KR101852304B1

KR101852304B1 - NecroX를 이용한 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율 및 성숙도 증진 방법

Info

Publication number: KR101852304B1
Application number: KR1020170103712A
Authority: KR
Inventors: 김효수; 양한모; 김주영; 이주은
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2018-04-25
Also published as: KR20180020906A

Abstract

본 발명자들은 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율을 증진시키고 성숙도를 향상시키기 위해 예의 연구한 결과, 네크로엑스(NecroX) 처리군에서 줄기세포기반 심근세포로의 분화효율이 증가하였을 뿐만 아니라 더 성숙한 심근세포를 단기간에 획득할 수 있다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따른 NecroX의 처리로 줄기세포 유래 심근세포는 세포의 크기가 대조군에 비해 크고 굵으며, 튼튼할 뿐만 아니라 치밀한 액틴의 구조를 보여, NecroX 처리로 유도된 줄기세포유래 심근세포는 성숙도가 높아진 심근세포를 제작할 수 있음을 보여주는바, 따라서 NecroX를 처리하면 줄기세포에서 유래된 심근세포의 고효율, 고순도 분화를 유도할 수 있다. 이에, 본 발명의 NecroX는 다른 분화세포의 분화효율과 성숙도도 증가시킬 수 유용한 물질로서 환자 맞춤형 유도만능줄기세포에서 심근세포의 분화를 확립해 심장질환 모델을 제작하는데 도움이 될 것으로 기대된다.

Description

NecroX를 이용한 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율 및 성숙도 증진 방법 {Method for enhancement of maturation and differentiation efficiency of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes}

본 발명은 미토콘드리아유래 ROS(Reactive Oxygen Species)의 스캐빈저 (scavenger)인 네크로엑스(NecroX)를 처리하여 줄기세포 유래 심근세포의 분화를 유도하는 방법에 의해 선택적으로 고비율의 심근세포를 분화시키고 성숙화 시키는 방법에 관한 것이다.

국내에서도 심혈관 질환에 의한 사망률은 급격히 증가해 오고 있다. 그 중에서도 심부전을 앓은 환자의 예후는 위암을 앓은 환자보다도 좋지 않아 심혈관 질환의 치료와 예후를 개선할 수 있는 약제 개발 및 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 심근경색 등을 통한 심근세포의 손상은 혈액을 말초로 보내는 심장의 구조적이고 기능적인 능력을 감소시키기 때문에 최종적으로 심부전을 야기하게 된다. 손상된 심근의 복원을 위해 손상 심근세포를 건강한 심근세포로 대체하는 연구가 심장재생의 잠재적인 방법으로 연구되기 시작하였다. 심근세포 대체 세포로서 성체줄기세포인 골격근 근육 모세포 (skeletal myoblast), 다양한 골수유래 줄기세포, 심장에 존재하는 심장 줄기세포 등이 연구되었으나 이들 세포로서는 실제 심근세포에 비해 심장의 기능을 회복을 위한 능력이 많이 떨어져 세포재생능력에 제한이 많거나, 임상적으로 심장의 정상적인 기능회복을 위한 충분한 양의 순수한 심근세포를 획득하기 어려웠다. 이후 배아줄기세포를 이용한 심근세포의 분화방법이 급격하게 발전되었고 배아줄기세포를 통한 심근세포는 원래의 심근세포처럼 수축능이나 활동전위를 가져 기능적이고 구조적인 측면에서는 가장 각광받았으나 결국 자신의 세포가 아니어서 획득된 심근세포를 타인이 이용하기에는 윤리적, 면역적 문제가 존재한다.

그러나 2006년 일본의 야마나카 교수에 의해 개발된 4가지 유전자를 이용한 유도만능 줄기세포 (iPSC : Induced Pluripotent Stem Cell) 제작 방법의 개발로 환자 맞춤형 세포치료 시장과 질병발생 기작연구에 새로운 발전 가능성이 제시되자 다수의 심근세포를 생산하기 위한 자원으로서 유도만능줄기세포의 이용연구도 활발히 진행되었다. 다양한 연구를 통해 유도만능 줄기세포의 심근세포로의 분화효율을 향상시킬 수 있었으며 최근에는 심근세포 분화에 재조합 싸이토카인이 아닌 미세화합물들을 이용해서 다량의 심근세포를 경제적으로 획득하는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 또한 유도만능 줄기세포에서 심근세포로의 분화 시 심근세포외에 생기는 다른 세포들을 제거하여 분화심근세포의 순도를 높이는 방법도 연구되고 있다. 주로 심근세포의 표면 마커를 이용한 세포 솔팅 방법이나 성인 심근세포의 대사적 차이를 이용한 선별방법이다.

