는 단계이다.
종래의 히알루론산 가교 방법은 보통 40℃, 또는 심지어 50℃ 근처의 온도에서, 3시간 보다 적은 시간 동안 수행되고, 이에 따라 다당류 겔이 충분히 가교되는 것을 가능하게 한다. 산업에서 이러한 제조 방법이 널리 사용되는 이유는 바로 이러한 이유 때문이다.
이러한 공정의 설명을 위하여, US 2006/0105002에서 개시한 공정은, 산성 또는 염기성 조건하에 적어도 10% 히알루론산, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물의 사용을 포함하고 있으며, WO 2006/056204은 가교된 히알루론산 겔과 다이비닐 설폰(divinyl sulphone)를 처리하는 단계를 포함하고 있으며, US 2007/0036745에서는 다이비닐 설폰(DVS)과 함께 가교된 히알루로난(hyaluronane) 고분자에서 출발하여 얻어진 코히시브 겔(cohesive gel)을 만드는 것이, 특별히 언급될 수 있다.
명백한 이유로서, 의학분야 및 화장품 분야에 적용하기 위하여 하이드로겔의 기계적(mechanical) 특성을 향상시키는 것은 변함없는 목적이다.
본 발명의 목적은 구체적으로 특히 유용한 기계적 특성을 가지는 가교된 겔을 얻기 위한 공정을 제공하는 것이다.
모든 기대와 상반되게, 본 발명자들은 종래의 공정 수단에 의하여 가교된 겔의 특성에서 나타나는 특성과 비교했을 때, 현저하게 향상되게 할 수 있는 가교된 겔을 제조하는 새로운 방법을 알아내었다.
그러므로, 본 발명의 첫번째 측면에 따르는 본 발명은 하기의 단계들을 적어도 포함하는, 적어도 하나 이상의 다당류 또는 이의 염들 중 하나의 가교된 겔을 제조하는 공정과 관한 것이다.
a) 적어도 하나 이상의 이관능성(difunctional) 또는 다관능성(multifunctional) 에폭시 가교제와 함께 적어도 하나 이상의 가교되지 않은 형태의 다당류를 포함하는 수용성 겔을, 35℃이하의 온도에서, 준비하는 단계;
b) a) 단계의 혼합물을 35℃이하의 온도에서 적어도 한시간 이상 동안 유지하는 단계;
c) b) 단계에서 얻어진 혼합물의 가교 반응을 촉진하는 단계, 및 필요하다면;
d) 형성된 상기 가교된 겔을 회수하는 단계로 이루어지는 단계.
보다 정확하게, 본 발명은 첫번째는 특별히 느리고 두번째는 현저하게 매우 빠른 두 가지 다른 가교 속도(crosslinking rate)를 번갈아 사용함으로써. 단일 가교 속도를 이용하는 종래의 공정 수단에 의하여 얻어진 가교 된 겔과 비교하였을 때, 현저하게 향상된 점탄성 특성을 가지는 가교된 다당류 겔을 얻게될 수 있다는 것에 대한 본 발명자들의 예상하지 못한 발견에 관한 것이다.
하기 실시예 3으로 부터 명백하게 나타나는 것과 같이, 본 발명에 따른 공정의 실행을 통하여 얻어진 가교된 겔에 의하여 보여지는 신규한 점탄성 성질은 결코 종래의 가교 공정, 즉 40℃ 이상의 온도에서 단일한 속도, 심지어 단일 반응 속도가 연장된 시간 동안 적용되었을 때에 얻어지는 겔에 의하여서는 재현될 수 없다.
제 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 공정은 가교된 겔을, 이들의 가교를 멈추기에 유리한 조건에 노출시키는 것으로 이루어지는, 가교의 중지 e) 단계를 더 포함할 수 있으며, 이러한 단계는 회수 d)단계 전에, 도중에 또는 그 이후에 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, e) 단계는 d) 단계 전에 수행된다.
유리하게, 본 발명에 따른 공정이 실행된 이후 얻어진 가교된 겔은 단일-상(single-phase) 겔이며, 보다 특히 대부분 탄력있는(elastic) 점탄성 겔, 즉 겔 무게 이외의 응력(stress)이 없는 상태에서, 유동성이 적거나 또는 심지어 없다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에서 정의된 공정을 실행하여 얻어진 가교된 겔을 피부의 볼륨(volume)의 함몰(defect)의 지속(lasting) 필링(filling), 및 특별히 주름의 필링의 용도로 사용하는 것과 관한 것이다.
Ⅰ) 공정
본 발명의 공정은, 첫번째 단계로, 적어도 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제와 함께 적어도 하나 이상의 가교되지 않은 형태의 다당류를 포함하는 수용성 겔을 제공하는 단계를 포함한다.
"가교되지 않은(uncrosslinked)"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 가교되지 않거나 혹은 약간 가교된 다당류 수용성 다당류 겔, 즉 1Hz의 동적 유동학(dynamic rheology) 조건하에서 측정된, 1Pa 이상의 응력이 적용되었을 때, 40°보다 큰 위상변이각(phase-shift angle) δ 을 갖는 것을 의미한다.
