KR101859654B1 - Cell scaffold including collagen and decellularized extraceulluar matrix and artificial cornea sheet - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포외 기질과 콜라겐을 포함하는 인공 각막시트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각막으로부터 얻어진 세포외 기질을 탈세포화 하여 얻어진 조직과 콜라겐 겔을 함께 압축시켜 얻어진 인공각막 시트에 관한 것이다. The present invention relates to an artificial cornea sheet comprising an extracellular matrix and collagen, and more particularly to an artificial cornea sheet obtained by compressing a collagen gel together with a tissue obtained by defatting an extracellular matrix obtained from the cornea.
Description
본 발명은 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐을 포함하는 각막유래 세포의 지지체 및 이를 포함하는 인공 각막 시트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각막 세포외 기질을 탈세포화 하여 얻어진 조직과 콜라겐 겔을 함께 압축시켜 얻어진 세포의 지지체에 관한 것이다. The present invention relates to a supporter of a cornea-derived cell comprising a deteriorated extracellular matrix and collagen, and an artificial cornea sheet comprising the same, and more particularly, to a method of decomposing a collagen gel and a tissue obtained by de- And the support of the obtained cell.
인간 각막은 상피, 세포외 기질 및 내피를 포함하는 3개의 주요 층으로 구성된다. 각막의 두께는 통상 500 내지 600 um이고, 90%가 세포외 기질이다. 상피는 대략 50 um 두께이고, 세포들 간에 긴밀한 접합을 갖는 5 내지 6개 층의 세포를 함유하고, 특히 처음 2개의 층은 평평한 판 모양의 표면 세포이다. 다음 2 내지 3개의 층은 일렬로 배열된 원주형 기저 세포 상의 날개 모양 또는 다각형의 세포를 함유한다.The human cornea consists of three main layers, including the epithelium, the extracellular matrix and the endothelium. The thickness of the cornea is usually 500 to 600 μm, and 90% is the extracellular matrix. The epithelium is approximately 50 μm thick and contains five to six layers of cells with tight junctions between cells, particularly the first two layers are flat plate-like surface cells. The next two to three layers contain wing or polygonal cells on columnar basal cells arranged in a line.
상피는 특히 극성 및 이온성 분자에 대해 투과성 장벽을 형성한다. 상피 아래의 다음 장벽은 보우만 막(Bowman's Membrane)이다. 보우만 막은 8 내지 14 um 두께의 균질한 시트이고 상피를 하부 무세포 세포외 기질(각막고유질)로부터 분리한다.The epithelium forms a permeable barrier especially for polar and ionic molecules. The next barrier below the epithelium is the Bowman's Membrane. Bowman's membrane is a homogeneous sheet of 8 to 14 μm thick and separates the epithelium from the subcellular extracellular matrix (corneal ectoderm).
세포외 기질은 200 내지 250개의 교번하는 라멜라(층) 유형의 콜라겐 섬유로 구성된다. 각각의 라멜라는 약 1 um 두께이고 10 내지 25 um 너비이다. 세포외 기질은 물을 70% 함유하고 약 500,000 달톤 초과의 분자의 이동을 방해한다. 프로테오글리칸 및 섬유 결합 콜라겐은 콜라겐 섬유에 연결되어 세포외 기질 구조의 지름을 조절하고 세포외 기질 구조를 안정화시킨다. 섬유 결합 프로테오글리칸은 소 류신-풍부 프로테오글리칸(SLRP)이라 불리는 범주를 포함하고, 데코린, 바이글리칸, 케라토칸, 루미칸, 미미칸 및 피브로모듈린을 포함한다. 섬유 결합 콜라겐은 불연속 3중 나선을 갖는 피브릴 결합 콜라겐 분자(FACIT)로서, 유형 VI, 유형 X, 유형 XII 및 유형 XIV 콜라겐을 포함한다.The extracellular matrix is composed of 200 to 250 alternating lamellar (layer) type collagen fibers. Each lamellar is about 1 [mu] m thick and 10 to 25 [mu] m wide. The extracellular matrix contains 70% water and inhibits the migration of molecules above about 500,000 daltons. Proteoglycan and fiber-bound collagen are linked to collagen fibers to control the diameter of the extracellular matrix and to stabilize the extracellular matrix. Fiber-linked proteoglycans include the category referred to as leucine-rich proteoglycans (SLRPs) and include decolin, viglican, keratokan, lumican, mimican, and pibromodulin. Fibrous binding collagen is a fibril-binding collagen molecule (FACIT) with a discontinuous triple helix and includes type VI, type X, type XII and type XIV collagen.
스티븐슨 존슨 증후군이나 안천포창, 화학 화상 등에 의한 안구 표면 질환은 각막과 결막이 망가지면서 각막상피와 각막의 간세포(윤부)도 손상을 받게 되며, 손상된 안구표면으로 혈관들이 자라게 되고 각막에 혈관화 및 혼탁을 일으켜서 결국 실명에 이르는 치명적인 질환들이다. 이러한 질환들로 인한 시력상실에 대한 치료법으로 과거 10년 동안 동종 각막 이식술(타인의 기증각막을 이용한 이식술), 자가 각막 윤부(각막 줄기세포가 있는 부분, 각막의 가장자리)이식술, 양막 이식술, 배양된 각막상피세포 이식술 등이 발전하였으나 여러 가지 한계점으로 인해 현실적으로 불가능한 경우가 많다.Ocular surface disease caused by Stevenson-Johnson syndrome, pemphigus, and chemical burns is destroyed by corneal and conjunctival damage, resulting in damage to corneal epithelium and corneal hepatocytes (limbus). The damaged cornea grows into blood vessels, Which eventually lead to blindness. For the treatment of vision loss caused by these diseases, it has been used for the past 10 years in allogeneic keratoplasty (donation with donor cornea of other people), autologous corneal limbus (corneal stem cell area, corneal edge) graft, amnion graft, And corneal epithelial cell transplantation have developed, but there are many cases where it is impossible in reality due to various limitations.
동종 이식의 경우, 각막 이식이 필요한 환자 중 각막 기증을 통해 각막 이식을 받을 수 있는 환자는 약 1% (WHO 보고)에 불과하며, 이식 후 장기적인 면역억제제의 사용으로 여러 부작용이 초래될 수 있다. In the case of allografts, only about 1% of patients (corneal transplantation) can receive corneal transplantation through corneal transplantation, and the use of long-term immunosuppressive drugs after transplantation may cause several side effects.
자가 각막 윤부 이식술 경우, 손상되지 않은 안구의 자가 윤부를 이식하는 시술로써, 대개 양쪽 눈을 침범하기 때문에 자가 이식이 힘들고, 만약 자가 이식이 가능하다고 하여도 공여조직이 충분하지 못하고, 손상되지 않은 안구의 간세포에도 손상을 주는 단점을 가지고 있다. Autologous limbal transplantation is an autologous transplantation of an uninjured eyeball, usually involving both eyes, so autotransplantation is difficult. Even if autotransplantation is possible, there is not enough donor tissue, But also damages hepatocytes of hepatocytes.
이에 인공각막 개발의 필요성이 제기되었고, 고분자로 이루어진 연질의 부드러운 합성 인공 각막(AlphaCor, 호주)등이 상용화 되었으나 인공 각막으로의 세포의 침윤, 단백질 침착으로 인해 인공각막 투명도 유지의 문제, 각막 하층인 기저층의 손실등과 같은 부작용이 일어나 영구적으로 안구에 이식되지 못하고 제한적인 수명을 가진 것으로 보고 되었다.Therefore, the necessity of artificial cornea development has been raised, and soft soft synthetic corneal flap made of polymer (AlphaCor, Australia) has been commercialized, but the problem of artificial corneal transparency maintenance due to infiltration of cells into artificial cornea, And the loss of the basal layer, so that it is not permanently transplanted into the eye and has a limited life span.