분화가 끝난 심근세포는 신생아의 심근세포와 유사한 성질을 나타내기 때문에 정확한 성인의 심근세포를 반영하고 있지 못하며 질환이 있을 경우 다양한 성인심근세포의 분자적, 구조적, 대사적 특징이 질환환경 조건에 따라 다양한 반응을 갖는 것이 밝혀졌다. 따라서 정밀한 분석을 요하는 독성 및 약물 효과 분석을 하기 위한 심근세포의 성숙도가 낮으면 편중된 결과를 가져오거나 베이스라인이 달라서 정확한 결과를 도출하는데 오류가 개입될 가능성이 높다. 2011년 Hom JR 등은 Developmental Cell지에 신생아의 심근세포는 미토콘드리아의 mPTP (mitochondrial permeability transition pore)가 열려 미토콘드리아의 막전위가 탈분극화되어 세포내 ROS(Reactive Oxygen Species) 레벨이 증가되어 있고, 분화가 진행되어 성숙한 심근세포가 될수록 mPTP가 닫혀서 미토콘드리아의 막전위가 안정되고 ROS 생성이 줄어든다는 보고를 하였다.

한편, 네크로엑스(NecroX)는 정상섬유아세포 유도만능 줄기세포 유래 분화 심근세포의 분화뿐만 아니라 다른 중배엽 유래 유도만능줄기세포 심근세포 분화의 효율도 증진시키는 등 정상섬유아세포 유도만능 줄기세포에서와 비슷한 역할을 보이는 것이 관찰되고 있으며, 추가 연구에 따라 NecroX는 심근세포 분화뿐 아니라 평활근 세포나 근육세포의 분화 효율 및 성숙도 증가에도 사용되는 등 그 효용은 기작 연구가 진행됨에 따라 심근세포뿐 아니라 다른 종류의 세포 분화에도 응용되는 등 더 넓어질 수 있을 것으로 예상된다.

아울러, 줄기세포의 분화를 유도하기 위하여 다양한 연구가 진행 중에 있으나(한국 등록특허 10-1465354 참조), 보다 효율적으로 줄기세포로부터 심근세포를 유도할 수 있는 방법에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율을 증진시키고 성숙도를 향상시키기 위해 예의 연구한 결과, 네크로엑스(NecroX)를 이용한 이전의 실험결과에서 NecroX가 mPTP의 개방을 억제하고 미토콘드리아의 막전위를 유지시켜주며, 토콘드리아 ROS(Reactive Oxygen Species)의 스캐빈저로서 세포괴사 (Necrosis)를 억제하면서, 이외에도 칼슘채널의 발현 증가에 NecroX가 기여한다는 사실을 확인하였는바, 이처럼 다양한 NecroX의 기능들이 줄기세포유래 심근세포의 분화효율과 성숙도에 어떠한 영향을 미치는지를 확인해 본 결과, 미토콘드리아 ROS(Reactive Oxygen Species)의 스캐빈저인 세포괴사의 억제제 NecroX-7 (NecX)를 심근세포 분화과정에 처리하였을 때, NecroX 처리군에서 줄기세포기반 심근세포로의 분화효율이 증가하였을 뿐만 아니라, 더 성숙한 심근세포를 단기간에 획득할 수 있다는 사실을 확인하고, 본원발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 네크로엑스(NecroX)를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 네크로엑스를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화되어 a) cardiac Troponin T (cTnT) 및 α-sarcomeric actin을 발현함; 및 b) 박동하는 세포인 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 심근세포 및 상기 심근세포를 유효성분으로 함유하는 심장질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 네크로엑스(NecroX)를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 네크로엑스를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 네크로엑스는 바람직하게는 5nM 내지 500nM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화되어 a) cardiac Troponin T (cTnT) 및 α-sarcomeric actin을 발현함; 및 b) 박동하는 세포인 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 심근세포 및 상기 심근세포를 유효성분으로 함유하는 심장질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명자들은 네크로엑스(NecroX)를 처리하면 줄기세포로부터 보다 효율적으로 순도 높은 심근세포의 분화를 유도할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 본원발명에 따라 NecroX를 이용하여 환자 맞춤형 유도만능줄기세포에서 심근세포의 분화를 확립할 수 있으며, 나아가 이를 이용한 심장질환 모델을 제작할 수 있어 진단기술 및 신약개발에 이바지할 수 있다. 또한, 향후 인체적용이 가능한 유도만능 줄기세포가 개발되면 이를 세포치료제로 이용하여 곧바로 임상시험을 시행할 수 있는 여건이 조성될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 줄기세포에서 심근세포를 분화시키는 과정을 시간순서에 따라 처리가 필요한 배지와 시약으로 간단하게 도식화한 것이다.
도 2는 줄기세포에서 심근세포로의 분화가 끝난 시점인 12일째에 보이는 분화세포의 특정 형태를 네크로엑스(NecroX; NecX) 처리 농도별로 촬영한 것이다.
도 3은 줄기세포에서 심근세포로의 분화가 끝난 시점인 12일째에 전체 분화세포에서 심근세포의 마커인 cTNT 양성세포의 비율을 네크로엑스(NecroX; NecX) 처리 농도별로 나타낸 유세포 분석결과와 그 정량 그래프이다.
도 4는 줄기세포에서 심근세포로의 분화 22일째에 대조군 (Vehicle)과 실험군 (NecroX; NecX)에서 심근의 actin을 염색하는 a-sarcomeric actin과 미토콘드리아를 표시해주는 Tom20, 그리고 세포의 핵을 염색하는 DAPI의 면역염색 결과이다.
도 5는 줄기세포에서 심근세포로의 분화 22일째에 대조군 (Vehicle)과 실험군 (NecX)에서의 칼슘 채널들 (RYR2, CAV2.1, SERCA2)의 유전자 발현을 보여주는 결과이다.
도 6은 줄기세포에서 심근세포로의 분화 22일째에 대조군 (Vehicle)과 실험군 (NecroX; NecX)을 이용한 실험으로 세포내 칼슘에 결합하는 염색액인 FLUO-4를 사용하여 분화 심근에서의 규칙적으로 방출되는 칼슘의 농도 (ΔF/F)를 나타낸 결과이다.
도 7은 줄기세포에서 심근세포의 분화과정에 네크로엑스(NecroX; NecX) 처리가 미치는 영향에 대한 도해이다.

