KR101863954B1 - 노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도 - Google Patents
노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101863954B1 KR101863954B1 KR1020160148881A KR20160148881A KR101863954B1 KR 101863954 B1 KR101863954 B1 KR 101863954B1 KR 1020160148881 A KR1020160148881 A KR 1020160148881A KR 20160148881 A KR20160148881 A KR 20160148881A KR 101863954 B1 KR101863954 B1 KR 101863954B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- yellow
- yel
- mutant
- seed
- embryo
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
- C07H17/06—Benzopyran radicals
- C07H17/065—Benzo[b]pyrans
- C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체, 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법, 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
Description
노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체, 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법, 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
벼 (Oryza sativa L.)는 아시아를 포함한 전 세계에서 경작되고 있다. 아시아에서 경작된 벼는 두-아종 즉, 인디카 타입(Oryza sativa. indica)과 자포니카 타입(Oryza sativa. japonica)으로 분류될 수 있다.
일반적으로 쌀의 구성성분은 90%가 전분이고 단백질이 7∼9%를 차지하며 약간의 지방이 들어있다. 쌀의 전분은 아밀로스와 아밀로펙틴 두 가지로 나뉜다. 자포니카는 아밀로스 함량이 17∼20%인데 비해 인디카는 아밀로스 함량이 25%나 된다. 예로부터 흑색, 자색, 갈색, 녹색 등의 종피를 가지고 있는 벼들을 음식의 색이나 풍미를 위해 사용해왔다.
이러한 종래 기술에 의하더라도, 노란색 종피를 갖는 종자를 생산하는 돌연변이 벼 식물체는 알려진 바 없다.
일 양상은 돌연변이 벼 식물체를 제공한다.
다른 양상은 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 제공한다.
다른 양상은 상기 산물을 코딩하는 유전자를 제공한다.
다른 양상은 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 단백질의 기능을 갖는 세포를 나타낸다. 상기 감소는 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)" 세포의 상기 단백질의 기능에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 상기 단백질의 기능은 종피색에 관련되는 물질을 합성하는데 관련될 기능일 수 있다. 상기 효소인 경우, 상기 기능은 효소 활성일 수 있다. "단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형"은 모세포 또는 야생형에 비하여 종피색을 더 노란색으로 변하게 하거나, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 또는 그 조합일 수 있다. 또한, 상기 유전적 변형은 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
상기 유전적 변형은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 결실(deletion) 또는 파괴(disruption)에 의하여 그 기능이 불활성화 또는 감소될 수 있다. 유전자의 "결실 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 상기 유전자의 일부 또는 전체의 돌연변이, 또는 프로모터 또는 터미네이터와 같은 상기 유전자의 조절 서열의 일부 또는 전체의 돌연변이로서, 자연적 유전자 산물에 비하여 상기 유전자가 발현되지 않거나 감소된 수준으로 발현되거나, 또는 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는 유전자 산물 (예, 효소)을 발현하도록 하는 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입, 결실 또는 전환을 포함할 수 있다. 상기 유전자의 결실 또는 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 제거 또는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자의 불활성화 또는 파괴는 상동 재조합에 의하여 야기될 수 있으며, 또는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 결실 또는 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 식물세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
일 양상은 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 포함하는 돌연변이 벼 식물체를 제공한다.
상기 조합은 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것 및 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 또는 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것 및 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 및 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것일 수 있다. 상기 노란 색 또는 검은 색은 모세포 또는 야생형에 비하여, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상, 약 200% 이상, 약 500% 이상, 약 1000% 이상, 약 10000% 이상 더 노란 색 또는 검은 색일 수 있다.
상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형, 또는 LOC_OsO2g53140 유전자가 결실 또는 파괴된 것일 수 있다.
상기 식물체에 있어서, LOC_OsO2g53140 유전자가 결실 또는 파괴된 것은 LOC_OsO2g53140 유전자 전체 또는 일부의 결실 또는 파괴를 포함한다. 상기 일부는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 중 246번부터 951번까지의 706 뉴클레오티드 영역일 수 있다. 상기 영역은 5'-UTR 즉 개시코돈으로부터 -19 bp, 개시코돈을 포함한 첫번째 엑손 342bp, 및 첫번째 인트론 345bp를 포함한다.
상기 식물체에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화 또는 파괴시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질에서 1번부터 114번까지의 아미노산 서열에 해당하는 RING-finger 도메인을 코딩하는 영역을 불활성화 또는 파괴시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 LOC_OsO2g53140 유전자인 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 중 246번부터 951번까지의 706 뉴클레오티드 영역의 결실일 수 있다.
상기 식물체에 있어서, 상기 유전적 변형은 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 종자에서 노란색 종피색 및 배 치사에 대하여 열성 표현형질(recessive phenotype)을 보이는 것일 수 있다. 상기 식물체는 한국생물자원센터에 2016년 9월 13일자로 기탁된 기탁번호 KCTC 18500P의 벼 식물체 또는 그로부터 유래된 식물체 또는 그 일부인 것일 수 있다.
상기 식물체는 종자, 미강(rice bran), 배(embryo) 또는 배유(endosperm)일 수 있다. 상기 식물체는 플라보노이드 화합물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 플라보노이드 화합물는 전체 종자, 미강(rice bran), 배 또는 배유에 포함하는 것일 수 있다. 상기 플라보노이드 화합물은 1: luteolin 6,8-di-C-hexoside, 2: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 3: Apigenin 6,8-di-C-hexoside, 4: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 5: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 3), 6: Chrysoeriol 6,8-di-C-hexoside, 7: isoorientin-2''-O-glucoside, 8: luteolin 6-C-glucoside('isoorientin'이라고도 함), 9: Apigenin 6-C-hexosyl-8-C-pentoside, 10: luteolin 8-C-glucoside('orientin'이라고도 함), 11: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 12: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 13: Apigenin 2''-O-glucosyl-8-C-glucoside, 14: Apigenin 8-C-glucoside('vitexin'이라고도 함), 15: Apigenin 6-C-glucoside('isovitexin'이라고도 함), 16: Chrysoeriol 2''-O-glucosyl-6-C-glucoside, 17: Chrysoeriol 6''-O-hexosyl-6-C-hexoside, 18: Chrysoeriol 6-C-glucooside('isoscoparin'이라고도 함), 및 19: Chrysoeriol 8-C-glucoside('scoparin'이라고도 함)의 19개 화합물을 포함할 수 있다. 상기 플라보노이드 화합물은 Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin 2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol 2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, Isoscoparin, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 식물체는 상기 플라보노이드 화합물을 야생형에 비하여 증가된 양으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 증가는 0.5(w/w)% 이상, 1(w/w)% 이상, 5(w/w)% 이상, 10(w/w)% 이상, 50(w/w)% 이상, 100(w/w)% 이상, 200(w/w)% 이상, 500(w/w)% 이상, 1000(w/w)% 이상일 수 있다. 또한, 상기 증가 함량은 야생형 대비 0.5 내지 1500(w/w)%, 1 내지 1500(w/w)%, 5 내지 1500(w/w)%, 10 내지 1500(w/w)%, 50 내지 1500(w/w)%, 100 내지 1500(w/w)%, 200 내지 1500(w/w)%, 500 내지 1500(w/w)%, 1000 내지 1500(w/w)%, 1000 내지 1100(w/w)%, 0.5 내지 1000(w/w)%, 1 내지 800(w/w)%, 5 내지 700(w/w)%, 또는 10 내지 500(w/w)%일 수 있다.
상기 식물체는 야생형 식물체에 화학적 돌연변이를 유발한 후 선발하거나, 돌연변이 yel 유전자를 야생형 식물체에 도입하는 것에 의하여 제조된 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계;를 포함하는, 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기한 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계;를 포함한다. 상기 식물체 및 플라보노이드 화합물에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 분리하는 예를 들면, 상기 돌연변이 벼 식물체 또는 그 부분을 용매와 접촉시켜 플라보노이드 화합물을 상기 용매에 중에 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출 방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 가압추출, 아임계추출, 초임계추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 열수 추출 방법일 수 있다. 열수 추출은 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있다. 상기 부분은 지상부, 또는 지하부일 수 있다. 상기 지상부는 전체 종자, 미강, 배, 배유, 줄기, 잎, 꽃 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지하부는 뿌리일 수 있다.
상기 용매는 물, C1 내지 C12의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C3의 알코올, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 일차 알콜일 수 있다. 상기 C1 내지 C6의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면 물과 메탄올의 혼합물일 수 있다.
상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에 일정 시간 동안 담가 두는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 교반 또는 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 또는 환류 온도까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 70℃ 내지 환류 온도, 80℃ 내지 환류 온도, 또는 환류 온도까지 가열하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도에 따라 달라질 수 있는데 1 시간 내지 2개월, 예를 들면, 1 시간 내지 1개월, 1 시간 내지 15일, 1 시간 내지 10일, 1 시간 내지 5일, 1 시간 내지 3일, 1 시간 내지 2일, 1 시간 내지 1일, 5 시간 내지 1개월, 5 시간 내지 15일, 5 시간 내지 10일, 5 시간 내지 5일, 5 시간 내지 3일, 5 시간 내지 2일, 5 시간 내지 1일, 10 시간 내지 1개월, 10 시간 내지 15일, 10 시간 내지 10일, 10 시간 내지 5일, 10 시간 내지 3일, 또는 10 시간 내지 2일일 수 있다. 상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에서 환류 추출하는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1 배, 2 배, 5 배, 10 배 또는 15배 이상의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1배 내지 15배, 2배 내지 15배, 5배 내지 15배, 10배 내지 15배 또는 약 15배의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 식물체는 건조된 것일 수 있다.