보다 정확하게, 단계 a)에서 고려되는 수용성 겔은 사전에 적절한 용기 내에서,
(ⅰ) 수용성 매질(medium);
(ⅱ) 가교되지 않은 형태의, 적어도 하나 이상의 다당류, 또는 이의 염들의 중 하나; 및
(ⅲ) 적어도 하나 이상의 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제
를 합치고, 그리고 이렇게 얻어진 혼합물을 균질화(homomgenizing)하여 얻어질 수 있고, 상기 화합물 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)의 첨가 순서는 무관하다.
제1 변형 구현예에 따르면, 상기 수용액은, 상기 용기에, 수용성 매질 및 다당류의 도입, 동시에 및/또는 이어서 균질화되게 형성된 혼합물, 그리고 나서 동시 및/또는 이어서 균질화하면서 가교제를 첨가 하는 것에 의하여 얻어질 수 있다.
제2 변형 구현예에 따르면, 상기 수용성 겔은, 상기 용기에, 수용성 매질, 다당류 및 가교제를, 동시에 및/또는 이어서 균질화되게 형성된 혼합물로서 얻을 수 있다.
제2 변형 구현예는 단일 균일화 단계에서 수행되는 것이 유리하다.
유리하게, 수용성 겔을 형성하는 이러한 단계는, 35℃ 이하의 온도, 바람직하게 15 내지 25℃의 범위의 온도, 보다 더 바람직하게 실온에서 수행될 수 있다.
당해 어떠한 구현예에서도, a) 단계에서 고려된 것과 같은 수용성 겔의 형성은 적어도 하나 이상의 균질화 작업을 포함한다.
이러한 작업의 목적은, 보다 특히 가교제의 존재에서 수행되거나 혹은 수행되지 않던지간에, 수용성 매질 내의 다당류 및, 필요하다면 가교제가, 수화 및 균질화가 완전하게 되고, 그래서 기대되는 가교된 겔의 특성을 최대화하는 것을 돕기 위한 것이다.
이러한 이유로, 가교된 겔의 균질성은 가교 전에 겔의 균질성에 밀접하게 의존한다.
균질화는 상기 얻어진 용액이 응집 없이, 균일하게 착색되고(coloured), 균일한 점성을 가질 때 만족된다고 고려된다. 균질화는 유리하게 다당류 사슬의 분해를 막기 위하여 온화한(mild)한 작업 조건에서 수행될 수 있다.
이러한 단계는 다당류가 높은 분자량을 가질때 보다 중요하며, 이는 이러한 화합물의 수화가 그 안에서 응집이 발현이 흔히 발견되는 고-점도 용액의 형성하는 결과를 일으키는 경향이 있기 때문이다.
이러한 균질화 단계 기간 동안, 다당류 및, 보다 특히 이들의 농도 및 분자량의 본성, 수용성 매질 내의 작업 조건 및 사용되는 균일화 기구에 의존한다.
충분히 균질한 수용성 다당류 겔을 얻기 위하여 적합한 균질화 시간을 조정하는 것은 이 기술분야의 기술자의 통상적인 지식에 따른다.
바람직하게, 본 발명에 따른 균일화 과정은 200 분 보다 적게, 바람직하게 150분 보다 적게, 보다 15 내지 100분 사이의 시간 동안 일어날 수 있다.
앞서 말한 것과 같이, a) 단계의 수용성 겔에 두가지 다른 가교 속도는, 번갈아서, a) 단계의 수용성 겔에 본 발명의 공정의 b) 및 c) 단계 각각에 의하여 기술된 것이 적용된다.
가교의 목적은 다당류 사슬, 특별히 히알루론산 체인 사이에 다리를 만드는 것이이며, 이것은 점성의 용액으로부터 밀집한 고형(solid) 3차원 네트워크를 얻는 것을 가능하게 한다.
ⅰ) b) 단계를 수행하기 위한 조건
b) 단계는 a) 단계의 혼합물을 적어도 한시간 이상 35℃ 이하의 온도에서 유지하는 것을 수반한다.
그러므로, b) 단계는, 이것이 수행되는 환경적 조건 하에서, 오직 느린 가교 속도로 호환된다.
바람직하게, b) 단계는 15 내지 25℃의 범위의 온도, 및 더 바람직하게 실온(room temperature)의 온도에서 수행된다.
b) 단계에서 고려되는 느린 가교 속도는 특별히 a) 단계 이후에 얻어진 혼합물 내에서 에폭시 가교제가 소실되는 속도에 의하여 특징지어질 수 있다.
그러므로 b) 단계 동안의 에폭시 가교제의 소실되는 속도의 평균은 히알루론산 농도가 20mg/g에서, 5ppm/min보다 작은, 바람직하게 2ppm/min 보다 작다.
바람직하게, b) 단계는 1시간 보다 길게, 바람직하게 2시간 보다 더 긴 시간의 기간동안 일어난다.
바람직하게, b) 단계는 1 시간 내지 2시간 30분의 범위의 시간, 및 더 바람직하게 1시간 30분 내지 2시간 동안 수행될 수 있다.
ⅱ) c) 단계를 수행하기 위한 조건
그러나, c) 단계는 가교 반응을 촉진하는 것을 수반한다.
그러므로, "촉진(stimulation)"이라는 용어는, 본 발명의 맥락상, 가교 반응의 속도의 현저한 증가를 의미하는 것이라 이해된다.