근래에 생분해성 고분자 지지체(scaffold)를 이용하여 손상된 생체조직이나 장기를 재생하는 조직공학(tissue engineering)이 활발히 연구되고 있다. 이때에 생분해성 고분자 지지체는 다공성(porous)으로서 내외부에 세포가 부착 성장하면서 지지체가 서서히 분해 소멸된다. 현재 지지체의 화학적 성질/표면 물성과 세포의 부착/성장의 상관 관계, 지지체의 공극(pore) 크기의 효과, 세포의 부착 및 양육 조건 등에 관하여 많은 연구가 진행되고 있다.Recently, tissue engineering for regenerating damaged biological tissue or organ using a biodegradable polymer scaffold has been actively studied. At this time, the biodegradable polymer scaffold is porous, and the support gradually decomposes and disappears while cells adhere to the inside and outside of the scaffold. Currently, much research has been conducted on the relationship between the chemical properties / surface properties of the support and the adhesion / growth of the cells, the effect of the pore size of the support,
일반적으로 합성 고분자는 소수성이므로 세포 부착(또한 세포가 함유된 배양액의 젖음(wetting))이 적다. 반면에 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자는 친수성이 커서 세포 부착이 많으나 기계적 강도가 약하고 분해 속도 조절이 어렵다.In general, the synthetic polymer is hydrophobic, so cell attachment (and also wetting of culture medium containing cells) is low. On the other hand, natural polymers such as collagen, hyaluronic acid and chitosan are highly hydrophilic and have a high cell adhesion, but they are weak in mechanical strength and difficult to control the decomposition rate.
콜라겐은 동물의 다양한 결합조직을 구성하는 단백질로 조직 내에서 세포의 지지 및 세포와 조직의 기능을 돕는 역할을 수행한다. 특히, 원섬유성 콜라겐은 생체 내에서 콜라겐 섬유를 형성하고 세포외 기질로써 각막, 피부, 인대, 혈관, 뼈 등 많은 조직에 분포한다. 또한 콜라겐 섬유는 각각의 조직에서 다른 단백질들의 도움과 함께 서로 다른 섬유 구조체를 형상하여 각 조직이 다른 특성을 갖도록 한다. Collagen is a protein that constitutes various connective tissues of animals and plays a role in supporting the function of cells and tissues in tissues. In particular, fibrillar collagen forms collagen fibers in vivo and is extracellular matrix and is distributed in many tissues such as cornea, skin, ligament, blood vessels and bones. In addition, collagen fibers form different fiber structures with the help of different proteins in each tissue, so that each tissue has different characteristics.
이러한 원섬유성 콜라겐은 생체 조직으로부터 추출하여 체외에서 사용 가능하다. 생체 조직으로부터 추출된 콜라겐은 산성용액에 용해하여 보관이 가능하며, 일반적으로 쥐, 돼지, 소로부터 이러한 콜라겐을 추출하여 사용한다. 또한, 용해된 콜라겐을 이용하여 다시 원섬유 형성 과정을 통해 미시적으로 수십 나노 수준의 섬유가 형성되어, 거시적으로는 콜라겐 겔 형태를 이루게 된다. 이를 재조합 콜라겐 겔(Recombinant collagen gel) 이라 하며 생적합성 및 세포 기능발현에 있어 우수한 재료로써, 조직공학 분야에서 각광을 받고 있다. Such fibrillary collagen can be extracted from living tissue and used outside the body. Collagen extracted from living tissues can be stored in an acidic solution. Generally, such collagen is extracted from rats, pigs and cows. Using dissolved collagen, microscopic fibers of several tens of nanometers are formed through the fibril formation process, resulting in macroscopic collagen gel formation. This is called recombinant collagen gel, and it is an excellent material for biocompatibility and cell function expression, and is getting attention in the field of tissue engineering.
더불어 콜라겐 겔 내부에 세포를 포함시키는 것이 가능하기 때문에 인공 조직 및 세포 지지체로서 조직 재생에 효과적인 물질로 여겨지고 있다. 하지만 추출된 콜라겐을 통하여 재조합된 콜라겐 겔의 경우 형성된 나노 섬유가 물리적으로 매우 느슨하게 얽혀있는 구조를 이루고 있으며, 많은 물을 포함하고 있기 때문에 기계적 강도가 낮아 물질을 다루기가 힘들며 원하는 형태나 구조로 만드는데 어려움이 있다. In addition, since it is possible to incorporate cells into the collagen gel, it is considered to be an artificial tissue and a cell supporter, and is effective for tissue regeneration. However, in the case of the collagen gel reconstructed through the extracted collagen, the formed nanofibers have a physically very loosely entangled structure. Since they contain a large amount of water, the mechanical strength is low and it is difficult to handle the material. .
이러한 단점을 극복하기 위하여, 화학적 가교제를 통해 콜라겐 섬유간 공유결합을 형성하여 기계적 특성을 향상시키는 방법이 이용되고 있으나 가교제의 독성으로 인해 콜라겐 겔 자체의 생체 적합성을 떨어뜨릴 뿐 아니라 세포를 겔 내부에 포함시킬 수 없다는 단점을 갖고 있다. In order to overcome this disadvantage, a method of improving the mechanical properties by forming a covalent bond between collagen fibers through a chemical crosslinking agent has been used. However, due to the toxicity of the crosslinking agent, not only the biocompatibility of the collagen gel itself is lowered, It can not be included.
가교제의 문제점을 해결하고자, 물리적 압축 공정을 이용한 콜라겐 시트를 제조하는 기술이 있으나, 하지만 이렇게 제작된 압축 콜라겐 시트는 기계적 강도가 다소 향상되었으나 본래 생체 내 조직이나 화학적 가교제를 이용한 콜라겐 구조보다는 여전히 낮은 기계적 강도를 갖기 때문에 인공각막 시트로써 각막 재생을 위한 이식 수술 시 봉합에 의해 시트가 손상될 수 있을 뿐 아니라 조직 자체로서의 역할을 충분히 수행하기에는 부족한 실정이다. In order to solve the problem of the cross-linking agent, there is a technique of producing a collagen sheet using a physical compression process. However, the compressed collagen sheet thus prepared has improved mechanical strength, but the mechanical structure of the collagen sheet is still lower than the collagen structure using the in vivo tissue or chemical cross- The cornea sheet is damaged by the suture during the transplant operation for regenerating the cornea because of its strength and it is not enough to perform the role as the tissue itself.
따라서, 콜라겐 압축 방식에서 더 나아가 화학적 가교제의 사용 없이 재조합 콜라겐의 기계적 특성을 향상시킬 수 있으며, 기존 콜라겐만으로 제작된 압축 시트 보다 세포의 증식과 기능 발현을 향상시킨 인공각막 시트의 연구개발이 요구되고 있다. Therefore, in addition to the collagen compression method, the mechanical properties of recombinant collagen can be improved without the use of a chemical crosslinking agent, and research and development of artificial cornea sheets having improved cell proliferation and functioning performance compared to a compression sheet made only of conventional collagen are required have.
본 발명은 탈세포화된 세포외 기질을 콜라겐과 혼합하여 제작된 압축 콜라겐 시트로 제작하여 기존 콜라겐만으로 제작된 압축 시트보다 세포의 증식과 기능 발현을 향상시키는 것을 목적으로 한다.The present invention aims at enhancing cell proliferation and functional expression of a compressed sheet prepared by mixing collagen with a deteriorated extracellular matrix with a compressed collagen sheet prepared using conventional collagen alone.
본 발명은 화학적 가교제의 사용 없이 재조합 콜라겐의 기계적 특성을 향상시킬 수 있는 각막 유래 세포의 지지체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. It is an object of the present invention to provide a method for producing a supporter of cornea-derived cells capable of improving the mechanical properties of recombinant collagen without using a chemical crosslinking agent.
본 발명은 또한 상기 각막 이식용 시트에 각막 유래 세포를 배양하여 제조된인공 각막시트 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention also provides an artificial cornea sheet prepared by culturing cornea-derived cells on the sheet for transplanting cornea, and a method for producing the same.
본 발명은 화학적 가교제를 사용하지 않고, 기존 콜라겐 겔의 기계적인 특성을 달성하고자, 압축 공정을 이용한 세포 지지체 시트, 상기 세포 지지체 시트에 각막 유래 세포를 배양한 인공 각막 시트에 관한 것이다. The present invention relates to a cell support sheet using a compression process and an artificial cornea sheet obtained by culturing cornea-derived cells on the cell support sheet, in order to achieve mechanical properties of a conventional collagen gel without using a chemical crosslinking agent.
