KR101851656B1 - 세포외다당류를 생산하는 신규 바실러스 소노렌시스 균주 및 세포외다당류의 용도 - Google Patents
세포외다당류를 생산하는 신규 바실러스 소노렌시스 균주 및 세포외다당류의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 다양한 기능성을 가진 세포외다당류(exopolysaccharide)의 생산능이 우수하다. 본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주로부터 생산된 세포외다당류(exopolysaccharide)는 점착성, 유화 안정화 활성, 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 의약품 또는 식품 분야에서 증점제, 유화 안정화제 또는 프리바이오틱스 등으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포외다당류를 생산하는 신규 소노렌시스 균주 및 세포외다당류의 다양한 용도에 관한 것이다.
미생물 유래 다당류는 미생물 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로서 발효 중에 축적된다. 이 중 미생물의 1차 또는 2차 대사산물을 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS)라고 한다(Kim DJ et al., 2001). 미생물로부터 생산되는 다당류는 긴 사슬(long-chain) 및 고분자(high-molecularmass)의 특성을 가진 폴리머로 텍스처라이저(texturizers), 증점제(viscosifiers), 유화제(emulsifiers), 필름 형성능 등의 다양한 기능을 보유하며 식품 공업에서 오래전부터 사용되어 왔으며, 최근 혈당조절 효과, 자외선 차단효과(Bae JT et al., 2005), 항산화 효과(Asker MMS et al., 2009; Wang J et al., 2007), 항균성 및 면역 강화 효과(Kolodzieja H et al., 2007) 등 건강에 유익한 효과의 연구보고에 따라 식품 및 제약산업 등 넓은 범위에서 활용 가능한 기능성 소재로서 그 중요성이 점점 증가하고 있다(Shivakumar S et al,. 2006). 또한 이렇게 미생물이 생산하는 세포외다당류는 배지의 구성성분 및 배양 조건 등을 개선함에 따라 그 생산성을 크게 높일 수 있다고 보고되고 있다(Vijayendra SVN et al., 2008). 그러나, 현재 산업적으로 상용화되어 있는 기능성 다당류의 대부분은 주로 버섯과 같은 곰팡이류(fungi)에서 많이 생산되는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 예로 차가버섯(Inonotus obliquus) 등과 같은 고등균사체 버섯에 의해서 생산되는 베타 글루칸(β-glucan)이 있다. 이러한 베타 글루칸은 최근 여러 연구로부터 항암(Cha JY et al., 2004), 항산화(Cui Y et al., 2005), 항고지혈증 및 혈당조절(Kim MA et al., 2009) 등을 지닌 것으로 알려짐에 따라 큰 주목을 받고 있다. 그러나 버섯과 같은 곰팡이류는 세균 (bacteria)에 비하여 성장속도가 느리고 배양특성상 상대적으로 대량 배양이 어려우며, 또한 세포외다당류의 생산량이 많지 않은 단점을 지니고 있다.
한편, 식품으로부터 분리된 균주로부터 생산된 세포외다당류에 대한 연구는 발효유제품으로부터 분리된 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.) 등과 특히 김치로부터 분리된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 웨이셀라 속(Weissella sp.) 등과 같은 유산균으로부터 생산된 세포외다당류가 있으나, 그 수가 많지 않으며 또한 각 미생물이 생산하는 세포외다당류의 기능성 입증에 대한 연구 또한 적은 것으로 알려져 있다. 따라서 기능성을 보유한 세포외다당류를 고효율로 생산하는 균주를 발굴하고, 균주 및 균주로부터 생성되는 세포외다당류의 기능성을 입증함으로써 차후 기능성을 보유한 발효 식품을 위해 적용 가능한 균주의 발굴의 필요성이 있다.