가교 반응을 촉진시키기 위하여 적용되는 특정한 조건은 다당류의 본성, 다당류의 분자량, 수용성 매질, 및 가교제의 본성에 의존한다.
일반적으로, 이러한 촉진은 b) 단계 이후에 얻어진 혼합물과, 유발요소(triggering element) 또는 자극제(stimulant), 예를 들면 가열 또는 UV에 노출과 같은 것과 접촉함으로써 얻어지거나, 또는 심지어 촉매 타입의 물질과 함께 상기 혼합물을 접촉하므로서 얻어질 수 있다.
이러한 유발요소의 선택은 이 기술분야의 통상의 기술자들의 일반적인 지식에 따른다.
그러므로, 유발요소는 하기와 같은 것에 의하여 적용될 수 있다.
- b) 단계 이후 얻어진 혼합물을 포함하는 용기(receptacle)를 열류(hot fluid)를 담고 있는 배쓰(bath)에 담지;
- 상기 혼합물을 특정 파장의 방사선에, 예를 들면 UV, 또는 마이크로파 또는 심지어 적외선에 노출;
- 전이선(ionizing ray) 수단으로, US2008/0139796 서류에 기재된 공정과 같이 조사(irradation); 및
- 효소적(enzymatic) 가교
본 발명의 맥락에서, 이러한 유발 요소는 유리하게 b)단계 이후에 얻어진 혼합물에 도입된 온도의 증가에 의하여 나타날 수 있다.
c) 단계를 위한 특히 적절한 온도는 당해 다당류의 본성에 의존한다.
만일 다당류가 히알루론산이라면, c) 단계에서 특히 적절한 온도는 35℃ 내지 60℃ 사이, 바람직하게 45 내지 55℃, 보다 더 바람직하게 48 내지 52℃ 사이이다.
상기 기술된 b) 단계의 경우에서, c) 단계에서 고려되는 빠른 가교 속도는 특히, b) 단계 이후 얻어진 혼합물 내에서, 에폭시 가교제의 소실 속도로 특징될 수 있다.
그러므로, c) 단계 동안 가교제의 소실 속도의 평균은 히알루론산 20mg/g의 농도에서 5ppm/min 보다 크고, 바람직하게 7ppm/min 보다 크다.
가교 정도는 또한 b) 단계 이후 얻어진 혼합물을 도입한 가교 시간에 의존한다. 시간이 길어지면, 가교의 정도는 더 높아지지만, 최대는 다당류의 분해의 위험을 무릅쓰지 않는 정도이다.
그러므로, c) 단계는 30 내지 300분의 범위의 시간, 바람직하게 100 내지 200분, 및 보다 더 150 내지 190분의 시간 동안 수행될 수 있다.
유리하게도, 가교 조건은 가교 효율이 최대화, 즉 사용되는 가교제의 최소량으로 가교의 유효 정도(effective degree)가 최대화되게 얻도록 조정된다.
바람직한 일 구현예에 따르면, b) 및 c)단계의 가교는 염기성 매질에서 수행되고, 용기는 실온에 한시간 동안 유지시킨 a) 단계에서 얻어진 혼합물을 함유 및, 그리고 나서 약 55 내지 55℃의 온도로 가열된 온도조절된(thermosttated) 배쓰(bath)에서, 적어도 1시간, 및 바람직하게 1시간 30분 내지 3시간 30분 동안 사이의 시간 동안 놓여지게 된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 가교의 중지 (단계 e)는 겔을 회수하는 d) 단계 전에, 도중에, 이후에 수행될 수 있다.
이러한 단계는, 본 발명에 따른 공정에서, 가교되는 동안에, 가교된 겔을 심지어 그것을 포함하고 있는 용기를, 가교를 중지하기에 유리한 조건 또는 아니면 다양한 다당류 사슬 사이에 결합의 형성을 중지시킬 수 있는 조건에 노출하는 것을 요구한다.
바람직한 변형 구현예에 따르면, e)단계는 d)단계 이전에 수행된다.
예를 들면, 가교 공정을 촉진시키는 것에 적용될 수 있는 열적 조건과 관련하여, 가교는 하기와 같이 중단될 수 있다.
- 단순히 온도조절된 배쓰로 부터 용기를 제거하고, 그것을 실온으로 돌아갈때까지 냉각;
- 상기 용기를 용기 내의 온도가 실온과 가까워질때 까지, 찬 물, 바람직하게 온도가 실온 이하의 물의 배쓰에 넣는 것; 또는 심지어
- 상기 용기에서 겔을 추출
방사능 가교의 경우, 상기 겔을 방사능에 노출시키는 것을 중지하면, 가교가 중지된다.
제1 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 공정은 a) 단계에서 얻어진 혼합물, 또는 심지어 b) 단계 이후에 얻어진 혼합물을 100 마이크론보다 큰 직경의 입자를 유지하는 것을 가능하게 하는 기구 적어도 하나 이상을 통과시키는 것으로 이루어진 적어도 하나의 단계를 또한 포함할 수 있다.
이 구체적인 단계는 또한 이하 명세서에서 "압출(extrusion) 단계"로 불리며, 그러므로 a) 단계 이후 및 b) 단계 전 및/또는 b) 단계 이후 및 c)단계 이전에 일어난다.