상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 추출은 식물체의 전체 종자, 미강, 배, 또는 배유와 같은 식물체를 용매와 혼합하고 인큐베이션하여 용매 중에 추출하여 추출물을 얻는 단계; 용매 중 추출물을 여과하는 단계; 및 여과된 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 플라보노이드 화합물은 Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin 2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol 2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, Isoscoparin, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 돌연변이 벼 식물체는 전체 종자, 미강, 배, 또는 배유일 수 있다. 상기 돌연변이 벼 식물체는 상기 유전적 변형에 대하여 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 분리하는 단계 전에 이형접합성 돌연변이 벼 식물체를 성장시켜 종자를 생산하는 단계; 및 생산된 종자로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 식물체를 성장시켜 종자를 생산하는 단계는 통상적으로 벼를 생육시키는 것을 포함한다. 상기 생육은 하우스 내 또는 노지 재배일 수 있다.
상기 생산된 종자로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계는 식물체의 색, 모양, 및 크기와 같은 특성에 근거하여 분리하는 것일 수 있다. 상기 단계는 예를 들면, 종자의 종피의 노란색과 배의 검은 색에 근거하여 종자를 분리하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 또한, 동형접합성 종자, 미강, 배, 또는 배유를 분리하는 것일 수 있다. 동형접합성 종자에서 배를 먼저 분리하고, 분리하고 남은 배유를 사용하거나 이 배유를 백미기로 도정할 때 부산물로 생성되는 미강을 사용한다. 상기 방법에 있어서, 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계는 동형접합성 종자, 미강, 배, 배유, 또는 이들의 조합으로부터 분리하는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 제공한다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 양상은 벼 세포에 대하여 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 도입시키는 단계를 포함하 는 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 벼 세포에 대하여 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형을 도입시키는 단계; 또는 LOC_OsO2g53140 유전자를 결실 또는 파괴시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전적 변형을 도입시키는 단계는 알려진 방법 예를 들면, agrobacterium-매개된 공동배양(co-culture) 방법일 수 있다.
상기 방법은 상기 유전적 변형이 도입된 벼 식물체로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성인 것을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 노란색 종피를 갖고 검은색 배를 가진 종자를 분리하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 돌연변이 벼 식물체는 플라보노이드 화합물을 분리하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법에 의하면, 플라보노이드 화합물을 효율적으로 분리할 수 있다.
다른 양상에 따른 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질 및 그를 코딩하는 유전자에 의하면, 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법에 의하면, 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 야생형과 yel 돌연변이 벼 사이의 현미(brown rice)를 비교한 것이다.
도 2는 yel 유전자의 지도(map)-기반 클로닝을 나타낸다.
도 3은 F2 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 YEL-OE 형질전환 식물체와 yel 이형접합성 식물체 사이의 교배로부터 분리된 자손을 나타낸 도면이다.
도 5는 YEL 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 6은 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체로부터 추출된 추출물 중에 존재하는 플라보노이드 화합물을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 yel 유전자의 지도(map)-기반 클로닝을 나타낸다.
도 3은 F2 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 YEL-OE 형질전환 식물체와 yel 이형접합성 식물체 사이의 교배로부터 분리된 자손을 나타낸 도면이다.
도 5는 YEL 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 6은 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체로부터 추출된 추출물 중에 존재하는 플라보노이드 화합물을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 노란색 배 치사 돌연변이(yellow embryo lethal) 벼의 선발 및 플라보노이드 함량 확인
1. 재료 및 방법
달리 언급이 없으면, 이하의 실시예에서 다음의 재료 및 방법을 사용하였다.
(1) 식물 재료
상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼는 서울대학교 식물자원학과의 식물분자육종 실험실로부터 제공된 자포니카 품종인 화청벼 식물체의 미개화된 영에 1M 농도의 N-methyl-N-nitrosourea (MNU) 용액을 25℃, 암 조건에서 45분간 담가 처리하였다. 이후 식물체를 즉시 세척용 물에 넣어 24시간 동안 처리하고 이후 건조시키고 종자의 등숙이 완료된 후 수확하였다. 이렇게 얻어진 종자(M0)를 발아시켜 심고, M2 세대부터 선발하여 돌연변이체가 유도되었다. 상기 식물재료는 M14 계통(M14 line), 75094, 화청 M-6-17N-1-3-2-1-1-1-2-1-1-2-2로부터 사용되었다. 이 돌연변이체는 억제된 발아로 인한 배 치사성(embryo lethality) 때문에 이형접합체(heterozygote)로서 유지되었다. 이렇게 얻어진 노란색 배 치사 돌연변이 유전자를 갖고 있는 이형접합체 돌연변이 벼의 종자는 한국생물자원센터에 2016년 9월 13일자로 기탁번호 KCTC 18500P로 기탁되었다.
(2) 후보 유전자의 서열 분석
후보 유전자의 전장 게놈 DNA 서열은 게놈을 여러 중복되는 세그멘트로 나누어 시퀀싱하였다. 각 세그멘트에 대한 특이적 PCR 프라이머를 화청 및 노란색 배 치사 돌연변이 벼로부터 게놈 DNA를 증폭하기 위하여 사용하였다. TA 클로닝을 위하여 PCR 산물을 PCR purification kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pGEM-T Easy Vector (Promega, USA)에 도입한 후 대장균 균주 DH5α에 형질전환시켰다. 얻어진 서열은 CodonCode Aligner software (version 1.6.3; CodonCode Coporation)에 의하여 비교되었다. 서열 정렬( Sequence alignment)은 Blast network service in National Center for Biotechnology Information (NCBI), Gramene 및 The Rice Annotation Project Database (RAP DB)와 함께 수행되었다.
(3) Gus
어세이
조직화학적 GUS-염색은 Jeon 등 (Plant J. 2000 Jun;22(6):561-70)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
일차적 형질전환체(primary transformant)의 성숙한 꽃, 잎, 종자, 줄기, 뿌리 등을 채취하고 각 조직을 Gus 용액에 처리하여 37℃에서 2일 동안 인큐베이션한 다음, 엽록소를 제거하기 위하여 95% 및 70% (w/v) 에탄올로 연속으로 치환하였다. 그 후, 상기 조직을 절단하는 현미경(dissecting microscope)하에서 검사하고, 그 염색 패턴을 분석하였다.
(4) 벡터 구조체 및 벼 형질전환
과발현 벡터를 생성하기 위하여, PCR-증폭된 야생형(서열번호 3) cDNA를 35S 프로모터 및 nos 터미네이터를 포함한 pMDC32 vector(서열번호 4)의 attR1 및 attR2 사이에 삽입하였다. 그 결과 얻어진 야생형 cDNA 과발현 구조체를 35S::COP1(YEL-OE)로 명명하였다. 프로모터-GUS 어세이를 위하여, COP1의 잠정적 프로모터 영역을 포함하는 게놈 서열(서열번호 5)을 게놈 DNA로부터 PCR에 의하여 증폭하였다. 상기 COP1 프로모터 단편은 바이너리 벡터 pHGWFS7의 attR1과 attR2 사이에 클로닝되었다. 상기 구조체를 갖는 형질도입 식물체(transgenic plants)는 agrobacterium-매개된 공동배양(co-culture) 방법(Hiei 등, Plant Mol Biol 35, 205-218, 1997)을 통하여 자포니카 품종인 야생형 동진 종자를 사용하여 생성되었다.
(5) 물질분석 관련 실험 방법
(5.1) 재료
(1) 식물재료'에서 기재된 노란색 배 치사 돌연변이 벼는 서울대학교 식물 과학과의 작물 분자 육종 실험실에서 20세대 동안 고정하였다. 본 실시예에 사용된 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼와 그 모 품종은 수원에서 소재하는 서울대학교 실험 농장에서 통상적 재배 관행에 따라 성장시켰다. 수확된 쌀알(rice grain)은 공기-건조시키고 수분 함량이 약 13%로 감소되도록 하였다. 시료를 11℃로 유지된 방에서 2개월 동안 저장한 후, 도정하고 갈라지거나(cracked) 명확하게 발색되지 않은 종자(unclearly colored seed)는 손으로 선발하여 제거하였다. 전체 종자(whole grain)는 배와 배유로 나눈 후, 상기 배유로부터 배와 배유의 경계의 일부분을 제거하였다. 각 시료는 밀(mill)(IKA® A11 B, 독일)를 사용하여 갈고 기공 크기 300μm를 통과시킴으로써 채질하고, 이들을 추후 실험에 사용하였다.