본 발명의 일 예는 각막에서 유래된 세포외 기질과 콜라겐을 혼합하여 각막 유래 세포의 부착율 및 증식율을 향상시킨 세포 지지체 시트 및 이를 포함하는 인공 각막 시트를 제공하며, 세포외 기질을 함유하는 세포 지지체 시트는 세포외 기질에 포함된 콜라겐 원섬유(collagen fibril)이외의 콜라겐 부착이나 세포의 증식에 도움이 되는 다양한 단백질을 함유하고 있어 콜라겐만을 이용해 제작된 콜라겐 시트보다 세포 기능을 활성화 시킬 수 있다.One example of the present invention provides a cell support sheet and an artificial cornea sheet comprising the same, wherein the adhesion rate and proliferation rate of the cornea-derived cells are improved by mixing the extracellular matrix derived from the cornea with collagen, The support sheet contains various proteins that contribute to collagen attachment or cell proliferation other than the collagen fibril contained in the extracellular matrix, and can activate the cell function more than the collagen sheet prepared using only collagen.
본 발명의 또 다른 일예는 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐을 포함하는 세포 지지체 시트 및 인공 각막 시트를 제조하는 방법으로서, 구체적으로 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐을 포함하는 성형체를 제조하고, 상기 시트에 압력을 가하여 콜라겐 내부의 물이 제거됨과 동시에 콜라겐 섬유가 물리적으로 얽히게 되어 시트의 기계적 강도를 높여 우수한 물성을 갖는 인공 각막 시트를 제공하는 것이다. Another embodiment of the present invention is a method for producing a cell support sheet and an artificial cornea sheet comprising a degassed extracellular matrix and collagen, and more particularly, to a method for producing a molded body containing a degassed extracellular matrix and collagen, The present invention provides a artificial cornea sheet having excellent physical properties by increasing the mechanical strength of the sheet by applying pressure to remove water in the collagen and physically entangling the collagen fibers.
상기 압축 공정은 화학적 가교제를 사용하지 않기 때문에, 각막 유래 세포를 함유하는 각막 세포 시트를 통해 각막을 포함한 조직 재생에 있어 더욱 큰 효과를 기대할 수 있다. Since the above-mentioned compression process does not use a chemical crosslinking agent, a greater effect can be expected in tissue regeneration including cornea through a corneal cell sheet containing cornea-derived cells.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
인간 눈의 각막은 대체로 평행한 상대적으로 탄탄한 조직의 층으로 구성된 특화된 구조이다. 각막의 가장 바깥쪽 또는 대부분의 표면층은 상피층이다. 이는 상해시에 재생되는 조직의 보호층이다. 눈 내부로 들어가면 보우만 막(Bowman's membrane)이라 알려진 상피층의 기저(base) 표면이 나온다. 산존하는(scattered) 케라토사이트(keratocyte)가 있는 세포외 콜라겐 구조 기질인 각막의 각막기질(stroma)은 보우만막에 바로 가까이에 인접해 있다. 각막 기질층은 데스메막(Descemet's membrane)이라 불리워지는 표피의 세포막에 의해서, 각막 기질의 맨 아래에서 경계지어지고, 각막의 후부(posterior) 표면을 형성하는 특화된 내피세포의 단일세포 두께를 가지는 단일층(monolayer)이 이어진다. The cornea of the human eye is a specialized structure composed of layers of relatively rigid tissue that are generally parallel. The outermost or most surface layer of the cornea is the epithelial layer. This is the protective layer of the tissue regenerated in Shanghai. Once inside the eye, the base surface of the epithelium, known as Bowman's membrane, emerges. The corneal stroma, an extracellular collagen structural substrate with a scattered keratocyte, is immediately adjacent to the Bowman's membrane. The corneal stroma layer is bounded by the cell membrane of the epidermis, called the Descemet's membrane, at the bottom of the corneal stroma, and is a single layer with a single cell thickness of specialized endothelial cells forming the posterior surface of the cornea (monolayer).
각막 등의 다양한 조직공학에 사용되는 생분해성 다공성 고분자 지지체는 독성이 없고 조직에 대한 생체적합성이 우수하여야 하며, 기계적 강도가 충분하여 세포가 부착 성장하는 동안에 형태를 유지하여야 하는 반면에 분해속도가 적당하여 세포 성장과 더불어 분해되어 없어져야 하는 조건을 만족해야 한다. The biodegradable porous polymer scaffold used in various tissue engineering such as cornea should have no toxicity, be biocompatible to tissues, have sufficient mechanical strength to maintain its shape during adherent growth of cells, And it should be satisfied with the condition that it should dissolve and disappear with the cell growth.
인공조직 제작에 있어서, 재료 내에 세포를 포함시킬 경우 세포의 기능 발현 및 조직재생 측면에 있어서 효과적이다. 하지만 화학적 가교제 방법을 통해서는 콜라겐 분자나 콜라겐 나노섬유간의 공유결합을 유도하여 높은 기계적 강도를 갖는 콜라겐 겔을 얻을 수 있으나, 가교제 사용 조건 및 가교제 자체의 독성 때문에 세포가 포함된 콜라겐 겔을 제작할 수 없다는 단점을 갖고 있다. 반면 압축방법을 통해서는 여타 세포의 영향을 줄 수 있는 화학 물질을 사용하지 않고 물리적인 힘만을 이용해 콜라겐 겔의 기계적 특성을 향상시킬 수 있기 때문에 세포를 지지체 내부에 포함시킬 수 있다. 그러나 기존의 압축 방법만을 이용한 경우에는 화학적 가교제 만큼의 기계적 특성을 얻을 수 없다는 문제가 있었으며, 탈세포화 세포외 기질을 포함한 겔의 압축을 통하여 이러한 문제점을 해결하였다. In the production of artificial tissue, the inclusion of cells in a material is effective in terms of cell function and tissue regeneration. However, through the chemical crosslinking method, it is possible to obtain collagen gel having high mechanical strength by inducing covalent bonding between collagen molecules and collagen nanofibers. However, since collagen gel containing cells can not be prepared due to the conditions of use of crosslinking agent and toxicity of crosslinking agent itself It has disadvantages. On the other hand, since the compression method can improve the mechanical properties of the collagen gel by using only physical force without using chemicals that can affect other cells, the cells can be contained in the support. However, in the case of using only the conventional compression method, there was a problem that the mechanical properties as the chemical crosslinking agent could not be obtained, and this problem was solved by compressing the gel containing the degassed extracellular matrix.
상기 압축 공정은 화학적 가교제를 사용하지 않기 때문에, 각막 유래 세포를 함유하는 각막 세포 시트를 통해 각막을 포함한 조직 재생에 있어 더욱 큰 효과를 기대할 수 있다. Since the above-mentioned compression process does not use a chemical crosslinking agent, a greater effect can be expected in tissue regeneration including cornea through a corneal cell sheet containing cornea-derived cells.
콜라겐 겔의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 복수 종의 혼재된 콜라겐을 사용할 수도 있다. 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 효소 가용화법 등에 의해 추출 및 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 감소시킬 목적으로, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소로 처리함으로써 텔로펩티드(telopeptide)를 제거한, 아테로콜라겐(atherocollagen)을 사용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔 재료로 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 사용할 수도 있다. 여기서, 양막 유래는 넓게는 양막을 출발 원료로 하여 얻어진 것을 의미한다.The type of collagen used as a raw material of the collagen gel is not particularly limited, and I-type collagen, type III collagen, type IV collagen, and the like can be used. A plurality of mixed collagens may be used. Collagen can be extracted and purified from connective tissues such as skin, cartilage, etc. of animals such as pigs, cows, sheep, etc. by an acid solubilization method, an alkali solubilization method, an enzyme solubilization method and the like. For the purpose of reducing the antigenicity, it is preferable to use atherocollagen in which a telopeptide is removed by treatment with a degrading enzyme such as pepsin or trypsin. Collagen derived from amniotic membrane, in particular human amniotic membrane, may be used as the collagen gel material. Here, amniotic membrane derived means broadly obtained from amniotic membrane as a starting material.
본 발명에 따른 세포외 기질 또는 ECM이란, 동물세포에 구조적인 지지를 통상 제공함과 동시에, 다른 다양한 중요한 기능을 수행하는 동물 조직의 세포외 부분이다. 세포외 기질은 동물에 있어서 결합 조직을 규정하는 특징이다. 본 발명에 적용 가능한 세포외 기질은 각막 유래 세포외 기질로서, 세포 주변을 둘러싸는 물리적인 구조 이외에 세포의 부착을 돕는 단백질이나 세포의 생장 및 기능의 발현에 도움이 되는 단백질들을 포함하고 있다. 이러한 세포외 기질을 돼지, 소와 같은 동물의 조직일 수 있고 다양한 기관으로부터 추출이 가능하다. The extracellular matrix or ECM according to the present invention is an extracellular portion of animal tissue that normally provides structural support to animal cells and performs a variety of other important functions. The extracellular matrix is a characteristic that defines connective tissue in animals. The extracellular matrix applicable to the present invention is an extracellular matrix derived from the cornea. In addition to the physical structure surrounding the cell, it includes proteins that help to adhere cells, and proteins that help in the growth and function of cells. Such extracellular matrix can be an animal tissue such as pigs and cows and can be extracted from various organs.