세포외다당류를 생산하는 균주와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1420355호에는 막걸리로부터 분리되고, 췌장 베타 세포의 증식 및 췌장세포의 사멸억제 활성을 갖는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) M76균주(기탁번호: KACC91683P)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0481678호에는 세포외 다당류를 분비하는 자이로디니움 임푸디쿰(Gyrodinium impudicum) KG03 균주(KCTC 10325BP)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0808956호에는 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지고, 위 및 장에서 생존 가능하며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 김치아이 GJ2 균주(Leuconostoc kimchii GJ2)(KCTC 10921BP). 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1569043호에는 수탁번호 KCCM11308P의 바실러스 서브틸리스 J-92 (Bacillus subtilis J-92) 균주로서, 글루코오스 대신에 수크로오스(Sucrose), 프럭토오스(Fructose) 또는 라피노오스(Raffinose)를 2%(w/w) 함유하는 MRS 배지에서 30℃로 24시간 동안 배양시 각각 98.05 mg/ml, 53.15 mg/ml 또는 70.41 mg/ml의 세포외다당류 (exopolysaccharide, EPS)를 생산하는 된장 유래의 균주가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1523205호에는 김치에서 분리되고, 세포외다당류(EPS) 생산능을 가진 기탁번호 KCCM11309P의 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18(Pediococcus pentosaceus KFT-18) 균주로서, 기질 당으로 람노오스 또는 수크로오스를 포함한 고체배지에서만 세포외다당류를 생성하는 콜로니를 형성하는 균주가 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류의 생산능이 우수한 신규 균주를 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 일 목적은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류 및 이를 높은 수준으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 일 목적은 세포외다당류의 다양한 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 간장으로부터 다양한 바실러스속 균주들을 스크링하였고, 소정의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주가 다양한 기능성을 가진 세포외다당류를 높은 수준으로 생산한다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 세포외다당류 생산능을 가진 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주를 배지에 접종하고 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계를 포함하는 세포외다당류의 생산방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 포함하는 증점제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 포함하는 유화 안정화제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류를 포함하는 프리바이오틱스를 제공한다.
본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 다양한 기능성을 가진 세포외다당류(exopolysaccharide)의 생산능이 우수하다. 본 발명에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주로부터 생산된 세포외다당류(exopolysaccharide)는 점착성, 유화 안정화 활성, 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 의약품, 식품 또는 화장품 분야에서 증점제, 유화 안정화제 또는 프리바이오틱스 등으로 사용될 수 있다.
도 1은 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 점착성 외관을 나타낸 사진이다.
도 2는 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
도 3은 TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 배양된 MJM60135 균주의 형태를 나타낸 것이고, 도 4는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 배양된 MJM60135 균주의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
도 5는 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 산 가수분해물을 TLC 방법으로 분석한 결과이다.
도 7은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS을 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 분석한 결과물이다.
도 8은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 톨루엔 및 자일렌 내에서의 유화 활성을 측정한 결과이다.
도 9는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 유산균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 10은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 병원균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
도 3은 TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 배양된 MJM60135 균주의 형태를 나타낸 것이고, 도 4는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 배양된 MJM60135 균주의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
도 5는 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 산 가수분해물을 TLC 방법으로 분석한 결과이다.
도 7은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS을 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 분석한 결과물이다.
도 8은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 톨루엔 및 자일렌 내에서의 유화 활성을 측정한 결과이다.
도 9는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 유산균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 10은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 병원균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류의 생산능이 우수한 신규 균주에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 세포외다당류 생산능을 가진다. 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 바람직하게는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P)이다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 바람직하게는 간장에서 유래한다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주의 성장에 적합한 pH는 4.5~9, 바람직하게는 5.5~8이다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주의 성장에 적합한 온도는 15~50℃, 바람직하게는 30~40℃ 이다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주의 성장에 적합한 배지로는 TSA(Tryptic soy agar) 배지, NA(Nutrient agar) 배지, MRS 한천(MRS agar) 배지, LB 한천(Luria-Bertani agar) 배지 또는 최소 영양 배지(효모 추출물, 펩톤 및 무기염류로 이루어짐)가 있다. 또한, 상기 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주는 그람 양성 균주이고, 막대(rod) 형상을 가진다.
본 발명의 일 측면은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 세포외다당류는 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된다. 상기 세포외다당류는 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함한다. 또한, 상기 세포외다당류는 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함한다.
