KR101866906B1 - 후코이단의 추출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 후코이단의 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합물에 물을 첨가한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계; (c) 다시마를 파쇄한 후 용매를 첨가하고 교반하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합한 후 가열 추출하여 후코이단을 수득하는 단계를 포함하는 후코이단의 추출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 후코이단의 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합물에 물을 첨가한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계; (c) 다시마를 파쇄한 후 용매를 첨가하고 교반하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합한 후 가열 추출하여 후코이단을 수득하는 단계를 포함하는 후코이단의 추출방법에 관한 것이다.
해조류는 오래전부터 식용이나 산업용으로 다양하게 이용되고 있는데, 아시아에서는 해조류를 주로 음식 재료로 사용하는 반면 서양에서는 새로운 화합물을 제조하기 위해 해조류를 사용하고 있다.
해조류 중 특히 다시마는 알지네이트, 라미나린, 만니톨, 후코이단 등의 다당류, 식이성 섬유질, 무기질 등을 다량으로 함유하고 있다.
후코이단은 L-푸코오스를 주성분으로 하고 다수의 황산기를 함유하는 다당류로서 다시마, 미역, 톳 등의 갈조류에 다량 함유되어 있다. 후코이단의 화학적 구조, 생리활성, 분자량 등은 갈조류의 종류, 수확장소, 수확시기 등에 따라 달라진다.
후코이단은 면역 활성 증진, 항 혈액응고 효과, 항산화 효과, 항암효과, 항균효과 등의 다양한 생리활성을 나타내며, 이러한 효과를 바탕으로 의약품, 화장품, 식품 산업 등에 적용하고자 하는 연구들이 활발히 진행되고 있다.
이와 관련하여 한국공개특허 제10-2008-0106741호, 한국공개특허 제10-2013-0055926호, 한국공개특허 제10-2014-0020005호 등은 후코이단의 추출방법을 개시하고 있다.
그러나 상기 문헌에 개시된 기술은 후코이단의 추출을 위해 용매로서 산, 염기, 유기용매, 효소 등을 사용하는데, 이러한 용매는 환경오염문제를 유발하고 작업자의 건강을 위협할 뿐 아니라 추출 공정에 많은 비용이 소요되는 단점이 있다.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 후코이단의 추출을 위해 공융용매를 사용함으로써, 기존에 사용되고 있는 산, 염기, 유기용매, 효소 등의 용매를 대체하여 친환경적이고 안전하며 경제적인 후코이단의 추출방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 공융용매로서 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 사용함으로써, 독성이 없어 인체에 무해하고 가격이 저렴하며 높은 안정성을 갖는 후코이단의 추출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합물에 물을 첨가한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계; (c) 다시마를 파쇄한 후 용매를 첨가하고 교반하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합한 후 가열 추출하여 후코이단을 수득하는 단계를 포함하는 후코이단의 추출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜의 몰비가 1:1~3인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계는 제1 혼합물과 물의 부피비가 30~60:40~70인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합하고 80~120℃에서 60~180분 가열 추출한 후 후코이단을 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마의 중량비는 5~30:1인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 후코이단의 추출을 위해 공융용매를 사용함으로써, 기존에 사용되고 있는 산, 염기, 유기용매, 효소 등의 용매를 대체하여 친환경적이고 안전하며 경제적인 후코이단의 추출방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 공융용매로서 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 사용함으로써, 독성이 없어 인체에 무해하고 가격이 저렴하며 높은 안정성을 갖는 후코이단의 추출방법을 제공할 수 있다.
도 1은 세 가지의 공융용매를 사용하여 수득한 후코이단의 FT-IR 스펙트럼을 나타내고 있다.
도 2는 실시예 1로부터 제조된 후코이단의 세포독성평가를 나타내고 있다.
도 2는 실시예 1로부터 제조된 후코이단의 세포독성평가를 나타내고 있다.
이하 실시예를 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.
본 발명은 (a) 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합물에 물을 첨가한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계; (c) 다시마를 파쇄한 후 용매를 첨가하고 교반하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합한 후 가열 추출하여 후코이단을 수득하는 단계를 포함하는 후코이단의 추출방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계는 공융용매(Deep eutectic solvent; DES)를 제조하는 단계로서, 본 발명은 공융용매로서 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 사용할 수 있다.
