KR101853993B1

KR101853993B1 - 펩티드 방사성추적자 조성물

Info

Publication number: KR101853993B1
Application number: KR1020137006689A
Authority: KR
Inventors: 피터 브라이언 이베슨; 라지브 발라; 바르트 인드레볼; 가레트 겟볼드젠
Original assignee: 지이 헬쓰케어 리미티드
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2011-08-11
Publication date: 2018-05-02
Also published as: ES2626410T3; AU2011290856A1; IL224463A; JP6014592B2; MX348733B; RU2594167C2; MX2013001939A; US20130149241A1; WO2012022676A1; CA2807491A1; JP2013540702A; NZ606466A; BR112013003469A2; SG187878A1; CA2807491C; RU2013105491A; KR20130135242A; US9533059B2; CN103153350A; CL2013000483A1

Abstract

본 발명은 생체내 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화에 적절한 방사성표지화 c-Met 결합 펩티드를 포함하는 영상화 시약 조성물에 관한 것이다. c-Met 결합 펩티드는 방사성동위원소 ¹⁸F로 표지화된다. 또한, 제약 조성물, 시약 및 조성물의 제조 방법, 및 특히 암의 관리에서 사용하기 위한 조성물을 사용한 생체내 영상화 방법이 개시되어 있다.

Description

펩티드 방사성추적자 조성물{PEPTIDE RADIOTRACER COMPOSITIONS}

본 발명은 생체내 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화에 적절한 방사성표지화 c-Met 결합 펩티드를 포함하는 영상화 시약 조성물에 관한 것이다. c-Met 결합 펩티드는 방사성동위원소 ¹⁸F로 표지화된다. 또한, 제약 조성물, 시약 및 조성물의 제조 방법, 및 특히 암의 진단에서 사용하기 위한 조성물을 사용하는 생체내 영상화 방법이 개시되어 있다.

간세포 성장 인자(HGF)(또한, 산란 인자(SF)로서 공지됨)는 다양한 생리학적 과정, 예컨대 상처 치유 및 혈관신생에 관여하는 성장인자이다. HGF와 그의 수용체(c-Met) 상호작용의 고 친화력 상호작용이 종양 성장, 침습 및 전이에 연루되어 있다.

크누드슨(Knudsen) 등은 영상화 및 치료에 미칠 수 있는 영향과 함께 전립선 암에서의 HGF 및 c-Met의 역할을 검토하였다(문헌 [Adv.Cancer Res., 91, 31-67 (2004)]). 진단 및 치료를 위한 표지화 항-met 항체가 WO 03/057155에 기재되어 있다.

c-Met는 상피 기원의 많은 인간 암에서 종양 성장, 침습 및 전이에 관여하는 것으로 밝혀졌다. c-Met는 대부분의 암종에 의해 발현되고, 정상 조직에 비해 상승된 발현이 폐, 유방, 직결장, 췌장, 두경부, 장, 간세포, 난소, 신장, 신경교종, 흑색종 및 다수의 육종의 암에서 검출되었다. 직결장 암종(CRC)에서, c-Met의 과다발현이 질병의 초기 종양전 병변인 이형성 이상선와에서 검출되었다. 두경부 편평상피세포 암에서, c-Met는 대략 80%의 원발성 종양에서 발현되거나 과다발현되는 것으로 보고되었다. 뼈로의 전립선암 전이에서, c-Met는 뼈 전이의 80% 이상에서 과다발현되는 것으로 보고되었다.

정상 상태 하에서는, c-Met는 상피 세포에서 발현되고, 중간엽 유래된 HGF에 의하여 주변분비(paracrine) 방식으로 활성화된다. 정상 세포에서 c-Met의 활성화는 일시적인 현상이고, 엄격히 조절된다. 그러나, 종양 세포에서는, c-Met는 구성적으로 활성일 수 있다. 암에서는, c-Met 증폭/과다발현, c-Met 돌연변이의 활성화(예, 구조적 변경) 및 자가분비(autocrine) 신호 루프의 발생을 통한 자율 성장 조절의 획득을 통해 이상 c-Met 자극이 달성될 수 있다. 추가로, c-Met 수용체의 결함적 하향-조절도 세포 막에서 이상 c-Met 발현에 기여할 것이다. c-Met의 과다발현은 HGF 의존적인 반면(자가분비/주변분비), 돌연변이에 의해 유발된 구조적 변경은 HGF 비의존적이다(예, 세포외 도메인의 손실).

WO 2004/078778은 c-Met와 HGF를 포함하는 복합체 또는 c-Met와 결합하는 폴리펩티드 또는 다량체 펩티드 구조물을 개시하고 있다. 펩티드의 대략 10개의 상이한 구조적 부류가 기재되어 있다. WO 2004/078778은 시험관내 및 생체내 응용을 위해 펩티드를 검출가능한 표지로 표지화하거나 또는 치료적 응용을 위해 약물로 표지화할 수 있음을 개시하고 있다. 검출가능한 표지는 효소, 형광성 화합물, 광학 염료, 상자성 금속 이온, 초음파 대비 시약 또는 방사성핵종일 수 있다. WO 2004/078778의 바람직한 표지는 방사성 또는 상자성인 것으로 언급되고, 가장 바람직하게는 금속 킬레이터에 의해 킬레이트화된 금속을 포함한다. WO 2004/078778은, 방사성핵종이 ¹⁸F, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁷Br, ⁷⁶Br, ^99mTc, ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴⁷Sc, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴¹Ce, ¹¹¹In, ¹⁶⁸Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴⁰La, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁸⁶Re, ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ^2l3Bi, ^2l4Bi, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ^117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁸Au 및 ¹⁹⁹Au로부터 선택될 수 있음을 언급하고 있다. WO 2004/078778은(62면) 진단 목적을 위한 바람직한 방사성핵종이 ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁹⁹ ^mTc 및 ¹¹¹In이고, ⁹⁹ ^mTc가 특히 바람직함을 언급하고 있다.

WO2008/139207은 근-적외선 파장 600 내지 1200 nm의 녹색 광을 사용하여 포유동물 신체의 생체내 영상화에 적절한 광학 리포터 영상화 잔기로 표지화된 17 내지 30 아미노산의 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 개시하고 있다. c-Met 결합 펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함한다.

Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶

[상기 식에서, X¹는 Asn, His 또는 Tyr이고;

X²는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이고;

X³은 Thr 또는 Arg이고;

X⁴는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이고;

X⁵는 Ser 또는 Thr이고;

X⁶은 Asp 또는 Glu이고;

Cys^a ^-d는 각각 시스테인 잔기이며, 잔기 a 및 b 뿐만 아니라 c 및 d가 고리화되어 2개의 별개의 디술피드 결합을 형성한다]. WO 2008/139207의 광학 리포터는 바람직하게는 시아닌 염료이다.

WO 2009/016180은 WO 2008/139207의 것과 유사한 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 개시하고 있으며, 여기에서 광학 리포터는 벤조피릴륨 염료이다. WO 2008/139207 및 WO 2009/016180의 시약은 시험관내 및 생체내 광학 응용, 특히 인간 신체의 생체내 광학 영상화에 유용한 것으로 언급된다. 직결장 암의 광학 영상화가 바람직한 응용이다.

본 발명은 생체내 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화에 적절한 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 펩티드를 포함하는 영상화 시약 조성물에 관한 것이다. c-Met 결합 펩티드는 라이신(Lys) 잔기를 통해 표지화된다.

상기 영상화 시약 조성물은 바람직하게는 존재하는 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드의 수준을 억제한다. 이것은, ¹⁸F-표지화 cMBP가 매우 낮은 화학적 농도로 존재하고 투여되는 방사성추적자이기 때문에 유리하며, 따라서 달리 제거되지 않는다면 비표지화 cMBP가 큰 화학적 과량으로 존재할 것이다. 이것은 생체내 PET 영상화 응용을 위해 중요한 것으로 확인되었는데, 그 이유는 그렇지 않은 경우에 비표지화 cMBP가 생체내 c-Met 결합 부위에 대해 ¹⁸F-표지화 cMBP와 효과적으로 경쟁하기 때문이다. 따라서, 이것은 생체내 흡수 및 신호-대-배경 비율에 대해 해로운 효과를 갖는다. 예를 들어 c-Met 결합 펩티드가 광학 리포터 염료로 표지화될 때, 포함된 표지화된 펩티드의 화학적 양이 PET의 경우보다 실질적으로 커서 경쟁 문제가 일어나지 않기 때문에, 이러한 문제는 선행 기술에서 보고되지 않았다.

본 발명의 영상화 시약 조성물은, 이전에 인지되지 않았던 문제로 방사성표지화 cMBP 펩티드가 필터를 비롯한 다양한 물질에 대해 접착되는 문제를 또한 극복한다. 가용화된 조성물이 제공되며, 이는 ¹⁸F-표지화 cMBP 방사성추적자가 필터에 대한 흡착으로 인한 방사성추적자의 유의한 손실없이 제조될 수 있고, 살균 여과할 수 있음을 의미한다.

제1 측면에서, 본 발명은 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하는 영상화 시약을 제공하고, 여기에서 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드는 하기 화학식 I의 18 내지 30량체 시클릭 펩티드이다.

<화학식 I>

Z¹-[cMBP]-Z²

[상기 식에서,

cMBP는 화학식 II를 가지며:

<화학식 II>

-(A)_x-Q-(A')_y-

{상기 식에서, Q는 아미노산 서열(SEQ-1)이고:

-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-

(여기에서, X¹은 Asn, His 또는 Tyr이고;

X²는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이고;

X³은 Thr 또는 Arg이고;

X⁴는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이고;

X⁵는 Ser 또는 Thr이고;

X⁶은 Asp 또는 Glu이고;

Cys^a-d는 각각 시스테인 잔기이며, 잔기 a 및 b 뿐만 아니라 c 및 d가 고리화되어서 2개의 별개의 디술피드 결합을 형성한다);

A 및 A'는 독립적으로 Cys 이외의 임의의 아미노산이고, 단 A 및 A' 중 적어도 하나는 존재하고 Lys이며;

x 및 y는 독립적으로 0 내지 13의 정수이고, [x+y] = 1 내지 13이 되도록 선택된다};

Z¹은 cMBP의 N-말단에 결합되고, H 또는 M^IG이고;

Z²는 cMBP의 C-말단에 결합되고, OH, OB^c 또는 M^IG이고,

(여기에서 B^c는 생체적합성 양이온이며;

각각의 M^IG은 독립적으로 cMBP 펩티드의 생체내 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체적합성 기인 물질대사 억제 기이다);

cMBP는 ¹⁸F로 A 또는 A' 기의 Lys 잔기에서 표지화된다.]

용어 "영상화 시약"은 포유동물 신체를 영상화 하기에 적절한 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 생체내 본래상태의 포유동물 신체이고, 더욱 바람직하게는 인간 대상체이다. 바람직하게는, 영상화 시약은 최소의 침습 방식으로, 즉 전문적인 의료적 판단 하에서 수행될 때 포유동물 대상체에 실질적인 건강상의 위험없이 포유동물 신체에 투여될 수 있다. 이러한 최소의 침습 투여는 바람직하게는 국소 또는 전신 마취의 필요 없이 상기 대상체의 말초 정맥으로의 정맥내 투여이다.

여기에서 사용된 용어 "생체내 영상화"는 포유동물 대상체의 내부 측면의 전부 또는 일부의 영상을 비-침습적으로 생성하는 기술을 가리킨다.