상기 세포외다당류는 비독성 및 비항원성을 가지기 때문에 의약품 분야, 식품 첨가제 분야 등에서 안정하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 세포외다당류는 점착성, 유화 안정화 활성, 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성 등과 같은 다양한 기능성을 가지기 때문에 의약품 분야, 식품 분야 또는 화장품 분야에서 유용한 소재로 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 유산균 성장 또는 병원균 성장은 유산균 증식 또는 병원균 증식과 혼용될 수 있다. 또한, 상기 세포외다당류에 의해 성장이 촉진되는 유산균의 종류로는 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp . plantarum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 락토바실러스 퍼텐툼(Lactobacillus fermentum) 등이 있으며, 여기에 반드시 한정되지 않는다. 또한, 상기 세포외다당류에 의해 성장이 억제되는 병원균의 종류로는 대장균 K99(E. coli K99), 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨(Salmonella enterica serovar . typhimurium) 등이 있으며, 여기에 반드시 한정되지 않는다.
본 발명의 일 측면은 다양한 기능성을 가진 세포외다당류의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 세포외다당류의 생산방법은 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주를 배지에 접종하고 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 배지는 TSB(tryptic soy broth) 배지, MRS 배지 또는 LB(Luria-Bertani) 배지 등에서 선택될 수 있고, 세포외다당류의 생산성을 고려할 때 TSB(tryptic soy broth) 배지인 것이 바람직하다. 또한, 상기 배양 온도는 30~40℃인 것이 바람직하고, 세포외다당류의 생산성 및 경제성을 고려할 때 35~40℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 배양 시간은 24~72 hr인 것이 바람직하고, 세포외다당류의 생산성 및 경제성을 고려할 때 36~60 hr인 것이 더 바람직하다.
상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 (a) 배양물을 원심분리하여 세포를 제거하고 제1 상등액을 얻는 단계; (b) 상기 제1 상등액을 저급 알코올(탄소 수가 1~5임) 또는 함수 저급 알코올(탄소 수가 1~5임)과 혼합하여 침전물을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 침전물이 형성된 제1 상등액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계로 구성될 수 있다. 상기 저급 알코올로는 바람직하게는 에탄올, 부탄올 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 바람직하게는 상기 (a) 단계와 (b) 단계 사이에 상기 제1 상등액을 탈색 및/또는 탈단백질화 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 바람직하게는 상기 (a) 단계, (b) 단계 및 (c) 단계 외에 (d) 상기 침전물을 물에 용해시키고 원심분리하여 제2 상등액을 수득하는 단계; 및 (e) 제2 상등액을 농축하고 고형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 상등액의 농축 방법으로는 멤브레인 여과, 투석 등이 사용될 수 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 농축된 제2 상등액의 고형화 방법으로는 스프레이 드라이, 동결건조 등이 사용될 수 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면은 세포외다당류의 다양한 용도이다. 예를 들어, 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된 세포외다당류는 점착성을 가지기 때문에 증점제(thickening agent)로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 세포외다당류는 치약, 크림, 연고, 로션 등과 같이 의약품, 화장품, 식품 분야에서 증점제로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 증점제는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류 외에 카르복시메틸셀룰로스와 같은 다른 공지의 증점 물질을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수도 있다.
또한, 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된 세포외다당류는 유화 안정화 활성을 가지기 때문에 유화 안정화제로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 세포외다당류는 에멀젼 형태의 의약품 제형, 연구 분야에서 사용되는 피콜(ficoll)의 대용품, 에멀젼 형태의 화장품 제형 등과 같이 의약품, 화장품, 식품 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유화 안정화제는 유제와 물이 공존하는 계에서 유화 형성에 도움을 주거나 형성된 유화의 안정화에 도움을 주는 성분을 말한다. 상기 유제로는 톨루엔, 자일렌과 같은 탄화수소 등이 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 예에 따른 유화 안정화제는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류 외에 왁스, 지방산 알코올 등과 같은 다른 공지의 유화 안정화 물질을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수도 있다.