하기 실시예로 부터 나타날 것과 같이, 이러한 압출 단계와 관계된 유리한 효과는 보다 향상된 점탄성 효과를 가지는 가교된 겔을 얻을 수 있다는 것이다.
압출 기구의 종류를 선택하는 것은 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자에 지식에 따른다.
유리하게도, 압출 공정은 적어도 하나의 필터를 포함하는 적어도 하나 이상의 기구를 이용하여 수행된다.
이 기술분야의 기술자들은 이러한 필터의 공극률(porosity), 기하학(geometry), 강도(strength) 및 머무름(retention) 능력의 용어의 적절한 특징을 정의할 수 있어서, 후자는 100 마이크론 보다 큰 입경의 입자를 유지하면서, a)단계 이후에, 또는 심지어 b)단계 이후에 얻은 혼합물을 통과하도록 한다.
본 명세서의 이후에서, 또한 압출 단계를 수행하는데 사용되는 적어도 하나의 필터를 포함하는 기구는 "압출 기구"라는 용어로 나타내질 수 있다.
유리하게도, 압출 단계는 2 내지 100 마이크론의 범위의 공극률, 바람직하게 5 내지 50 마이크론, 더 바람직하게 8 내지 30 마이크론, 및 더욱 바람직하게 10 마이크론의 공극률을 가진 필터를 적어도 하나 이상 포함하는 적어도 하나 이상의 기구를 통하여 수행된다.
유리하게, 압출기구(들)을 통과한, a)단계 및/또는 b) 단계 이후의 얻어진 상기 혼합물(들)의 압출의 선형 속도(linear rate)는 그것을 통해서 통과되는 동안에 다당류 사슬의 분해를 막기 위하여, 느리다.
그러므로, 압출기구(들)을 통과한, a)단계 및/또는 b) 단계 이후에 얻어진 상기 혼합물(들)의 압출의 선형 속도는 1 내지 100cm/min 사이, 바람직하게 1 내지 4cm/min 사이이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 공정은 예를 들어 파우치와 같이, 변형 가능한 벽을 가진 구체적인 용기 내에서 적어도 부분적으로 수행될 수 있다.
이러한 것은 이러한 용기의 변형가능한 성질 및 그것의 기밀성이 본 발명에 따른 공정의 다양한 단계를 가능하게 하고, 특별히 균질화 및 가교 단계가, 얻어진 가교된 겔에서 심지어 더 좋은 결과, 즉 단지(pot) 또는 탱크(tank) 타입의 종래의 용기를 적용하는 공정에 따라 얻어지는 겔에서 보여지는 것보다 우수한 주입성을 가지게 되는 결과를 얻게 하는 최대화된 조건 하에서 수행하는 것을 가능하게 하기 때문이다.
상기 기술된 발명의 공정 이후에 얻어진 가교된 겔은, 일반적을 직접적으로 주입될 수 없으며, 이는 특히 다당류의 농도 및/또는 가교제 잔여물의 존재의 가능성 때문이거나 또 다르게는 상기 고려된 적용의 분야에서 양립하여 사용 불가능한 pH 및/또는 그것의 생리학 조건 때문이다.
또한, 본 발명의 공정에 따라 얻어진 겔은 특별히 보통 말하는 그런 환자에게 주입되기에 너무 뻣뻣(stiffness)하다.
그러므로, 주입성 하이드로겔을 얻기 위하여 이 기술분야에서 알려진 몇몇 추가적인 단계가 수행될 수 있다.
보다 구체적으로, 겔의 팽창(expanding) 및 중성화(neutralizing) 단계는 그것의 삽입(implant)의 품질을 얻기 위하여 요구된다. 다당류 네트워크의 사슬은 그리고 난 후 상기 겔의 pH가 진피의 pH로 되는 동안에, 늘어지고(stretched) 수화된다.
겔의 보호 및 재밀도화(redensifying) 단계는 또한 이 기술분야의 기술자의 노하우에 따라, 삽입의 품질을 보다 향상시키기 위하여 수행될 수 있다. 이러한 겔은 주입되는 매질의 것과 동등한 양의 염의 존재에 의하여 생리학적으로 제형화되어야만 한다.
보다 높은 순도를 위하여, 추가적인 정제 단계가 또한 수행될 수 있다.
마지막으로, 이렇게 얻어진 하이드로겔은 조절된 대기 조건 하에서, 시린지를 채우기 위하여 사용 가능하고, 이때 상기 시린지는 멸균 단계, 바람직하게 열적 멸균 단계를 진행시키는 것이 가능하다.
Ⅱ) 다당류
"다당류(polysaccharide)"라는 용어는 글리코사이드 결합에 의하여 함께 연결된 여러 단당류(monosacchride)로 이루어진 어떠한 고분자를 의미하는 것으로 이해되며, 일반적인 화학식은 -[Cx(H2O)y]n-이다.
본 발명에 따르는 다당류는 보다 특히 본 발명에 따라 얻어지는 가교된 겔이 보여주기를 원하는 특성에 따라 선택된다. 보다 특히 그러한 다당류는 좋은 생체적합성(biocompatibility)을 가져야만 한다.
그러므로, 생리학적으로 허용가능한 다당류 또는 다당류 염은 천연의 또는 합성 유래의 것일 수 있다.