(5.2)
UPLC
-DAD-
ESI
-Q-
TOF
-MS 분석을 위한 시료 준비
야생형 즉, 모 품종과 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 전체 종자, 배, 및 배유 부분 500mg을 메틸알콜과 물을 7:3으로 섞은 용매 1ml와 섞어 상온에서 20분간 소니케이션한 후, 15분간 4℃에서 원심분리하고, 0.5mL 상등액을 취하여 추출하였다. 이 과정을 한 번 더 반복하였다. 수집된 상등액을 5mL 유리 바이알에 모으고, 40℃에서 질소가스 하에서 증발시켜 농축시켰다. 이 추출물을 메틸알콜과 물을 1:1의 부피 비로 섞은 용매에 녹여 10 μg/ml의 내부 표준(internal standard) 아카세틴을 포함한 최종 농도가 2mg/mL가 되게 한다. 상기 시료는 UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 분석을 위하여 PVDF 필터(기공크기 0.2 μm)(현대마이크로 사, 한국)를 통하여 여과하였다.
(5.3)
UPLC
-DAD-
ESI
-Q-
TOF
-MS 시스템 및 조건
HR-ESI-MS 스펙트럼은 Waters XEVO G2 Q-TOF MS 상에서 측정되었다. UPLC 분석은 binary pump, degasser, autosampler 및 PDA detector가 구비된 UPLC 장치를 사용하여 BEH C18 column (100 x 2.1 mm, 1.7 μm; Waters, Milford, MA, USA) 상에서 수행되었다.
UV-vis 흡광도 스펙트럼은 UPLC 분석 동안 200 nm 내지 500 nm으로부터 온라인으로 기록되었다. 이동상은 A (0.1% v/v formic acid aqueous solution) 및 B (0.1% v/v formic acid in acetonitrile)로 구성되었다. 구배 용출 조건은 다음과 같다: 0분에서 10% B, 5분에서 11% B, 8분에서 12% B, 12분에서 16% B, 13분에서 40% B, 15분에서 50% B, 18분에서 90% B, 및 21분에서 100%. 칼럼 및 autosampler 온도는 각각 40℃ 및 15℃로 맞추었다. 시료 주입 부피는 1 μl이었다.
MS E 검출을 위하여, 전자스프레이 이온화(electrospray ionization:ESI) 소스는 음이온 모드에서 작동되었고 최적 변수는 다음과 같다: capillary voltage of 3.2 kV; sampling cone voltage of 30 V; extraction cone voltage of 4 V; source temperature of 120℃; desolvation temperature of 350℃; cone gas flow of 50 L /hr; desolvation gas flow of 800 L/hr. 질량 범위는 m/z 50 내지 2000이었다. 아르곤이 충돌 기체로서 사용되었고 질소를 네불라이저 및 탈용매화 기체(desolvation gas)로 사용하였다. 낮은 에너지 함수에 대하여, 6 eV의 충돌 에너지가 적용되었고, 20 내지 40V의 충돌 에너지 랩프가 사용되었다. 질량 정확도를 보증하기 위하여 데이터는 LocksprayTM (leucine-enkephalin at m/z 554.2615 in negative-ion detection mode)를 사용하여 보정하였다. 모든 조작, 데이터 획득 및 처리는 Masslynx 4.1 software를 사용하여 수행되었다.
노란색 돌연변이의 전체 낟알(whole grain)에 대한 19개 플라보노이드의 상대적 정량화가 내부 표준 acacetin을 병렬적으로 사용하여 확립되었다.
(5.4) 노란색 돌연변이체로부터 C-
글리코시딕
플라보노이드의 분리
노란색 돌연변이체 종자의 분말화된 배유 부분(288.4 g)을 실온에서 24 시간 동안 담가 두어 (maceration) 70% 메탄올(1.5L x 3)에 의하여 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 로터리 진공 증발기에서 농축하여 노란색 잔류물(7.0 g)을 얻었다. 상기 잔류물을 물 500 mL에 현탁하고 DCM (500 mLx4)으로 분배하여, DCM (2.0 g), 및 H2O (4.6 g)의 농축된 추출물을 얻었다. 이 플라보노이드-풍부 수성 잔류물을 수성 메탄올의 계단식 구배(15% MeOH -> 100% MeOH -> 100% Acetone)와 함께 Diaion HP-20 column chromatography (4.0 x 30 cm)(Mitsubishi Chemical Industry, 일본)에 적용하였다. 100% MeOH 분획물은 수성 MeOH로 용출된 (10% MeOH -> 100% MeOH), 중간압력 액체 크로마토그래패(Medium-pressure liquid chromatography:MPLC)에 대하여 수행되어 15 개 분획물 (OSAM-1 내지 OSAM0-15)을 얻었다. 상기 MPLC 분리는 Grace 사로부터 구입된 MPLC 시스템을 가진 Reveleris C18 reverse phase catridge 상에서 수행되었다. OSAM-6, OSAM-7, OSAM-8, OSAM-9 및 OSAM-10은 ACN/H2O (containing 0.1% v/v formic acid) (각각 83:17, 84:16, 78:22, 81:19 및 77:23, v/v)로 용출된 YMC Hydrosphere C18 column (250 x 10.0 mm, 5 μm)을 사용한 semi-preparative HPLC에 의하여 더 분리되었다. 상기 HPLC 분리는 Gilson UV/Vis-151 detector (Gilson, 미국)가 구비된 Gilson 321 HPLC system을 사용하여 수행되었다.
하기 화합물을 얻었다: 1 (25.1 mg) (from OSAM-6), 2 (16.7 mg) (from OSAM-7), 3 (43.8 mg) (from OSAM-8), 4 (19.3 mg) (from OSAM-8), 5 (0.8 mg) (from OSAM-9) and 6 (11.1 mg) (from OSAM-10). 상기 분리된 화합물은 1차원 (1D) 1H-NMR, 1D 13C-NMR, 2차원 (2D) NMR(1H-1H COSY, HSQC, HMBC) 분광법, 및 음 이온 모드 전자 스프레이 이온화 질량 분석을 사용하여 확인하였다.
(5.5)
HPLC
-DAD 분석을 위한 시료 준비
3반복으로 HPLC 분석을 위한 노란색 돌연변이체 (YM) 및 야생형(WT)의 전 낟알, 노란색 돌연변이체(YEM) 및 야생형(WEM)의 배 부분, 노란색 돌연변이체(YEN) 및 야생형(WEN)의 배유 부분을 분말화하였다. 각 시료를 (350 mg)를 실온에서 20 분 동안 소니케이션을 사용하여 1.0 mL 70% MeOH로 두 번 추출하였다.
각 추출 단계에 대하여 500ml 상등액을 수집하였다. 수집된 상등액을 40℃에서 질소 기체 하에서 증발에 의하여 농축하였다. 상기 추출물은 MeOH/H2O (1:1, v/v)에 녹여 각각 최종 농도 0.5 mg/mL (YEM), 4 mg/mL (YT) 16 mg/mL (YEN) 및 32 mg/mL (WT, WEM, WEN)가 되게 하고, HPLC-DAD 분석을 위하여 PVDF 필터로 여과하였다. 정량 분석을 위하여, 화합물 1-6을 포함한 혼합된 표준 용액을 준비하였다. 각 표준물은 50% MeOH에 녹였다.
(5.6)
HPLC
분석을 사용한 플라보노이드 함량 결정
HPLC 분석은 autosampler, gradient system 및 diode array detector (DAD)가 구비된 Ultimate® 3000 UHPLC system (Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용하여 XBridge C18 column (250 x4.6 mm, 5 μm; Waters, Milford, MA, USA) 상에서 수행되었다. Chromatogram은 365 nm에서 얻었고 photodiode array 스펙트럼은 190 내지 800 μm에서 기록되었다. 용출액 A는 0.1% formic acid aqueous solution이고 용출액 B는 0.1% formic acid in acetonitrile이다. 다음과 같은 구배 용출 프로토콜을 사용하였다: 0분에서 10% B, 10분에서 15.5% B, 22분에서 15.9% B, 23분에서 60% B, 30분에서 80% B, 및 32분에서 100% B.
유속은 1.0 mL/min이고 칼럼 및 autosampler 온도는 각각 30℃ 및 15℃로 유지되었다. 시료의 주입 부피는 5 μl이었다.
2. 결과
(1)
yel
유전자의 분자
클로닝
노란색 배 치사 돌연변이 벼를 MNU를 이용한 화학적 돌연변이유발(chemical mutagenesis)에 의하여 얻었으며, 이는 쌀알(grain)에서 노란색 종피(yellow pericarp) 및 배 치사(embryo lethality)의 열성 표현형질(recessive phenotype)을 보였다. 그에 따라 yel로 명명하였다. 도 1은 야생형과 yel 돌연변이 벼 사이의 현미(brown rice)를 비교한 것이다. 도 1에서, A는 야생형 즉 화청의 갈색 쌀이고, B는 yel 돌연변이 벼의 갈색 쌀이고, C는 야생형 종자의 배이고, D는 yel 돌연변이 벼 종자의 배이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, yel 돌연변이 벼의 종자는 야생형에 비교하여 노란색 종피색과 검은색 배를 나타내었다.