용어 "c-Met 결합 시클릭 펩티드"(또한, c-Met(또는, 단순히 MET)로서 공지됨)는 간세포 성장 인자 수용체에 결합하는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 적절한 펩티드는 화학식 I의 18 내지 30개 아미노산의 시클릭 펩티드이다. 이러한 펩티드는 약 20 nM 미만의 c-Met에 대한 겉보기 K_D를 갖는다. 상기 펩티드의 cMBP 서열은 프롤린 잔기를 포함하고, 이러한 잔기는 주쇄 아미드 결합의 시스/트랜스 이성질체화를 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 cMBP 펩티드는 이러한 임의의 이성질체를 포함한다.

Z¹ 기는 cMBP의 마지막 아미노산 잔기의 아민기, 즉 아미노 말단을 치환한다. 따라서, Z¹이 H일 때, cMBP의 아미노 말단은 마지막 아미노산 잔기의 자유 NH₂ 기로 종결된다. Z² 기는 cMBP의 마지막 아미노산 잔기의 카르보닐 기 - 즉 카르복시 말단을 치환한다. 따라서, Z²가 OH일 때, cMBP의 카르복시 말단은 마지막 아미노산 잔기의 자유 CO₂H 기로 종결되고, Z²가 OB^c일 때 말단 카르복시 기는 CO₂B^c 기로서 이온화된다.

용어 "생체적합성 양이온"(B^c)이란, 이온화된 음 전하 기와의 염을 형성하는 양 전하 반대이온을 의미하고, 여기에서 상기 양 전하 반대이온은 또한 비-독성이고, 따라서 포유동물 신체, 특히 인간 신체에 투여하기에 적절하다. 적절한 생체적합성 양이온의 예는, 알칼리 금속 나트륨 또는 칼륨; 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘; 및 암모늄 이온을 포함한다. 바람직한 생체적합성 양이온은 나트륨 및 칼륨, 가장 바람직하게는 나트륨이다.

용어 "물질대사 억제 기"(M^IG)는 아미노 말단(Z¹) 또는 카르복시 말단(Z²)에서 cMBP 펩티드의 생체내 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체적합성 기를 의미한다. 이러한 기는 당업자에게 잘 알려져 있고, 펩티드 아민 말단에 대하여: N-아실화 기 -NH(C=O)R^G(여기에서, 아실 기 -(C=O)R^G는 C₁ _-6 알킬 또는 C₃ _-10 아릴 기로부터 선택된 R^G를 갖거나 폴리에틸렌글리콜(PEG) 구성 블록을 포함함)로부터 선택된다. 펩티드 카르복시 말단에 대해서는 카르복스아미드, tert-부틸 에스테르, 벤질 에스테르, 시클로헥실 에스테르, 아미노 알콜 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 구성 블록으로부터 선택된다. 바람직한 PEG 기는 하기 화학식 IA 또는 IB의 생체개질제이다.

<화학식 IA>

화학식 IA의 17-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15-테트라옥사헵타데칸산

[상기 식에서, p는 1 내지 10의 정수이다.]

대안적으로, 하기 화학식 IB의 프로피온산 유도체를 기초로 한 PEG-유사 구조가 사용될 수 있다.

<화학식 IB>

[상기 식에서, p는 화학식 IA에 대해 정의된 것과 같고, q는 3 내지 15의 정수이다.]

화학식 IB에서, p는 바람직하게는 1 또는 2이고, q는 바람직하게는 5 내지 12이다.

바람직한 아미노 말단 M^IG 기는 아세틸, 벤질옥시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸, 가장 바람직하게는 아세틸이다.

용어 "¹⁸F-방사성표지화"는, c-Met 결합 시클릭 펩티드가 그것에 공유 결합으로 접합된 방사성동위원소 ¹⁸F를 가짐을 의미한다. ¹⁸F는 C-F 플루오로알킬 또는 플루오로아릴 결합을 통해 적절하게 부착되는데, 그 이유는 이러한 결합이 생체내에서 비교적 안정하여 cMBP 펩티드로부터의 ¹⁸F 방사성표지의 물질대사 절단에 대해 저항성을 부여하기 때문이다. ¹⁸F는 바람직하게는 C-F 플루오로아릴 결합을 통해 부착된다. ¹⁸F는 cMBP의 아미노산 중의 하나에 직접 부착될 수도 있지만, 바람직하게는 cMBP 상의 방사성플루오로화 치환기의 일부로서 접합된다. 상기 치환기는 바람직하게는 하기 화학식이다:

-(L)_n-¹⁸F

[상기 식에서,

L은 화학식 -(A)_m-의 합성 링커 기이고, 각각의 A는 독립적으로 -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NR(C=O)-, -(C=O)NR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR- -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, -CR₂-O-N=, -CR₂-O-NR-, -CR₂-O-NH(CO)-, C_4-8 시클로헤테로알킬렌 기, C_4-8 시클로알킬렌 기, C_5-12 아릴렌 기 또는 C₃ _-12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 구성 블록이고; 각각의 R은 독립적으로 H, C₁ _-4 알킬, C₂ _-4 알케닐, C₂ _-4 알키닐, C_1-4 알콕시알킬 또는 C_1-4 히드록시알킬로부터 선택되며;

m은 1 내지 20의 정수이고;

n은 0 또는 1의 정수이다.]

용어 "아미노산"은 L- 또는 D- 아미노산, 아미노산 유사체(예, 나프틸알라닌), 또는 자연 발생적 또는 순수한 합성 기원일 수도 있는 아미노산 모방체를 의미하고, 광학적으로 순수, 즉 단일 거울상이성질체일 수 있고, 키랄 또는 거울상이성질체의 혼합물일 수도 있다. 아미노산에 대하여 통상적인 3-문자 또는 단일 문자 약어가 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 아미노산은 광학적으로 순수하다. 용어 "아미노산 모방체"는 동배체, 다시 말해서 천연 화합물의 입체 및 전자 구조를 모방하도록 설계된 자연발생적 아미노산의 합성 유사체를 의미한다. 이러한 동배체는 당업자에게 잘 알려져 있고, 이에 한정되지 않지만 데프시펩티드, 레트로-인버소 펩티드, 티오아미드, 시클로알칸 또는 1,5-이치환된 테트라졸을 포함한다(문헌 [M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)] 참조).

용어 "펩티드"는 상기 정의된 바와 같이 펩티드 결합(즉, 하나의 아미노산의 아민을 다른 아미노산의 카르복실에 연결하는 아미드 결합)에 의해 연결된 2 이상의 아미노산을 포함하는 화합물을 의미한다.

용어 "당"은 단당류, 이당류 또는 삼당류를 의미한다. 적절한 당류는 글루코스, 갈락토스, 말토스, 만노스 및 락토스를 포함한다. 임의로, 당은 아미노산에 용이하게 결합될 수 있도록 작용화될 수도 있다. 즉, 예를 들어 아미노산의 글루코사민 유도체는 펩티드 결합을 통해 다른 아미노산에 접합될 수 있다. 아스파라긴의 글루코사민 유도체(노바바이오켐(NovaBiochem)으로부터 상업적으로 입수가능함)가 이것의 한 예이다:

A 및 A'가 "Cys 이외의 임의의 아미노산"일 때, 이것은 A 및 A' 기의 추가의 아미노산이 자유 티올 기, 특히 Cys 잔기가 부재함을 의미한다. 이것은, 추가의 Cys 잔기가 디술피드 다리결합이 Q 서열의 Cys^a-Cys^b 및 Cys^c-Cys^d 디술피드 다리결합과 혼동될 위험이 있고, 그 결과 c-Met 결합 친화력이 손실되거나 감소되기 때문이다.

바람직한 특징

본 발명의 바람직한 cMBP 펩티드는 c-Met/HGF 복합체에 대한 c-Met의 결합에 대해 약 10 nM 미만의 K_D(형광 편광 분석 측정 기준), 가장 바람직하게는 1 내지 5 nM 범위의 K_D를 갖고, 3 nM 미만이 이상적이다.

화학식 I 및 II의 cMBP 펩티드는 바람직하게는 화학식 IIA이다.

<화학식 IIA>

-(A)_x-Q-(A')_z-Lys-

[상기 식에서, A는 화학식 II에 대해 정의된 것과 같고,

z는 0 내지 12의 정수이고 [x+z] = 0 내지 12이고,

cMBP는 단지 하나의 Lys 잔기를 포함한다.]

따라서, 화학식 IIA에서, 하나의 Lys 잔기가 cMBP의 C-말단에 특이적으로 위치한다. 즉, 이것은 ¹⁸F 방사성표지가 바람직하게는 C-말단 위치에 존재함을 의미한다.

Q는 바람직하게는 SEQ-2 또는 SEQ-3의 아미노산 서열을 포함한다:

Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶

(SEQ-2);

Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-

X⁴-X⁵-X⁶-Gly-Thr (SEQ-3).

SEQ-1, SEQ-2 및 SEQ-3에서, X³은 바람직하게는 Arg이다. 화학식 I 및 화학식 II에서, -(A)_x- 또는 -(A')_y- 기는 바람직하게는 다음으로부터 선택된 링커 펩티드를 포함한다:

-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4)

-Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) 또는

-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6)

제1 측면의 cMBP 펩티드는 바람직하게는 하기 아미노산 서열(SEQ-7)을 갖는다:

Ala-Gly-Ser-Cys^a-Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

본 발명의 바람직한 영상화 시약은 M^IG 기에 의해 보호된 양쪽 cMBP 펩티드 말단을 갖고, 다시 말해서 바람직하게는 Z¹ 및 Z² 둘 다가 M^IG이고, 이것은 보통 상이하다. 이러한 방식으로 보호된 양쪽 펩티드 말단을 갖는 것은, 그렇지 않으면 빠른 펩티드 물질대사가 예상되고 그 결과 c-Met에 대한 선택적인 결합 친화력이 손실되기 때문에, 생체내 영상화 응용을 위해 중요하다. Z¹ 및 Z² 둘 다가 M^IG일 때, 바람직하게는 Z¹이 아세틸이고 Z²가 1차 아미드이다. 가장 바람직하게는, Z¹이 아세틸이고, Z²가 1차 아미드이고, ¹⁸F 잔기가 cMBP의 라이신 잔기의 엡실론 아민 측쇄에 부착된다.

방사성플루오르화 치환기 -(L)_n-¹⁸F는 c-Met 결합 펩티드의 N-말단의 알파 아미노 기에 부착될 수도 있거나, 또는 대안적으로 아미노-치환된 아미노산의 아민 측쇄(예, Lys 잔기)에 부착될 수도 있다. 바람직하게는, 이것은 cMBP의 Lys 잔기의 엡실론(ε) 아민 기에 부착된다.

바람직한 방사성플루오르화 치환기 -(L)_n-¹⁸F는 n=1을 갖고, 다시 말해서 상기 정의된 합성 링커 기가 존재한다. 더욱 바람직한 치환기는 페닐 기에 결합된 ¹⁸F 방사성표지를 포함하고, 다시 말해서 치환기는 하기 화학식이다:

-(A)_xC₆H₄-¹⁸F

[상기 식에서, A는 상기 정의된 바와 같고,

x는 0 내지 5의 정수이다.]

가장 바람직한 치환기는 Lys 아민 잔기를 플루오르화 활성 에스테르로 N-아실화하거나, 또는 Lys 아민 잔기의 아미노-옥시 유도체를 플루오르화 벤즈알데히드와 축합시킴으로써 생성되고, 하기 화학식을 갖는다:

제1 측면의 영상화 시약은 제5 측면(하기)에 기재된 것과 같이 제조될 수 있다.