본 발명에 적합한 다당류는 특히 콘드로이틴 황산(chondroitin sulphate), 케라탄(keratan), 케라탄 황산(keratan sulphate), 헤파린(heparin), 헤파린 황산(heparin sulphate), 잔탄(xanthan), 카라기난(carrageenan), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 셀룰로오즈(cellulose) 및 이의 유도체, 알긴산(alginate), 전분(starch), 덱스트란(dextran), 풀란(pullulan), 갈락토만난(galactomannan) 및 생물학적으로 허용 가능한 이들의 염에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르는 다당류 염은 보다 특히 생리학적으로 허용 가능한 염, 예를 들면 나트륨 염, 칼륨 염, 아연 염, 은 염 및 이들의 혼합물, 바람직하게 나트륨 염에서 선택될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따르는 다당류 및 다당류 염은 해당되는 적용에 따라서, 높은 분자량, 바람직하게 100 000Da이상, 보다 바람직하게 1MDa(또는 1. 106 Da) 이상, 또는 심지어 3 MDa(또는 3.106) 보다 큰 분자량을 가진다.
특히 바람직한 하나의 다당류는 히알루론산 또는 이의 염, 바람직하게는 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate, NaHA)이다.
유리하게, 다당류는 상기 다당류의 수용성 겔 안에서 상기 수용성 겔의 전체 중량에 상대적으로, 5 내지 15중량%의 범위의 함량, 바람직하게 10중량% 보다 많은 함량으로 가교되지 않은 상태로 존재할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따르는 공정의 a)단계의 혼합은 가교되지 않은 형태의 수용성 다당류 겔, 또는 이의 염들 중 하나, 적어도 하나 이상의 에폭시 가교제와 함께 혼합된, 적어도 하나 이상을 만들 수 있다.
이제, 상기 수용성 다당류 겔은 그 자체로 상기 다당류, 또는 이의 염들 중 하나, 수용성 매질과 함께 접촉된 것을 사전에 가져옴으로 인해서 만들어질 수 있다.
"수용성 매질(aqueous medium)"이라는 용어는 본 발명의 맥락상 물을 포함하며 다당류 또는 이의 염들 중 하나를 용해시키는 성질을 가지는 어떠한 액체 매질을 의미하는 것으로 이해된다.
수용성 매질의 본성은 보다 특히 예상되는 가교의 타입, 그러나 또한 사용되는 고분자의 타입에 의존한다.
이와 관련하여, 적절한 수용성 매질은 산성 또는 염기성 중 하나 일 수 있다.
하나의 특정 바람직한 수용성 매질은 알칼리성 매질, 바람직하게 수산화나트륨(NaOH), 보다 바람직하게 12보다 큰 pH를 가지는 수산화나트륨이다.
Ⅲ. 에폭시 가교제
"가교제(crosslinking agent)"라는 용어는 다양한 다당류 체인들 사이에 가교를 유발할 수 있는 성능을 가진 어떠한 화합물을 의미한다고 이해된다.
깨끗이 가교되는 다당류를 위한 가교제의 선택은 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 기술자의 능숙도에 따른다.
본 발명에 따른 가교제는 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제, 예를 들면 부탄디올 디글리시딜 에테르(butanediol diglycidyl ether, BDDE), 다이에폭시옥탄(diepoxyoctane) 또는 1,2-비스(2,3-에폭시프로필)2,3-에틸렌(1,2-bis(2,3-epoxypropyl)-2,3-ethylene, 및 이들의 혼합물과 같은 것에서 선택된다.
바람직하게, 본 발명에 따르는 가교제는 부탄디올 디글리시딜 에테르이다.
가교 반응을 수행하기 위한 가교제의 함량의 조정은 이 기술분야의 통상의 지식인의 능숙도에 따른다.
특히 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 공정은 가교제로서 부탄디올 디글리시딜 에테르와 함께 알칼리성 매질내의 히알루론산 나트륨을 사용한다.
청구항들을 포함하는 명세서를 통해서, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 특별히 다르게 언급된 적이 없다면 "적어도 하나를 포함하는(comprising at least one)"와 동의어로 이해되어야만 한다.
"... 내지 ... 사이(between ... and ... )" 및 ... 내지 ...의 범위(ranging from ... to ...)"은 특별한 다른 말이 없으면, 경계값을 포함하는 의미로 이해되어야 한다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 설명을 제한되지 않는 방법으로 나타나야한다.
- 도 1 : 측정된 히알루론산 겔의 점탄성 성질을 탄성계수 G'(단위 Pa)로 보여준다.
- 도 2 : 2시간 동안 실온에서 BDDE와 함께 12% 의 수용성 히알루론산 겔의 혼합물을 유지하는 첫번째 단계 및 그 이후에 52℃에서 다양한 시간 동안 상기 혼합물을 인큐베이션하는 두번째 단계로 특징지어 지는 가교 단계 이후에 얻어지는 하이드로겔의 탄성계수 G'(단위 Pa)의 변화를 보여준다.
- 도 3: 다양한 시간 동안 52℃에서 BDDE와 함께 12%의 수용성 히알루론산 겔을 인큐베이션하는 단일한 단계로 특징지어 지는 가교 단계 이후에 얻어지는 하이드로겔의 탄성계수 G'(단위 Pa)의 변화를 보여준다.