Yel 돌연변이 벼와 인디카 타입 벼인 밀양 23호 사이의 교배로부터 파생된 집단(population)을 사용하여 yel 좌(locus)를 세밀하게 지도(mapping)를 작성하였다. yel 유전자는 AP004058의 BAC 클론으로부터 기원되고 물리적 거리가 55kb인, 두 인접하는 마커(flanking marker), S02k-1과 S02k 사이의 2번 염색체의 긴 팔(long arm) 상에 위치하였다. 총 7개 후보 유전자가 이 영역 중에 위치하였다. 표 1은 이들 7개 후보 유전자를 나타낸다. yel 유전자를 확인하기 위하여, 7개 후보 유전자를 시퀀싱하였고 yel 돌연변이 벼와 그의 야생형, 화청 사이의 서열을 비교하여 변이를 확인하였다. 서열 분석 결과, 706-bp 결실이 Loc_Os02g53140 상의 5'-UTR로부터 개시 코돈을 포함한 제1 엑손과 제1 인트론에서 발견되었다.
번호 | 좌 이름 | 유전자 기술 |
1 | Loc_Os02g53130 | 니트레이트 레덕타제 |
2 | Loc_Os02g53140 | COP1 (constitutive photomorphogenesis 1) |
3 | Loc_Os02g53150 | 발현된 단백질 |
4 | Loc_Os02g53160 | 티로신 포스파타제 패밀리 단백질 |
5 | Loc_Os02g53169 | 발현된 단백질 |
6 | Loc_Os02g53180 | 1-아미노시클로프로판-1-카르복실레이트 옥시다제 단백질 |
7 | Loc_Os02g53200 | 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제 전구체 |
도 2는 yel 유전자의 지도(map)-기반 클로닝을 나타낸다. 도 2에서, A는 STS 마커들에 의한 yel 좌의 유전적 지도를 작성한 것이고, B는 추가적인 STS 마커들에 의한 상기 yel 좌를 세밀하게 지도를 작성한 것이다. 상기 yel 좌는 S02K-1과 S02K 사이의 약 55kb 게놈 DNA 영역에 위치하고 있다. C는 세밀한 지도 작성에 의하여 확인된 상기 55kb 게놈 DNA 영역 중 7개 후보 유전자를 나타낸 것이다. D는 게놈 서열에서 상기 yel 유전자 구조를 나타낸다. 13개 엑손과 11개 인트론이 각각 검은색 사각형과 검색 선을 사용하여 표시되어 있다. 상기 706-bp 결실이 5'-UTR로부터 전체 제1 엑손을 포함한 제1 인트론까지에서 확인되었다.
상기 706-bp 결실이 돌연변이 표현형과 연관되어 있는지를 결정하기 위하여, 공동-우성(co-dominant) 마커를 사용하여 F2 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행하였다. 도 3은 F2 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 상기 706-bp 결실 다형을 공동-우성 마커를 사용한 공동-분리에 대하여 시험하였다. 도 3에서, Y는 yel 돌연변이체를 나타내고, W는 야생형 표현형질을 타나내고, M은 돌연변이 표현형질을 나타내고, H는 F2 자손들에서 이형접합성 표현형질을 나타낸다. 이 결과는 Loc_Os02g53140 유전자에서 확인된 상기 706-bp 결실은 노란색 종피색 및 배 치사 표현형질에 대한 원인이라는 것을 나타낸다. YEL은 RING-finger, coiled-coil, 및 WD40 도메인을 포함한 단백질을 코딩한다. 상기 706-bp 결실의 결과로서 모든 RING-핑거 도메인은 YEL 유전자에서 결실되었다.
(2) 형질전환 식물에서
yel
유전자에 의하여 주어진 노란색
종피색
표현형질의 입증
야생형 YEL(35S::YEL (이하 'YEL-OE'라고도 함)를 과발현하는 형질전환 동진 식물체(YEL)를 제작한 후 돌연변이형 종자의 치사성으로 인하여 돌연변이를 분리하기 위하여 유지되고 있는 이형접합성 식물체(heterozygous plant)와 교배하였다. 본 발명자들은 F1 식물체 중에서 YEL-OE 삽입된 식물체를 선발하였으며, 이후 식물체에서 F2 종자를 확보하였고, F2 종자의 분리를 관찰하였다.
도 4는 YEL-OE 형질전환 식물체와 yel 이형접합성 식물체 사이의 교배로부터 분리된 자손을 나타낸 도면이다. 도 4에서, A는 야생형 종자이고, B는 yel 동형접합성 종자(돌연변이형)이고, C는 YEL-OE에 의하여 회복된 종자를 나타낸다.
상기 모든 흰색 치사성 종자가 YEL-OE 및 yel 동형접합성 대립인자를 동시에 가지고 있는지를 확인하기 위하여, F2 종자의 유전형을 분석하였다(genotype). 그 결과는 상기 모든 흰색 치사성 종자가 YEL-OE 삽입체와 동시에 yel 대립인자를 가졌다. 노란색 치사성 종자, 흰색 치사성 종자, 및 정상 종자의 분리 비율은 카이-검정 테스트(chi-square test)에 의하여 예측된 비율 1:3:13에 부합되었다. 표 2는 YEL-OE 삽입된 식물체 중 F2 종자의 분리 비율을 나타낸다. 상기 노란색 종피색 표현형질은 쌀 yel 유전자의 기능 상실(loss of function)의 결과일 수 있다는 것을 나타낸다.
이삭 | 노란색 치사성 | 흰색 치사성 | 정상 | 합계 |
1 | 8 | 22 | 60 | 90 |
2 | 5 | 16 | 59 | 80 |
3 | 8 | 15 | 55 | 78 |
4 | 4 | 3 | 44 | 51 |
5 | 4 | 13 | 44 | 61 |
6 | 4 | 6 | 33 | 43 |
7 | 3 | 7 | 35 | 45 |
8 | 3 | 13 | 64 | 80 |
합계 | 39 | 95 | 394 | 528 |
X2-1.26, p-0.53
(3) 벼 식물체의 다른 기관 및 조직에서
yel
유전자의 발현 패턴
벼 발생에서 상기 yel 유전자의 역할을 더 잘 이해하기 위하여, 다른 기관 및 조직에서 YEL 유전자의 발현 패턴을 YEL 프로모터의 조절 하의 베타-글루쿠로니다제 리포터 유전자를 사용하여 시험하였다. GUS 염색은 화분, 배, 종피, 및 절(node)에서 주로 검출되었다 (도 5의 C, E, G 및 H 참조). 상대적으로 강한 GUS 염색 신호가 분화영역(differentiation zone) 및 줄기의 분열영역(meristematic region)에서 검출된 반면 GUS 발현은 영(spikelet), 잎, 암술(stigma) 및 배유(endosperm)에서는 검출되지 않았다 (도 5의 A, C 및 D 참조).
도 5는 YEL 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다. 도 5에서, A 내지 H는 YEL 프로모터::GUS 형질전환된 식물체에서 검출된 GUS 활성을 나타낸 것으로서, A는 영, B는 꽃 기관(floral organ), C는 화분, D는 잎, E는 절, F는 종자, G는 배, H는 종피를 나타낸다.
(4) 종자, 배 및
배유
중 플라보노이드 화합물의 분석
"1. 재료 및 방법"에서, (5) 물질분석 관련 실험 방법의 "(5.1) 내지 (5.6)"에 기재된 방법에 따라 추출물 중에 존재하는 물질의 분석 결과는 다음과 같다.
도 6은 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체로부터 추출된 추출물 중에 존재하는 화합물을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체에는 19개 화합물이 존재하는 것으로 확인되었다. 도 6에서 각 피크에 해당하는 화합물을 다음과 같다. 도 6에서, y축은 %를 나타낸다. 상기 19개 화합물이 노란색 배 치사 돌연변이 벼 종자에서 검출되었다.
1: luteolin 6,8-di-C-hexoside, 2: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 3: Apigenin 6,8-di-C-hexoside, 4: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 5: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 3), 6: Chrysoeriol 6,8-di-C-hexoside, 7: isoorientin-2''-O-glucoside, 8: luteolin 6-C-glucoside('isoorientin'이라고도 함), 9: Apigenin 6-C-hexosyl-8-C-pentoside, 10: luteolin 8-C-glucoside('orientin'이라고도 함), 11: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 12: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 13: Apigenin 2''-O-glucosyl-8-C-glucoside, 14: Apigenin 8-C-glucoside('vitexin'이라고도 함), 15: Apigenin 6-C-glucoside('isovitexin'이라고도 함), 16: Chrysoeriol 2''-O-glucosyl-6-C-glucoside, 17: Chrysoeriol 6''-O-hexosyl-6-C-hexoside, 18: Chrysoeriol 6-C-glucoside('isoscoparin'이라고도 함), 및 19: Chrysoeriol 8-C-glucoside('scoparin'이라고도 함)
이들 19개 화합물은 UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 분석으로부터 얻어진 데이터에 의하여 확인되고 잠정적으로 규명되었다. 상가 확인은 그 m/z 비율, 체류 시간(tR), UV 스펙트럼, 및 단편화 패턴을 표준 물질과 비교하여 확증되었다. 분리하거나, 상업적으로 구입할 수 있는 표준품이 없는 경우, 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 전체 종자의 TIC의 피크를, 과학 문헌 또는 데이터베이스(Massbank, KNApSAcK, MoTo DB, METLIN, HMDB and ReSpect)로부터 얻어진 병렬 질량분석 데이터(tandem mass spectral data)와 비교하였다.