제2 측면에서, 본 발명은

(i) 제1 측면의 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드;

(ii) 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드

를 포함하고,

여기서, 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드가 (i) 및 (ii)에서 동일한 아미노산 서열을 갖고,

비표지화 cMBP 펩티드가 상기 ¹⁸F-표지화 cMBP 펩티드의 몰 량의 50배 이하로 상기 조성물에 존재하는, 영상화 시약 조성물을 제공한다.

제2 측면에서 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드의 바람직한 실시양태는 제1 측면(상기)에 기재된 바와 같다.

용어 "조성물"은 그의 통상적인 의미를 갖고, 다시 말해서 특정한 성분의 혼합물이다. 조성물은 고체 또는 액체/용액 형태일 수도 있다.

용어 "비표지화"란, c-Met 결합 시클릭 펩티드가 비-방사능, 다시 말해서 ¹⁸F 또는 임의의 다른 방사성동위원소로 방사성표지화되지 않음을 의미한다. 이러한 하나 이상의 펩티드가 조성물에 존재할 수 있고, 이러한 비표지화 펩티드는 주로 제4 측면(하기)의 비-방사능 전구체를 포함한다. 용어 "비표지화"는 ¹⁹F로 표지화된 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 배제하고, 여기에서 상기 ¹⁹F는 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 방사성표지화하기 위해 사용되는 ¹⁸F-플루오라이드에 존재하고, 따라서 동일한 방사성표지화 반응의 생성물이다. 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 2개의 불소-치환된 화합물이 불소 원자의 동위원소에서만 다르다면, 이들은 거의 동일한 방식으로 화학적으로 거동하고, 따라서 그들의 분리는 극히 어렵다. 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드 또는 전구체는 바람직하게는 이미 부착된 기 Z¹ 및/또는 Z²를 갖는다. 본 발명자들은, ¹⁸F-표지화 알데히드를 사용하여 아미노옥시-작용기화 cMBP 펩티드 전구체에 접합시킬 경우, 비-방사능 알데히드 불순물이 부산물의 주요 공급원인 것을 밝혀냈다. ¹⁸F-벤즈알데히드에서 중요한 알데히드 불순물은 DMAP(즉, 4-디메틸아미노)벤즈알데히드이다. 따라서, 비-방사능 알데히드(예컨대 DMAP)와 아미노옥시-작용기화 cMBP 펩티드의 접합 생성물도 용어 "비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드"의 범위 내에 존재한다.

바람직하게는, 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드가 상응하는 ¹⁸F-표지화 펩티드의 30배 이하, 더욱 바람직하게는 20배 이하, 가장 바람직하게는 10배 미만의 몰 량으로 상기 조성물에 존재한다.

제2 측면의 조성물은 바람직하게는 용액 형태이고, 여기에서 성분 (i) 및 (ii)는 모두 용액으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 용액은 생체적합성 용매이거나, 2종 이상의 이러한 용매의 혼합물이다. 바람직한 이러한 생체적합성 용매는 제3 측면(하기)에 기재되어 있고, 바람직하게는 수성 용매를 포함한다.

본 발명자들은, 방사성추적자 농도(대략 1 내지 50 ㎍/ml의 농도 범위)에서, 본 발명의 ¹⁸F-표지화 cMBP 펩티드가 다양한 물질에 대해 원하지 않는 결합을 나타냄을 밝혀냈다. 방사성추적자가 이처럼 매우 낮은 농도로 존재하기 때문에, 심지어 작은 화학적 흡착량이라도 존재하는 방사성동위원소에 대해 유의한 백분율을 나타낼 수 있다. 방사성추적자 농도는, 예를 들어 농도가 대략 2 내지 10 mg/ml, 거의 1000배 이상인 상응하는 시아닌 염료-표지화 c-Met 결합 펩티드와 비교되어야 한다. 이러한 경우에, 흡착 물질의 ㎍ 양 손실은 용액 중의 염료-표지화 펩티드에 대해서는 유의하지 않은 백분율이다. 방사성추적자 부착이 관찰되는 물질에는 플라스틱, 유리 및 실리카가 포함된다. 필터의 경우에, 이것은 살균 여과를 수행할 때 방사능의 높은 손실 백분율을 의미할 수 있다.

본 발명자들은, 상기 부착 현상이 cMBP 펩티드가 산성 조건(특히 저온에서) 하에서 침전된다는 사실로부터 비롯된다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 용액 중에서 바람직한 ¹⁸F-표지화 c-Met 결합 펩티드를 유지하고, 따라서 물질의 손실을 피하기 위하여 pH 7.5 이상, 더욱 바람직하게는 pH 8.0 이상에서 조성물을 유지하는 것이 바람직하다. 조절된 pH의 사용에 대해 대안적으로 또는 추가로, 가용화제가 포함될 수도 있다.

용어 "가용화제"는 용매 중에 영상화 시약의 용해도를 증가시키는 조성물에 존재하는 첨가제를 의미한다. 바람직한 용매는 수성 매질이고, 따라서 가용화제는 바람직하게는 물에서의 용해도를 개선한다. 적절한 가용화제는 C_1-4 알콜; 글리세린; 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 프로필렌 글리콜; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트; 소르비탄 모노올레에이트; 폴리소르베이트; 폴리(옥시에틸렌)폴리(옥시프로필렌)폴리(옥시에틸렌) 블록 공중합체(플루로닉스(Pluronics)^TM); 시클로덱스트린(예, 알파, 베타 또는 감마 시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린) 및 레시틴을 포함한다.

바람직한 가용화제는 시클로덱스트린, C_1-4 알콜 및 플루로닉스^TM, 더욱 바람직하게는 시클로덱스트린 및 C_2-4 알콜이다. 가용화제가 알콜일 때, 이것은 바람직하게는 에탄올 또는 프로판올, 더욱 바람직하게는 에탄올이다. 에탄올은 이것이 방사선보호제로서 기능할 수 있기 때문에 잠재적인 이중 역할을 갖는다. 가용화제가 시클로덱스트린일 때, 이것은 바람직하게는 시클로덱스트린, 더욱 바람직하게는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPCD)이다. 시클로덱스트린의 농도는 약 0.1 내지 약 40 mg/mL, 바람직하게는 약 5 내지 약 35 mg/mL, 더욱 바람직하게는 20 내지 30 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 25 mg/mL일 수 있다. 단일 가용화제가 사용될 때, 이것은 바람직하게는 에탄올 또는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 더욱 바람직하게는 에탄올이다. 가용화제의 조합이 사용될 때, 이것은 바람직하게는 에탄올 및 히드록시프로필-β-시클로덱스트린이다.

바람직하게는, 제2 측면의 조성물은 7.5 이상의 pH에서, 임의로 가용화제로서 5 내지 10% v/v 에탄올과 함께 유지된다.

제2 측면의 영상화 시약 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 방사선보호제를 더 포함한다. 용어 "방사선보호제"란, 고-반응성 자유 라디칼, 예컨대 물의 방사선분해로부터 비롯된 산소-함유 자유 라디칼을 포획함으로써 산화환원 과정과 같은 분해 반응을 억제하는 화합물을 의미한다. 2종 이상의 상이한 방사선보호제의 조합을 사용할 수도 있다. 본 발명의 방사선보호제는 적절하게는 에탄올; 아스코르브산; 파라-아미노벤조산(즉, 4-아미노벤조산 또는 pABA); 겐티스산(즉, 2,5-디히드록시벤조산), 및 적용가능하다면 상기 정의된 생체적합성 양이온과의 상기 산의 염으로부터 선택된다. 본 발명의 방사선보호제는 바람직하게는 파라-아미노벤조산 또는 파라-아미노벤조산나트륨을 포함한다.

본 발명의 가장 바람직한 영상화 시약 조성물은 Z¹=Z²=M^IG가 부착된 SEQ-7의 cMBP 펩티드, 및 수성 완충액 중의 파라-아미노벤조산 방사선보호제와 에탄올 방사선보호제/가용화제의 조합을 포함한다. 이러한 바람직한 조성물 중의 SEQ-7의 바람직한 펩티드는 펩티드 1이고, 바람직한 ¹⁸F-표지화 cMBP 펩티드는 화합물 3이다. 방사능 농도는 바람직하게는 350 MBq/ml 미만이고, pABA 농도는 2 mg/ml이고, 에탄올은 약 5 내지 10% vol/vol, 바람직하게는 6.5 내지 7.5% vol/vol이다.

제3 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 영상화 시약 또는 제2 측면의 영상화 시약 조성물을 생체적합성 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 포유동물 투여에 적절한 무균 형태로 제공한다.

제3 측면에서 영상화 시약 및 조성물의 바람직한 측면은 각각 제1 및 제2 측면에서 정의된 것과 같다.

"생체적합성 담체"는 유체, 특히 액체이고, 여기에서 영상화 시약을 현탁하거나 바람직하게는 용해시킬 수 있고, 그 결과 조성물이 생리학적으로 허용가능하고, 다시 말해서 독성 또는 과도한 불편함 없이 포유동물 신체에 투여될 수 있다. 생체적합성 담체는 적절하게는 주사가능한 담체 액체, 예컨대 무균, 발열원-무함유 주사용 수; 염수와 같은 수용액(주사를 위한 최종 제품이 등장성이 되도록 유리하게 균형을 이룰 수 있음); 생체적합성 완충제를 포함하는 수성 완충 용액(예, 포스페이트 완충제); 1종 이상의 장성-조절 물질의 수용액(예, 생체적합성 반대이온과 혈장 양이온의 염), 당(예, 글루코스 또는 수크로스), 당 알콜(예, 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜(예, 글리세롤) 또는 기타 비-이온성 폴리올 물질(예, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 등)이다. 바람직하게는, 생체적합성 담체는 발열원-무함유 주사용 수, 등장성 염수 또는 포스페이트 완충액이다. pH를 조절하기 위해 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.

영상화 시약 및 생체적합성 담체를 각각, 무균 무결성 및/또는 방사능 안전성을 유지하도록 하는 밀봉 용기 및 임의로 불활성 헤드스페이스 기체(예, 질소 또는 아르곤)를 함께 포함하며 주사기 또는 카눌라에 의한 용액의 첨가와 회수가 가능한 적절한 바이알 또는 용기에 담아 공급한다. 바람직한 용기는 셉텀-밀봉 바이알이고, 여기에서 기밀 마개가 오버실(overseal)(일반적으로 알루미늄)로 크림핑되어 있다. 마개는 무균 무결성을 유지하면서 피하주사용 바늘로 하나 또는 다수의 구멍을 뚫기에 적절하다(예, 크림핑된 셉텀 밀봉 마개). 이러한 용기는 원한다면 마개가 진공을 견딜 수 있다는 추가의 장점을 갖고(예를 들어 헤드스페이스 기체 또는 탈기체 용액을 바꾸기 위해), 외부 대기 기체, 예컨대 산소 또는 수증기의 유입을 허용하지 않으면서 압력 감소와 같은 압력 변화를 견딜 수 있다.

바람직한 다용량 용기는 다수의 환자 용량을 함유하는 단일 벌크 바이알(예, 10 내지 30 cm³ 부피)을 포함하고, 이에 의해 임상 상황에 적합하도록 제제의 사용가능한 수명 동안에 1인 환자 용량을 다양한 시간 간격으로 임상용 주사기에 뽑아낼 수 있다. 사전-충전된 주사기는 1회 인간 용량 또는 "단위 용량"을 함유하도록 설계되고, 따라서 바람직하게는 임상 사용에 적절한 1회용 또는 기타 주사기이다. 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 1인 환자에 대해 적절한 투여량을 갖고, 상기 기재된 것과 같이 적절한 주사기 또는 용기에 제공된다.