상기 세포외 기질은 탈세포화 처리된 것이 바람직하다. 이에 따라 면역반응을 유도하는 항원으로서 작용할 수 있는 세포를 제거함으로써 동종이식 (allograft) 또는 이종이식 (xenograft)시 면역반응을 최소화화는 효과가 있다. 조직에 따라 세포의 종류와 수, 조직 자체의 물리적 특성이 다르기 때문에 산, 염기, 저장액, 고장액, 세제 등 다양한 화학물질을 이용하여 탈세포화가 이루어진다. 또한 탈세포화 과정만을 거쳐 조직 자체의 구조를 유지한 채로 사용하기도 하지만, 동결건조와 분쇄과정을 거쳐 산성 용액에 녹여 액상으로 사용하거나 이를 다시 중화과정을 거쳐 겔 형태로 만들어 사용하기도 한다. It is preferable that the extracellular matrix is de-saturated. Accordingly, it is effective to minimize the immune response upon allograft or xenograft by removing cells that can act as an antigen to induce an immune response. Since the type and number of cells and the physical properties of tissues are different depending on the tissues, depletion is carried out by using various chemical substances such as acid, base, storage liquid, fault liquid and detergent. In addition, it may be used while retaining the structure of the tissue itself only through the de-saturation process, but it may be used as a liquid form after dissolving in an acidic solution through freeze-drying and pulverization, or may be used as a gel form after being neutralized again.
본 발명에 따른 세포 지지체 시트에서, 2.5~3.5 mg/mL 농도의 콜라겐 용액과 세포외 기질 용액의 혼합용액을 25:75 내지 25:75의 중량비, 바람직하게는 40: 60 내지 60: 40 중량비, 더욱 바람직하게는 50:50 의 중량비로 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 콜라겐 용액에는 각막 유래 세포를 추가로 포함할 수 있으며, 탈세포화 세포외 기질 용액에는 세포 배양 배지를 추가로 포함할 수 있다. 탈세포화 세포외 기질 용액의 혼합 비율이 증가할 경우 세포 배양에는 유리하나 시트의 기계적 강도를 고려하면 압축을 통한 시트형성이 제한적이다. In the cell support sheet according to the present invention, a mixed solution of a collagen solution and an extracellular matrix solution at a concentration of 2.5 to 3.5 mg / mL is mixed at a weight ratio of 25:75 to 25:75, preferably 40:60 to 60:40, More preferably in a weight ratio of 50:50. The collagen solution may further include a cornea-derived cell, and the cell culture medium may further include a cell culture medium for the de-saturated cell matrix solution. When the blending ratio of the deteriorated saturated extracellular matrix solution is increased, the cell culture is advantageous but the sheet formation through compression is limited considering the mechanical strength of the sheet.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 시트는 탈수된 것이고, 탈수 및 압축 후 시트의 밀도는 5 내지 30 mg/mL 일 수 있다. 상기 세포의 지지체의 두께는 50~600 um정도이다.According to an embodiment of the present invention, the sheet is dehydrated, and the density of the sheet after dehydration and compression may be 5 to 30 mg / mL. The thickness of the supporter of the cell is about 50 to 600 μm.
본 발명의 지지체는 3차원적으로 조직이 부착 성장할 수 있고 세포 성장 및 새로운 조직 형성에 필요한 영양분과 특정 성장인자들을 전달하는 것이다. 궁극적으로는 세포의 증식, 성장과 더불어 세포외 기질이 분비되어 새로운 조직이 형성되고 고분자 지지체는 서서히 분해되 어 완전히 소멸되므로 세포군과 세포외 기질만으로 구성된 새로운 조직 대체물이 완성된다. 따라서, 이러한 생분해성 고분자 지지체는 독성이 없고 조직에 대한 생체적합성(tissue compatibility)이 우수하여야 하며, 기계적 강도가 충분하여 세포가 부착 성장하는 동안에 형태를 유지하나 분해속도가 적당하여 세포 성장과 더불어 분해 소멸되어야 한다. The scaffold of the present invention is capable of three-dimensionally adhering tissue and transporting nutrients and specific growth factors necessary for cell growth and new tissue formation. Ultimately, the proliferation and growth of cells together with the secretion of extracellular matrix form new tissue, and the scaffold of polymer scaffold is gradually degraded and completely disappeared, resulting in a new tissue substitute composed of only the cell group and extracellular matrix. Therefore, such a biodegradable polymer scaffold is free from toxicity, has excellent tissue compatibility with tissues, has sufficient mechanical strength to maintain its shape during adherent growth of cells, It must be destroyed.
따라서, 본 발명에 따른 세포의 지지체는 각막-유래 세포의 부착율 및 증식율이 우수하며, 본 발명에 따른 콜라겐과 각막 유래 세포외 기질을 포함하는 세포 지지체 시트에 각막 유래 세포, 예를 들면 각막내피세포, 각막상피세포 및 세포외 기질세포로 이루어지는 군에서 선택된 세포를 배양하여 얻어지는 각막-유래 세포를 포함하는 인공 각막 시트를 제공한다. Thus, the support of cells according to the present invention is excellent in the rate of adhesion and proliferation of the cornea-derived cells, and the cornea-derived cells such as the corneal endothelium cells in the cell support sheet containing the collagen and the cornea- The present invention also provides an artificial cornea sheet comprising cornea-derived cells obtained by culturing cells selected from the group consisting of cells, corneal epithelial cells and extracellular stromal cells.
본 명세서에 있어서 인공 각막 시트란, 각막과 유사한 특징을 가지며, 각막의 대체제로서 이식에 제공되는 세포층 또는 세포층을 포함하는 구조물을 의미하는 용어로서 사용된다. 시트상에, 각막 유래 세포를 접종 및 배양하여 얻어질 수 있으며, 이러한 시트는 한 종류의 각막 유래 세포를 배양하거나, 여러 종류의 세포를 배양하여 인공 각막으로 제조할 수도 있다. In the present specification, the artificial cornea sheet is used as a term having a structure similar to a cornea and including a cell layer or a cell layer provided for implantation as an alternative to the cornea. The cells can be obtained by inoculating and culturing the cornea-derived cells on a sheet. Such a sheet can be produced as an artificial cornea by culturing one kind of cornea-derived cells or culturing various kinds of cells.
예를 들면, 각막 내피 세포를 포함하는 각막 세포 시트인 경우, 각막 내피세포를 접종 및 배양하여 각막 내피세포가 컨플루언트가 되고 나서 각막 내피세포를 포함한 시트를 배양 용기로부터 박리함으로써 얻어진다. For example, in the case of a corneal cell sheet containing corneal endothelial cells, the corneal endothelial cells are inoculated and cultured to obtain a corneal endothelial cell as a confluent, and then the sheet containing the corneal endothelial cells is peeled from the culture container.
각막 상피세포는 각막 윤부 조직으로부터 채취할 수 있다. 예를 들면, 각막 윤부 조직으로부터 내피세포를 박리 및 제거하고, 결막을 절제하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 그리고 이것을 질소 탱크에서 보존시키고, 이후 신속하게 37에서 융해시켜 각막 상피세포 현탁액을 준비한다. 필요에 따라 이차배양을 실시한다. 이차배양에는, 예를 들면, 무혈청 배지인 EpiLifeTM(Cascade Biologics), CnT-PR(CELLnTEC Advanced Cell Systems AG)나 이들의 배지의 아미노산 조성 등을 변형시킨 배지 등을 사용할 수 있다. Corneal epithelial cells can be harvested from corneal limbal tissue. For example, endothelial cells are detached and removed from corneal limbal tissue, and the conjunctiva is excised to produce a single cell suspension. This is preserved in a nitrogen tank and then rapidly melted at 37 to prepare a corneal epithelial cell suspension. Secondary cultivation is carried out as necessary. For secondary culture, for example, a serum-free medium such as EpiLife ™ (Cascade Biologics), CnT-PR (CELL ™ TEC Advanced Cell Systems AG) or a culture medium in which the amino acid composition of the medium is modified can be used.