본 발명자들은 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율을 증진시키고 성숙도를 향상시키기 위해 예의 연구한 결과, 네크로엑스(NecroX) 처리군에서 줄기세포기반 심근세포로의 분화효율이 증가하였을 뿐만 아니라 더 성숙한 심근세포를 단기간에 획득할 수 있다는 사실을 확인하고, 본원발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 네크로엑스(NecroX)를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "네크로엑스(NecroX)"는 괴사(necrosis)에 대한 강력한 세포 보호 효과와 염증 억제 기능을 가진 저분자화합물로서 과도하게 축적된 활성산소와 칼슘을 제거하는 기전이 확인되었으며, 미토콘드리아의 mPTP가 열리는 것을 억제해서 세포의 미토콘드리아 막전압을 유지시켜주고, ROS(reactive oxygen species) 스케빈저로서 산화스트레스(oxidative stress)를 억제한다. 여기에 더하여 JNK pathyway를 억제하는 작용들이 알려져 있다.

또한, 본 발명에서 "ROS"는 reactive oxygen species의 약자로서, 활성산소를 의미하며, 활성산소(reactive oxygen species)는 세포에 손상을 입히는 모든 종류의 변형된 산소를 말한다. 활성산소가 우리 몸에 무조건 해로운 것은 아니며, 예를 들어 체내에서 과산화수소의 분해 결과 생성되는 수산화 라디칼은 병원체 등을 무차별적으로 공격하여 소독약 역할을 수행하고 있다.

또한, 본 발명은 네크로엑스(NecroX)를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화되어 a) cardiac Troponin T (cTnT) 및 α-sarcomeric actin을 발현함; 및 b) 박동하는 세포인 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 심근세포 및 상기 심근세포를 유효성분으로 함유하는 심장질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