제약 조성물은 추가의 임의의 부형제, 예컨대 항균 보존제, pH-조절제, 충전제, 방사선보호제, 가용화제 또는 삼투 조절제를 함유할 수도 있다. 용어 "방사선보호제" 및 "가용화제" 및 그의 바람직한 실시양태는 제2 측면(상기)에서 설명된 바와 같다. 용어 "항균 보존제"는 세균, 효모 또는 곰팡이와 같은 잠재적 유해 미생물의 성장을 억제하는 제제를 의미한다. 항균 보존제는 사용된 투여량에 따라 일부 살균 성질을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 항균 보존제(들)의 주 역할은 제약 조성물에서 임의의 상기 미생물의 성장을 억제하는 것이다. 그러나, 항균 보존제는 투여 전에 상기 조성물을 제조하기 위해 사용되는 키트의 하나 이상의 성분에서 잠재적 유해 미생물의 성장을 억제하기 위해 임의로 사용될 수도 있다. 적절한 항균 보존제(들)는 파라벤, 즉 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 파라벤 또는 이들의 혼합물; 벤질 알콜; 페놀; 크레졸; 세트리미드 및 티오머살(thiomersal)을 포함한다. 바람직한 항균 보존제(들)는 파라벤이다.

용어 "pH-조절제"는, 조성물의 pH가 인간 또는 포유동물 투여에 허용가능한 한계(대략 pH 4.0 내지 10.5) 이내에 있도록 보장하는 유용한 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 적절한 pH-조절제는 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 트리신, 포스페이트 또는 TRIS[즉, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄] 및 제약상 허용되는 염기, 예컨대 탄산나트륨, 중탄산나트륨 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 조성물이 키트 형태로 사용될 때, pH 조절제는 임의로 별도의 바이알 또는 용기로 제공될 수도 있고, 그 결과 키트의 사용자가 다-단계 절차의 일부로서 pH를 조절할 수 있다.

용어 "충전제"는 제조 및 동결건조 동안에 물질 취급이 용이하도록 할 수 있는 제약상 허용되는 벌크화제를 의미한다. 적절한 충전제는 무기 염, 예컨대 염화나트륨 및 수용성 당류 또는 당 알콜, 예컨대 수크로스, 말토스, 만니톨 또는 트레할로스를 포함한다.

제3 측면의 제약 조성물은 바람직한 무균, 발열원-무함유 제품을 수득하기 위해 무균 제조(즉, 클린 룸) 조건 하에서 제조될 수도 있다. 주요 성분, 특히 관련된 시약 뿐만 아니라 영상화 시약과 접촉되는 장치(예, 바이알)의 일부가 무균상태인 것이 바람직하다. 성분 및 시약은 살균 여과, 감마-조사, 오토클레이브, 건열 또는 화학 처리(예, 에틸렌 옥시드에 의함)를 사용한 터미널 살균을 포함하여 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 살균될 수 있다. 최소 수의 조작의 수행이 필요하도록 일부 성분들을 미리 살균하는 것이 바람직하다. 그러나, 예방책으로서, 제약 조성물의 제조에서 최종 단계로서 적어도 살균 여과 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 나타낸 것과 같이, 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 pH 7.5 이상에서 바람직하게 유지되고/되거나 가용화제를 포함하고, 그 결과 필터 물질에 흡착된 방사능의 과도한 손실 없이 살균 여과 단계를 사용할 수도 있다. 유사한 고려사항이, 가용화제를 사용하지 않으면 흡착이 방사능의 손실을 일으킬 수 있는 임상용 주사기 내 또는 플라스틱 관을 사용한 제약 조성물의 조작에 적용된다.

제약 조성물을 제6 측면(하기)에 기재된 바와 같이 바람직하게 제조한다.

제3 측면의 제약 조성물은 임의로 키트로부터 제조될 수 있다. 이러한 키트는 제1 측면에 기재된 화학식 I의 c-Met 결합 펩티드 또는 제4 측면의 전구체를 무균, 비발열성 형태로 포함하고, 그 결과 적절한 용매 중에서 방사성동위원소 ¹⁸F의 무균 공급물과의 반응 시에 방사성표지화가 일어나서 원하는 ¹⁸F-표지화 c-Met 결합 펩티드를 수득할 수 있다.

키트의 경우, 바람직하게는 c-Met 결합 펩티드 또는 전구체 뿐만 아니라 상기 기재된 기타 임의의 부형제를 동결건조된 분말로서 적절한 바이알 또는 용기에 담아 제공한다. 이어서, 제제를 생체적합성 담체에서 ¹⁸F로 직접적으로(즉, 재구성으로서) 또는 키트를 생체적합성 담체로 먼저 재구성한 다음 ¹⁸F의 공급물과의 반응에 의해 재구성하도록 설계한다.

c-Met 결합 펩티드 또는 전구체의 바람직한 무균 형태는 동결건조된 고체이다. 무균 고체 형태는 제약 조성물(상기)에 대해 상기 기재된 바와 같이 바람직하게는 제약용 용기에 담아 공급된다. 키트가 동결건조될 때, 제형은 사카라이드, 바람직하게는 만니톨, 말토스 또는 트리신으로부터 선택된 동해방지제를 임의로 포함할 수도 있다.

제4 측면에서, 본 발명은 제3 측면의 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드의 제조에 유용한 전구체, 또는

(i) Z¹ = Z² = M^IG인, 제1 측면에서 정의된 화학식 I의 c-Met 결합 시클릭 펩티드; 또는

(ii) 아미노-옥시 작용기화 c-Met 결합 시클릭 펩티드

를 포함하는, 제1 또는 제2 측면의 조성물을 포함한다.

용어 "아미노-옥시 작용기화 c-Met 결합 시클릭 펩티드"는 그것에 공유 결합으로 접합된 아미노-옥시 작용기를 가진 화학식 I의 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 의미한다. 이러한 아미노-옥시 기는 화학식 -O-NH₂, 바람직하게는 -CH₂O-NH₂이고, 아미노-옥시 기의 아민이 옥심 에테르를 형성하는 알데히드와의 축합 반응에서 Lys 아민 기보다 더욱 반응성이라는 장점을 갖고 있다. 이러한 아미노-옥시 기는 하기 기재된 바와 같이 cMBP의 Lys 잔기에서 적절히 부착된다.

전구체는 비-방사능이고, 높은 정도의 화학 순도로 수득될 수 있도록 설계된다. 또한, ¹⁸F의 적절한 공급원과의 반응 시에, 반응이 만족스런 방사화학 순도(RCP)로 효율적으로 일어나도록 설계된다. "¹⁸F의 적절한 공급원"은 전구체의 성질에 의존한다. 전구체가 화학식 I의 비표지화 c-Met 결합 펩티드를 포함할 때, 비표지화 펩티드의 라이신(Lys) 잔기의 아민 기는 방사능표지의 부위가 되도록 설계된다. Z¹ = Z² = M^IG이기 때문에 cMBP 펩티드의 말단이 보호된다. 이러한 바람직한 c-Met 결합 펩티드 및 바람직한 Z¹/Z² 기는 제1 측면에 기재되어 있다. 따라서, ¹⁸F의 적절한 공급원은 라이신 아민 기, 바람직하게는 Lys 엡실론 아민과 가능한 한 효율적으로 반응하도록 설계된다.

제3 측면의 제약 조성물의 제조의 경우, 전구체는 바람직하게는 무균 형태이고, 더욱 바람직하게는 동결건조된 고체이다.

제4 측면의 전구체는 바람직하게는 아미노-옥시 작용기화 c-Met 결합 펩티드이다.

본 발명의 화학식 I의 c-Met 결합 펩티드, 즉 Z¹-[cMBP]-Z²는

(i) 원하는 cMBP 펩티드와 동일한 펩티드 서열을 갖고 Cys^a 및 Cys^b가 비보호되며 Cys^c 및 Cys^d 잔기가 티올-보호 기를 갖는 직쇄 펩티드를 고체상 펩티드 합성하고;

(ii) 용액 중에서 수성 염기로 단계 (i)로부터의 펩티드를 처리하여, Cys^a 및 Cys^b를 연결한 제1 디술피드 결합을 가진 모노시클릭 펩티드를 제공하고;

(iii) Cys^c 및 Cys^d 티올-보호기를 제거하고, 고리화하여 Cys^c 및 Cys^d를 연결한 제2 디술피드 결합을 제공하고, 원하는 비시클릭 펩티드 생성물 Z¹-[cMBP]-Z²를 수득하는 것

을 포함하는 제조 방법에 의해 수득될 수 있다.

용어 "보호기"는, 바람직하지 않은 화학 반응을 억제하거나 저지하지만, 분자의 나머지를 변형하지 않기에 충분히 온화한 조건 하에서 당해 작용기로부터 절단될 수도 있고 충분히 반응성이 되도록 설계된 기를 의미한다. 탈보호 후에, 원하는 생성물이 수득된다. 아민 보호기가 당업자에게 알려져 있고, Boc(여기에서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐), Fmoc(여기에서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐), 트리플루오로아세틸, 알릴옥시카르보닐, Dde[즉, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸] 또는 Npys(즉, 3-니트로-2-피리딘 술페닐)로부터 적절하게 선택된다. 적절한 티올 보호기는 Trt(트리틸), Acm(아세트아미도메틸), t-Bu(tert-부틸), tert-부틸티오, 메톡시벤질, 메틸벤질 또는 Npys(3-니트로-2-피리딘술페닐)이다. 추가의 보호기의 사용이 문헌 ['Protective Groups in Organic Synthesis', 4th edition, Theorodora, W. Greene and Peter G. M. Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]]에 기재되어 있다. 바람직한 아민 보호기는 Boc 및 Fmoc이고, 가장 바람직하게는 Boc이다. 바람직한 아민 보호기는 Trt 및 Acm이다.

실시예 1 및 2는 추가의 구체적인 세부사항을 제공한다. 고체상 펩티드 합성의 추가의 세부사항은 문헌 [P. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997]에 기재되어 있다. cMBP 펩티드가 불활성 대기 하에서 가장 잘 보관되고 동결기에서 유지된다. 용액 중에서 사용될 때, 디술피드 다리결합의 혼합 위험 때문에 7 초과의 pH를 피하는 것이 최선이다.

아미노-옥시 작용기화 c-Met 결합 펩티드는 문헌 [Poethko et al, J.Nucl.Med., 45, 892-902 (2004)], [Schirrmacher et al., Bioconj.Chem., 18, 2085-2089 (2007)], [Solbakken et al, Bioorg.Med.Chem.Lett, 16, 6190-6193 (2006)] 또는 [Glaser et al., Bioconj. Chem., 19, 951-957 (2008)]의 방법에 의해 제조될 수 있다. 아미노-옥시 기는 2단계로 임의로 접합될 수 있다. 먼저, N-보호된 아미노-옥시 카르복실산 또는 N-보호된 아미노-옥시 활성화 에스테르가 c-Met 결합 펩티드에 접합된다. 두 번째로, 중간체 N-보호된 아미노-옥시 작용기화 c-Met 결합 펩티드를 탈보호하여, 원하는 생성물을 제공한다(상기 인용된 Solbakken 및 Glaser 문헌 참조). N-보호된 아미노-옥시 카르복실산, 예컨대 Boc-NH-O-CH₂(C=O)OH는, 예를 들어 노바바이오켐으로부터 상업적으로 입수가능하다.