각막 유래 세포는, 예를 들면 세포 밀도가 약 1 x 104 개/cm2 이상, 바람직하게는 약 1 x 104 개/cm2 - 약 5 x 104 개/cm2, 더욱 바람직하게는 약 2 x 104 개/cm2 - 약 1 x 105 개/cm2로 시트위에 접종되어 컨플루언트 될 때까지 배양한다. The cornea-derived cells have a cell density of, for example, about 1 x 10 4 / cm 2 or more, preferably about 1 x 10 4 / cm 2 to about 5 x 10 4 / cm 2 , 2 x 10 4 cells / cm 2 - Approximately 1 x 10 5 cells / cm 2 inoculated onto the sheet and cultured until confluent.
상기 각막 유래 세포는 인체 세포, 예를 들면 1차 인체 세포 또는 세포주로 부터 유래된 세포일 수 있으며, 각막내피세포, 각막상피세포 및 세포외 기질세포로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.The cornea-derived cells may be human cells, for example, cells derived from primary human cells or cell lines, and may be at least one selected from the group consisting of corneal endothelial cells, corneal epithelial cells and extracellular stromal cells.
각막 상피 세포를 배양할 때에 이용되는 배지는 당해 세포를 증식시키는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 생체 유래 세포 배양용 배지는 상기 세포를 증식시키는 임의의 것으로, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, CnT-PR(CELLnTEC Advanced Cell Systems AG), EpiLifeTM(Cascade Biologics), 또는 이들의 배지의 아미노산 조성 등을 변경한 배지, 상피세포의 성장에 통상적으로 사용할 수 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정 비율로 혼합한 배지 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 무혈청성 배지이며, 동시에 이종 동물 세포에서 유래된 단백질을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. The culture medium used for culturing the corneal epithelial cells is not particularly limited as far as it is capable of proliferating the cells. The culture medium for culturing a cell derived from a living body is not particularly limited, and any medium for propagating the cell can be used. For example, a medium prepared by changing the amino acid composition of CnT-PR (CELLnTEC Advanced Cell Systems AG), EpiLife ™ (Cascade Biologics) or their medium, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium ) And Ham's F12 medium (Ham's F12 medium) at a predetermined ratio can be used. Particularly, in the present invention, it is preferable to use a medium which is a bloodless medium and does not contain proteins derived from different animal cells.
특히, 본 발명에서는 무혈청으로 또한 이종 동물 유래의 단백질을 포함하지 않은 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 성장 인자나 항생 물질 등이 첨가된 배지를 사용해도 괜찮다. 단, 혈청을 포함하지 않은 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 배양 방법으로서 무혈청배양법을 채용하는 것이 바람직하다. 혈청 유래의 성분의 혼입에 의한 면역 거절 등의 문제를 회피할 수 있기 때문이다. 상, 혈청을 포함한 배지안에서 배양하기로 해도 괜찮지만, 그 경우에는 동종 유래의 혈청(사람의 각막 상피 세포를 배양할 때에는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다. 물론, 가능하면, 면역 거절반응의 야기의 우려가 없어지는 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다. Particularly, in the present invention, it is preferable to use a medium free of serum-free protein from a different animal. On the other hand, a medium supplemented with growth factors or antibiotics may be used. However, it is preferable to use a medium not containing serum. That is, it is preferable to adopt the serum-free culture method as the culture method of the present invention. And problems such as immune rejection due to the incorporation of components derived from serum can be avoided. In this case, it is preferable to use serum derived from the same species (when human corneal epithelial cells are cultured, human-derived serum), or to use autologous serum. Of course, it is preferable to use an autologous serum, which avoids the fear of causing an immune rejection reaction, if possible.
각막 상피 세포의 양호한 증식 및 중층화를 목적으로 해 배양 스텝의 도중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.The culture conditions may be changed during the incubation step for the purpose of favorable proliferation and stratification of corneal epithelial cells.
본 발명에 따른 이러한 각막 시트는, 각막이 손상, 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용될 수 있다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용해 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하는 것이 바람직하다. 각막 상피의 이식이 필요한 안구 표면 질환에 적용 가능한 이식용 재료(각막 상피형 시트)를 제공한다.Such a corneal sheet according to the present invention can be used as an implantable material (replacement of the corneal epithelium) for a patient in which the cornea is damaged or missing. At the time of implantation, it is preferable to fix the graft to peripheral tissues using surgical suture to promote survival. (Corneal epithelial sheet) applicable to ocular surface diseases requiring transplantation of the corneal epithelium.
본 발명의 생체 조직 시트는, 각막 상피 등의 재생(재건)에 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 생체 조직 시트를 생체의 조직 결손부에 직접 이식할 수 있다. The biopsy sheet of the present invention is used for regeneration (reconstruction) of corneal epithelium and the like. For example, the biotissue sheet of the present invention can be directly implanted into a tissue defect portion of a living body.
본 발명의 또 다른 일 예는 콜라겐과 탈세포화 세포외 기질을 포함하는 세포 지지체 시트 및 상기 시트와 각막-유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인공 각막 시트를 제조하는 방법을 제공한다.Another example of the present invention provides a method for producing a corneal tissue sheet comprising a cell support sheet comprising collagen and a depleted outer cell matrix, and culturing the sheet and the cornea-derived cells.
일 예에서, 상기 세포 지지체 시트의 제조방법은, In one example, the method of producing the cell support sheet comprises:
탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 용액을 준비하고, A degassed saturated extracellular matrix and collagen solution were prepared,
상기 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 용액을 몰드에 주입하여 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔을 함유하는 성형체를 제조하고, The degassed extracellular matrix and the collagen solution are injected into a mold to prepare a molded body containing a degassed extracellular matrix and a collagen gel,
상기 성형체에 가압하여 압축 및 탈수공정을 수행하는 단계를 포함한다. And pressing the molded body to perform a compression and dehydration process.
상기 성형체를 제조하는 공정은 실린더형 몰드를 사용하여 제조할 수 있으며, 예를 들면, 실리더형 몰드에 콜라겐 겔과 세포외 기질을 주입하여 성형체를 제조할 수 있다.The process for producing the molded article can be performed using a cylindrical mold. For example, a molded article can be produced by injecting a collagen gel and an extracellular matrix into a cylindrical mold.
상기 세포 지지체는 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔의 성형체를 가압하여 압축 및 탈수처리된 것이다. 가압공정은 콜라겐 겔의 밀도가 5~30 mg/mL 또는 탈수율이 70 내지 99 중량%가 되도록 수행할 수 있다. 상기 탈수율의 구체적 계산식은 다음과 같다. The cell support is compressed and dehydrated by pressurizing a deglazing outer cell matrix and a collagen gel. The pressing process may be performed so that the density of the collagen gel is 5 to 30 mg / mL or the dehydration rate is 70 to 99% by weight. The specific formula of the dehydration rate is as follows.
탈수율 = [(압축 전 무게 - 압축 후 무게)/(압축 전 무게)]×100 (중량%)Dehydration rate = [(weight before compression - weight after compression) / (weight before compression)] × 100 (% by weight)
상기 가압 공정은, 30 gf 내지 2,000 gf의 압력으로 상기 성형체에 압력을 가하여 수행될 수 있다. 가압공정은 압축기를 이용하여 수행할 수 있으며, 압축기는 그 사이에 성형체를 두어 압축할 수 있도록 평행하게 배치되며, 수분을 통과하나 세포외 기질과 콜라겐 겔 성분은 통과하지 못하는 멤브레인이 부착된 한쌍의 압축판; 및 상기 압축판중 적어도 하나에 부착되며 압력을 가하는 장치를 구비할 수 있다. 압축기의 일 예를 도 2 및 도 3에 나타냈다. The pressing process may be performed by applying pressure to the molded body at a pressure of 30 gf to 2,000 gf. The pressurization process can be performed by using a compressor. The compressor is arranged in parallel so as to compress and place a molded body therebetween, and a pair of membranes, which are permeable to moisture but not through the extracellular matrix and the collagen gel component Compression plate; And a device for applying pressure to at least one of the compression plates. An example of the compressor is shown in Fig. 2 and Fig.