또한, 전술한 신규 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산된 세포외다당류는 유산균 성장 촉진 활성 또는 병원균 성장 억제 활성을 가지기 때문에 프리바이오틱스(Prebiotics)로 사용될 수 있다. 상기 프리바이오틱스는 장내 유익한 박테리아(예를 들어 유산균)의 생장을 돕는 난소화성 성분으로서 프로바이오틱스(probiotics)의 영양원이 되어 장내 환경을 개선하는데 도움을 주는 물질을 말한다. 식품 성분이 프리바이오틱스의 조건을 갖추려면 위장관의 상부에서 소화 또는 흡수되지 않아야 하고 대장 내 미생물 중 비피도박테리아와 같은 유용 세균을 선택적으로 활성화시키고 병원균 등의 유해균은 억제할 수 있어야 한다. 본 발명의 일 예에 따른 프리바이오틱스는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 균주에 의해 생산되는 세포외다당류 외에 라피노오스, 대두올리고당, 프럭토올리고당, 갈락토올리고당 등의 올리고당류와 기타 락툴로오스(lactulose), 락티톨(lac- titol), 자일리톨(xylitol) 등과 같은 공지의 프리바이오틱 물질을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 세포외다당류(
exopolysaccharide
)를 생산하는 균주의 분리 및 동정
(1) 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS)를 생산하는 후보 균주의 분리
간장 샘플을 순차적으로 희석하고, 희석된 간장 현탁액을 TSA(tryptic soy agar) 배지에 도말한 후 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 구별되는 형태를 보이는 콜로니들을 선택하고, TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 계대배양 하였다. 점착성 외관과 배양물의 끈적끈적함을 육안으로 판단하고 총 37개의 후보 균주를 분리하였다. 이중 점착성 외관을 보이는 총 9개의 후보 균주를 선별하고 추가적인 연구를 진행하였다.
세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주는 콜로니의 점착성 외관에 기초하여 선별하였다. 점착성 외관을 보이는 총 9개의 후보 균주 콜로니들를 선택하고, TSA(tryptic soy agar) 배지 상에 도말한 후 37℃에서 2일 동안 계대배양 하였다. 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 총 9개의 후보 균주를 EPS 생산 바실러스속 균주 1 내지 EPS 생산 바실러스속 균주 9로 명명하고, 이를 EPSB1 내지 EBSB9로 약칭하였다. 도 1은 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 점착성 외관을 나타낸 사진이다. 도 1에서 "A"는 EPSB1 후보 균주의 외관이고 "B"는 EPSB2 후보 균주의 외관이고 "C"는 EPSB3 후보 균주의 외관이고 "D"는 EPSB4 후보 균주의 외관이고 "E"는 EPSB5 후보 균주의 외관이고 "F"는 EPSB6 후보 균주의 외관이고 "G"는 EPSB7 후보 균주의 외관이고 "H"는 EPSB8 후보 균주의 외관이고 "I"는 EPSB9 후보 균주의 외관이다.
(2) 최종 균주의 선별
선별한 바실러스속 후보 균주들을 TSB(tryptic soy broth) 배지에 접종하고 37℃에서 2일 동안 진탕배양 하였다. 이후 배양액을 5000×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였다. 이후, 상등액을 10분 동안 끓여 효소를 실활시켰다. 이후 상등액을 40℃의 수조 안에서 활성탄으로 30분 동안 처리하여 탈색시키고, [Wang, Yuan, Wang, Zhang, Yang & Xu, 2007]의 방법에 의거하여 탈단백질화 시켰다. 이후, 탈단백질화된 상등액을 5000×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고 4배 부피의 95% 에탄올 수용액과 혼합한 후 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이후, 혼합물을 8000×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 펠렛을 수거하고, 수거한 펠렛을 멸균 증류수에 용해시켰다. 이후, 펠렛 용액을 3000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 24 hr 동안 투석하여 세포외다당류(exopolysaccharide, 이하 'EPS'라 함) 농축액을 수득하였다. 이후, EPS 농축액을 동결건조하여 고형의 EPS를 수득하고 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. 바실러스속 후보 균주들의 배양액 내 EPS 함량을 글루코스를 표준품으로 사용한 페놀-황산 방법(phenol-sulfuric acid method; Masuko, Minami, Iwasaki, Majima, Nishimura & Lee, 2005)으로 측정하였다.