상기 공융용매는 낮은 용융점을 가진 2개의 용매를 혼합 및 가열하여 제조되며, 독성이 없어 인체에 무해하고 가격이 저렴하며, 높은 안정성, 낮은 증기압 등의 특성을 갖고 있어 기존 용매(산, 염기, 유기용매, 효소 등)를 대체할 수 있다.
본 발명은 공융용매로서 테트라메틸암모늄 클로라이드, 하이드록시메틸트리메틸암모늄 클로라이드, 하이드록시에틸트리메틸암모늄 클로라이드(콜린클로라이드), 하이드록시에틸트리에틸암모늄 클로라이드, 하이드록시에틸트리프로필암모늄 클로라이드, 테트라에틸암모늄 클로라이드, 테트라부틸암모늄 클로라이드, 하이드록시에틸트리부틸암모늄 클로라이드 등의 수소 결합 받게(hydrogen bond acceptor); 및 에틸렌글리콜, 1,2-부탄디올, 페놀, 우레아 등의 수소 결합 주게(hydrogen bond donor)를 사용할 수 있다. 특히, 본 발명은 공융용매(제1 혼합물)로서 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 사용함으로써 다시마로부터 추출되는 후코이단의 수율을 획기적으로 향상시킬 수 있다.
상기 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜의 몰비는 1:1~3인 것이 바람직하며, 몰비가 1:1 미만이거나 몰비가 1:3을 초과하면 추출되는 후코이단의 수율이 감소하게 된다.
상기 공융용매는 콜린클로라이드와 에틸렌글리콜을 혼합한 후, 80~120℃에서 10~60분 동안 교반하여 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계는 공융용매에 용매를 첨가하여 혼합용매(제2 혼합물)를 제조하는 단계로서, 본 발명은 첨가하는 용매로서 물을 사용할 수 있다.
상기 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 등이 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 첨가되는 용매로서 물을 사용함으로써 다시마로부터 추출되는 후코이단의 수율을 획기적으로 향상시킬 수 있다.
상기 공융용매와 물의 부피비는 30~60:40~70인 것인 것이 바람직하며, 부피비가 30:70 미만이면 추출되는 후코이단의 양이 감소하며, 부피비가 60:40을 초과하면 가공성이 저하되고 추출되는 후코이단의 수율이 감소하게 된다.
상기 (c) 단계는 다시마를 파쇄한 후 용매(물, 알코올 등)를 첨가하고 교반하여 불순물을 제거하는 단계로서, 다시마로부터 후코이단을 추출하기 전에 불순물(염분, 색소, 찌꺼기 등)을 제거하여 추출효율을 높일 수 있다.
일예로, 다시마를 분쇄한 후, 분쇄된 다시마 10중량부에 100~500중량부의 증류수를 가한 다음 10~60분 교반하여 상등액을 버린다. 상기 과정을 염분이 0%가 될 때까지 반복한 다음 85% 에탄올 100~500중량부를 가한 후 5~15시간 교반하여 색소를 제거한다. 상기 색소가 제거된 다시마를 아세톤으로 세척하고 여과한 다음 건조하여 다시마를 전처리할 수 있다.
상기 (d) 단계는 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합한 후 가열 추출하여 후코이단을 수득하는 단계로서, 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합하고 80~120℃에서 60~180분 가열 추출하여 후코이단을 수득할 수 있다.
상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마의 중량비는 5~30:1인 것이 후코이단의 수율 측면에서 바람직하다.
일예로, 불순물이 제거된 다시마 3g에 제2 혼합물 60㎖를 가한 후, 100℃에서 2시간 동안 교반하여 추출물을 수득한다. 상기 추출물을 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분리된 상등액에 염화칼슘을 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 교반하여 알긴산 침전물을 제거한다. 알긴산이 제거된 상등액에 에탄올을 첨가하고 원심분리하여 후코이단을 수득한 후, 이를 건조하여 고순도의 후코이단을 얻을 수 있다.