본 발명의 일실시예에서는, 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율을 증진시키고 성숙도를 향상시키기 위하여, 인슐린이 포함 안 된 배지로 시작하여 Wnt 억제제 (CHIR99021)를 2일간 처리한 후, 10ng/ml 농도의 액티빈A (activin A)와 그 두 배 양의 bFGF (20ng/ml)를 하루 동안 처리하였다가, 하루가 지난 후 배지를 갈고, 그 다음날 GSK 억제제인 IWR1을 이틀간 처리한 다음, 이틀 후에 인슐린이 포함된 배지로 2일에 한 번씩 배지를 갈아주면서, 네크로엑스(NecroX)를 첨가한 심근세포 분화배지를 관찰하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 심근세포 마커 발현 세포의 증가를 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행하였으며(실시예 2 참조), 면역형광염색을 수행하여 심근세포에서의 α-sarcomeric actin과 미토콘드리아 (Tom20)을 관찰하였고(실시예 3 참조), 심근세포에서의 유전자 발현 양상을 조사하고자 Realtime PCR을 수행하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 분화된 심근세포 내 칼슘의 변화를 측정하기 위하여, 칼슘 특이적 염색시약인 FLUO-4를 이용해 분화 심근세포의 기능상의 차이를 비교하였고, 본 발명의 NecroX가 분화심근세포의 칼슘채널의 증가를 유도해 박동 수가 더 빠르고 강해진 심근세포를 대조군보다 더 이른 시간에 획득할 수 있으며, 더 순도 높은 심근세포를 제공함을 확인하였다(실시예 5 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 인간피부섬유아세포 유도만능줄기세포 심근세포의 고효율 고순도 분화 방법 확립

줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율을 증진시키고 성숙도를 향상시키기 위하여, 정상인 피부섬유아세포 유래 유도만능 줄기세포에서 단층 분화 조건을 확립하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 마트리젤이 코팅된 35mm 배양접시에 ROCK 억제제를 10μM의 농도로 첨가하여 아큐테이즈를 사용해 단일세포로 분리한 유도만능줄기세포를 2X10⁶개로 씨딩하였다. 세포가 35mm 배양접시를 가득 채울 때까지 mTeSR^TM1 (STEMCELL Technologies)으로 갈아주고, 유도만능줄기세포가 35mm 배양접시를 가득 채우면 B27 minus insulin (Thermo Fisher Scientific) 보충제가 들어간 RPMI 1640배지 (Thermo Fisher Scientific)에 6μM의 농도가 되도록 GSK-3 억제제인 CHIR99021 (Cayman Chemical)을 첨가한 다음, 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 네크로엑스(NecroX)도 첨가한 심근세포 분화배지를 준비하였고, RPMI 1640배지로 가볍게 한 번 씻어낸 후에 위의 심근세포 분화배지를 2ml 넣어서 24시간 동안 배양하였다.

그 후, 다음날도 동일하게 RPMI 1640배지로 가볍게 한 번 씻어낸 다음 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 NecroX가 첨가된 동일한 심근세포 분화 배지로 바꾸어주고 24시간동안 배양하였다. 다음날 10ng/ml의 액티빈 A (Activin A: R&D)와 20ng/ml의 bFGF를 B27 minus insulin 보충제가 들어간 RPMI1640 배지에 첨가하고 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 NecroX도 첨가하여 이전 실험과 동일하게 RPMI 1640배지로 가볍게 한 번 씻어낸 후 배지를 갈아주고 24시간 동안 배양하였다.

다음날 B27 minus insulin 보충제가 들어간 RPMI1640 배지에 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 NecroX만 첨가하여 RPMI 1640배지로 가볍게 한 번 씻어주고 배지를 갈아서 24시간동안 배양하였다. 다음날 B27 minus insulin 보충제가 들어간 RPMI1640 배지에 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 NecroX를 첨가하고 5μM의 Wnt 억제제인 IWR1 (SigmaAldrich)을 넣어준 배지를 RPMI 1640로 가볍게 한 번 씻어낸 후 배지를 갈아서 48시간 동안 배양하였다. 이후 B27 minus insulin 보충제가 들어간 RPMI1640 배지에 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 NecroX만 첨가하여 RPMI 1640배지로 가볍게 한 번 씻어주고 배지를 갈아서 24시간 동안 배양하였으며, 동일 과정을 다음날에도 반복하였다. 이후 B27 (Thermo Fisher Scientific) 보충제가 들어간 배지에 각 5nM, 100nM, 및 500nM의 NecroX를 첨가하고 RPMI 1640로 가볍게 한 번 씻어낸 후 배지를 갈아서 48시간 동안 배양하였다. B27 보충제가 들어간 배지로 갈아줄 경우 당일에도 심근세포가 출현한 것을 볼 수 있으며, 심근세포의 박동 수와 출현비율은 NecroX 농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, NecroX를 처리한 군에서 더 균일하게 배양접시 바닥에서 떨어진 심근세포를 관찰할 수 있었으며, 심근세포의 분화 효율이 증가되었다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 유세포 분석을 통한 심근세포 마커 (cTnT) 발현 세포의 증가 확인