도 2는 간장에서 유래하고 세포외다당류(exopolysaccharide)를 생산하는 후보 균주들의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 EPSB6 균주는 가장 높은 EPS 생산성(8.4±0.8 g/L)을 보였고, EPSB9 균주의 경우 7.0±0.76 g/L, EPSB5 균주의 경우 5.6±0.4 g/L, EPSB1의 경우 4.0±1.1 g/L의 EPS 생산성을 보였다. 한편, EPSB8 균주 및 EPSB4 균주의 경우 낮은 EPS 생산성(2.3±0.34 g/L)을 보였다. 가장 높은 EPS 생산성을 보인 EPSB6 균주를 ECUM(the Extract collection of useful microorganisms) library에 "MJM60135"로 기탁하였다. 이후, EPSB6 균주는 MJM60135 균주로 언급한다. 도 3은 TSA(tryptic soy agar) 배지 상에서 배양된 MJM60135 균주의 형태를 나타낸 것이고, 도 4는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 배양된 MJM60135 균주의 세포외다당류(exopolysaccharide) 생산성을 나타낸 것이다.
(3) MJM60135 균주의 동정
최종 선별된 MJM60135 균주에 대해 계통학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 먼저, 유전체 DNA 분리 키트(genomic DNA isolation kit; GeneALL, Seoul, Republic of Korea)를 이용하여 제조자의 사용설명서에 따라 균주의 유전체 DNA를 분리하였다. 이후, 균주의 16S rDNA을 증폭시키기 위해 순방향 프라이머인 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 역방향 프라이머인 1492R(5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 솔젠트사(SolGent sequencing company, Republic of Korea)에 의뢰하여 균주의 전장에 가까운 부분 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 이때, 프라이머로 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')를 사용하였다. 그 결과, MJM60135 균주의 16S rDNA는 서열번호 1의 연속 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 이후, MJM60135 균주의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GeneBank nucleotide database와 비교하고, MEGA 6 소프트웨어(Tamura et al. 2013)를 이용하여 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 완성하였다.
도 5는 MJM60135 균주의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 MJM60135 균주의 염기서열은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) NBRC 101234T의 16S rDNA와 99% 이상의 상동성을 보였다. 이를 통해 MJM60135 균주의 종을 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis)로 확정하였다.
(4) 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주의 수탁 정보
본 발명의 발명자들은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주를 2015년 12월 1일에 공인기탁기관인 국립농업과학원 농업미생물은행(주소 : 대한민국 전라북도 전주시 완산구 농생명로 370 )에 특허기탁 신청하여 수탁번호 KACC 92109P를 부여받았다.
2.
바실러스
소노렌시스(
Bacillus
sonorensis
)
MJM60135
균주로부터 생산된 EPS의 특성 분석
(1) EPS의 구성 성분 분석
바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS 분말 10㎎을 6M 농도의 TFA(trifluoroacetic acid) 용액과 100℃에서 6hr 동안 반응시켜 가수분해하였다. 이후, 회전식 감압 증발기를 이용하여 가수분해 용액에 존재하는 TFA(trifluoroacetic acid)를 제거하고 15M 농도의 암모니아 용액 0.32㎖를 첨가하여 중화시켰다. 또한, 단당류 표준품에 대해서도 위에서와 같이 6M 농도의 TFA(trifluoroacetic acid) 용액으로 처리하고 암모니아 용액으로 중화시켰다. 이후, EPS 가수분해물을 TLC(thin layer chromatography)로 분석하여 EPS를 구성하는 단당류를 결정하였다. 구체적으로 EPS 가수분해물을 실리카겔 60 TLC 플레이트(Merck) 상에서 에틸아세테이트:n-프로판올:아세트산:물의 부피비가 4:2:2:1인 이동상으로 전개하여 분리하였다. 분리된 당들을 오르시놀-황산 분무 시약으로 가시화하였다.
도 6은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 산 가수분해물을 TLC 방법으로 분석한 결과이다. 도 6에서 "GM"은 갈락토만난(Galactomannan)을 나타내고, "EPS"는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS를 나타낸다. 도 6에서 보이는 바와 같이 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 구성 단당류로 만노스 및 갈락토스가 검출되었다.