표 3은 HPLC-DAD를 이용하여 얻은 종자 전체, 배, 및 배유에서 추출된 추출물 중에 존재하는 주요 6개 플라보노이드 화합물의 정량 결과를 나타낸다. 표 3에서, WM은 야생형 종자 전체, WEM은 야생형 배, WEN은 야생형 배유, YM은 yel 돌연변이체 종자 전체, YEM은 yel 돌연변이체 배, 및 YEN은 yel 돌연변이체 배유, nd는 검출되지 않음(not detectable)을 각각 나타낸다.
위치 | 화합물((w/w)%) | |||||
Isoorientin-2"-O-glucoside | Isoorientin | Apigenin 2"-O-glucosyl-8-C-glucoside | isovitexin | Chrysoeriol 2"-O-glucosyl-6-C-glucoside | Isoscoparin | |
WM | nd | nd | nd | nd | nd | nd |
WEM | nd | nd | Nd | nd | nd | nd |
WEN | nd | nd | nd | nd | nd | nd |
YM | 2.75±0.12 | 6.25±0.24 | 1.97±0.10 | 1.32±0.08 | 2.24±0.12 | 1.37±0.07 |
YEM | 12.51±0.69 | 50.05±1.74 | 4.11±0.21 | 3.63±0.18 | 8.47±0.39 | 4.91±0.22 |
YEN | 1.25±0.14 | 2.39±0.25 | 1.82±0.19 | 1.33±0.13 | 1.86±0.20 | 1.69±0.18 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 6개 화합물은 야생형 대비 yel 돌연변이체의 전체 종자, 배 또는 배유에서 현저하게 높은 함량을 보였다. 이들 중 6개 화합물 즉, Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin 2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol 2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, 및 Isoscoparin의 함량이 특히 높았다.
상기한 바와 같이, yel 돌연변이체는 전체 종자, 배 또는 배유에 야생형에 대하여 19개 페놀성 화합물 특히 6개 화합물 즉, Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin 2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol 2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, 및 Isoscoparin의 함량이 높아서, 이들 화합물을 분리하는데 사용할 수 있다.
<110> Seoul National University Industry Foundation
<120> Mutant rice plant capable of producing seed having yellow
pericarp and use thereof
<130> PN115572KR
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 625
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 1
Met Gly Asp Ser Thr Val Ala Gly Ala Leu Val Pro Ser Val Pro Lys
1 5 10 15
Gln Glu Gln Ala Pro Ser Gly Asp Ala Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val
20 25 30
Ala Gly Glu Gly Glu Glu Asp Ala Gly Ala Arg Ala Ser Ala Gly Gly
35 40 45
Asn Gly Glu Ala Ala Ala Asp Arg Asp Leu Leu Cys Pro Ile Cys Met
50 55 60
Ala Val Ile Lys Asp Ala Phe Leu Thr Ala Cys Gly His Ser Phe Cys
65 70 75 80
Tyr Met Cys Ile Val Thr His Leu Ser His Lys Ser Asp Cys Pro Cys
85 90 95
Cys Gly Asn Tyr Leu Thr Lys Ala Gln Leu Tyr Pro Asn Phe Leu Leu
100 105 110
Asp Lys Val Leu Lys Lys Met Ser Ala Arg Gln Ile Ala Lys Thr Ala
115 120 125
Ser Pro Ile Asp Gln Phe Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Gly Asn Asp Met
130 135 140
Ala Val Lys Glu Leu Asp Ser Leu Met Thr Leu Ile Ala Glu Lys Lys
145 150 155 160
Arg His Met Glu Gln Gln Glu Ser Glu Thr Asn Met Gln Ile Leu Leu
165 170 175
Val Phe Leu His Cys Leu Arg Lys Gln Lys Leu Glu Glu Leu Asn Glu
180 185 190
Ile Gln Thr Asp Leu Gln Tyr Ile Lys Glu Asp Ile Ser Ala Val Glu
195 200 205
Arg His Arg Leu Glu Leu Tyr Arg Thr Lys Glu Arg Tyr Ser Met Lys
210 215 220
Leu Arg Met Leu Leu Asp Glu Pro Pro Ser Ala Pro Ile Gln Ser Gly
225 230 235 240
Asn Val Ile Ala Arg Lys Arg Arg Val Gln Ala Gln Phe Asn Glu Leu
245 250 255
Gln Glu Tyr Tyr Leu Gln Arg Arg Arg Thr Gly Ala Gln Ser Arg Arg
260 265 270
Leu Glu Glu Arg Asp Ile Val Thr Ile Asn Lys Glu Gly Tyr His Ala
275 280 285
Gly Leu Glu Asp Phe Gln Ser Val Leu Thr Thr Phe Thr Arg Tyr Ser
290 295 300
Arg Leu Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg His Gly Asp Leu Phe His Ser
305 310 315 320
Ala Asn Ile Val Ser Ser Ile Glu Phe Asp Arg Asp Asp Glu Leu Phe
325 330 335
Ala Thr Ala Gly Val Ser Lys Arg Ile Lys Val Phe Glu Phe Ser Thr
340 345 350
Val Val Asn Glu Pro Ser Asp Val His Cys Pro Val Val Glu Met Ala
355 360 365
Thr Arg Ser Lys Leu Ser Cys Leu Ser Trp Asn Lys Tyr Ser Lys Asn
370 375 380
Val Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Glu Gly Ile Val Thr Val Trp Asp Val
385 390 395 400
Gln Thr Arg Gln Ser Val Met Glu Tyr Glu Glu His Glu Lys Arg Ala
405 410 415
Trp Ser Val Asp Phe Ser Arg Thr Glu Pro Ser Met Leu Val Ser Gly
420 425 430
Ser Asp Asp Cys Lys Val Lys Val Trp Cys Thr Lys Gln Glu Ala Ser
435 440 445
Ala Ile Asn Ile Asp Met Lys Ala Asn Ile Cys Ser Val Lys Tyr Asn
450 455 460
Pro Gly Ser Ser His Tyr Val Ala Val Gly Ser Ala Asp His His Ile
465 470 475 480
His Tyr Phe Asp Leu Arg Asn Pro Ser Ala Pro Val His Val Phe Gly
485 490 495
Gly His Lys Lys Ala Val Ser Tyr Val Lys Phe Leu Ser Thr Asn Glu
500 505 510
Leu Ala Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Leu Arg Leu Trp Asp Val Lys
515 520 525
Glu Asn Cys Pro Val Arg Thr Phe Arg Gly His Lys Asn Glu Lys Asn
530 535 540
Phe Val Gly Leu Ser Val Asn Asn Glu Tyr Ile Ala Cys Gly Ser Glu
545 550 555 560
Thr Asn Glu Val Phe Val Tyr His Lys Ala Ile Ser Lys Pro Ala Ala
565 570 575
Asn His Arg Phe Val Ser Ser Asp Leu Asp Asp Ala Asp Asp Asp Pro
580 585 590
Gly Ser Tyr Phe Ile Ser Ala Val Cys Trp Lys Ser Asp Ser Pro Thr
595 600 605
Met Leu Thr Ala Asn Ser Gln Gly Thr Ile Lys Val Leu Val Leu Ala
610 615 620
Pro
625
<210> 2
<211> 5547
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Oryza sativa
<400> 2
acgcacattt gcccgcagcg ccgcggcgcg cgaggctacc ccgaccccga cgtggtctcc 60
tcccacccat acacccttcc gcttccacgc ccacacacag aacccaattc ccctccctcc 120
tcctccaccc gcccctccct cccacacaca ccacaccacc accaccacca cccacccctc 180
gtatgcaatt attcacgccc agtcgccgcc tccaccgccg ccgcctgctc gactcaccac 240
cgcagggcgg cctcctcctg ccgcatgggt gactcgacgg tggccggcgc gctggtgcca 300
tcggtgccga agcaggagca ggcgccgtcg ggggacgcgt ccacggcggc gttggcggtg 360
gcgggggagg gggaggagga tgcgggggcg cgcgcctccg cggggggcaa cggggaggcc 420
gcggccgaca gggacctcct ctgcccgatc tgcatggcgg tcatcaagga cgccttcctc 480
accgcctgcg gccacagctt ctgctacatg tgcatcgtca cgcatctcag ccacaagagc 540
gactgcccct gctgcggcaa ctacctcacc aaggcgcagc tctaccccaa cttcctcctc 600
gacaaggttt gcttgctcgt tctgcttaca cagccgagat ggataatgga ttggccgtgg 660
cttccatatt ccgccgatcg attgggaatt ttggatgcct atcctaattt caaacgcagg 720
gctttgtaat tgaaatgtca ctgccccgca aaaaaaaaaa attgaaatgt cactgaatgt 780
acctttggat gtggcttggg ataggtatcc ggtataacca attttaacaa atgtagcaac 840
tattcaacag tatgcctttc gattcgtttg tagcaactat tcaacagtat tcagcgcttg 900
agctgcgatt tattgtacta ctgtttgtgg tagcttctga agtagtagca ggtgttctga 960
ttggatagct cagttttatt tgacttgcac ggtacattac agtttgttgt taatgtaagt 1020
tttgtttaga atcaccagca gtggacagta ttagttctat gtctgctctg gttatcagta 1080
cctattatat aatttgttca tcactagagt tcttctctag ttctgttaaa acttaaaaca 1140
agctgtaatt actggttact tgatactggg attgtataaa tgtatctcta agcatgttta 1200
tcacatttat gtctgcatag gtcttgaaga aaatgtcagc tcgccaaatt gcgaagacag 1260
catcaccgat agaccaattt cgatatgcac tgcaacaggt cagtcacttc acatgtttta 1320
cttttgaaaa tgtctacttt caatagctcc ttaaacatag tggtatgttc ctaaatggtt 1380
ttatgtactg tgaaaatttt gcttccgtac cttagctgtg cttgtgatct tcagttcaga 1440
actaagtagt acagagtagt aattaagttc tacactgaac atgcttatct cttgcatcaa 1500
ttgtagaatc taagctactg tgaccgatat caaagtatct tttgttcctt cgctcttaca 1560
gccacatgat ctctatcgtc ctcttaactg ttacaaggat tgtccatatg ataaaccaag 1620
tataccacag aagatagatt tgcactacct tgctgacttt atatctgttt caaaattcaa 1680
acataaaact gacgttctct aaataagtaa tagatgaatg atgaccaaac actatcatat 1740
gttttagttt aattcttctt tctttttcta gggaaacgat atggcggtta aagaactaga 1800
tagtcttatg actttgatcg cggagaagaa gcggcatatg gaacagcaag agtcagaaac 1860
aaatatgcaa atattgctgg tcttcttgca ttgcctcaga aagcaaaagt tggaagagct 1920
gaatgaggtt tgtctatatg tatttttcag tatgcaggtt ttttttcttg ctacctacaa 1980
caataaataa tcttttactg atgtctattg ttgttaatca tgttaacctc ttttttacac 2040
agattcaaac tgacctacag tacatcaaag aagatataag tgctgtggag agacataggt 2100
tagaattata tcgaacaaaa gaaaggtact caatgaagct ccgcatgctt ttggatgaac 2160
ctgctgcatc aaagatgtgg ccctcaccta tggataaacc tagtggtctc tttcctccca 2220
actctcgggg accacttagt acatcaaatc cagggggttt acagaataag aagcttgact 2280
tgaaaggtca aattagtcat caaggatttc aaaggagaga tgttctcact tgctcggatc 2340
ctcctagtgc ccctattcaa tcaggcaacg ttattgctcg gaagaggcga gttcaagctc 2400
aggtttgttt ctcccattgc gcgcttgata gtttggtact atcatattgc aagcatgtag 2460
acagcttaga ttaggaactt atatgtttat tttgttttga tgtaagatga aatgctaatg 2520
tgctatgggg catattgcag tttaacgagc ttcaagaata ctatcttcaa agacggcgta 2580
ccggagcaca atcacgtagg ctggaggaaa gagacatagt aacaataaat aaagaaggtt 2640
atcatgcagg acttgaggat ttccagtctg tgctaacaac attcacacga tataggtccg 2700
ctgattattt gtccttttta gcacattatg atcatggtag tggttatgcc tattcatttg 2760
gcttatcatt cttttgttct ctgtcattta tgcttcagtc gcttgcgtgt aattgcggag 2820
ctaagacatg gagatctgtt tcactctgca aatatcgtat caaggttagt gcttttacaa 2880
aatatgtgcc ttatttcatg tgcatcaaca tgctattggc aatgtggatg ttgtcatagc 2940
tgaatcctca agccagcagt gagctgagga gaggttttgg ttggaggggg gatggtctat 3000
tgctcctatg agtcaaactt caactatgtt caattagcaa acaaatccac taatcttgaa 3060
tgctgatgtt tatcatgtat tataaggaac aaaatatgac tataagtttg tgcctgtttt 3120
tttggtgcat aattttcatt tccatgtcta tctgtaatct catatgtttt tcagtcgcct 3180
accttacatg agaataggga atcacattga tatttcttaa atgcagtatc gaatttgacc 3240
gtgatgatga gctatttgct actgctggag tctcaaagcg catcaaagtc ttcgagtttt 3300
ctacagtaag ttttttttca ggaatcttat gttggccata gctatatgcc tgtatagtat 3360