상기 제조된 세포 지지체 시트에 각막 유래 세포를 배양하여 인공 각막 시트를 제공할 수 있다. 각막 유래 세포의 종류, 배양된 세포의 밀도, 세포 배양방법 등은 상술한 바와 같다.The cornea-derived cells may be cultured on the prepared cell support sheet to provide an artificial cornea sheet. The type of cornea-derived cells, the density of the cultured cells, and the cell culture method are as described above.
본 발명에서와 같이 탈세포화 세포외 기질 재료를 콜라겐과 혼합하여 압축 콜라겐 시트를 제작할 경우, 그 내부에 콜라겐 섬유 이외에 다른 세포기능의 발현에 도움이 되는 분자를 포함하기 때문에 기존 콜라겐만을 이용한 압축 콜라겐 시트 내에 세포를 포함시킬 때 보다 세포의 증식 및 기능 발현을 도모할 수 있다. When a compressed collagen sheet is prepared by mixing a deaerated extracellular matrix material with collagen as in the present invention, a molecule useful for expressing other cell functions other than collagen fibers is contained in the compressed collagen sheet. Therefore, The proliferation and function of the cells can be promoted more than when cells are contained in the cells.
도 1은 본 발명의 일 예에 따라 콜라겐, 탈세포화 각막 세포외 기질을 세포외 기질세포와 함께 혼합하여 겔을 만들고 이를 압축하여 세포 지지체 시트를 만드는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따라 탈세포화 세포외 기질을 포함한 콜라겐 겔의 탈수 압축 공정을 통해 탈세포화 세포외 기질이 포함된 콜라겐 시트를 제작하는 과정에 대한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일예에서 탈세포화 세포외 기질을 함유하는 콜라겐 겔의 탈수 압축을 위한 장비의 일예를 도시한 것이다.
도 4는 실시예 2에 따라 세포배양 1일, 3일 및 7일차에 세포를 염색하고 공초점 레이저 스캔 현미경으로 측정한 세포 지지체 시트와 상기 시트내 배양된 세포외 기질 세포의 분포와 그 형상을 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 2-2에 따라, 본원 발명에 따른 각막조직의 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔을 포함하는 세포 지지체와, 콜라겐만을 포함하는 세포 지지체에 대해서, 각막세포의 positive marker의 발현을 나타내는 도면이다. FIG. 1 is a schematic view showing a process of preparing a cell support sheet by mixing a collagen and a de-aeration keratocyte extracellular matrix with extracellular stromal cells according to an embodiment of the present invention, and compressing the gel to form a cell support sheet.
FIG. 2 is a schematic view illustrating a process for preparing a collagen sheet containing a de-saturated cell matrix through a dehydration / compression process of a collagen gel including a degassed extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
Fig. 3 shows an example of equipment for dehydrating and compressing collagen gels containing an outgassing extracellular matrix in an example of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the distribution and shape of the cell support sheet and the extracellular stromal cells cultured in the sheet stained with the cells on
FIG. 5 is a graph showing the expression of a positive marker of corneal cells in a collagen-containing cell support and a collagen-only cell support, according to Example 2-2 of the present invention. Fig.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 예시적인 의미로 제공되는 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the following examples are offered by way of illustration only and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예Example 1. 탈세포화 1. Tax evasion 세포외Extracellular 기질을 함유하는 콜라겐 시트 Collagen sheet containing substrate
1-1: 탈세포화 1-1: Tax evasion 세포외Extracellular 기질 재료의 준비 Preparation of substrate material
우선 각막은 돼지, 소 등의 각종 동물군에서 선택하여서 할 수 있는데 본 발명에서는 소 각막을 사용하였다. 각막모양은 대부분의 크기가 대부분 10 mm 크기이며 동공모양 대로 절개를 하고 상피와 내피 또한 절개한다. 스토로마층의 두께는 500 um정도 이며 두께의 차이가 있으며 얇은 두께의 스트로마는 그대로 사용하고 500 um정도의 스토로마는 두 세겹으로 다시 분리가 가능하다. 완충용액으로 20~30 워싱을 한 후 냉동건조를 하루 동안 진행한다. 이 후, 0.5% triton과 20Mm NH4OH를 3~4시간 150 rpm에서 교반을 진행하고 Tris 용액에서 24h 150~200 rpm으로 교반하게 되면 대부분의 남아있던 DNA는 제거된다. 이후 1% Triton과 함께 10Mm Tris로 4~6 시간 교반을 진행하고 24~ 48h 완충용액을 12h 마다 갈아주면서 워싱하게 되면 남아있던 시약들의 성분들도 모두 제거된다. 이 후에 냉동건조를 이틀 동안 한 후에 잘 갈아서 pH를 7.4로 1M 아세트산을 이용하여 맞춘 후에 콜라겐과 혼합하여 사용하게 된다. 상기 얻어진 탈세포화 세포외 기질재료는 콜라겐 용액과 동일한 밀도를 갖도록 세포 배양배지(DMEM; Gipco®)와 혼합하였다.First, the cornea can be selected from various animal groups such as pigs and cows. In the present invention, bovine cornea is used. Most of the cornea is 10 mm in size, and the incision is made in the pupil shape and the epithelium and endothelium are also incised. The thickness of the stroma layer is about 500 μm. Thickness of the stroma is used as it is and thickness of the stroma is about 500 μm. After 20 ~ 30 washes with buffer solution, freeze-drying is carried out for one day. After that, 0.5% triton and 20 mM NH 4 OH were stirred at 150 rpm for 3 ~ 4 hours and stirred at 150 ~ 200 rpm for 24 h in Tris solution. Most of the remaining DNA was removed. Thereafter, the mixture is stirred with 10 mM Tris for 4 to 6 hours with 1% Triton, and 24 to 48 h buffer solution is changed for 12 hours. When the solution is washed, all components of the remaining reagents are removed. After this, freeze-drying is carried out for two days, and the mixture is well ground, adjusted to pH 7.4 with 1M acetic acid, and then mixed with collagen. The obtained degassed extracellular matrix material was mixed with cell culture medium (DMEM; Gipco) so as to have the same density as the collagen solution.
1-2: 콜라겐 용액 및 탈세포화 1-2: Collagen solution and de-saturation 세포외Extracellular 기질 용액의 준비 Preparation of Substrate Solution
실시예 1-1에서 준비된 탈세포화 세포외 기질을 재조합 콜라겐과 포함하는 세포 지지체 시트를 제작하기 위해서는 일련의 단계가 필요하다. A series of steps are required to prepare a cell support sheet containing the recombinant collagen and the degassed outer cell matrix prepared in Example 1-1.
아세트산 용액 (0.02N)에 용해되어 있는 3~4 mg/mL의 Rat tail type I 콜라겐(Corning®)을 이용하여 1M 수산화 나트륨을 이용해 중화시킴과 동시에 PBS 또는 세포배양배지를 첨가하여 2.5 ~ 3.5 mg/mL 정도의 농도를 갖는 (예, 3.4 mg/mL의 농도를 갖는 콜라겐 2.6 mL에 1M 수산화 나트륨 0.06 mL 와 세포배양배지 0.3 mL를 첨가하여 최종적으로 3 mg/mL의 농도를 갖는) 중화 콜라겐 용액(Neutralized collagen solution)을 제조하였다. 탈세포화 세포외 기질이 포함된 콜라겐 겔과의 비교를 위한 콜라겐 용액의 경우에는 3 x 103 개/mL 내지 104 개/mL 의 밀도로 세포외 기질세포를 함께 혼합하였다. Neutralized with 1 M sodium hydroxide using 3 to 4 mg / mL Rat tail type I collagen (Corning®) dissolved in acetic acid solution (0.02 N) and added with PBS or cell culture medium to give 2.5 to 3.5 mg (for example, by adding 0.06 mL of 1 M sodium hydroxide and 0.3 mL of cell culture medium to 2.6 mL of collagen having a concentration of 3.4 mg / mL), and then adding a neutralized collagen solution having a final concentration of 3 mg / mL (Neutralized collagen solution). In the case of the collagen solution for comparison with the collagen gel containing the deteriorated extracellular matrix, extracellular stromal cells were mixed together at a density of 3 x 10 3 / mL to 10 4 / mL.