심근세포 마커 발현 세포의 증가를 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행하였는바, 유도만능줄기세포 유래 분화 심근세포가 있는 디쉬를 PBS로 두 번 헹구어내고 0.25% Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 FACS 튜브로 모았다. 1000 rpm, 3분간 원심분리기를 이용해 시험관에 모인 세포를 PBS+2.5% FBS (Fetal bovine serum)이 첨가된 FACS buffer로 헹구어주고, 세포 pellet을 잘 풀어준 다음, 최종농도 1% paraformaldehyde로 10분간 실온에서 세포를 고정해 주었다. 고정 후, FACS buffer를 첨가하여, 1000 rpm, 3분간 원심분리로 세포를 헹구어 준 다음, vortex를 하면서 천천히 최종 농도 90%가 되도록 Methanol을 넣어서 세포를 4℃에서 10분간 permeabilization 시켜주었다. Permeabilization 후, FACS tube 윗부분까지 FACS buffer를 채워 1000rpm, 3분간 원심분리하고 여분의 methanol을 헹구어 내준 다음, FACS buffer로 한 번 더 세포를 씻어주었다. 세포를 분주한 후, 1:100의 농도로 cardiac troponin T 일차 항체를 넣어서 얼음 위에서 30분간 배양해준 다음, FACS buffer를 채워 1800rpm, 3분간 원심분리로 여분의 항체를 제거해 주었다. 각 항체가 상응하는 형광이 달린 이차 항체를 1:300으로 넣어서 동일하게 얼음 위에서 30분간 배양한 후, 다시 FACS buffer를 채워 1800rpm, 3분간 원심분리로 세포를 헹구어 주었다. 이후 세포 pellet을 잘 풀어주고 FACS 기기를 이용해 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, NecroX 처리군은 분화 실시 후 빠르면 약 12일부터 박동 심근세포가 관찰되었으며, 유세포 분석을 통해 심근세포 마커인 cardiac Troponin T (cTnT)의 발현 여부를 검토하였을 때 대조군에 비해 NecroX 처리군이 cTnT양성세포가 더 증가한 것을 관찰할 수 있었고, 100nM의 NecroX 처리군에서는 양성세포의 증가비율이 5배 이상 되었다.

실시예 3. 분화 22일째의 심근세포에서의 α- sarcomeric actin과 미토콘드리아 ( Tom20 )의 면역형광염색

면역형광염색을 수행하기 위하여, 유도만능줄기세포 유래 분화 심근세포가 있는 디쉬를 PBS로 두 번 헹구어내고 -20℃에 보관한 차가운 100% 메탄올을 1 ㎖ 디쉬에 첨가한 후 즉시 -20℃로 세포를 옮겨 10분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 10분 후 세포를 꺼내어 메탄올을 버리고 0.05% TBS-T(1XTBS :Tris-Buffered Saline, 0.05% tween 20)로 5분씩 3번 씻어준 다음, 염색하고자 하는 부위에 Dako pen으로 동그랗게 표시를 하였다. 이후 1% BSA(Bovine Serum Albumin), 0.05% Triton X-100을 PBS에 녹이고 0.22 μm 필터로 걸러 준비한 블로킹 용액(blocking solution)을 세포가 마르지 않게 표시한 부분에 덮어준 다음, 실온에서 30분 동안 블로킹 과정을 실시하였다. 다음으로, α-sarcomeric actin에 대한 1차 항체를 희석액에 1 : 100으로 희석해서 1차 항체 용액을 제조한 후 블로킹 용액을 제거하고, 1차 항체 용액을 처리한 다음, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 0.05% TBS-T로 10분씩 3번 헹구어 준 후 세포가 마르지 않도록 각각의 항체에 상응하는 2차 항체 용액(1:100)을 제작하여 각각의 세포에 처리한 다음, 실온에서 차광하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 다시 두 번째 항체 염색을 위해 블로킹 과정부터 다시 수행하여 Tom20에 대한 1차 항체를 처리하고 이후 동일한 과정을 통해 염색을 진행하였다. 마지막으로, 0.05% TBS-T로 실온에서 10분간 3번 헹구어준 후 핵 염색을 위해 1 ㎎/㎖의 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 용액을 1:1000이 되도록 희석액에 섞어준 다음, 세포에 넣어주고 차광하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 형광현미경으로 DAPI가 핵에 염색이 된 것을 확인하고 0.05% TBS-T로 3번 헹구어낸 후 커버슬립(cover slip)을 이용하여 fluorescence mounting medium(DAKO사)으로 마운팅하였다. 마운팅 후, Laser scanning confocal microscopy 710 (Zeiss, Germany)를 이용해서 형광을 찍은 후, Zeiss Zen software로 분석하였다.