제5 측면에서, 본 발명은

(i) 제4 측면의 전구체를 제공하고;

(ii) 상기 전구체가 Z¹ = Z² = M^IG인 화학식 I의 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함할 경우는, ¹⁸F-표지화 활성화 에스테르와 또는 활성화 시약의 존재 하에서 ¹⁸F-표지화 카르복실산과 반응시켜 상기 시클릭 펩티드의 cMBP의 Lys 잔기에서 아미드 결합을 통해 접합된 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제공하고;

(iii) 상기 전구체가 아미노-옥시 작용기화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함할 경우는,

(a) ¹⁸F-표지화 활성화 에스테르와 또는 활성화 시약의 존재 하에서 ¹⁸F-표지화 카르복실산과 반응시켜 상기 작용기화 펩티드의 아미노-옥시 위치에서 아미드 결합을 통해 접합된 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제공하거나; 또는

(b) ¹⁸F-표지화 알데히드와 반응시켜 상기 작용기화 펩티드의 아미노-옥시 위치에서 옥심 에테르 결합을 통해 접합된 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제공하는 것

을 포함하는, 제1 측면의 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드의 제조 방법을 제공한다.

용어 "활성화 에스테르" 또는 "활성 에스테르"는 더 좋은 이탈 기가 되도록 설계되고 따라서 아민과 같은 친핵기와의 더욱 용이한 반응을 가능하게 하는 관련된 카르복실산의 에스테르 유도체를 의미한다. 적절한 활성 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드(NHS); 술포-숙신이미딜 에스테르; 펜타플루오로페놀; 펜타플루오로티오페놀; 파라-니트로페놀; 히드록시벤조트리아졸 및 PyBOP(즉, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)이다. 바람직한 활성 에스테르는 N-히드록시숙신이미드 또는 펜타플루오로페놀 에스테르, 특히 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.

용어 "활성화 시약"은 아미드를 생성하기 위해 아민과 카르복실산 간에 결합을 촉진하기 위해 사용되는 시약을 의미한다. 적절한 활성화 시약은 당 기술분야에 공지되어 있고, 카르보디이미드, 예컨대 EDC[N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드] 및 N,N'-디알킬카르보디이미드, 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 또는 디이소프로필카르보디이미드; 및 트리아졸, 예컨대 HBTU[O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트], HATU[O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N-N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트], 및 PyBOP[벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트]를 포함한다. 추가의 세부사항은 문헌 [March's Advanced Organic Chemistry, 5^th Edition, pages 508-510, Wiley Interscience (2001)]에 기재되어 있다. 바람직한 활성화 시약은 EDC이다.

¹⁸F-표지화 활성화 에스테르, 예컨대 [¹⁸F]SFB는 Glaser 등의 문헌 [J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)] 및 그의 참조문헌의 방법 또는 Marik 등의 문헌 [Appl.Rad.Isot., 65(2), 199-203 (2007)]의 자동화 방법에 의해 제조될 수 있다.

¹⁸F-표지화 카르복실산은 상기 인용된 Marik 등의 방법에 의해 수득될 수 있다. 화학식 ¹⁸F(CH₂)₂O[CH₂CH₂O]_qCH₂CHO(여기에서 q는 3이다)의 ¹⁸F-표지화 지방족 알데히드는 문헌 [Glaser et al., Bioconj.Chem., 19(4), 951-957, (2008)]의 방법에 의해 수득될 수 있다. ¹⁸F-플루오로벤즈알데히드는 문헌 [Glaser et al., J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]의 방법에 의해 수득될 수 있다. 전구체 Me₃N⁺-C₆H₄-CHOCF₃SO₃ ^-는 문헌 [Haka et al., J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)]의 방법에 의해 수득된다.

아미노-옥시 작용기화 c-Met 펩티드에 ¹⁸F-표지화 알데히드의 접합은 바람직하게는 문헌 [Flavell et al., J.Am.Chem.Soc., 130(28), 9106-9112 (2008)]에 기재된 것과 같이 아닐린 촉매의 존재 하에서 수행된다. 전구체로서 보호된 아미노-옥시 c-Met 펩티드(예컨대 화합물 1)를 사용할 수 있긴 하지만, 자유 아미노-옥시 유도체(예컨대 화합물 2)가 바람직하다. 이것은, 전체 합성이 쉽게 자동화될 수 있는 반면, 보호된 전구체에 대해서는 일반적으로 수동 탈보호 단계가 요구되기 때문이다.

제6 측면에서, 본 발명은

(i) 제5 측면의 제조 방법에 정의된 것과 같은 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제조하고;

(ii) ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드로부터 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 크로마토그래피 분리하는 것

을 포함하는, 제2 측면의 영상화 시약 조성물 또는 제3 측면의 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.

제6 측면에서 영상화 시약 조성물 및 제약 조성물의 바람직한 측면은 각각 제2 및 제3 측면에 기재된 바와 같다.

단계 (ii)의 크로마토그래피 분리는 하나 이상의 SPE 카트리지(들)를 사용한 HPLC 또는 SPE(고체상 추출)에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성장치가 사용될 때 SPE가 바람직하고, 다른 상황에서는 HPLC가 바람직하다. 실시예 5는 본 발명의 화합물 3에 적절한 HPLC 방법을 제공한다.

제3 측면의 제약 조성물을 수득하기 위해, 바람직하게는 제6 측면의 방법을 사용한다. 제3 측면의 제약 조성물을 제공하기 위해 상기 방법을 사용할 때, 바람직하게는 자동화 합성장치를 사용하여 제조 방법을 수행한다.

용어 "자동화 합성장치"는 문헌 [Satyamurthy et al., Clin.Positr.Imag., 2(5), 233-253 (1999)]에 기재된 것과 같은 단위 작동 원리를 기초로 한 자동화 모듈을 의미한다. 용어 "단위 작동"은, 복잡한 공정이 일련의 단순한 작동 또는 반응으로 감소됨을 의미하고, 이것이 다양한 재료에 적용될 수 있다. 이러한 자동화 합성장치는 특히 방사성제약 조성물을 원할 때 본 발명의 방법을 위해 바람직하다. 이들은 GE 헬쓰케어(GE Healthcare); CTI Inc; 이온 빔 어플리케이션스 에스. 에이.(Ion Beam Applications S.A.)(벨기에 루벵-라-네브 B-1348, 쉬멩 드 사이클로트론(Chemin du Cyclotron) 3; 레이테스트(Raytest)(독일) 및 바이오스캔(Bioscan)(USA)을 비롯한 다양한 공급업자 [Satyamurthy et al., 상기]로부터 상업적으로 입수가능하다.

또한, 시판되는 자동화 합성장치는 방사성약제 제조 결과로서 발생된 액체 방사능 폐기물을 위해 적절한 용기를 제공한다. 자동화 합성장치는 적절히 배치된 방사능 작업 셀에서 사용되도록 고안되었기 때문에, 전형적으로 방사선 차폐물이 구비되지 않는다. 방사능 작업 셀은 잠재적인 방사선 선량으로부터 작업자를 보호하기 위해 적절한 방사선 차폐물 뿐만 아니라 화학적 및/또는 방사능 증기를 제거하기 위한 통풍장치를 제공한다. 자동화 합성장치는 바람직하게는 카세트를 포함한다. 용어 "카세트"란, 합성장치의 이동 부위의 기계적 이동이 카세트 밖으로부터, 즉 외부적으로 카세트의 작동을 제어하는 방식으로, 자동화 합성장치(하기 정의됨) 상에 제거가능하고 교환가능하게 끼워지도록 설계된 장치의 일부를 의미한다. 적절한 카세트는, 역전된 셉텀-밀봉 바이알의 바늘 구멍에 의해 또는 기밀 결합 조인트에 의해 시약 또는 바이알이 부착될 수 있는 구멍에 각각 연결된 선형 밸브 배열을 포함한다. 각각의 밸브는 자동화 합성장치의 상응하는 이동 팔과 접속되는 암-수 조인트를 갖고 있다. 따라서 팔의 외부 회전은 카세트가 자동화 합성장치에 부착될 때 밸브의 개폐를 조절한다. 자동화 합성장치의 추가의 이동 부위는 주사기 플런저 끝에 고정되도록 설계되고 따라서 주사기 분량을 증가시키거나 감소시킨다.

카세트는 용도가 다양하고, 전형적으로 시약이 부착될 수 있는 다수의 위치를 가지며, 시약의 주사기 바이알 또는 크로마토그래피 카트리지(예, SPE)의 부착에 적절하다. 카세트는 항상 반응 용기를 포함한다. 이러한 반응 용기는 바람직하게는 1 내지 10 cm³, 가장 바람직하게는 2 내지 5 cm³ 부피이고, 카세트의 3개 이상의 구멍이 연결되도록 구성되어 카세트 상의 여러 구멍으로부터 시약 또는 용매의 전달이 가능하도록 한다. 바람직하게는, 카세트는 선형 배열로 15 내지 40개, 가장 바람직하게는 20 내지 30개의 밸브를 가지며, 특히 바람직하게는 25개의 밸브를 갖는다. 카세트의 밸브는 바람직하게는 각각 동일하고, 가장 바람직하게는 3-웨이 밸브이다. 카세트는 방사성제약 제조에 적절하도록 설계되고, 따라서 제약용 물질로부터 제조되며, 이상적으로는 방사선분해도 견딘다.

본 발명의 바람직한 자동화 합성장치는, 주어진 회분의 방사성플루오르화 방사성제약을 제조하기 위해 필요한, 모든 시약을 포함하는 폐기가능하거나 1회용인 카세트, 반응 용기 및 장치를 포함하는 것이다. 카세트는, 자동화 합성장치가 단순히 카세트를 교환함으로써 최소의 교차오염 위험으로 각종 상이한 방사성제약을 제조할 수 있도록 하는 융통성을 갖고 있음을 의미한다. 카세트 접근법은 또한, 작업자 실수의 위험을 감소시키는 단순화된 설비; 개선된 GMP(우수 제조 관리기준) 순응성; 다-추적자 능력; 제조 시행 간의 빠른 변화; 카세트 및 시약의 예비-시행 자동화 진단 검사; 화학 시약 대 수행된 합성의 자동화 바코드 교차-검사; 시약 검사소급성; 단일 사용 및 그에 따른 교차 오염, 손상 및 남용 내성의 위험이 없다는 장점을 갖고 있다. 본 발명의 이러한 측면에는, 제2 측면의 제약 조성물을 제조하기 위한 자동화 합성 장치의 용도가 포함된다.

제7 측면에서, 본 발명은, 제1 측면의 영상화 시약, 제2 측면의 영상화 시약 조성물 또는 제3 측면의 제약 조성물이 미리 투여된 포유동물 신체를 영상화하는 것을 포함하는, c-Met 과다발현 또는 국소화 부위의 영상을 얻기 위하여 포유동물 신체의 생체내 영상화 방법을 제공한다.

제7 측면에서 영상화 시약, 영상화 시약 조성물 및 제약 조성물의 바람직한 측면이 각각 제1, 제2 및 제3 측면에 기재되어 있다.

바람직하게는, 포유동물은 생체내 본래 상태의 포유동물 신체이고, 더욱 바람직하게는 인간 대상체이다. 바람직하게는, 영상화 시약을 최소의 침습 방식으로, 다시 말해서 전문적인 의학적 판단 하에서 수행될 때에도 포유동물 대상체에 실질적인 건강 상의 위험 없이 포유동물 신체에 투여할 수 있다. 이러한 최소의 침습 투여는 바람직하게는 국소 또는 전신 마취의 필요 없이 상기 대상체의 말초 정맥으로의 정맥내 투여이다.