상기 세포외 기질 세포는 다음과 같은 과정을 통해 수득하였다. 먼저, 각막과 결막을 포함하는 인간 각막 윤부를 Dispase II (4 mg/ml, PBS)에 담구어 37℃ 에 10분간 반응시키고 Phosphate buffered saline (PBS)에 수세 후 0.25% Trypsin-EDTA에 37℃에 10분간 반응시켰다. 이후, 수술용 칼을 이용하여 상피세포 및 내피세포를 제거하고 Collagenase I (5 mg/ml, PBS)에 37℃ 조건에서 2시간 이상 반응시켰다. 각막이 완전히 분해되었을 때 상층액을 회수하고, 1000 rpm의 속도로 5분간 원심분리를 진행하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 Stromal Cell Growth Medium (SCGM) 배양액을 이용하여 배양조(Tissue culture flask)에서 배양을 진행하여 상기 시트 제작에 이용하였다.The extracellular stromal cells were obtained through the following procedure. Human corneal limbus containing corneas and conjunctiva was immersed in Dispase II (4 mg / ml, PBS), incubated at 37 ° C for 10 minutes, washed with phosphate buffered saline (PBS) and incubated in 0.25% Trypsin-EDTA at 37 ° C The reaction was carried out for 10 minutes. Subsequently, epithelial cells and endothelial cells were removed using a surgical knife and reacted at 37 ° C for 2 hours or longer in Collagenase I (5 mg / ml, PBS). When the cornea was completely degraded, the supernatant was recovered and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to recover the cells. The recovered cells were cultured in a Tissue culture flask using a culture medium of Stromal Cell Growth Medium (SCGM) and used in the production of the sheet.
1-3: 탈세포화 기질을 함유하는 콜라겐 시트 제조1-3: Preparation of Collagen Sheet Containing Depleted Saturated Substrate
실시예 1-2에서 얻은 세포외 기질세포를 함유하는 콜라겐 용액과, 실시예 1-1에서 얻은 세포 배양배지와 탈세포화 세포외 기질 용액의 혼합 용액을 세포외 기질과 콜라겐의 중량비가 1:1이 되도록 혼합하여, 실린더 형상의 몰드에 주입하고, 세포 배양기 내에서 30분에서 1시간 정도 37℃를 유지시켜 탈세포화 세포외 기질이 혼합된 콜라겐 겔의 성형체를 제조하였다. The collagen solution containing the extracellular stromal cells obtained in Example 1-2 and the mixed solution of the cell culture medium and the degassed extracellular matrix solution obtained in Example 1-1 were mixed at a weight ratio of extracellular matrix and collagen of 1: The mixture was injected into a cylindrical mold, and maintained at 37 캜 for 30 minutes to 1 hour in a cell incubator to prepare a molded body of collagen gel mixed with degassed extracellular matrix.
본 실시예에 따른 가압에 의한 압축 및 탈수 과정을 나타내는 모식도를 도 2에 도시하고, 압축장비의 일예를 도 3에 나타냈다. FIG. 2 is a schematic view showing a compression and dehydration process by pressurization according to the present embodiment, and FIG. 3 shows an example of a compression device.
구체적으로, 스텝모터를 통해 최소 2 um 의 스텝으로 작동하는 선형 스테이지의 움직임을 PID control 방식을 통해 움직임을 제어함으로써 상기 제작된 겔에 힘을 가하게 된다. 겔의 경우 상판과 하판 사이에 콜라겐으로부터 수분만을 투과시키기 위한 나일론 멤브레인, 수분을 흡수하기 위한 용지와 함께 위치하게 되며, 겔에 가해지는 힘은 로드셀을 통하여 지속적으로 피드백을 받아 PID 제어를 위한 결과값으로 이용함으로써 보다 정밀한 압축이 이루어지도록 하였다. 상판과 하판의 경우 하판의 하단에 위치한 goniometer를 이용하여 평행을 이루도록 하였다. 이와 같은 압축장비를 통해 100 gf의 힘을 가해 겔의 탈수화와 함께 탈세포화 세포외 기질을 재조합 콜라겐으로 감싼 형태의 압축 시트로서 두께 약 200 um 미터 및 10~15 mm 정도의 직경을 갖는 시트를 제작하였다. Specifically, the motion of the linear stage operated at a step of at least 2 [mu] m through a step motor is controlled by the PID control method, thereby applying the force to the prepared gel. In the case of the gel, a nylon membrane for permeating water only from the collagen is placed between the upper plate and the lower plate together with a paper for absorbing moisture. The force applied to the gel is continuously fed back through the load cell, So that more accurate compression can be achieved. In the case of the upper plate and the lower plate, the goniometer located at the lower end of the lower plate was used to make parallelism. A compression sheet having a deformation rate of 100 gf and a gel dehydration and a degassed extracellular matrix wrapped with recombinant collagen was used as a compression sheet, and a sheet having a diameter of about 200 μm and a diameter of about 10 to 15 mm Respectively.
실시예Example 2. 세포 지지체 시트를 이용한 세포 배양 2. Cell culture using cell support sheet
2-1: 2-1: 각막세포의Corneal cell 세포생존율 확인 Confirm cell viability
실시예 1-2에서 얻어진 세포 지지체 시트의 내부에 포함된 세포외 기질 세포는 압축을 통해 얻어진 시트 내부에서 배양조 내의 Stromal Cell Growth Medium (SCGM) 배양액을 이용하여 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포배양기에서 7일간 배양하였으며, 배양액은 2~3일에 한 번씩 교환하였다. The extracellular stromal cells contained in the cell support sheet obtained in Example 1-2 were cultured in a medium containing Stromal Cell Growth Medium (SCGM) in a culture tank at 37 ° C under 5% CO 2 For 7 days, and the culture medium was changed every 2 to 3 days.
상기 배양된 세포의 생존여부와, 세포 형상 및 증식을 확인하고자, Viability Kit (Calcein AM, Ethidium homodimer-1 (EthD-1))를 사용하여 세포외 기질 세포를 염색하였다. 구체적으로, 세포 염색은 LIVE/DEAD® Calcein AM (4 mM)과 EthD-1 (2 mM)을 Phosphate buffered saline (PBS)에 함께 녹여 각각 2 uM의 농도의 용액을 제조하고 각각의 시트상에 150~200 uL씩 첨가하여 30분간 염색하였다. Extracellular stromal cells were stained with Viability Kit (Calcein AM, Ethidium homodimer-1 (EthD-1)) to confirm the survival of the cultured cells, cell shape and proliferation. Specifically, LIVE / DEAD® Calcein AM (4 mM) and EthD-1 (2 mM) were dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to prepare solutions each having a concentration of 2 μM. ~ 200 uL was added and stained for 30 minutes.
염색된 세포는 공초점 레이저 스캔 현미경(confocal laser scanning microscope)와 형광 현미경(fluorescent microscope, Eclipse TS 100-F, Nikon)을 이용하여, 시트의 두께방향으로의 위치에 따라 8~10 um 씩 15~20 step에 걸쳐 촬영하였으며 그 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4는 실시예 2에 따라 세포배양 1일, 3일 및 7일차에 세포를 염색하고 공초점 레이저 스캔 현미경으로 측정한 상기 세포 지지체 내에서 배양된 각막 실질 세포 와 그 형상을 나타내는 사진이다.The stained cells were stained with a confocal laser scanning microscope and a fluorescent microscope (Eclipse TS 100-F, Nikon) at 15 - The photographs were taken over 20 steps and the results are shown in FIG. FIG. 4 is a photograph showing the corneal stromal cells cultured in the cell support and their shape measured by confocal laser scanning microscopy by staining cells at
도 4에 나타낸 바와 같이 두께방향으로 측정된 이미지를 병합하여, 1, 5, 7일차에 대한 세포의 분포를 살펴보면, 콜라겐만을 이용하여 제작한 시트 내에서 보다 탈세포화 세포외 기질을 섞은 경우 세포외 기질 세포의 수가 훨씬 더 많이 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한 세포외 기질 세포가 콜라겐만을 이용하여 제작된 시트 내 보다 형태와는 다르게 탈세포화 세포외 기질을 섞은 시트 내에서 훨씬 더 길게 뻗은 형태로 자라는 것을 확인할 수 있다. 즉, 탈세포화 세포외 기질이 갖고 있는 구조 외에 다른 단백질의 영향을 받아 세포의 증식 및 기능발현에 훨씬 도움이 되는 시트 제작이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 4, when the images measured in the thickness direction are merged and the distribution of cells on the 1 st, 5 th and 7 th day is examined, in the case of mixing the degassed extracellular matrix in the sheet prepared using only collagen, It can be seen that the number of stromal cells is increased much more. In addition, it can be seen that the extracellular matrix cells grow much longer in the sheet mixed with the deglazed extracellular matrix, unlike the form which is produced using only collagen. In other words, it was confirmed that it is possible to produce a sheet which is much more effective in cell proliferation and function expression, under the influence of other proteins besides the structure possessed by the deteriorated extracellular matrix.