광학현미경으로 관찰한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 분화 후 22일 경과된 시점에서 면역형광염색을 통해서 α-sarcomeric actin의 염색을 진행한 결과 vehicle 군에 비해 NecroX을 처리한 군의 분화심근세포가 크기도 더 크고 α-sarcomeric actin의 염색의 패턴도 좀 더 굵고 뚜렷한 경향을 보이는 것이 관찰되었다. Tom20로 염색되는 미토콘드리아는 두 군 간의 차이가 미미했으나 NecroX 처리군의 미코콘드리아가 좀더 진하고 양이 증가되어 있는 것이 관찰되었다.

실시예 4. 분화 22일째의 심근세포에서의 유전자 발현의 조사

심근세포에서의 유전자 발현 양상을 조사하고자 Realtime PCR을 수행하기 위하여 유도만능줄기세포 유래 분화 심근세포를 Trizol reagent로 녹여서 RNA를 획득하였다. 획득한 심근세포의 RNA를 정량하여 RNA 1μg을 이용하여 reverse transcription을 통해 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA 생성물 1μl를 SYBR® Green PCR Master Mix와 섞어주고 RYR2, CaV2.1, 및 SERCA2의 프라이머를 사용하여 realtime PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 분화 후 22일 경과된 시점에서 유전자의 발현 양상을 조사하였을 때 NecroX를 처리한 군이 대조군에 비해 세포내 calcium handling에 관련된 유전자들인 RYR2, CaV2.1, 및 SERCA2 (RYR2; SR막에 있는 calcium 유리 ion channel, CaV2.1; L-type calcium channel, SERCA2; sarcomeric reticulum (SR) 내로 calcium을 집어넣는 pump)이 더 증가되어 있는 경향을 관찰할 수 있었다.

실시예 5. 칼슘(Calcium) 염색시약인 FLUO-4를 이용한 분화심근세포 내 calcium의 변화 측정 결과

유도만능줄기세포 유래 분화 심근세포를 D-PBS로 두 번 헹구어준 후 organic anion-transport inhibitors인 probenecid가 1mM로 처리된 1% FBS가 첨가된 PBS에 최종농도 1uM 이 되도록 칼슘 indicator인 FLUO-4가 들어간 용액을 세포에 처리해 주었다. FLUO-4가 처리된 상태에서 30분간 37°C에서 배양한 다음, 다시 1% FBS가 들어간 PBS로 두 번 세포를 헹구어 주었다. 이후 1.8 mM CaCl₂와 5mM glucose가 포함된 extracellular solution (Nacl, Kcl, HEPES, MgCl₂)로 세포를 갈아주고, 실온에서 30분간 배양한 후, 라이브 이미징 장치로 Ca2+의 intensity 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, calcium 특이적 염색시약인 FLUO-4를 이용해 분화 심근세포의 기능상의 차이를 비교해 보았을 때에도 NecroX를 처리한 군이 대조군에 비교해서 더 규칙적이고 높은 ΔF/F 값을 보였다. 즉, 최대치에 도달하는 calcium의 양과 최대치에서 기저레벨로 감소 되는 속도가 NecroX를 처리한 군에서 증가 되는 것이 관찰되었다. 반면, 최대 calcium 배출량의 90%에 도달하기까지의 시간은 NecroX 처리한 군에서 감소되는 것으로 보였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

네크로엑스(NecroX)를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법으로서,
상기 방법으로 얻어진 심근세포는 세포 내 칼슘이 증가됨에 따라 박동이 촉진되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 네크로엑스는 5nM 내지 500nM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 방법.
네크로엑스를 포함하는, 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물로서,
상기 심근세포는 세포 내 칼슘이 증가됨에 따라 박동이 촉진되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 네크로엑스는 5nM 내지 500nM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 네크로엑스는 심근세포 내 칼슘의 증가를 유도하여 박동을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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