실시예 :
실시예 1
하기 기술된 가교겔 각각을 위하여, 히알루론산(1.5 MDa) 10g, 1% 수산화나트륨 73g 및 부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE) 1,2g을 사용하였다.
각 겔에 적용된 구체적인 조건은 하기와 같다.
물질 A (대조군)
준비 프로토콜은 하기와 같았다:
1. 완벽하게 균질한 점성의 용액을 얻기 위하여 약 1시간 30분 동안 히알루론산/1% 수산화나트륨의 혼합물을 실온에서 균질화;
2. 가교제(BDDE)의 첨가 및 약 20분 동안 실온에서 균질화;
3. 히알루론산/1% 수산화나트뮬 혼합물/BDDE 점성 용액을 3시간 동안 52℃에서 인큐베이션; 및
4. 중성에 가까운 pH의 히알루론산 20mg/g을 함유하는 하이드로겔을 얻기 위하여, 산화된 포스페이트 완충 용액(acidified phosphate buffer solution) 내에서 얻어진 고형(가교된 히알루론산 용액)의 중성화, 팽윤(swelling) 및 균질화.
물질 B (본 발명에 따른)
프로토콜은 상기 물질 A에 기재된 방법에서 2단계와 3단계 사이, 2단계 이후에 얻어진 혼합물을 실온에서 2시간 동안 유지되는 중간단계와 함께 수행되는 점을 제외하고는 동일하였다.
상기 중간 단계는 본 명세서의 나머지 부분에서, "휴식 단계(rest step)"이라는 표현으로 나타내질 수 있다.
52℃에서 인큐베이션 하기 전에 전체 "히알루론산/BDDE"는 접촉 시간은 따라서 약 2시간 20분이었다.
물질 C (본 발명에 따른)
프로토콜은 상기 물질 A에서 기재된 방법에서, BDDE를 첨가하고 15분동안 균질화 하는 2단계 이후에, 압출 공정과, 물질 B가 2시간 동안 실온에서 유지되는 중간 단계, 그리고 나서 3시간 동안 52℃에서 인큐베이션하는 3단계를 제외하고는 동일하였다.
이러한 압출 공정은 10 마이크론 메쉬 사이즈를 가진, 스크린 팩 타입 압출기(extruder screen pack type)의 둥근 스크린(circular screen) 수단을 이용하여 수행되었다.
52℃에서 인큐베이션 하기 전에 전체 "히알루론산/BDDE"는 접촉 시간은 따라서 약 2시간 20분이었다.
시린지는 A, B 및 C 물질로 채워졌다. 이러한 세가지 물질의 점탄성 특성은 cone/plate 구조(1˚원추각(cone angle)/35 mm 직경 plate)의 유동계(Haake RS6000)을 이용하여 측정되었다. 변형(strain)이 수행되었고 탄성계수(eleastic modulus) G´(단위 Pa) 및 위상-반전 각도(phase-shift angle) δ (단위˚)가 5 Pa의 응력으로 측정되었다.
결과
아래 도 1은 측정된 탄성 계수 G´값 (단위 PA)을 보여준다. 참고로, 위상-반전 각도 δ는 각 기둥의 위쪽, G´값의 오른쪽에 기재되었다. (단위˚)
측정된 위상 반전은 극히 작고, 이는 이것은 이러한 겔이 주로 탄성 성질을 보여주는 것을 의미한다.
도 1의 결과, 특히 물질 B의 결과는 본 발명에 따른 공정에 의하여 가교반응이 수행되었을 때, 즉, 가교 반응이 번갈아 두가지 다른 속도로 수행되었을 때, G´가 현저히 상승된 것을 보여준다.
이러한 효과는 압출 단계가 10 마이크론 공극률의 필터를 포함하는 기구를 이용하여 수행되었을 때에도 보다 더 나타났다.
실시예 2 : 다양한 시기에, 본 발명에 따른 공정이 적용된 히알루론산 겔 내의 가교제 양의 측정.
몇몇 가교된 하이드로겔은 구체적 용기, 즉 상기 정의된 변형 가능한 파우치의 사용을 통하여 본 발명의 공정을 이용하여 동시에 준비되었다.
1% NaOH 내에 12% 히알루론산 용액이 따라서 준비되었다. 히알루론산의 수화 이후에, 1% NaOH 내에서 5배로 희석된 BDDE 용액이 첨가되었다.
그러므로 사용된 BDDE의 총량은 20mg/g 히알루론산 하이드로겔 내에서 1.8mg/g과 등가의 이론적 함량에 일치하였다.
상기 얻어진 혼합물로부터 A, B 및 C의 몇몇 분획들이 준비되었다.
분획 A는 이하 기술된 인큐베이션 단계 전에 실온(romm temperature, RT)에서 1시간 동안 유지시킨 히알루론산 겔에 해당한다.
분획 B는 이하 기술된 인큐베이션 단계 전에 실온에서 2시간 동안 유지시킨 히알루론산 겔에 해당한다.
마지막으로 분획 C는 하기 기술된 인큐베이션 단계 이전에 실온에서 1시간 동안 유지시킨 것이고, 이러한 휴식 단계? 또한 10㎛의 메쉬 사이즈의 스크린을 통하여 압출되는 단계와 결합된다.