바람직하게는, 제3 측면의 제약 조성물이 사용된다. 제7 측면의 영상화 방법에서, c-Met 과다발현 또는 국소화 부위는 바람직하게는 암성 종양 또는 전이이다. 시약은 전구암성 및 암성 종양 또는 전이 양쪽 모두에서 c-Met 발현을 영상화하고, 잠재적으로 치료의 선택을 가능하게 하기 위해 유용한 것으로 생각된다. 추가로, 이러한 영상화 시약에 의한 영상화 반복은 기존 및 신규 치료 요법에 대해 개별 대상체의 반응을 빠르고 효과적으로 검사할 가능성을 가지며, 이에 의해 효과가 없는 치료를 중단하도록 한다. 또한, c-Met의 과다발현이 공격적인 종양의 잠재적 속성이기 때문에, c-Met 영상화 시약은 그들의 발생 초기 단계에서 공격적 및 덜 공격적인 암을 구별할 가능성을 갖고 있는 것으로 기대된다.

이러한 측면에는, 제7 측면의 영상화 방법을 포함하는, 포유동물 신체 내에서 생체내 c-Met 과다발현 또는 국소화 부위를 진단하는 방법이 포함된다.

본 발명은 하기 상술된 비-제한적 실시예에 의해 예시된다. 실시예 1은 양쪽 말단에서 물질대사 억제 기(Z¹ = Z² = M^IG)를 가진 본 발명의 cMBP 펩티드(펩티드 1)의 합성을 제공한다. 실시예 2는 본 발명의 보호된 전구체(화합물 1)의 합성을 제공한다. 실시예 3은 불소-표지화 c-Met 펩티드의 비-방사능 플루오로화(즉, ¹⁹F) 대응물(화합물 3A)의 합성을 제공한다. 실시예 4는 본 발명의 ¹⁸F-방사성플루오르화 c-Met 펩티드(화합물 3B)의 합성을 제공한다. 실시예 5는 표지화 및 비표지화 c-Met 결합 펩티드의 분리를 위한 HPLC 조건을 제공한다.

실시예 6은 동물 종양 모델에서 본 발명의 ¹⁸F-표지화 펩티드(화합물 3B)의 생체분포를 제공한다. 이 결과는, HT-29 종양에서 발현된 인간 c-Met 수용체로의 결합 및 그에 따른 종양 영상화에 대한 유용성을 나타낸다. 실시예 7은, 흡수(uptake)가 비-방사능 ¹⁹F-표지화 c-Met 결합 펩티드(화합물 3A)의 공동-투여에 의해 억제될 수 있기 때문에, 실시예 6의 종양 흡수가 특이적임을 증명한다. 실시예 8은 또한 ¹⁹F-표지화 c-Met 결합 펩티드를 공동-투여할 때 영장류에서 약 40%의 감소된 간 흡수를 증명한다. c-Met 수용체에 대해 친화력을 갖지 않는, 펩티드의 ¹⁹F-표지화 혼합 버전의 공동-투여는 간 흡수를 현저히 감소시키지 않았다. 간은 고도의 c-Met 발현 수준을 갖고, 따라서 ¹⁹F-표지화 cMBP와의 경쟁 후의 흡수 감소는 생체내 특이적 c-Met 결합의 증거를 나타내는 것으로 생각된다.

실시예 9는, 가용화제 시클로덱스트린이 생체내에서 화합물 3B의 생체분포에 유의하게 효과를 미치지 않음을 나타낸다. 실시예 10은 화합물 3B(화합물 2로부터 출발)의 완전 자동화 합성을 화합물 1로부터 출발한 부분 자동화 합성과 비교한다. 화합물 2가 더 높은 수율을 제공하기 때문에 화합물 2를 사용하는 것이 바람직하고, 화합물 1의 탈보호는 다음과 같은 단점을 갖는다:

(i) 방사성표지화 전에 탈보호 정도를 확인하기 어려움;

(ii) 펩티드를 탈보호하기 위해 사용되는 TFA가 자동화 합성장치의 플라스틱과 상용성이 아님.

실시예 11은 SPE 카트리지 정제의 자동화 사용을 더 포함하는, 화합물 3B의 자동화 합성을 제공한다. 그 결과는, 이 접근법을 사용하여 화합물 3B가 고순도 및 만족할만한 방사성화학 수율로 수득될 수 있음을 나타낸다. 실시예 12는, 본 발명의 전구체의 동결 건조를 제공한다. 실시예 13은 본 발명의 영상화 시약의 pH의 효과를 나타낸다. 실시예 14는 본 발명의 영상화 시약을 사용한 인간 영상화를 기재한다.

약어

통상적인 단문자 또는 3-문자 아미노산 약어가 사용된다.

%id: 주사 투여량 백분율

Ac: 아세틸

Acm: 아세트아미도메틸

ACN: 아세토니트릴

Boc: tert-부틸옥시카르보닐

DCM: 디클로로메탄

DIPEA: N,N-디이소프로필에틸 아민

DMF: 디메틸포름아미드

DMSO: 디메틸술폭시드

EDC: N-3-디메틸아미노프로필-N'-에틸카르보디이미드

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐

HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

HSPyU: O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸렌우로늄 헥사플루오로포스페이트

NHS: N-히드록시-숙신이미드

NMM: N-메틸모르폴린

NMP: 1-메틸-2-피롤리디논

pABA: 파라-아미노벤조산

Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐

PBS: 포스페이트-완충 염수

p.i.: 주사후

PyBOP: 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트

tBu: tert-부틸

TFA: 트리플루오로아세트산

TIS: 트리이소프로필실란

Trt: 트리틸

상기 표에서,

화합물 1, 2 및 3은 펩티드 1의 카르복시 말단 Lys의 엡실론 아민 기에서 작용기화되고,

Boc = tert-부틸옥시카르보닐임.

실시예 1: 펩티드 1의 합성

단계 (a): 보호된 전구체 선형 펩티드의 합성

전구체 선형 펩티드는 하기 구조를 갖는다:

Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH₂

0.1 mmol 링크 아미드 노바겔(Rink Amide Novagel) 수지로 시작하여 Fmoc 화학을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 433A 펩티드 합성장치에서 펩티딜 수지 H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψ^Me ^, ^Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-중합체를 조립하였다. 과량의 1 mmol 예비-활성화된 아미노산(HBTU를 사용함)을 결합 단계에서 적용하였다. Glu-Thr 슈도프롤린(노바바이오켐 05-20-1122)을 서열에 도입하였다. 수지를 질소 기포화 장치로 옮기고, DCM(5 mL) 중에 용해된 아세트산 무수물(1 mmol) 및 NMM(1 mmol)의 용액으로 60분 동안 처리하였다. 무수물 용액을 여과에 의해 제거하고, 수지를 DCM으로 세척하고 질소 기류 하에 건조시켰다.

2.5% TIS, 2.5% 4-티오크레졸 및 2.5% 물을 함유하는 TFA(10 mL) 중에서 2시간 30분 동안 측쇄 보호기의 동시 제거 및 수지로부터 펩티드의 절단을 수행하였다. 여과에 의해 수지를 제거하고, TFA를 진공 하에 제거하고, 디에틸 에테르를 잔류물에 첨가하였다. 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고, 통풍 건조하여 264 mg의 조 펩티드를 수득하였다.

조 펩티드를 분취용 HPLC(구배: 40분에 걸쳐 20-30% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 30분)에 의해 정제하여 100 mg의 순수한 펩티드 1 선형 전구체를 수득하였다. 순수한 생성물을 분석 HPLC에 의해 분석하였다(구배: 10분에 걸쳐 10-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분). 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(MH₂ ² ⁺ 계산치: 1464.6, MH₂ ² ⁺ 실측치: 1465.1).

단계 (b): 모노시클릭 Cys4-16 디술피드 다리결합의 형성

Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH_2.

단계 (a)로부터의 선형 전구체(100 mg)를 5% DMSO/물(200 mL) 중에 용해시키고, 암모니아를 사용하여 용액을 pH 6으로 조정하였다. 반응 혼합물을 5일 동안 교반하였다. 이어서, TFA를 사용하여 상기 용액을 pH 2로 조정하고, 용매의 대부분을 진공 하에 증발에 의해 제거하였다. 잔류물(40 mL)을 생성물 정제를 위하여 분취용 HPLC 컬럼 상에 소량씩 주입하였다.

잔류물을 분취용 HPLC(구배: 10분에 걸쳐 0% B, 이어서 40분에 걸쳐 0-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 44분)에 의해 정제하여 72 mg의 순수한 화합물 1 모노시클릭 전구체를 수득하였다.

순수한 생성물(이성질체 P1 내지 P3의 혼합물로서)을 분석 HPLC에 의해 분석하였다(구배: 10분에 걸쳐 10-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 5.37분(P1); 5.61분(P2); 6.05분(P3)). 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(MH₂ ² ⁺ 계산치: 1463.6, MH₂ ² ⁺ 실측치: 1464.1(P1); 1464.4(P2); 1464.3(P3)).

단계 (c): 제2 Cys6 -14 디술피드 다리결합의 형성(펩티드 1)

단계 (b)로부터의 모노시클릭 전구체(72 mg)를 질소 블랭킷 하에서 75% AcOH/물(72 mL) 중에 용해시켰다. AcOH(4.8 mL) 중의 1M HCl(7.2 mL) 및 0.05M I₂를 순서대로 첨가하고, 45분 동안 혼합물을 교반하였다. 1M 아스코르브산(1 mL)을 첨가하여 무색 혼합물을 수득하였다. 대부분의 용매를 진공 하에 증발시키고, 잔류물(18 mL)을 물/0.1% TFA(4 mL)로 희석하고, 분취용 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하였다.

잔류물을 분취용 HPLC(구배: 10분에 걸쳐 0% B, 이어서 40분에 걸쳐 20-30% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 43-53분)에 의해 정제하여 52 mg의 순수한 펩티드 1을 수득하였다.

순수한 생성물을 분석 HPLC에 의해 분석하였다(구배: 10분에 걸쳐 10-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분). 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(MH₂ ² ⁺ 계산치: 1391.5, MH₂ ² ⁺ 실측치: 1392.5).

실시예 2: 화합물 1의 합성

(Boc-아미노옥시)아세트산(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 138 mg, 0.72 mmol), EDC(138 mg, 0.72 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드(83 mg, 0.72 mmol)을 DMF(1 ml) 중에 용해시켰다. 이 용액을 25분 동안 진탕하고, 이어서 DMF(5 ml) 중의 펩티드 1(1.0 g, 0.36 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2분 동안 교반하였다. 이어서, Sym.-콜리딘(239 ㎕, 1.80 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(5 ml)로 희석하고, 생성물을 조제 RP-HPLC에 의해 정제하였다.

HPLC 조건: 워터스 프레프(Waters Prep) 4000 시스템, 용매 A=H₂O/0.1% TFA 및 용매 B=ACN/0.1% TFA; 60분에 걸쳐 구배 20-40% B; 유량=50 ml/분; 컬럼: 페노메넥스 루나 10㎛ C18 (2) 250×50 mm, 검출: UV 214 nm. 정제된 화합물 1의 수율 690 mg(65%), 실측치 m/z: 1478.4, 예상치 MH₂ ² ⁺: 1478.1.