이하 실시예 및 비교예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 실시를 위하여 예시된 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
콜린클로라이드와 에틸렌글리콜을 1:2의 몰비로 혼합한 후, 100℃에서 20분 동안 교반하여 제1 혼합물을 제조하였다.
상기 제1 혼합물에 물을 첨가한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하였으며, 이때 제1혼합물과 물의 부피비는 50:50이었다(F-ChCl-EG-50%).
다시마를 분쇄한 후, 분쇄된 다시마 10중량부에 200중량부의 증류수를 가한 다음 30분 교반 후 상등액을 제거하였으며, 상기 과정을 염분이 0%가 될 때까지 반복하였다. 여기에 85% 에탄올 200중량부를 가한 다음, 12시간 교반하여 색소를 제거하였다. 상기 색소가 제거된 다시마를 아세톤으로 세척하고 여과한 다음 건조하여 다시마를 전처리하였다.
상기 전처리된 다시마 3g에 제2 혼합물 60㎖를 가한 후, 100℃에서 2시간 동안 교반하여 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분리된 상등액에 염화칼슘을 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 교반하여 알긴산 침전물을 제거하였다. 알긴산이 제거된 상등액에 에탄올을 첨가하고 원심분리하여 후코이단을 수득한 후, 이를 60℃에서 건조하여 고순도의 후코이단을 얻었다.
(실시예 2)
콜린클로라이드와 에틸렌글리콜을 1:0.9의 몰비로 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 후코이단을 수득하였다.
(실시예 3)
콜린클로라이드와 에틸렌글리콜을 1:4의 몰비로 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 후코이단을 수득하였다.
(실시예 4)
제1혼합물과 물을 25:75의 부피비로 혼합한 것(F-ChCl-EG-25%)을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 후코이단을 수득하였다.
(실시예 5)
제1혼합물과 물을 65:35의 부피비로 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 후코이단을 수득하였다.
(비교예 1)
다시마를 분쇄한 후, 분쇄된 다시마 10중량부에 200중량부의 증류수를 가한 다음 30분 교반 후 상등액을 제거하였으며, 상기 과정을 염분이 0%가 될 때까지 반복하였다. 여기에 85% 에탄올 200중량부를 가한 다음, 12시간 교반하여 색소를 제거하였다. 상기 색소가 제거된 다시마를 아세톤으로 세척하고 여과한 다음 건조하여 다시마를 전처리하였다.
상기 전처리된 다시마 3g에 물 60㎖를 가한 후(F-ChCl-EG-0%), 100℃에서 2시간 동안 교반하여 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분리된 상등액에 염화칼슘을 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 교반하여 알긴산 침전물을 제거하였다. 알긴산이 제거된 상등액에 에탄올을 첨가하고 원심분리하여 후코이단을 수득한 후, 이를 60℃에서 건조하여 고순도의 후코이단을 얻었다.
(비교예 2)
공융용매로서 테트라메틸암모늄 클로라이드과 1,2-부탄디올을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 후코이단을 수득하였다.
상기 실시예 및 비교예로부터 제조된 후코이단의 특성을 측정하여 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.
(후코이단의 수율)
수득된 후코이단의 수율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
(염도)
다시마를 분쇄한 후, 분쇄된 다시마 10중량부에 200중량부의 증류수를 가한 다음 30분 교반 후 염도계를 사용하여 염도를 측정하였다.
(pH)
증류수에 수득한 후코이단을 1㎎/㎖의 농도로 용해시킨 후 pH 미터를 사용하여 측정하였다.
(분자량)
후코이단의 분자량은 GFC(Gel filtration chromatography)로 측정하였다. 컬럼은 Agilent 1200 Series HPLC system을 사용하였고, 유속은 1㎖/min이고, 유동상은 0.02% sodium azide 이며, 검량곡선은 풀루란으로부터 얻었다.