상기 기술된 다양한 조치 이후에, A, B 및 C 분획은 3시간 동안 52℃에서 인큐베이션된다.
상기 인큐베이션 단계 이후에 얻어진 각각의 고형는(가교된 히알루론산 용액)은 20mg/g 히알루론산 하이드로겔을 얻기 위하여 pH 7.3의 포스페이트 완충 용액에서 그리고 중화되고, 팽윤되고 그리고 균질화된다.
본 발명의 공정의 다양한 단계에서 소모되는 가교제의 양을 모니터하기 위하여, 다양한 시기에서 BDDE 분석이 수행되었다.
그러므로, T1 및 T2 샘플은 52℃에서 3시간 동안 유지하는 인큐베이션 단계 전에, 히알루론산/BDDE 혼합물을 실온에서 각각 1시간, 2시간 동안 유지시킨 이후에 얻어진 겔의 샘플에 해당된다.
샘플 T1 및 T2은 그리고 난 후 20mg/g 히알루론산 하이드로겔을 얻기 위하여 A, B 및 C 분획용 상기 기술된 것과 동일한 중화, 팽창 및 균질화 단계를 거쳤다.
샘플 A, B 및 C는 52℃에서 3시간 동안 인큐베이션 및 20mg/g 하이드로겔로 변환시킨 이후에 대응되는 분획으로 부터 얻어진 겔 샘플과 일치하였다.
결과
표 1은 측정된 가교제의 양 및 얻어진 하이드로겔의 탄성 계수( G´, 단위 Pa) 값을 보여준다.
참고로, 복소 점도(complex viscosity) |η|* 및 위상-반전 각도 δ 값도 역시 언급되었다.
샘플: BDDE ( mg /g) G´( Pa ) |η|* ( Pa .s) d (°)
T1 1.53 NCO * (대두분 가교의 부존재 때문에 낮은 탄성의 점성 용액, δ >45˚)
T2 1.43
분획 A
(실온에서 1시간 동안 유지)		 0.20 136 22 5
분획 B
(실온에서 2시간 동안 유지)		 0.17 174 28 5
분획 C
(실온에서 1시간 동안 유지 및 10㎛ 필터를 통한 압출 단계)		 0.20 159 25 5
* NCO = 수행되지 아니함( not carried out )
측정된 잔여 BDDE 함량은 비-멸균된(non-sterilized) 및 비-정제된(purified) 겔과 일치한다는 것에 주의하여야 된다.
샘플 T1 및 T2의 가교제(BDDE)의 측정된 함량은 규모의 순서와 동일하다. 상기 지시된 이론적 함량과 비교하여 관찰된 BDDE의 양의 소량의 감소는 가교 반응의 느린 반응에 의하여 설명되며, 이러한 경우와 같이, BDDE의 분해와 관련있고, 이는 에폭시 작용기의 불안정 때문이다.
반대로, BDDE 함량의 감소는 3시간 동안 52℃에서 인큐베이션 단계 이후에 두드러지며, 이러한 BDDE의 실질적인 소비는 그러므로 가교 반응의 빠른 속도에 일치한다.
얻어진 된 겔(분획 A, B 및 C)의 기계적 특성 측면에서, (ⅰ) 측정된 위상 전환은 극도로 작은것, 이것은 이러한 겔이 주로 탄성 성질을 가지는 것을 의미하고, (ⅱ) 가장 높은 탄성 계수 G´가 B분획, 즉 52℃에서 인큐베이션 하기 전에 2시간 동안 실온에서 유지시키는 것으로 부터 얻어진 것, 그리고 (ⅲ) 가교 이전에 압출된, 분획 C는 압출되지 않은 동일한 하이드로겔(분획 A)와 비교할 때 현저하게 향상된 탄성 계수 G´를 가진다는 점을 설명한다는 점에서 가치 있다.
상기 (ⅱ) 및 (ⅲ)는 그러므로 가교 반응 동안 번갈아 사용한 두 가지 다른 가교 속도 또한 본 발명에 따르는 가교 겔을 준비하기 위한 공정의 맥락 내에서 압출 과정 덕분에 유리한 효과가 나타남을 보여준다.
실시예 3:
실시예 2에서 기술한 것과 동일한 수용성 다당류 겔/가교제 혼합물이 준비되었다.
그리고 나서 두 가지 테스트가 수행되었다:
- 첫번째 경우는, 여러 분획 A, B, C 및 D가 상기 혼합물로부터 준비되었다. 가교 반응은 상기 분획들을 다양한 시간 동안의 52℃에서 그것들이 놓여지기 전에 2시간 동안 실온에서 상기 분획물들을 놓아둠으로써 수행되었다.
- 두번째 경우는, 여러 분획 A', B', C' 및 D'가 또한 준비되었다. A, B, C 및 D 분획과는 다르게, 이러한 것은 직접적으로 다양한 시간 동안에 52℃에서 직접적으로 인큐베이션 되었다.
여러 분획들의 52℃에서 인큐베이션 시간은 하기와 같이 고려되었다.