2-2: 2-2: 각막세포의Corneal cell positive marker의 발현 확인 Expression of positive marker
우선 각막세포(keratocyte)가 각막의 투명함을 유지하게 하는 데에 가장 중요한 positive marker인 KERA(keratocan sulfate proteoglycan)와 ALDH(aldehyde dehydrogenase)와 이들의 발현을 조절하는 FGF-2 양상을 확인하였다. First, keratocan sulfate proteoglycan (KERA), aldehyde dehydrogenase (ALDH), and FGF-2, which controls the expression of keratocyte, are the most important positive markers for maintaining keratocyte transparency.
FGF-2 발현양상은 PCR을 수행하여 확인하였다. 구체적으로, 유전자들의 프라이머(primer)들은 사람의 각막세포(keratocyte)의 KERA, ALDH, FGF-2의 특정부위들을 인지할 수 있게 제작되었다. 콜라겐과 탈세포화기질에 encapsulate 된 세포들은 TRIZOL을 이용하여, RNA를 추출한다. 이후 분리된 RNA는 빠르게 degradation이 되므로, 안정한 DNA로 reverse transcript를 한다. 이 과정은 cDNA Synthesis kit을 이용한다. 이 때 RNA의 양은 50 ng을 EcoDry Premix(Oligo dT 포함되어있음) 에 넣고 42℃에서 1시간 반응한다. 그 후에 70℃에서 10분 반응을 멈춘 후 PCR을 시행한다. PCR수행시 DNA의 양을 많이 넣어서 하면 비 특이적인 결합이 나올 수 있으므로 50~100 ng으로 20 ul에 넣어서 시행한다. 프라이머(primer)는 100~120 pml로 0.5~1 ul로 넣을 수 있게 만들어서, 실행하며 GC함량은 40~60%로 제작되었다. qPCR은 primer와 결합하여 증폭되는 template DNA에 형광 probe 결합되는 것을 정량한 실험으로 수행했다. 상기 실험결과를 도 5에 나타냈으며, 도 5에서 X축은 유전자의 종류, Y축은 유전자들의 상대적인 발현양 차이를 나타낸다. 유전자들이 콜라겐보다 상대적으로 많은 발현양을 보이며, 이는 각막의 투명도와 관련하여 중요한 유전자들의 발현이 세포로부터 많이 이루어지고 있음을 나타낸다.FGF-2 expression pattern was confirmed by PCR. Specifically, the primers of the genes were designed to recognize specific regions of KERA, ALDH, and FGF-2 of human keratocyte. Cells that are encapsulated in collagen and de-saturated cells are extracted with TRIZOL. Since the isolated RNA is rapidly degraded, reverse transcripts are made with stable DNA. This process uses a cDNA synthesis kit. At this time, 50 ng of RNA is added to EcoDry Premix (containing Oligo dT) and reacted at 42 ° C for 1 hour. After the reaction is stopped at 70 ° C for 10 minutes, PCR is performed. When PCR is carried out, the amount of DNA should be increased to 50 ~ 100 ng in 20 μl since non-specific binding may occur. The primer was made to be in the range of 0.5-1 μl with 100-120 pml, and the GC content was 40 ~ 60%. qPCR was performed by quantitative analysis of binding of a fluorescent probe to template DNA amplified by binding with a primer. The results of the experiment are shown in FIG. 5. In FIG. 5, the X axis represents the type of gene and the Y axis represents the relative amount of expression of genes. The genes show relatively higher expression levels than collagen, indicating that many of the important genes are expressed from the cells in relation to the transparency of the cornea.
그 결과 도 5에 도시된 것과 같이, 대조군인 콜라겐만 있는 것에 비해 탈세포화 세포외 기질을 섞은 경우 이들 유전자들의 발현이 현저하게 많이 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 더욱이 Keratocyte는 환경에 의해 자극이 되어 활성화되면 fibroblast로 되어서, 각막을 불투명하게 하는 MMP(metalloproteinase)와 opaque extracellular protein 을 분비하게 되는데, 이때는 각막 투명함을 유지하는데 관련된 KERA, ALDH와 같은 유전자들은 분비하지 않는다. 종래의 연구결과들을 고려해 볼 때 위의 positive 마커들이 발현이 되는 경우는 keratocyte가 안정화된 상태라고 볼 수 있다. 즉 탈세포화 세포외 기질을 섞은 경우는 keratocyte에게 가장 효과적인 환경을 제공한다고 볼 수 있다. As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the expression of these genes was remarkably increased when the deglycosylated extracellular matrix was mixed with the collagen alone as a control group. Furthermore, Keratocyte is activated by environmental stimulation and becomes fibroblast, which secretes MMP (metalloproteinase) and opaque extracellular protein which makes the cornea opaque. In this case, genes such as KERA and ALDH which are related to maintaining corneal transparency are secreted Do not. Considering the results of previous studies, keratocyte is stabilized when the above positive markers are expressed. In other words, when the depleted outer cell matrix is mixed, it can provide the most effective environment for keratocyte.
Claims (16)
상기 각막조직의 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔은 25: 75 내지 75: 25 중량비로 포함되며,
상기 지지체 시트는, 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐을 함유하는 성형체에, 30 gf 내지 2,000 gf의 압력으로 가압하여 제조되고,
상기 지지체 시트의 밀도는 5~30 mg/ml이고 탈수율이 70 내지 99 중량%인, 기계적 강도가 증가된 세포의 지지체 시트.A support sheet for a cell having increased mechanical strength, comprising an extracellular extracellular matrix, an extracellular part of an animal corneal tissue, and a collagen gel,
The de-saturated cell extracellular matrix of the corneal tissue and the collagen gel are contained in a weight ratio of 25:75 to 75:25,
The support sheet is produced by pressing a molded body containing a degassed extracellular matrix and collagen at a pressure of 30 gf to 2,000 gf,
Wherein the support sheet has a density of 5 to 30 mg / ml and a dehydration rate of 70 to 99% by weight.
상기 탈세포화 세포외 기질 용액과 콜라겐 용액의 혼합액을 몰드에 주입하여 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔을 함유하는 성형체를 제조하고,
압축기를 사용하여 상기 성형체에 30 gf 내지 2,000 gf의 압력으로 가압하여 압축 및 탈수공정을 수행하는 단계를 포함하며,
상기 압축기는, 그 사이에 성형체를 두어 압축할 수 있도록 평행하게 배치되며, 수분을 통과하나 세포외 기질과 콜라겐 겔 성분은 통과하지 못하는 멤브레인이 부착된 한쌍의 압축판; 및 상기 압축판 중 적어도 하나에 부착되며 압력을 가하는 장치를 구비한 것인,
각막조직의 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔을 포함하는 기계적 강도가 증가된 세포의 지지체 시트의 제조방법.The extracellular matrix and extracellular matrix of animal corneal tissue and collagen solution were prepared,
A mixture of the degassed extracellular matrix solution and collagen solution is injected into a mold to prepare a molded body containing a degassed extracellular matrix and a collagen gel,
Compressing the molded body by using a compressor at a pressure of 30 gf to 2,000 gf to perform a compression and dehydration process,
The compressor includes a pair of compression plates disposed parallel to each other so as to compress the molded body therebetween, and having a membrane through which water passes but can not pass through the extracellular matrix and the collagen gel component; And a device for applying pressure to at least one of said compression plates.
A method for producing a support sheet of a cell having increased mechanical strength including degeneration of extracellular matrix of corneal tissue and collagen gel.
상기 세포의 지지체 시트에 접종하여 배양하거나 또는 세포의 지지체 시트 제조시 콜라겐 용액에 첨가된 각막 유래 세포를 포함하는 인공 각막 시트. A cell support according to any one of claims 1, 2, 3 and 6 Sheet and
Wherein the cornea-derived cells are inoculated on the support sheet of the cell and cultured, or the cornea-derived cells added to the collagen solution when the support sheet of the cell is prepared.
The artificial cornea sheet according to claim 15, wherein the cornea-derived cells are at least one selected from the group consisting of corneal endothelial cells, corneal epithelial cells, and corneal stromal cells.
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