실시예 3: 화합물 3A의 합성

단계 (a): N-(4-플루오로벤질리덴)아미노옥시아세트산의 제조

(Boc-아미노옥시)아세트산(96 mg, 0.50 mmol) 및 4-플루오로벤즈알데히드(53 ㎕, 0.50 mmol)을 포름산(0.5 ml) 중에 용해시키고, 반응 혼합물을 135분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 20% ACN/물/0.1% TFA(7 ml)로 희석하고, 생성물을 반-조제 RP-HPLC에 의해 정제하였다.

HPLC 조건: 베크만 시스템 골드(Beckman System Gold); 용매 A=H₂O/0.1% TFA 및 용매 B=ACN/0.1% TFA; 40분에 걸쳐 구배 25-35% B; 유량=10 ml/분; 컬럼: 페노메넥스 루나 5㎛ C18 (2) 250×21.2 mm, 검출: UV 214 nm. 수율 92 mg(93%).

단계 (b): 화합물 3A의 제조

N-(4-플루오로벤질리덴)아미노옥시아세트산(단계 (a)로부터, 43 mg, 0.22 mmol) 및 PyBOP(112 mg, 0.22 mmol)을 DMF(2 ml) 중에 용해시켰다. DMF(10 ml) 중의 DIPEA(157 ㎕, 0.90 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 1분 동안 진탕하였다. 이어서, 용액을 DMF(10 ml) 중의 펩티드 1(500 mg, 0.18 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 진탕하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물(20 ml)로 희석하고, 생성물을 분취용 HPLC에 의해 정제하였다.

용매 A=H₂O/0.1% 암모늄 아세테이트 및 용매 B=ACN을 제외하고는, 실시예 2에 따른 HPLC 조건. 순수한 물질의 수율 291 mg(55%). 실측치 m/z: 988.6, 예상치 MH₃ ³⁺: 987.7.

실시예 4: 화합물 1로부터 화합물 3B의 합성

단계 (a): 화합물 2를 수득하기 위한 화합물 1의 탈보호

5 ml 반응 바이알에서 화합물 1(7 mg, 2.37 μM)을 물(10 ㎕) 및 트리플루오로아세트산(190 ㎕)으로 처리하고, 이어서 초음파 욕조에서 10분 동안 밀봉된 바이알 내에 침지시켰다. 이어서, 수성 TFA를 진공 하에 제거하고(대략 30분), 잔류물을 시트레이트 완충액(pH 2.6, 1.7 mL) 중에 재구성하고, 자동화 합성장치 카세트(패스트랩(FastLab)^TM, GE 헬쓰케어 리미티드(GE Healthcare Ltd)) 상에 위치 14에 로딩하였다.

단계 (b): ¹⁸ F- 벤즈알데히드의 합성 및 정제

[¹⁸O](p,n)[¹⁸F] 핵 반응을 통해 은 표적을 구비한 GEMS PET트레이스 사이클로트론을 사용하여 [¹⁸F]플루오라이드를 제조하였다. 1.5 내지 3.5 mL의 총 표적 부피를 사용하였다. 방사성플루오라이드를 워터스 QMA 카트리지(카르보네이트로 전처리) 상에 포획하고, 플루오라이드를 물(80 ㎕) 및 아세토니트릴(320 ㎕) 중의 크립토픽스(Kryptofix)₂ _.2.2.(4 mg, 10.7 μM)와 탄산칼륨(0.56 mg, 4.1 μM)의 용액으로 용리하였다. 용액을 QMA 카트리지로부터 반응 용기에 내보내기 위하여 질소를 사용하였다. 질소의 정상(steady) 기류 및 진공 하에서 120℃에서 9분 동안 [¹⁸F]플루오라이드를 건조시켰다. 디메틸술폭시드(1.1 mL) 중의 트리메틸암모늄 벤즈알데히드 트리플레이트(문헌 [Haka et al., J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)])(3.3 mg, 10.5 μM)를 건조 [¹⁸F]플루오라이드에 첨가하고, 혼합물을 105℃에서 7분 동안 가열하여 4-[¹⁸F]플루오로벤즈알데히드를 제조하였다. 표지화 효율은 69±3% 붕괴 보정되었다.

이어서, 조 표지화 혼합물을 수산화암모늄 용액으로 희석하고, MCX+ SPE 카트리지(패스트랩 시퀀스의 일부로서 물로 사전-조절됨) 상에 로딩하였다. 카트리지를 물로 세척하고, 4-[¹⁸F]플루오로벤즈알데히드의 용리 전에 질소 기체로 건조시켜 에탄올(1 ml) 중에 반응 용기에 되돌렸다. 대략 13%(붕괴 보정됨)의 [¹⁸F]플루오로벤즈알데히드가 카트리지 상에 포획된 채로 유지되었다.

단계 (c): 아미노-옥시 유도체(화합물 2)와의 알데히드 축합

MCX+ 카트리지로부터 복귀한 4-[¹⁸F]플루오로벤즈알데히드의 용리 전에 화합물 2(5 mg, 1.8 μmol)을 패스트랩 반응 용기로 옮겼다. 이어서, 혼합물을 70℃에서 17분 동안 가열하였다. 분석 HPLC는, 화합물 3B 생성물의 RCP가 63±9%임을 입증하였다.

조 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석하고, 분취용 HPLC 상에 로딩하였다. 10 mM 암모늄 아세테이트 대 아세토니트릴 시스템은, 조 반응 혼합물 중의 3개의 가능한 방사능 성분, 즉 [¹⁸F]플루오라이드(T_R = 0.5분), [¹⁸F]화합물 3B(T_R = 6분) 및 4-[¹⁸F]플루오로벤즈알데히드(T_R = 9분) 간의 완벽한 분리를 제공하였다. HPLC 시스템으로부터의 방사능의 회수는 양호하였고, 회수 효율은 97%이었다. 약 6분의 체류 시간 동안 수집함으로써 정제된 생성물을 수득하였다.

실시예 5: 비표지화 펩티드로부터의 ⁿ F -표지화 c- Met 시클릭 펩티드의 HPLC 분리

실시예 3에 따라서 화합물 3A를 제조하였다.

(i) 분석 HPLC 조건

컬럼: X브릿지 쉴드(XBridge Shield) RP 18(4.6 × 50)mm, 2.5 ㎛

수성 이동상 A: 10 mM NH₄Ac(완충액) pH 약 6.8

유기 이동상 B: 아세토니트릴

컬럼 온도: 25℃

유동: 1.2 ml/분

( ii ) 분취용 HPLC 조건

컬럼: X브릿지 쉴드 RP 18(10 × 100)mm, 5 ㎛

수성 이동상 A: 10 mM NH₄Ac(완충액) pH 약 6.8

유기 이동상 B: 에탄올(90%), 이동상 A(10%)

컬럼 온도: 25℃

유동: 4 ml/분

( iii ) 분석 및 분취용 HPLC 결과

실시예 6: 종양-보유 누드 마우스에서의 ¹⁸ F-표지화 c- Met 펩티드(화합물 3B)의 생체분포

CD-1 수컷 누드 마우스(약 20 g)들을 음식물 및 물에 무제한으로 접근하게 하면서 각각의 통풍되는 우리에 살게 하였다. HT-29 세포(ATCC, 목록 번호 HTB-38)를 10% 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 맥코이(McCoy's) 5a 배지(시그마 # M8403)에서 생육시켰다. 0.25% 트립신을 사용하여 70 내지 80% 융합에서 세포를 1:3으로 1주 2회 분할하고, 5% CO₂ 중에서 37℃에서 배양하였다. 경미한 기체 마취(이소플루란)하에, 미세한 구멍 바늘(25G)을 사용하여 100 ㎕의 부피로 주사 당 10⁶ 세포의 공칭 용량을 가진 HT-29 세포 현탁액을 하나의 부위(목덜미)에서 마우스에 피하 주사하였다. 이어서, 종양을 20일 동안 또는 적어도 200 mm³ 부피까지(연구에 포함시키기 위해) 발달시켰다.

20일의 성장 시간 후에, 꼬리 정맥을 통해 정맥내 볼루스(bolus)로서 화합물 3B(0.1 ml, 1 내지 5 MBq/동물)을 동물에 주사하였다. 다양한 시간에, 주사후 동물을 안락사시키고, 해부한 후, 기관 및 조직을 제거하였다.

종양 흡수는 2분에 2.3 %id/g이고, 30분에 피크(3.8% id/g)인 다음, 시간이 경과하면서 120분 p.i.에서 1.9 %id/g로 감소하였다. 종양 내의 전체 체류율은 83%이었다. 시간에 걸쳐 상당히 빠른 혈액 제거가 존재하였다(초기 2분의 혈액은 9.2 %id/g이고, 120분 p.i.에서 0.81 %id/g로 감소하였다). 주된 배경 조직(예, 폐 및 간)은 시간의 경과에 따라 상기 혈액 제거 양상을 따랐으며, 120분 p.i.에서의 흡수가 1.1 %id/g(간) 및 1.56 %id/g(폐)이었다.

실시예 7: 종양-보유 누드 마우스에서의 화합물 3B의 수용체 봉쇄 연구

100 및 1000배 과량의 비-방사능 유사체, 화합물 3A(동물 당 ~1.5 ㎍ 및 15 ㎍ 과량)을 동시 주입하면서 실시예 6의 연구를 반복하였고, 주사 후 120분에 동물을 해부하였다. 이 연구에서의 모든 동물은 유사한 체중을 가졌다(25 내지 30 g의 범위). 데이터는, 1000배 과량의 비표지화 펩티드로 화합물 3B의 종양 흡수에서 통계적으로 의미있는 감소(p<0.01)가 달성되었음을 증명하였다(HT-29 종양 흡수는 1.9에서 1.1 %id/g로 감소하였다; 40% 감소).

실시예 8: 화합물 3B의 영장류 PET 영상화

3마리의 암컷 시노물구스(cynomolgus) 원숭이에서 화합물 3B의 생체분포를 PET에 의해 측정하였다. 각각의 경우에 2회의 추적자 주입을 수행하였다:

(a) 추적자 단독(화합물 3B) 3 MBq/kg(기준선 연구);

(b) 기준선 주사 4시간 후에 0.15 mg/kg의 화합물 3A의 공동-주입과 함께 추적자 9 MBq/kg(봉쇄 연구).

추적자를 1 내지 3 ml의 볼루스 용량으로 주사한 후, 1 mL 염수를 주사하였다.

방사능 결정을 위해 혈액 샘플(0.2 ml)을 투여 후 210분까지 일정 간격으로 취하였다. 주요 동적 연구 영역에서는 뼈, 심장, 신장, 폐, 간 및 근육에서 뽑아내었다. 전신 연구에서는, 주요 영역은 뼈, 뇌, 결장, 심장, 신장, 폐, 간, 근육, 췌장, 소장, 비장 및 방광에서 뽑아내었다. 표준 흡수 계수(SUV)로서 표현되는 시간-활성 데이터를 생성하였다.

동결 절편 자가방사선술을 사용하여 시험관내에서 레서스(rhesus) 원숭이 간에서의 특이적 결합(~40%)이 관찰되었다. 레서스 원숭이 근육은 어느 특정한 결합을 갖는 것으로 관찰되지 않았다. 시노몰구스 원숭이에서의 생체내 연구는, 0.15 mg/kg의 화합물 3A의 공동-주사 후에 >40% 만큼 감소되는, 간에서의 빠른 흡수를 나타내었다. 생체내 근육에 대한 비 특이적 결합이 관찰되었다.