■ 분획 A 및 A' : 2시간 40분
■ 분획 B 및 B' : 2시간 50분
■ 분획 C 및 C' : 3시간
■ 분획 D 및 D' : 3시간 10분
인큐베이션 단계 이후에 얻어진 가교된 히알루론산 겔은 20mg/g의 히알루론산 하이드로겔을 얻기 위하여 7.3pH 포스페이트 완충(phostpate buffer, PB) 용액에서 그리고 나서 중화되고, 그리고 나서 팽윤되고 그리고나서 균질화 되었다. 하기 특성 및 분석은 얻어진 하이드로겔에서 수행되었다.
결과
하기 표 2는 얻어진 하이드로겔의 탄성 계수 G´(단위 Pa)의 값을 나타낸다. 참고로, 복소 점도 (complex viscosity) |η|* 및 위상-반전 각도 δ 의 값도 역시 언급되었다.


 진폭 스캔 ( cone / plate )
τ = 5 Pa
G(Pa) |η| * (Pa.s) δ (°)
A 174.5 27.9 5.1
B 186.9 29.9 5.7
C 174.0 27.8 5.5
D 152.2 24.3 4.8
A' 119.2 19.1 7.1
B' 126.5 20.3 6.4
C' 125.8 20.1 6.3
D' 122.7 19.6 5.7
하기 도 2 및 도 3 는 상기 표 2에 주어진 결과로 설명된다.
가교의 52℃ 인큐베이션 단계에서 최적 효율은 실온에서 수용성 다당류 겔/가교제 혼합물을 유지시키는 이전 단계와 함께 또는 단계 없이도 약 3시간 일어난다.
52℃ 인큐베이션 단계 이전에, 2시간 동안 실온에서 유지 단계를 수행하는 공정에 의하여 얻어진 하이드로겔은 실온에서 유지시키는 단계 없는 프로토콜에 의하여 얻은 하이드로겔에서 보여지는 최대값보다 현저하게 더 나은 점탄성 성질을 가지고 있다.
이러한 결과는, 가교 반응의 수행하는 동안, 오랜 기간 동안 주위 온도에서 수용성 다당류 겔/가교제 혼합물을 유지시키는 단계의 존재 덕분에 얻은 유익한 효과가 단순히 52℃에서 가교 시간을 늘리는 것에 의하여 재현될 수 없다는 것을 증명해준다.
이것은 본 발명의 가교 공정에 따른 얻은 하이드로겔에서 측정된 최적 G´가 52℃에서 인큐베이션 단계의 기간과는 상관없이, 종래의 가교 공정에 따라 얻어진 하이드로겔에서 얻어진 것에 의하여는 절대 얻어질 수 없기 때문이다.

Claims (14)

  1. 가교된 겔을 제조하는 공정에 있어서,
    a) 적어도 하나 이상의 이관능성(difunctional) 또는 다관능성(multifunctional) 에폭시 가교제와 함께 적어도 하나 이상의 가교되지 않은 형태의 히알루론산을 포함하는 수용성 겔을, 35℃이하의 온도에서 준비하는 단계,
    상기 준비 단계 이후에 얻어진 혼합물은 파우치에서
    ⅰ. 수용성 매질(medium);
    ⅱ. 가교되지 않은 형태의, 적어도 하나 이상의 히알루론산, 또는 이의 염들 중 하나; 및
    ⅲ. 적어도 하나 이상의 이관능성 또는 다관능성 에폭시 가교제를 혼합하고,
    얻어진 혼합물을 균질화(homogenizing)를 통하여 얻어지며, 상기 화합물 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)를 상기 파우치에 첨가되는 순서는 무관하며;
    b) a) 단계의 혼합물을 35℃ 이하의 온도에서 적어도 한시간 이상 동안 유지하는 단계;
    c) b) 단계 이후에 얻어진 혼합물의 가교 반응을 촉진하고, c) 단계는 열에 의해, 35 내지 60℃ 사이의 온도에서 수행되는 단계; 및
    d) 형성된 상기 가교된 겔을 회수하는 단계로 이루어지는 단계들을 적어도 포함하는, 적어도 하나 이상의 히알루론산 또는 이의 염들 중 하나의 가교된 겔의 제조 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a) 및 b) 단계는 15 내지 25℃의 범위의 온도에서 수행되는 가교된 겔의 제조 공정.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 b) 단계는 2시간 보다 더 긴 시간동안 수행되는 가교된 겔의 제조 공정.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균질화 단계는 200 분 보다 적은 시간 동안에 일어나는 가교된 겔의 제조 공정.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계는 45 내지 55℃의 사이의 온도에서 수행되는 가교된 겔의 제조 공정.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계는 30 내지 300분의 범위의 시간 동안 수행되는 가교된 겔의 제조 공정.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 가교제는 부탄디올 디글리시딜 에테르(butanediol diglycidyl ether, BDDE)인 가교된 겔의 제조 공정.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산은 1 MDa 이상의 분자량을 가지는 가교된 겔의 제조 공정.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산은 상기 히알루론산의 수용성 겔 안에서, 가교되지 않은 형태로, 상기 수용성 겔의 전체 중량 대비, 5 내지 15중량%의 함량으로 존재하는 가교된 겔의 제조 공정.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제조 공정은 가교제로서, 부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE) 및 알카리성 매질 내의 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)을 사용하는 가교된 겔의 제조 공정.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 가교된 겔은 겔 무게 이외의 응력(stress)이 없는 상태에서, 유동성이 적거나 또는 없는 겔인 가교된 겔의 제조 공정.
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