(황산기 함량)
후코이단의 황산기 함량은 Dodgson의 barium chloride-gelatin 방법에 의하여 측정하였다. 검량곡선은 sodium sulfate로부터 얻었다.
| 구분 | 실시예 | 비교예 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 1 | 2 | |
| 수율(%) | 1.38 | 0.96 | 0.98 | 0.93 | 0.99 | 0.93 | 0.91 |
| 염도(%) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| pH | 6.47 | 6.75 | 6.81 | 6.86 | 6.69 | 6.83 | 6.61 |
| Mn (×104 g/mol) |
1.6 | 1.8 | 2.3 | 3.1 | 2.1 | 4.9 | 2.8 |
| Mw (×104 g/mol) |
9.3 | 9.7 | 10.2 | 13 | 9.9 | 15 | 10.5 |
| PI | 5.86 | 5.62 | 5.66 | 4.13 | 5.29 | 3.10 | 5.57 |
| 황산기 함량 (%) |
26.18 | 16.31 | 17.89 | 13.91 | 17.05 | 15.99 | 16.07 |
상기 표 1의 결과로부터, 실시예 1 내지 5는 비교예 1 및 2에 비해 높은 수율을 보이고 있으며(0.96~1.38%), 특히 실시예 1은 가장 높은 수율을 나타낸다.
염도는 모두 0% 이어서 다시마의 염분이 완전히 제거됨을 알 수 있으며, pH는 모두 약산성(6.47~6.86)을 띄는데, 이는 식품 품질기준에 부합하므로 본 발명의 후코이단은 식품, 화장품, 의약품 등에 적용 가능함을 알 수 있다.
수득한 후코이단의 수평균분자량은 1.6×104~3.1×104g/mol 이며, 중량평균분자량은 9.3×104~13×104g/mol 이고, PI(polydispersity index; 다분산지수)는 4.13~5.86 이다.
또한 공융용매의 함량이 증가할수록 평균분자량이 낮아지고 PI가 증가함을 확인할 수 있다(실시예 1, 실시예 4, 비교예 1).
아울러 실시예 1 내지 5는 비교예 1 및 2에 비해 높은 황산기 함량을 나타내고 있다.
따라서 본 발명은 공융용매로서 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 사용함으로써, 인체에 무해하고 가격이 저렴하며 높은 안정성을 갖는 후코이단을 높은 수율로 수득할 수 있다.
도 1은 세 가지의 공융용매를 사용하여 수득한 후코이단의 FT-IR 스펙트럼을 나타내고 있다. 세 경우 모두 다당류에서 보이는 피크를 나타내며, 특히 1250~1257cm-1 부근에서 S=O asymmetric stretching 피크를 나타낸다.
도 2는 실시예 1로부터 제조된 후코이단의 세포독성평가를 나타내고 있다.
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)를 이용하여 세포독성평가를 진행하였으며, 후코이단을 0.5, 1, 3, 5㎎/㎖의 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 MTS reduction assay 방법으로 세포에 대한 독성 여부를 분석하였다.
각 농도에서 세포독성 수치는 약물을 처리하지 않은 control과 유사한 값을 나타내고 있으므로, 수득한 후코이단은 HeLa 세포에 대해 독성이 없음을 확인하였다.
Claims (5)
- (a) 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜을 혼합하여 제1 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 상기 제1 혼합물에 물을 첨가한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계;
(c) 다시마를 파쇄한 후 용매를 첨가하고 교반하여 불순물을 제거하는 단계; 및
(d) 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합한 후 가열 추출하여 후코이단을 수득하는 단계를 포함하는 후코이단의 추출방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계는 콜린클로라이드 및 에틸렌글리콜의 몰비가 1:1~3인 것을 특징으로 하는 후코이단의 추출방법.
- 제2항에 있어서,
상기 (b) 단계는 제1 혼합물과 물의 부피비가 30~60:40~70인 것을 특징으로 하는 후코이단의 추출방법.
- 제3항에 있어서,
상기 (d) 단계는 상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마를 혼합하고 80~120℃에서 60~180분 가열 추출한 후 후코이단을 수득하는 것을 특징으로 하는 후코이단의 추출방법.
- 제4항에 있어서,
상기 제2 혼합물 및 상기 불순물이 제거된 다시마의 중량비는 5~30:1인 것을 특징으로 하는 후코이단의 추출방법.
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