실시예 9: 화합물 3B의 생체분포에 대한 시클로덱스트린의 효과

화합물 3B 및 가용화제 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPCD)과 제제화된 화합물 3B의 생체분포를 비교하였다. 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

실시예 10: 화합물 3B의 완전 자동화 합성

완충액 또는 아닐린 용액 중에 용해된 화합물 2를 사용하여 실시예 4와 유사한 합성을 수행하고, 즉시 사용을 위해 패스트랩 카세트 상에 로딩하였다.

하기 표는, 분석 HPLC의 방사성화학 순도에 의해 계산된 것으로서, 각각의 주요 방사성표지화 구성성분의 양을 요약한다.

실시예 11: SPE 정제를 사용한 화합물 3B의 자동화 합성

패스트랩^TM(GE 헬쓰케어 리미티드) 자동화 합성장치를 사용하여 실시예 4의 합성을 수행하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 시약, 주사기 및 SPE 카트리지로 카세트를 구성하였다.

QMA(4급 메틸 암모늄 물 처리), MCX+(혼합된 양이온 교환) 및 C2(낮은 소수성) SPE 카트리지는 모두 워터스로부터 입수되었다.

패스트랩 시퀀스 동안에, 카트리지를 에탄올로 (텐덤식으로) 상태조절하였다. 사용 직전에, 카트리지를 묽은(0.2%) 인산으로 전처리하였다. 조 반응 혼합물을 1% 인산으로 희석하고, SPE 상에 로딩하였다. 생성물을 6 mL 물(80% 에탄올)로 용리하기 전에 SPE를 물로 세척하고, 방사성화학 순도(RCP)를 분석 HPLC에 의해 분석하였다.

사용된 ¹⁸F-플루오라이드의 출발량을 기준으로 하여, 결과는 다음과 같았다:

실시예 12: 전구체의 제형 및 동결 건조

펩티드 전구체 화합물 2(2.5 또는 5 mg)를 제형 완충액(인산수소이나트륨 이수화물 및 시트르산 일수화물, pH 2.8)과 혼합하고, 균질 현탁액이 수득될 때까지 교반하였다. 동결 건조 마개를 가진 패스트랩^TM 자동화 합성장치(GE 헬쓰케어 리미티드)로부터의 13 mm 바이알을 각각 1 mL 현탁액으로 채웠다. 이어서, 동결 건조 장치에서 바이알을 동결시키고, 4일 동결 건조 주기로 처리하였다.

펩티드를 함유하는 모든 바이알은 만족스러운 동결건조 케이크를 제공하였다. 동결건조된 전구체는 건조-분배된 화합물 2에 비해 훨씬 빨리 용해되는 것으로 밝혀졌다.

실시예 13: 용해도에 대한 pH 의 효과

패스트랩^TM 합성장치 상에서 화합물 3B를 제조하고, 생성물 용리제(~ 6 ml)를 2 mL의 제형 완충액(pABA, 시트르산 완충액, pH 7)을 함유하는 바이알에 수집하였다. 뿌연 용액이 관찰되었다. 용액(8 ml)은 예비-필터(소수성 반발 스트립을 가진 0.2㎛ 수포르(Supor) 막을 가진 폴(Pall) 25 mm 필터, 부품 번호 6124211)를 통해 쉽게 여과되어 투명 용액을 제공하였다.

여과된 용액을 4 × 2 ml 샘플로 나누고, 4개 샘플에서의 pH를 다음과 같이 포스페이트(고체, 부피를 변화시키기 않기 위함)로 조정하였다:

바이알 1 pH 7.5(원래 용액, 조정되지 않음)

바이알 2 pH 6.1

바이알 3 pH 8.6

바이알 4 pH 9.1

모든 샘플을 상온에서 어두운 곳에서 보관하였다. 잠재적인 응집/침전을 평가하기 위하여, 4개 샘플을 28일 동안 정적 광 산란으로 처리하였다. 다음이 관찰되었다:

- pH 6.1은 10일에 육안 침전물을 나타내었다;

- 28일 후에 pH ≥ 7.5에서 응집 징후가 관찰되지 않았다.

실시예 14: 인간 연구

두경부 편평상피세포 암종으로 미리 진단된 6명의 인간 환자에게서 화합물 3B에 의한 영상화를 연구하였다. 시약은 잘 허용되었다(부작용 없음). 6명 중 5명의 환자는 추적자의 중간/높은 흡수를 가졌으며, 1명의 환자는 낮은 흡수를 가졌다(대측부와 유사). 이것은 c-Met를 과다발현하는 환자가 80%라는 문헌 보고와 일치한다.

SEQUENCE LISTING <110> GE Healthcare Limited <120> Peptide Radiotracer Compositions <130> PZ1058 WO <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (1)..(13) <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> N, H or Y <220> <221> DISULFID <222> (3)..(11) <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> D or E <400> 1 Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (2)..(14) <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> N, H OR Y <220> <221> DISULFID <222> (4)..(12) <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> D or E <400> 2 Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (4)..(16) <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> N, H or Y <220> <221> DISULFID <222> (6)..(14) <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> D or E <400> 3 Ala Gly Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Thr 20 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Lys 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Gly Ser Gly Lys 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (4)..(16) <220> <221> DISULFID <222> (6)..(14) <400> 7 Ala Gly Ser Cys Tyr Cys Ser Gly Pro Pro Arg Phe Glu Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr Glu Thr Glu Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25

Claims

¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하고, 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드가 하기 화학식 I의 18 내지 30량체 시클릭 펩티드인 영상화 시약.
<화학식 I>
Z¹-[cMBP]-Z²
[상기 식에서,
cMBP는 화학식 II를 가지며:
<화학식 II>
-(A)_x-Q-(A')_y-
{상기 식에서, Q는 아미노산 서열(SEQ-1)이고:
-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-
(여기에서, X¹은 Tyr이고;
X²는 Ser이고;
X³은 Arg이고;
X⁴는 Glu이고;
X⁵는 Thr이고;
X⁶은 Glu이고;
Cys^a-d는 각각 시스테인 잔기이며, 잔기 a 및 b 뿐만 아니라 c 및 d가 고리화되어서 2개의 별개의 디술피드 결합을 형성한다);
A 및 A'는 독립적으로 Cys 이외의 임의의 아미노산이고, 단 A 및 A' 중 적어도 하나는 존재하고 Lys이며;
x 및 y는 독립적으로 0 내지 13의 정수이고, [x+y] = 1 내지 13이 되도록 선택된다};
Z¹은 cMBP의 N-말단에 결합되고, H 또는 M^IG이고;
Z²는 cMBP의 C-말단에 결합되고, OH, OB^c 또는 M^IG이고,
(여기에서 B^c는 생체적합성 양이온이며;
각각의 M^IG은 독립적으로 cMBP 펩티드의 생체내 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체적합성 기인 물질대사 억제 기이다);
cMBP는 ¹⁸F로 A 또는 A' 기의 Lys 잔기에서 표지화된다.]

제1항에 있어서, cMBP가 하기 화학식 IIA인 영상화 시약.
<화학식 IIA>
-(A)_x-Q-(A')_z-Lys-
[상기 식에서,
z는 0 내지 12의 정수이고 [x+z] = 0 내지 12이고,
cMBP는 단지 하나의 Lys 잔기를 포함한다.]

제1항 또는 제2항에 있어서, Q가 SEQ-2 또는 SEQ-3의 아미노산 서열을 포함하는 영상화 시약.
Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶
(SEQ-2);
Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-
X⁴-X⁵-X⁶-Gly-Thr (SEQ-3).

삭제

제1항 또는 제2항에 있어서, -(A)_x- 또는 -(A')_y- 기가 다음으로부터 선택된 링커 펩티드를 포함하는 영상화 시약.
-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4)
-Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) 또는
-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6)

제5항에 있어서, cMBP가 하기 아미노산 서열(SEQ-7)을 갖는 영상화 시약.
Ala-Gly-Ser-Cys^a-Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

제1항 또는 제2항에 있어서, Z¹ 및 Z²둘 다가 독립적으로 M^IG인 영상화 시약.

제7항에 있어서, Z¹이 아세틸이고 Z²가 1차 아미드인 영상화 시약.

(i) 제1항 또는 제2항의 영상화 시약; 및
(ii) 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하고,
여기서, 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드가 (i) 및 (ii)에서 동일한 아미노산 서열을 갖고,
비표지화 cMBP 펩티드가 상기 ¹⁸F-표지화 cMBP 펩티드의 몰 량의 50배 이하로 조성물에 존재하는, 영상화 시약 조성물.

제9항에 있어서, pH 7.5 이상으로 유지되고/되거나 가용화제를 더 포함하는 영상화 시약 조성물.

제9항에 있어서, 하나 이상의 방사성보호제를 더 포함하는 영상화 시약 조성물.

제1항 또는 제2항의 영상화 시약을 생체적합성 담체와 함께 포함하는, 포유동물 투여에 적절한 무균 형태인, 암의 진단에서 사용하기 위한 제약 조성물.

Z¹= Z²= M^IG인, 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하는, 제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조에 유용한 전구체.

(i) Z¹= Z²= M^IG인, 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하는, 제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조에 유용한 전구체를 제공하고;
(ii) ¹⁸F-표지화 활성화 에스테르와 또는 활성화 시약의 존재 하에서 ¹⁸F-표지화 카르복실산과 반응시켜 상기 시클릭 펩티드의 cMBP의 Lys 잔기에서 아미드 결합을 통해 접합된 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제공하는 것을 포함하는,
제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조 방법.

삭제

영상화 시약 조성물의 제조 방법으로서,
상기 영상화 시약 조성물은,
(a) 제1항 또는 제2항의 영상화 시약; 및
(b) 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하고,
여기서, 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드가 (a) 및 (b)에서 동일한 아미노산 서열을 갖고, 비표지화 cMBP 펩티드가 상기 ¹⁸F-표지화 cMBP 펩티드의 몰 량의 50배 이하로 조성물에 존재하는 것이고,
상기 제조 방법은,
(i) ① Z¹= Z²= M^IG인, 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하는, 제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조에 유용한 전구체를 제공하고;
② ¹⁸F-표지화 활성화 에스테르와 또는 활성화 시약의 존재 하에서 ¹⁸F-표지화 카르복실산과 반응시켜 상기 시클릭 펩티드의 cMBP의 Lys 잔기에서 아미드 결합을 통해 접합된 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제공하는 것을 포함하는 제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조 방법을 사용하여 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제조하고;
(ii) ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드로부터 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 크로마토그래피 분리하는 것을 포함하는 것인,
영상화 시약 조성물의 제조 방법.

(i) ① Z¹= Z²= M^IG인, 제1항 또는 제2항에 정의된 화학식 I의 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 포함하는, 제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조에 유용한 전구체를 제공하고;
② ¹⁸F-표지화 활성화 에스테르와 또는 활성화 시약의 존재 하에서 ¹⁸F-표지화 카르복실산과 반응시켜 상기 시클릭 펩티드의 cMBP의 Lys 잔기에서 아미드 결합을 통해 접합된 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제공하는 것을 포함하는 제1항 또는 제2항의 영상화 시약의 제조 방법을 사용하여 ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제조하고;
(ii) ¹⁸F-방사성표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드로부터 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 크로마토그래피 분리하는 것을 포함하고,
자동화 합성장치를 사용하여 상기 방법을 수행하는,
제1항 또는 제2항의 영상화 시약을 생체적합성 담체와 함께 포함하는, 포유동물 투여에 적절한 무균 형태인, 암의 진단에서 사용하기 위한 제약 조성물의 제조 방법.

삭제