ttgaaaatac tcaaatttgg cctatcttat gtcgtaggtt gttaatgaac catcagatgt 3420
gcattgtcca gttgttgaaa tggctactag atctaaactc agctgcctta gctggaacaa 3480
gtactcaaaa aatgttatag caagcagcga ctatgagggt atagtaactg tttgggatgt 3540
ccaaacccgc caggtatttc ttgctctgtt ccacagttca ttttgcacac ttgtgttatt 3600
ttctgaactt ggattcatga tatttatgta ttcaatcttc tttagagtgt gatggagtat 3660
gaagaacatg aaaagagagc atggagtgtt gatttttctc gaacagaacc ctcgatgcta 3720
gtatctggga gtgatgattg caaggtattt gcaaatttca atggtacaac tacttttgtt 3780
attcccgaaa gcaagaaaac tttgcgtagt tctcaaaata cagtaaaaca taacttggat 3840
atatcgcatg ttatgcaaca tactaggatt ttattttatt tatcagtttt tcatgtccct 3900
ttttctataa tggtgcattt ttctacctag gctatcccaa cctcattgaa tgcatagatg 3960
gaagtatctg tattgcagta taccttatgg aacctactgc tgtttgtgct aggtcaaagt 4020
gtggtgcaca aagcaagaag caagtgccat caatattgat atgaaggcca atatttgctc 4080
tgtcaaatat aatcctgggt cgagccacta tgttgcagta tgttcctttg attttcttgg 4140
ctcatatcaa atataagttt ttttttcctt accagatgtt acattattgc aggtgggttc 4200
tgctgatcac catattcatt attttgattt gcgaaatcca agtgcgcctg tccatgtttt 4260
tggtgggcac aagaaagctg tttcttatgt gaagttcctg tccaccaatg agcttgcgtc 4320
tgcatcaact gatagcacat tacggttatg ggatgtcaaa gaaaattgcc ctgtatgtgt 4380
cattgagatt tttcttgcac tgcaattatg aaattatgtt tttgcctttt aagcagctat 4440
gacttattag taaaaagtga tgttttagga tatactctat ttcatatcga taaaaattgg 4500
agctatagtg tttctttatt tcctgggaaa aaactatttg agaagcttcg cttttttttc 4560
gaagaattct ggtccttgaa aaacctttgg ttaggtccga aattcttgga taagcatttg 4620
ttttcacctt tgtttctttt ttagctcatc tattagtctg gcttggttta gtagttacgt 4680
catgctaggc ttctcagaaa acagattgtt gaccttttgt ttaaaatggt tacctttttc 4740
aggtaaggac attcagaggg cacaagaatg aaaagaactt tgttgggctg tctgtaaata 4800
acgagtacat tgcctgcggg agtgaaacga atgaggtttt tgtttaccac aaggtaattg 4860
caagcttatt gcctgctctt gtttccgtat ctgtgattca gcattatgtg ccatgcttaa 4920
ctgtacaggt tggtctcctg tggcaccata taccattcta acttcaagta actctgtacc 4980
aattgcaggc tatctcaaaa cctgctgcca accacagatt tgtatcatct gatctcgatg 5040
atgcagatga tgatcctggc tcttatttta ttagcgcagt ctgctggaag agcgatagcc 5100
ctaccatgtt aactgctaac agtcagggca ccattaaagt tcttgtactt gctccttgat 5160
gaaatcagtg gttttcatga gatccctaga tagcttgtat atttgatgta tacagttgtt 5220
tccttttcgt gccattatac cccaaatggg agtggaggta ttactgatct ccaacatagg 5280
gcgcaaagtt ttgaaggtaa tcagctgaca tagggtttcg agggctcgaa atgtgcatag 5340
tccagaattc tcatgtatag gtttaaagca gtcaagtaat tgattataca tatgtaacgt 5400
gagaattgag aaatgaacat caaataagct tgtttggttg catatattgg attggatttt 5460
gggaactggg aagacaagct gtactgggct gatttcagca acacaagcca gtttgtcaca 5520
catctgctac ctaacagaaa tagttaa 5547
<210> 3
<211> 2400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amplified wild type yel gene
<400> 3
gcaattattc acgcccagtc gccgcctcca ccgccgccgc ctgctcgact caccaccgca 60
gggcggcctc ctcctgccgc atgggtgact cgacggtggc cggcgcgctg gtgccatcgg 120
tgccgaagca ggagcaggcg ccgtcggggg acgcgtccac ggcggcgttg gcggtggcgg 180
gggaggggga ggaggatgcg ggggcgcgcg cctccgcggg gggcaacggg gaggccgcgg 240
ccgacaggga cctcctctgc ccgatctgca tggcggtcat caaggacgcc ttcctcaccg 300
cctgcggcca cagcttctgc tacatgtgca tcgtcacgca tctcagccac aagagcgact 360
gcccctgctg cggcaactac ctcaccaagg cgcagctcta ccccaacttc ctcctcgaca 420
aggtcttgaa gaaaatgtca gctcgccaaa ttgcgaagac agcatcaccg atagaccaat 480
ttcgatatgc actgcaacag ggaaacgata tggcggttaa agaactagat agtcttatga 540
ctttgatcgc ggagaagaag cggcatatgg aacagcaaga gtcagaaaca aatatgcaaa 600
tattgctggt cttcttgcat tgcctcagaa agcaaaagtt ggaagagctg aatgagattc 660
aaactgacct acagtacatc aaagaagata taagtgctgt ggagagacat aggttagaat 720
tatatcgaac aaaagaaagg tactcaatga agctccgcat gcttttggat gaacctgctg 780
catcaaagat gtggccctca cctatggata aacctagtgg tctctttcct cccaactctc 840
ggggaccact tagtacatca aatccagggg gtttacagaa taagaagctt gacttgaaag 900
gtcaaattag tcatcaagga tttcaaagga gagatgttct cacttgctcg gatcctccta 960
gtgcccctat tcaatcaggc aacgttattg ctcggaagag gcgagttcaa gctcagttta 1020
acgagcttca agaatactat cttcaaagac ggcgtaccgg agcacaatca cgtaggctgg 1080
aggaaagaga catagtaaca ataaataaag aaggttatca tgcaggactt gaggatttcc 1140
agtctgtgct aacaacattc acacgatata gtcgcttgcg tgtaattgcg gagctaagac 1200
atggagatct gtttcactct gcaaatatcg tatcaagtat cgaatttgac cgtgatgatg 1260
agctatttgc tactgctgga gtctcaaagc gcatcaaagt cttcgagttt tctacagttg 1320
ttaatgaacc atcagatgtg cattgtccag ttgttgaaat ggctactaga tctaaactca 1380
gctgccttag ctggaacaag tactcaaaaa atgttatagc aagcagcgac tatgagggta 1440
tagtaactgt ttgggatgtc caaacccgcc agagtgtgat ggagtatgaa gaacatgaaa 1500
agagagcatg gagtgttgat ttttctcgaa cagaaccctc gatgctagta tctgggagtg 1560
atgattgcaa ggtcaaagtg tggtgcacaa agcaagaagc aagtgccatc aatattgata 1620
tgaaggccaa tatttgctct gtcaaatata atcctgggtc gagccactat gttgcagtgg 1680
gttctgctga tcaccatatt cattattttg atttgcgaaa tccaagtgcg cctgtccatg 1740
tttttggtgg gcacaagaaa gctgtttctt atgtgaagtt cctgtccacc aatgagcttg 1800
cgtctgcatc aactgatagc acattacggt tatgggatgt caaagaaaat tgccctgtaa 1860
ggacattcag agggcacaag aatgaaaaga actttgttgg gctgtctgta aataacgagt 1920
acattgcctg cgggagtgaa acgaatgagg tttttgttta ccacaaggct atctcaaaac 1980
ctgctgccaa ccacagattt gtatcatctg atctcgatga tgcagatgat gatcctggct 2040
cttattttat tagcgcagtc tgctggaaga gcgatagccc taccatgtta actgctaaca 2100
gtcagggcac cattaaagtt cttgtacttg ctccttgatg aaatcagtgg ttttcatgag 2160
atccctagat agcttgtata tttgatgtat acagttgttt ccttttcgtg ccattatacc 2220
ccaaatggga gtggaggtat tactgatctc caacataggg cgcaaagttt tgaaggtaat 2280
cagctgacat agggtttcga gggctcgaaa tgtgcatagt ccagaattct catgtatagg 2340
tttaaagcag tcaagtaatt gattatacat atgtaacgtg agaattgaga aatgaacatc 2400
2400
<210> 4
<211> 11752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PMDC32 vector
<400> 4
aattcagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt 60
tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca 120
taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt 180
atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa 240
tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctcc accgcggtgg gcggccgctc tagaactagt 300
taattaagga attatcgaac cactttgtac aagaaagctg aacgagaaac gtaaaatgat 360
ataaatatca atatattaaa ttagattttg cataaaaaac agactacata atactgtaaa 420
acacaacata tccagtcact atggtcgacc tgcagactgg ctgtgtataa gggagcctga 480
catttatatt ccccagaaca tcaggttaat ggcgtttttg atgtcatttt cgcggtggct 540
gagatcagcc acttcttccc cgataacgga gaccggcaca ctggccatat cggtggtcat 600
catgcgccag ctttcatccc cgatatgcac caccgggtaa agttcacggg agactttatc 660
tgacagcaga cgtgcactgg ccagggggat caccatccgt cgcccgggcg tgtcaataat 720
atcactctgt acatccacaa acagacgata acggctctct cttttatagg tgtaaacctt 780
aaactgcatt tcaccagtcc ctgttctcgt cagcaaaaga gccgttcatt tcaataaacc 840
gggcgacctc agccatccct tcctgatttt ccgctttcca gcgttcggca cgcagacgac 900
gggcttcatt ctgcatggtt gtgcttacca gaccggagat attgacatca tatatgcctt 960
gagcaactga tagctgtcgc tgtcaactgt cactgtaata cgctgcttca tagcacacct 1020
ctttttgaca tacttcgggt atacatatca gtatatattc ttataccgca aaaatcagcg 1080
cgcaaatacg catactgtta tctggctttt agtaagccgg atcctctaga ttacgccccg 1140
ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 1200
tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 1260
taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 1320
tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 1380
cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 1440
agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 1500
tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 1560
attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 1620
ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 1680
acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 1740
tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 1800
ttagctcctg aaaatctcgc cggatcctaa ctcaaaatcc acacattata cgagccggaa 1860
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gcggccgcca tagtgactgg atatgttgtg 1920
ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 1980
tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tgtacaaact tgtttgatag cttggcgcgc 2040
ctcgaggggg ggcccggtac ccggggatcc tctagagtcg aggtcctctc caaatgaaat 2100
gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt 2160
acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct 2220
ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca 2280
tcttcaacga tggcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt 2340
tccactatct tcacaataaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg 2400
gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatt gccctttggt cttctgagac tgtatctttg 2460
atatttttgg agtagacaag tgtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc 2520
tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 2580
tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga 2640
tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct 2700
gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc 2760
ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagtgt gtcgtgctcc 2820
accatgttga cctgcaggca cgccaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 2880
ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 2940
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 3000
tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 3060
actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 3120
gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca 3180
tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat 3240
agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag 3300
tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt 3360
tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag 3420
agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc 3480
aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc 3540
ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac 3600
gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt 3660
gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac 3720
accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag 3780
cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg 3840
aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc 3900
gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc 3960
ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt 4020
gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc 4080
caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg 4140
aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct 4200
caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc 4260
cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg 4320
agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa 4380
tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa 4440
gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt 4500
agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc 4560
gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg 4620
gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat 4680
caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac 4740
cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc 4800
ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc 4860
gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc 4920
aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg 4980
cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa 5040
gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc 5100
aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag 5160
ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt 5220
accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat 5280
gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac 5340
cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg 5400
ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg 5460
gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga 5520
agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg 5580
aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg 5640
gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga 5700
tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc 5760
tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg 5820
tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga 5880
tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc 5940
ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg 6000
gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg 6060
ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag 6120
ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga 6180
tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga 6240
cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg 6300
cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca 6360
gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa 6420
atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca 6480
tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga 6540
tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata 6600
gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc 6660
caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag 6720
gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct 6780
gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt 6840
cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa 6900
aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac 6960
tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 7020
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 7080
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 7140
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 7200
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 7260
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 7320
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 7380
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 7440
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 7500
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 7560
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 7620
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 7680
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 7740
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 7800
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 7860
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 7920
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 7980
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 8040
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 8100
gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat 8160
attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact 8220
gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt 8280
ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac tttgccatct ttcacaaaga 8340
tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct 8400
ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc 8460
aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta 8520
agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg 8580
catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga 8640
cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga 8700
cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat 8760
cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc 8820
ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt 8880
tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt agccatttat tatttccttc 8940
ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat tataacaaga cgaactccaa 9000
ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt 9060
ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca 9120
ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt 9180
ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc 9240
tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg 9300
agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata 9360
tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta 9420
atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt 9480
tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg 9540
tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg 9600
aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat ccggtcggca 9660
tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag 9720
tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc 9780
gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc 9840
atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata 9900
cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg 9960
ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga 10020
atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag 10080
gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc 10140
ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac 10200
agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt 10260
gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc 10320
cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga acagcgggca gttcggtttc 10380
aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc 10440
gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg 10500
ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc 10560
acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag 10620
gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc 10680
aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcgaaa gctcgagaga gatagatttg 10740
tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag 10800
aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc 10860
acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct 10920
cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt 10980
tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat 11040
gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg 11100
aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac 11160