(2) EPS에 존재하는 관능기 분석
바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS에 존재하는 관능기를 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 결정하였다. 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS 분말을 분광분석법 등급의 KBr과 혼합하고 1㎫의 압력으로 처리하여 펠렛 형태의 시편을 제조하였다. 이후, 펠렛 시편은 직경이 약 10㎜ 이고 두께가 약 1㎜ 이었다. 구체적으로 Varian 2000 FTIR spectrometer (Varian, Inc., USA)를 사용하여 4000~400 ㎝-1 파장수 범위에서 FT-IR 분광분석 데이터를 기록하였다.
도 7은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS을 FT-IR 분광분석법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)으로 분석한 결과물이다. 도 7의 FT-IR 스펙트럼에서 3420 ㎝-1 파장수에 위치하는 피크는 OH stretch에 해당하고 2920 ㎝-1 파장수에 위치하는 피크는 CH stretch에 해당한다. 1000~1200 ㎝-1 사이에 위치하는 C-O-C 및 C-O의 넓은 stretch는 탄수화물에 해당한다. 1366 ㎝-1 파장수에 위치하는 피크는 COO-의 C=O strecth 및 COO-의 C-O 결합에 할당될 수 있다(Wang, Ahmed, Feng, Li & Song, 2008). 도 7에서 보이는 EPS의 FT-IR 스펙트럼으로부터 EPS에 2가 양이온의 결합 부위로 작용할 수 있는 카르복실기가 존재한다는 것을 알 수 있다. 또한, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS에는 카르복실기 및 하이드록실기가 존재하는데, 상기 관능기들은 고분자 전해질(polyelectrolyte)에서 관찰되는 과정과 유사한 응집 과정을 위해 선호되는 관능기이다(Wang, Ahmed, Feng, Li & Song, 2008).
(3) EPS의 유화 활성 분석
바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 유화 활성을 분석하기 위해 [Fusconi, Maria Nascimento Assuncao, de Moura Guimaraes, Rodrigues Filho & Eduardo da Hora Machado, 2010)에 의거하여 유화 시험(Emulsification assay)을 수행하였다. 구체적으로 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주를 TSB(tryptic soy broth) 배지에 접종하고 37℃에서 1일 동안 진탕배양 하였다. 이후 배양액을 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 이후, 테스트 튜브 안에서 상등액 3㎖ 및 이와 동일 부피의 탄화수소 화합물(톨루엔 또는 o-자일렌)을 혼합하였다. 이후 테스트 튜브를 2분 동안 볼텍스(vortex) 한 후 24℃에서 24 hr 동안 배양하였다. 배양 완료 후 24 hr가 경과되었을 때 유화 활성을 검사하고, 유화 지수(emulsification index, E24)는 다음과 같은 식으로 계산하였다.
한편 양성 대조군으로 EPS 대신 Triton X-100(10% in TSB)을 사용하고 동일한 방법으로 유화 활성을 검사하였다. 또한, 대조군(Control)으로 EPS 대신 증류수를 사용하고 동일한 방법으로 유화 활성을 검사하였다.
도 8은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 톨루엔 및 자일렌 내에서의 유화 활성을 측정한 결과이다. 도 8에서 "Control"은 대조군을 나타내고, "TX-100"은 양성 대조군을 나타낸다. 도 8에서 보이는 바와 같이 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS의 유화 지수는 톨루엔 내에서 60%에 가까웠다. 따라서, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS는 천연 유화 안정화제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
(4) EPS의 프리바이오틱스 특성 분석
락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp . plantarum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 퍼텐툼(Lactobacillus fermentum)과 같은 유산균들의 성장에 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 미치는 영향을 평가하였다. 구체적으로 글루코스가 1% 함유된 MRS 액체 배지 또는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 MRS 액체 배지에 유산균을 접종하고 37℃에서 배양하면서 배양 시간에 따른 배양액의 흡광도로 측정하여 유산균의 성장 수준을 평가하였다.
또한, 대장균 K99(E. coli K99) 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨(Salmonella enterica serovar . typhimurium)과 같은 병원균들의 성장에 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 미치는 영향을 평가하였다. 구체적으로 글루코스가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지 또는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에 병원균을 접종하고 37℃에서 배양하면서 배양 시간에 따른 배양액의 흡광도로 측정하여 병원균의 성장 수준을 평가하였다.
도 9는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 유산균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 10은 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 병원균의 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 9의 (a)는 글루코스가 1% 함유된 MRS 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이고, 도 9의 (b)는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 MRS 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이다. 또한, 도 10의 (c)는 글루코스가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이고, 도 10의 (d)는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS가 1% 함유된 LB(Luria-Bertani) 액체 배지를 사용하였을 때의 결과이다. 도 9 및 도 10에서 그래프의 X 좌표는 배양 시간(hr)이고, 그래프의 Y 좌표는 600㎚ 파장에서의 흡광도 값이다. 도 9 및 도 10에서 보이는 바와 같이 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS는 유산균의 성장을 지지하는 반면 병원균의 성장을 억제하였다. 따라서, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135 균주로부터 생산된 EPS는 프리바이오틱 소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation
<120> Novel Bacillus sonorensis strain capable of producing
exopolysaccharide and use of exopolysaccharide
<130> DP-16-213
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 16S rDNA of Bacillus sonorensis MJM60135
<400> 1
gctatacatg cagtcgagcg aaccgacggg agcttgctcc cttaggttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120
ataccggatg cttgattgaa ccgcatggtt caattataaa aggtggcttt tagctaccac 180
ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 240
atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360
gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtaccg 420
ttcgaacagg gcggtgcctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540
gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600
aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720
gcgcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tctgacaccc ctagagatag ggcttcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080
cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200
gggcagaaca aagggcagcg aagccgcgag gctaagccaa tcccacaaat ctgctctcag 1260
ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380
ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttggagcca gccgccgaag gtgggacaga 1440
tgattggggt gaagtcgtaa aaggtaaacc cgtaa 1475
Claims (20)
- 간장에서 유래하고 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하며 세포외다당류 생산능을 가진 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 세포외다당류는 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함하고, 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포외다당류는 점착성, 유화 안정화 활성 또는 병원균 성장 억제 활성을 가지며,
상기 병원균은 대장균 K99(E.coli K99) 또는 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티피무륨(Salmonella enterica serovar. typhimurium)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주.
- 제 1항의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주에 의해 생산되고, 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함하며, 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외다당류.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주를 배지에 접종하고 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및
상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계를 포함하는 세포외다당류의 생산방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 배지는 TSB(tryptic soy broth) 배지, MRS 배지 또는 LB(Luria-Bertani) 배지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포외다당류의 생산방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 배양 온도는 30~40℃이고, 배양 시간은 24~72 hr인 것을 특징으로 하는 세포외다당류의 생산방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 배양물로부터 세포외다당류를 분리하는 단계는 하기의 단계들로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포외다당류의 생산방법 :
(a) 배양물을 원심분리하여 세포를 제거하고 제1 상등액을 얻는 단계;
(b) 상기 제1 상등액을 탄소수 1~5의 저급 알코올 또는 함수 탄소수 1~5의 저급 알코올과 혼합하여 침전물을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 침전물이 형성된 제1 상등액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계.
- 제 12항에 있어서, 상기 (a) 단계와 (b) 단계 사이에 상기 제1 상등액을 탈색 또는 탈단백질화 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외다당류의 생산방법
- 제 12항에 있어서, 하기의 단계들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외다당류의 생산방법 :
(d) 상기 침전물을 물에 용해시키고 원심분리하여 제2 상등액을 수득하는 단계; 및
(e) 제2 상등액을 농축하고 고형화하는 단계.
- 세포외다당류를 포함하는 증점제로서,
상기 세포외다당류는 제 1항의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주에 의해 생산되고, 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함하며, 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 증점제.
- 삭제
- 세포외다당류를 포함하는 유화 안정화제로서,
상기 세포외다당류는 제 1항의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주에 의해 생산되고, 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함하며, 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유화 안정화제.
- 삭제
- 세포외다당류를 포함하는 프리바이오틱스로서,
상기 세포외다당류는 제 1항의 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) MJM60135(수탁번호 : KACC 92109P) 균주에 의해 생산되고, 구성 단당류로 만노스(mannose) 및 갈락토스(galactose)를 포함하며, 관능기로 카르복실기 및 하이드록실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스. - 삭제
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| Current Microbiol. 2013, vol. 67, no. 1, pp. 21-29. |
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