gagagtgtcg tgctccacca tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg 11220
aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc 11280
ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc 11340
accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag 11400
gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac 11460
tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tggcaagctg 11520
ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 11580
cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 11640
ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 11700
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cg 11752
<210> 5
<211> 2152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GUS assay promoter sequence
<400> 5
ctgaacccca gtcctcgtta agtatgggtt agtgctggca gtgtgttgcc ctagcctgag 60
gtctctgata tggcaacttg tcgcgtgatc agtgatcgtc tctgtctagc tgacatctct 120
cctggatgaa atcaatccaa aaaaaaagaa ggctttgatc agatagatta gggttcacac 180
ttcacaactc tgacgtttca acgcagcgcg aaagcaaatt ctgttggaat ttttgaatcg 240
tttcagaatt tttcaaattt gaattgaaaa tttatgaaga atattttaaa aataacttgt 300
aaatagtcct acatttgtag taaatacatg catatgaaat gtcaaaaaat ataggcgtag 360
aatgaaaatg ctctttggac aacaactgaa ttggtaaatt gaaaaaagac atctagaagg 420
gtttacaata tgtgttgatt gtgtatgcac tttatattat ggactttgta ttgttgttat 480
actatgttgt ttatgcactt tacagtatgt attgattgtg ggtgtacttt gtattgtgtt 540
gatgtacttt atattatgcg tgttgatgtt aatggcgtaa catatatttg gttatgcata 600
tttaattgtc aatgatatgg acttcaaatt atcttgtatt tgtgttcatg aatatacatt 660
gcgcttattc tcaatgtgag gttgtcaaat tgtaggaaag gtcatgctga atttctttat 720
taatttctta cattttccca cgtttccacg gtttccccat tttgatatcc ttttagtttg 780
caatgttcct atcatctcca tgaattttct catatttcaa acattttccc ctattatcca 840
aatattcaga aaacacaatt aattcccacg ctactctttg gcttttcagc aaatccaatg 900
agttttagat gcttttgttt ggtttccaaa acactggaac ggtggtttcc tgttcgaatc 960
aactgaaatc ctggtagttc cggttggaat tcggtgattt tgatcatttt tcattgacgg 1020
gcaaatggaa cttgagaatt tggcttctta attttgtttg aaatttgacg gttttcgtga 1080
aaaccgttat actgacaggg tcaggagcgg gacctcgatt ggaaatataa acccttgcct 1140
gtaatacggt acagccgtac agaattcgtg tggtggccac gggctcacgc accgggtcag 1200
tgatagcatc cagtggccaa tttggccatg gagatgatgc attttttaca cggagaatga 1260
tcccagaaac acgcatgatc ttctcttaca agaattttct aacagaacat ccatttcacc 1320
acacccactt gttcaatgca gcgctgtttt gtaacccaca taacaaccgg acccagcacg 1380
tctgaaacta aggttactca tcggttacct aaattaaagt actccctccg tattgtattt 1440
taatgtatgg tgccgttgac tttttttatc aatatttgac tattcgtttt attcaaattt 1500
tttgtgataa tgtgaaaata tttatgtcat gcttaaaaaa catttgatga tggatcaagt 1560
cacaataaaa taaacgataa ttacataaac tttgtgaata agacgaatga tcaaacgtta 1620
gataaaaagt caacagcgtc atatattaaa atatgaaggt agtagtaatt tacagagatg 1680
ttttagcgac ctaaaattct caagtttgaa attttaattt ttggttttca tttatgagga 1740
caattgggac tctaaccact cccccggtcg cttcgcgacg cgtccgtccc gacctgccaa 1800
attcctcgca cggattaagc aaaccaaact actcggatta aatgcgcaaa tcgaaagcac 1860
gcgttccatt gggagaccgg caaacttcgt tttttccttc gagaggaacg gagacggagt 1920
ttgccgtcgt cgtgtgcgtg cctcctcgcg tacgcacatt tgcccgcagc gccgcggcgc 1980
gcgaggctac cccgaccccg acgtggtctc ctcccaccca tacacccttc cgcttccacg 2040
cccacacaca gaacccaatt cccctccctc ctcctccacc cgcccctccc tcccacacac 2100
accacaccac caccaccacc acccacccct cgtatgcaat tattcacgcc ca 2152
Claims (20)
- 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 포함하는 돌연변이 벼 식물체로서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 YEL 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화 또는 파괴시키는 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 YEL 단백질에서 1번 내지 114번까지의 아미노산 서열에 해당하는 RING-finger 도메인을 코딩하는 영역을 불활성화 또는 파괴시키는 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 종자에서 노란색 종피색 및 배 치사에 대하여 열성 표현형질(recessive phenotype)을 보이는 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 청구항 1에 있어서, 기탁번호 KCTC 18500P로 기탁된 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 청구항 1에 있어서, 종자, 미강(rice bran), 배(embryo) 또는 배유(endosperm)인 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형을 포함하지 않는 야생형 식물체에 비하여 이소오리엔틴-2"-O-글루코시드, 이소오리엔틴, 아피게닌 2"-O-글루코실-8-O-글루코시드, 이소비텍신, 크리소에리올 2"-O-글루코실-O-글루코시드, 이소스코파린, 또는 이들의 조합을 증가된 양으로 포함하는 것인 돌연변이 벼 식물체.
- 청구항 1, 5 및 7 내지 11 중 어느 한 항의 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계;를 포함하는, 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법으로서, 상기 플라보노이드 화합물은 이소오리엔틴-2"-O-글루코시드, 이소오리엔틴, 아피게닌 2"-O-글루코실-8-O-글루코시드, 이소비텍신, 크리소에리올 2"-O-글루코실-O-글루코시드, 이소스코파린, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 돌연변이 벼 식물체는 전체 종자, 미강, 배, 또는 배유인 것인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 돌연변이 벼 식물체는 상기 유전적 변형에 대하여 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에 이형접합성 돌연변이 벼 식물체를 성장시켜 종자를 생산하는 단계; 및 생산된 종자로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계는 동형접합성 종자, 미강, 배, 배유, 또는 이들의 조합으로부터 분리하는 단계인 것인 방법.
- 청구항 15에 있어서, 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계는 종자의 종피의 노란색과 배의 검은 색에 근거하여 종자를 분리하는 것인 방법.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 벼 세포에 대하여 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 도입시키는 단계를 포함하는 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법으로서, 상기 유전적 변형을 도입시키는 단계는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020160148881A KR101863954B1 (ko) | 2016-11-09 | 2016-11-09 | 노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020160148881A KR101863954B1 (ko) | 2016-11-09 | 2016-11-09 | 노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20180051926A KR20180051926A (ko) | 2018-05-17 |
KR101863954B1 true KR101863954B1 (ko) | 2018-06-01 |
Family
ID=62486071
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020160148881A KR101863954B1 (ko) | 2016-11-09 | 2016-11-09 | 노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101863954B1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110827918A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-21 | 广西壮族自治区农业科学院 | 植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115896007A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-04-04 | 五邑大学 | 金圣草素在制备促进胚胎发育产品中的应用 |
-
2016
- 2016-11-09 KR KR1020160148881A patent/KR101863954B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
김백기. 서울대학교 석사학위논문. Characterization and fine mapping of the yellow pericarp lethal mutant in rice (2010.)* |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110827918A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-21 | 广西壮族自治区农业科学院 | 植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20180051926A (ko) | 2018-05-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3805391B1 (en) | Use of yr4ds gene of aegilops tauschii in stripe rust resistance breeding of triticeae plants | |
CN109402141B (zh) | 小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用 | |
CN106661583B (zh) | 非生物胁迫条件下改良农艺性状的植物和方法 | |
US20200354735A1 (en) | Plants with increased seed size | |
CN106687591B (zh) | 非生物胁迫下具有改良的农学性状的植物以及涉及非生物胁迫耐性的相关构建体和方法 | |
WO2010127969A1 (en) | Plants having enhanced yield-related traits and/or enhanced abiotic stress tolerance and a method for making the same | |
EP3390641B1 (en) | Compositions and methods for manipulating the development of plants | |
CN106604995A (zh) | 非生物胁迫下农艺性状改变的植物和涉及编码nac3/onac067多肽的构建体和方法 | |
CN107418957B (zh) | 控制水稻耐冷基因cold2及其应用 | |
KR101863954B1 (ko) | 노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도 | |
CN114540357A (zh) | 玉米长链非编码RNA lncRNA25659及其用途 | |
CN106636180B (zh) | 一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法 | |
JPWO2015108185A1 (ja) | 単為結果制御遺伝子およびその利用 | |
CN106536737B (zh) | 非生物胁迫下具有改良的农学性状的植物以及涉及非生物胁迫耐性基因的相关构建体和方法 | |
WO2020120753A1 (en) | Method of increasing resistance against soybean rust in transgenic plants by in-creasing the scoparone content | |
AU2021103672A4 (en) | Protein related to rice wax synthesis and its coding gene WSL5 and application thereof | |
CN101646773A (zh) | 具有改良生长特性的木本植物及其产生方法 | |
US8461414B2 (en) | Gene having endoreduplication promoting activity | |
AU2013245338A1 (en) | Plants having one or more enhanced yield-related traits and method for making same | |
US6563023B2 (en) | Identification and characterization of a CURLY phenotype (CUR) in plants | |
MX2012009370A (es) | Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas. | |
Li et al. | A novel maize gene, glossy6 involved in epicuticular wax deposition and drought tolerance | |
JP2020036591A (ja) | コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物、及びその製造方法、並びに植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性の判定方法 | |
WO2014181216A2 (en) | Plants having one or more enhanced yield-related traits and a method for making the same | |
US20020004943A1 (en) | Identification and characterization of a pagoda phenotype (PGD) in plants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
AMND | Amendment | ||
AMND | Amendment | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |