KR101848201B1 - Reaction research chip for research of reaction between different kind of cells which compose tissue - Google Patents

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남효근
손형국
황민호
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Abstract

The present invention relates to a reaction research chip for researching reaction between different kinds of cells forming tissue, wherein the reaction research chip comprises: a reaction area; and multiple culture chambers which are arranged in a radial direction around the reaction area and cultures each of multiple cells. The reaction area forms an overlapping area that overlaps a portion of an area of each culture chamber. A reaction mediation factor, reacting to at least one of the cells, is formed on the reaction area and reacts to a relevant cell in the overlapped area. Accordingly, when a user observes an inflammation reaction between cells forming a disk tissue, the user can observe various interactions between cells which occur in an inflammation reaction in one chip. In addition to a disk, the user can observe interactions in accordance with other reactions including inflammation reactions between different kinds of cells forming other tissues than a disk.

Description

조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩{REACTION RESEARCH CHIP FOR RESEARCH OF REACTION BETWEEN DIFFERENT KIND OF CELLS WHICH COMPOSE TISSUE}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a reaction kit for the reaction between heterogeneous cells constituting a tissue,

본 발명은 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩에 관한 것으로서, 예컨대 추간판 조직을 구성하는 섬유륜 세포, 수핵 세포, 혈관 세포, 신경 세포들 간의 염증 반응을 관찰 및 연구할 수 있는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩에 관한 것이다.The present invention relates to a reaction chip for studying the reaction between heterogeneous cells constituting a tissue. For example, the present invention relates to a chip capable of observing and studying the inflammatory reaction between fibricular cells, nucleus pulposus cells, vascular cells, And to a reaction research chip for studying the reaction between heterologous cells constituting the cell.

추간판 조직은 인체에 가해지는 다양한 부하(Biomechanical loading)를 흡수하고 완충하는 작용을 하는 구조물이다. 추간판 조직은 해부학적으로 다양한 세포의 구역으로 나누어져 있다. Disc tissue is a structure that acts to absorb and cushion various loads (biomechanical loading) on the human body. Disc tissue is anatomically divided into various cell compartments.

추간판 조직 내의 세포와 세포 간의 상호 작용은 추간판 조직을 비롯하여 주변부에 존재하는 혈관 및 신경세포에 다양한 분비 단백질을 전달하여 세포 신호 전달 과정을 나타나게 한다. 이러한 세포 및 그들의 상호 작용은 추간판을 화학적으로 유지하는데 매우 중요한 역할을 한다. The interaction between cells and cells in the intervertebral disc tissue induces cellular signal transduction by transferring a variety of secretory proteins to the blood vessels and nerve cells present in the peripheral disc, including the disc tissue. These cells and their interactions play a very important role in maintaining the intervertebral disc chemically.

도 1에 도시된 바와 같이, 정상 추간판(Intervertebral Disc; IVD)은 디스크 안쪽에 존재하는 수핵(Nucleus pulposus; NP)과, 수핵의 바깥쪽으로 존재하는 섬유륜(Annulus fibrosus; AF)을 포함한다. 그리고, 유리 신경 말단(Free nerve ending)은 섬유륜의 바깥쪽 3분의 1지점에 위치된다. 유리 신경 말단(Free nerve ending)은 영양분을 공급받을 수 있는 혈관 세포와 척추에 위치하는 신경다발(dorsal root ganglion)로부터 유래한다. As shown in FIG. 1, the intervertebral disc (IVD) includes Nucleus pulposus (NP) present inside the disc and Annulus fibrosus (AF) present outside the nucleus. The free nerve ending is located at the outer third of the fibrous ring. Free nerve ending is derived from vascular cells that can receive nutrients and dorsal root ganglia located in the vertebrae.

추간판 조직은 지속적인 부하 또는 역치를 넘어서는 일정 수준 이상의 충격이 가해지는 경우 손상이 나타난다. 또한, 추간판 조직은 연령이 증가함에 따라 탄력성을 잃고, 섬유륜에 균열을 일으키는 등의 퇴행성 변화에 외력이 가해지면 섬유륜의 약해진 부분이나 찢어진 부분으로 수핵이 후방으로 밀려나오면서 증상을 일으키게 된다. The intervertebral tissue is damaged if it is subjected to more than a certain level of impact beyond a sustained load or threshold. In addition, the disc structure loses its elasticity as age increases, and when an external force is applied to degenerative changes such as cracks in the fibrous rings, the nucleus pulses into the weakened or torn part of the fibrous ring, causing symptoms.

밀려나오는 형태에 따라 섬유륜이 골고루 팽윤된 추간판 팽윤(bulging), 국소적으로 돌출된 추간판 탈출(protrusion), 섬유륜이 파열되어 경막외 공간으로 수핵이 밀려나왔으나 내부와 연결된 형태인 추간판 추출(extrusion), 파열되어 수핵편이 경막외 공간으로 이동하여 내부와 연결이 끊어진 추간판 수핵 부골화(sequestration) 등으로 구분할 수 있다.Depending on the shape of the extruded disc, bulging of the intervertebral disc swelling, localized protrusion of the intervertebral disc, extrusion of intervertebral disc, And sequestration of the disc-nucleus pulposus where the nucleus is ruptured and the nucleus moves to the epidural space and is disconnected from the inside.

추간판 조직의 손상시, 인체는 이러한 조직을 회복하는 기전으로 다양한 물질들을 서로 분비하고 손상된 조직을 제거하고 다시 수선하는 일련의 과정을 거친다. 추간판의 퇴행이 진행되면, 추간판 조직을 이루는 수핵 세포 및 섬유륜 세포는 면역세포에 의해 염증반응을 일으킨다. 추간판 구조물의 손상 또는 퇴행에 의한 염증 반응시, 정상 상태와 비교하여 발현된 다양한 분비단백질(염증매개인자, 혈관생성인자, 신경자극인자, 성장인자 등)이 추간판을 구성하는 섬유륜 세포나 수핵 세포로부터 분비된다. In the event of damage to the intervertebral disc, the human body undergoes a series of processes to restore these tissues, secrete various substances to each other, remove the damaged tissue, and repair it again. When degeneration of the intervertebral disc is progressed, the nucleus pulposus cells and fibricular cells constituting the intervertebral disc tissue cause an inflammatory reaction by the immune cells. (Inflammatory mediators, angiogenic factors, nerve stimulating factors, growth factors, etc.) compared with normal state in the inflammatory reaction caused by damage or degeneration of the intervertebral disc structure, Is secreted.

예를 들어, 섬유륜에 손상이 일어나면, 해당 손상 부위를 회복하는 과정에서 염증이 발생한다. 이러한 염증 반응에 관여하는 대식 세포는 섬유륜 세포와의 상호 작용을 통해 다양한 염증매개인자를 발현하게 되고, 이를 통해 섬유륜 세포 역시 다양한 분비 단백질을 분비한다.For example, when a fibrous ring is damaged, inflammation occurs during the recovery of the damaged area. Macroscopic cells involved in this inflammatory reaction express various inflammatory mediators through interaction with fibroblast cells, and thus fibrocystic cells also secrete various secretory proteins.

염증 반응시, 섬유륜 세포에서 발현되는 분비 단백질들은 추간판 주변부에 존재하는 혈관세포 및 신경세포를 자극하게 된다. 그러한 과정에서 분비 단백질 중 MMP(Matrix Metalloproteinase)는 조직 주변의 ECM(Extra Cellular Matrix)들을 분해하여 디스크 조직을 붕괴시키며 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 같은 혈관성장인자에 의해, 디스크 조직 내부로 혈관성장(vascularization)이 발생된다. 이러한 과정에서 추간판 베타-신경성장인자(beta-nerve growth factor, beta-NGF) 및 뇌신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 등 다양한 신경 자극 인자(neurogenic factor)를 분비한다. In the inflammatory response, secretory proteins expressed in fibroblast cells stimulate vascular and nerve cells present in the periphery of the disc. In this process, Matrix Metalloproteinase (MMP) secreted proteins break down the ECM (Extracellular Matrix) around the tissue to disrupt the disc tissue and cause vascular growth into the disc tissue by vascular growth factors such as VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) vascularization occurs. In this process, various neurogenic factors such as intervertebral discs (beta-nerve growth factor, beta-NGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are secreted.

한편, 염증과정에서 나타나는 분비 단백질에 의해 섬유륜 바깥쪽에 존재하는 유리 신경말단이 자극을 받게 되면, 신경세포가 섬유륜과 수핵의 안쪽으로 내성장(ingrowth)하면서, CNS(central nerve system)를 통한 통증이 발생한다. On the other hand, stimulation of the free nerve endings outside the fibrous ring by secretory proteins in the inflammatory process causes ingrowth of nerve cells into the fibrous ring and the nucleus pulposus, resulting in pain through the central nervous system (CNS) Occurs.

그러나, 상기와 같은 요통의 발병 기전은 정확히 밝혀져 있지 않은 상태이다. 즉, 섬유륜 세포나 수핵 세포에서 발현되는 분비 단백질과 혈관 세포 또는 신경 세포 간의 상호 작용, 그리고, 신경 세포의 내성장에 의한 섬유륜 세포와 수핵 세포와의 상호 작용이 어떠한 양상으로 발생하는지 아직 정확히 밝혀지지 않고 있다.However, the pathogenesis of the above-mentioned back pain is not clearly known. In other words, it is not yet clear how interactions between secretory proteins expressed in fibroblast or nucleus pulposus, vascular cells or nerve cells, and interactions between fibricular cells and nucleus pulposus cells due to inner growth of nerve cells It is not.

현재 요통 발병기전 연구의 경우, 해당 염증 매개물 등의 분자적 발현정도의 측정과 같은 마이크로 플레이트 리더(micro plate reader)등의 실험에 의존적이며, 실시간으로 세포들의 상호작용과 움직임을 정확히 관찰하기 어렵다. Currently, research on the pathogenesis of back pain is dependent on experiments such as microplate reader, such as measurement of the degree of molecular expression of the inflammatory mediators, and it is difficult to observe the interaction and movement of cells in real time.

또한, 해당 실험들이 개별적으로 이루어지면서 각 세포를 동시에 배양해야 하는 복잡성으로 인한 다양한 조건(예를 들어, 미세환경의 조성, 각 세포간의 동시 배양 및 실험분석)의 실험이 어려운 단점이 있다. In addition, since the experiments are performed individually, it is difficult to test various conditions (for example, composition of micro environment, co-cultivation of each cell and experiment analysis) due to the complexity of culturing each cell simultaneously.

아울러, 실험실 환경에서 세포-세포간의 공동 배양을 통한 영향을 보기 위해서는 인서트웰(insert well) 또는 트랜스웰(trans well)과 같은 공동 배양 장치를 사용해야 하는데, 해당 장치들은 구조적 특성으로 인해 세포의 실시간적 형태 변화를 확인하기에 어려움이 있다. 기존의 세포 공동배양장치는 추가적인 구성품들을 필요로 한다.In addition, co-cultivation devices such as insert wells or trans wells must be used to effect cell-cell co-culture in a laboratory environment, It is difficult to confirm the shape change. Conventional cell co-culture devices require additional components.

또한, 추간판 조직을 구성하는 다양한 세포, 예를 들어, 섬유륜 세포, 신경 세포, 대식 세포, 혈관 세포, 신경 세포 들 간의 상호 작용을 한 번에 관찰할 수 있는 장치나 방법이 제안되지 못하고 있다.Further, a device or a method for observing the interaction between various cells constituting the disc tissue such as fibroblast cells, nerve cells, macrophages, vascular cells, and nerve cells at a time is not proposed.

이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, 추간판 조직을 구성하는 세포 간의 염증 반응을 관찰하는데 있어, 하나의 칩에서 염증 반응에서 발생하는 세포 간의 다양한 상호 작용을 관찰할 수 있는 반응 연구 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to obviate the above-mentioned problems, and to observe the inflammation reaction between the cells constituting the intervertebral disc tissue, it is possible to observe various interactions among the cells occurring in the inflammation reaction in one chip And to provide a reaction research chip.

또한, 추간판 조직 뿐만 아니라 추간판 이외의 다른 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 염증 반응을 포함한 다른 반응에 따른 상호 작용을 관찰할 수 있는 반응 연구 칩을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.It is another object of the present invention to provide a reaction research chip capable of observing not only intervertebral disc tissue but also interactions due to other reactions including inflammation reaction between heterogeneous cells constituting other tissues other than the discs.

상기 목적은 본 발명에 따라, 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩에 있어서, 반응 영역과, 상기 반응 영역을 중심으로 방사상으로 배치되고, 복수의 상기 세포가 각각 배양되는 복수의 배양 챔버를 포함하고; 상기 반응 영역은 각각의 상기 배양 챔버 내에 각각의 상기 배양 챔버의 일부 영역과 중첩되는 중첩 영역을 형성하고; 상기 반응 영역에는 복수의 상기 세포 중 적어도 하나와 반응하는 반응 매개 인자가 형성되어 상기 중첩 영역에서 해당 세포와 반응하는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩에 의해서 달성된다.According to the present invention, the above object can be achieved by a reaction chip for studying the reaction between heterologous cells constituting a tissue according to the present invention, which comprises a reaction zone, a plurality of cells arranged radially around the reaction zone, A culture chamber; Wherein the reaction zone forms an overlapping area overlapping with a part of each of the culture chambers in each of the culture chambers; Wherein a reaction mediator that reacts with at least one of the plurality of cells is formed in the reaction zone to react with the cell in the overlap region. do.

여기서, 하나의 상기 배양 챔버 내의 해당 중첩 영역에서 해당 세포와 상기 반응 매개 인자와의 반응에 의해 발현되는 분비 단백질이 상기 반응 영역을 통해 나머지의 배양 챔버로 이동 가능하여, 상기 중첩 영역에서의 반응에 따른 상기 세포 간의 상호 작용의 관찰이 가능하다.Here, the secretory protein expressed by the reaction of the cell with the reaction mediator in the overlap region of one culture chamber is movable to the remaining culture chamber through the reaction region, and the reaction in the overlap region It is possible to observe the interaction between the cells.

그리고, 상기 세포는 추간판 조직을 구성하는 섬유륜 세포, 수핵 세포, 대식 세포, 혈관 세포 및 신경 세포 중 적어도 2 이상을 포함하며; 상기 반응 매개 인자는 상기 섬유륜 세포, 상기 수액 세포, 상기 대식 세포 및 상기 혈관 세포 중 적어도 하나에 염증 반응을 유발하는 염증 매개 인자를 포함할 수 있다.The cells include at least two of fibrous ring cells, nucleus pulposus cells, macrophages, vascular cells and nerve cells constituting the intervertebral disc tissue; The response mediator may include an inflammatory mediator that causes an inflammatory reaction in at least one of the fibroblast cell, the infusion cell, the macrophage cell, and the blood vessel cell.

그리고, 상기 염증 매개 인자는 IL-1beta, TGF-beta 및 TNF-alpha 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.And, the inflammatory mediator may comprise at least one of IL-1beta, TGF-beta and TNF-alpha.

또한, 상기 섬유륜 세포, 상기 수액 세포, 상기 대식 세포 및 상기 혈관 세포 중 적어도 하나와 상기 염증 매개 인자와의 염증 반응에 의해 발현되는 분비 단백질은 상기 반응 영역을 통해 상기 신경 세포가 배양된 상기 배양 챔버로 이동할 수 있다.In addition, a secretory protein expressed by the inflammatory reaction of at least one of the fibroblast cell, the infliximate cell, the macrophage cell, and the blood vessel cell with the inflammatory mediator may be introduced into the culture chamber . ≪ / RTI >

그리고, 상기 반응 영역의 표면에는 아민기를 포함한 링커가 형성되고; 상기 염증 매개 인자는 상기 링커의 상기 아민기와의 아미노 결합을 통해 상기 반응 영역에 표면 처리될 수 있다.A linker including an amine group is formed on the surface of the reaction region; The inflammatory mediator may be surface treated to the reaction zone through the amino linkage of the linker with the amine group.

여기서, 상기 링커는 APTES-GA 링커, APTMS-GA 링커, APTED-GA 링커, BPEI-GA 링커, GOPS-BPEI-GA 링커 및 LPEI-GA 링커 중 어느 하나를 포함할 수 있다.Here, the linker may include any one of an APTES-GA linker, an APTMS-GA linker, an APTED-GA linker, a BPEI-GA linker, a GOPS-BPEI-GA linker, and an LPEI-GA linker.

또한, 각각의 상기 배양 챔버와 상기 반응 영역 사이에는 상기 배양 챔버 내의 상기 세포의 상기 반응 영역으로의 이동을 차단하고, 상기 중첩 영역에서 발현되는 상기 분비 단백질의 상기 반응 영역으로의 이동을 허용하는 복수의 격벽이 형성될 수 있다.Also, between each of said culture chambers and said reaction zone, there is provided a means for blocking movement of said cells in said incubation chamber into said reaction zone and for allowing movement of said secretory protein expressed in said overlap zone into said reaction zone Barrier ribs may be formed.

상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따르면, 추간판 조직을 구성하는 세포 간의 염증 반응을 관찰하는데 있어, 하나의 칩에서 염증 반응에서 발생하는 세포 간의 다양한 상호 작용을 관찰할 수 있는 반응 연구 칩이 제공된다.According to the present invention, there is provided a reaction research chip capable of observing various interactions among cells occurring in an inflammatory reaction in one chip in observing the inflammatory reaction between cells constituting the intervertebral disc tissue do.

또한, 추간판 조직 뿐만 아니라 추간판 이외의 다른 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 염증 반응을 포함한 다른 반응에 따른 상호 작용을 관찰할 수 있다.In addition, not only intervertebral discs but also interactions due to other reactions including inflammatory reactions between heterogeneous cells constituting other tissues other than the intervertebral disc can be observed.

도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩의 사시도이고,
도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩의 평면도이고,
도 3은 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩의 단면도이고,
도 4는 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩의 사시도이고,
도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩의 평면도이고,
도 6은 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩의 단면도이다.1 is a perspective view of a reaction research chip according to a first embodiment of the present invention,
2 is a plan view of a reaction research chip according to a first embodiment of the present invention,
3 is a cross-sectional view of a reaction research chip according to a first embodiment of the present invention,
4 is a perspective view of a reaction research chip according to a second embodiment of the present invention,
5 is a plan view of a reaction research chip according to a second embodiment of the present invention,
6 is a cross-sectional view of a reaction research chip according to a second embodiment of the present invention.

이하에서는 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, embodiments according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩(100)의 사시도이고, 도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩(100)의 평면도이고, 도 3은 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩(100)의 단면도이다. 도 1 내지 도 3을 참조하여 설명하면, 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩(100)은 반응 영역(130)과, 복수의 배양 챔버(120)를 포함한다.FIG. 1 is a perspective view of a reaction research chip 100 according to a first embodiment of the present invention, FIG. 2 is a plan view of a reaction research chip 100 according to a first embodiment of the present invention, and FIG. 3 is a cross- Sectional view of a reaction research chip 100 according to the first embodiment. 1 to 3, the reaction research chip 100 according to the first embodiment of the present invention includes a reaction region 130 and a plurality of culture chambers 120. [

복수의 배양 챔버(120)는 반응 영역(130)을 중심으로 방사상으로 배치된다. 본 발명의 제1 실시예에서는 4개의 배양 챔버(120)가 반응 영역(130)을 중심으로 4 방향에 각각 형성되는 것을 예로 하고 있으나, 배양 챔버(120)의 개수는 조직을 구성하는 세포의 종류 및 그 개수에 따라 달라질 수 있음은 물론이다.A plurality of culture chambers 120 are arranged radially around the reaction region 130. In the first embodiment of the present invention, four culture chambers 120 are formed in four directions around the reaction region 130. However, the number of the culture chambers 120 may vary depending on the type of cells constituting the tissue And the number thereof.

여기서, 반응 영역(130)은 다각형, 예컨대 제1 실시예에서와 같이 사각형 형상을 갖도록 마련될 수 있으며, 배양 챔버(120)는 다각형 형상의 반응 영역(130)의 각 변에 위치하여 반응 영역(130)을 중심으로 방사상으로 배치되는 형상을 갖는다.Here, the reaction region 130 may be formed to have a polygonal shape, for example, a rectangular shape as in the first embodiment, and the culture chamber 120 may be located on each side of the polygonal reaction region 130, 130 in the radial direction.

또한, 반응 영역(130)은 각각의 배양 챔버(120) 내에 각각의 배양 챔버(120)의 일부 영역과 중첩되는 중첩 영역(131)을 형성한다. 즉, 반응 영역(130)은 각각의 배양 챔버(120) 내부의 일부 영역까지 연장되어 형성됨으로써, 각각의 배양 챔버(120)와 중첩되는 중첩 영역(131)을 형성하게 된다.The reaction region 130 also forms an overlap region 131 in each culture chamber 120, which overlaps with a portion of each culture chamber 120. That is, the reaction region 130 is extended to a portion of the interior of each culture chamber 120, thereby forming an overlapping region 131 overlapping each of the culture chambers 120.

한편, 반응 챔버 각각에는 조직을 구성하는 이기종의 세포가 각각 독립적으로 배양된다. 일 예로, 본 발명에 따른 반응 연구 칩(100)이 추간판 조직의 염증 반응의 연구에 적용되는 경우, 추간판 조직을 구성하는 섬유륜 세포, 수핵 세포, 혈관 세포, 신경 세포 및 대식 세포가 선택적으로 배양 챔버(120)에 각각 배양될 수 있다.On the other hand, heterogeneous cells constituting the tissue are independently cultured in each of the reaction chambers. For example, when the reaction research chip 100 according to the present invention is applied to the study of the inflammatory reaction of the intervertebral disc tissue, the fibrous ring cells, the nucleus pulposus cells, the vascular cells, the nerve cells and the macrophages constituting the intervertebral disc tissue, (120). ≪ / RTI >

그리고, 반응 영역(130)에는 배양 챔버(120)에 배양되는 세포 중 적어도 하나와 반응하는 반응 매개 인자가 형성된다. 이를 통해, 배양 챔버(120) 내의 중첩 영역(131)에는 반응 매개 인자와 해당 배양 챔버(120)에 배양되는 세포가 함께 위치하게 되고, 세포 중 반응 매개 인자와 반응하는 세포는 중첩 영역(131)에서 상호 반응하게 된다.In the reaction region 130, a reaction mediator that reacts with at least one of the cells cultured in the culture chamber 120 is formed. In this way, the reaction medium factor and the cells cultured in the culture chamber 120 are placed together in the overlapping region 131 in the culture chamber 120, .

한편, 각각의 배양 챔버(120)와 반응 영역(130) 사이에는 배양 챔버(120) 내의 세포가 반응 영역(130)으로 이동하는 것을 차단하는 복수의 격벽(140)이 형성된다. 예컨대, 격벽(140) 간의 간격이 세포의 사이즈 보다 작게 형성하게 되면, 배양 챔버(120)에서 배양되는 세포는 반응 영역(130) 쪽으로의 이동없이 배양 챔버(120) 내에서만 배양된다. 반면, 중?? 영역에서의 반응을 통해 발현되는 후술할 분비 단백질은 격벽(140) 사이로의 미세 공간을 통해 반응 영역(130)으로 이동 가능하게 되는데 이에 대한 상세한 설명은 후술한다.A plurality of barrier ribs 140 are formed between each culture chamber 120 and the reaction zone 130 to block the cells in the culture chamber 120 from moving to the reaction zone 130. For example, when the distance between the barrier ribs 140 is smaller than the size of the cells, the cells cultured in the culture chamber 120 are cultured only in the culture chamber 120 without moving toward the reaction region 130. On the other hand, A secreted protein to be described later, which is expressed through a reaction in the region, can move to the reaction region 130 through the fine space between the barrier ribs 140. A detailed description thereof will be described later.

이하에서는, 상기와 같은 구성을 갖는 반응 연구 칩(100)에 추간판 조직을 구성하는 세포가 배양되는 경우를 예로 하여 상세히 설명한다. 제1 실시예에서와 같이, 4개의 배양 챔버(120)에 각각 섬유륜 세포, 수핵 세포, 혈관 세포 및 신경 세포가 배양되고, 반응 매개 인자로는 섬유륜 세포나 수핵 세포와 염증 반응을 유발하는 염증 매개 인자가 형성되는 것을 예로 하여 설명한다.Hereinafter, the case where the cells constituting the intervertebral disc tissue are cultured on the reaction research chip 100 having the above-described structure will be described in detail as an example. As in the first embodiment, the fibroblast cells, the nucleus pulposus cells, the vascular cells, and the nerve cells are cultured in the four culture chambers 120, respectively. As the reaction medium factors, inflammatory mediators An example will be described in which a factor is formed.

염증 매개 인자로는 IL-1beta, TNF-alpha, TGF-beta 등의 사이토카인(Cytokine) 중 적어도 하나가 적용될 수 있는데, 반응 영역(130)에 염증 매개 인자를 형성하는 방법에 대해서는 후술한다.At least one of cytokines such as IL-1beta, TNF-alpha, and TGF-beta may be used as an inflammatory mediator, and a method of forming an inflammatory mediator in the reaction region 130 will be described later.

반응 영역(130)에 염증 매개 인자가 형성되고, 배양 챔버(120)에 각각의 세포가 배양되면, 상술한 바와 같이, 각 배양 챔버(120) 내부에 중첩 영역(131)에는 염증 매개 인자와 세포가 공존하게 된다. 이 경우, 섬유륜 세포와 염증 매개 인자가 공존하는 중첩 영역(131)에서는 염증 매개 인자와 섬유륜 세포 간에 염증 반응이 발생하게 되어, 섬유륜 세포는 다양한 분비 단백질을 분비하게 된다.As described above, when the inflammatory mediator is formed in the reaction zone 130 and each cell is cultured in the culture chamber 120, the overlapping region 131 inside each culture chamber 120 is filled with inflammatory mediators and cells . In this case, an inflammatory reaction occurs between the inflammatory mediator and the fibrous ring cell in the overlap region 131 where the fibrous ring cell and the inflammatory mediator coexist, and fibricular cells secrete various secretory proteins.

섬유륜 세포에서 분비되는 분비 단백질은 IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), MMP-1(Matrix metalloproteinase-1), MMP-3(Matrix metalloproteinase-3) 등이 있다.The secretory proteins secreted from fibroblast cells are IL-6, interleukin-8, VEGF, MMP-1, MMP-3 and Matrix metalloproteinase -3).

섬유륜 세포에서 분비되는 분비 단백질은 격벽(140) 사이의 공간을 통해 반응 영역(130)으로 이동하게 되는데, 본 발명에서는 분비 단백질의 분비를 통해 반응 영역(130)과 중첩 영역(131) 사이에 발생하는 농도차에 의해 분비 단백질이 격벽(140) 사이로 반응 영역(130) 측으로 이동하는 것을 예로 한다.Secretory proteins secreted from fibroblast cells migrate to the reaction region 130 through spaces between the barrier ribs 140. In the present invention, secretory proteins secreted from fibroblast cells are generated between the reaction region 130 and the overlap region 131 The secretory protein moves toward the reaction region 130 between the barrier ribs 140 due to the difference in concentration.

섬유륜 세포를 통해 분비되는 분비 단백질은 반응 영역(130)을 거쳐 다른 세포, 즉 수핵 세포, 혈관 세포 및 신경 세포가 각각 배양된 배양 챔버(120)로 이동하게 된다. 이를 통해, 섬유륜 세포의 염증 반응을 통해 분비된 분비 단백질과 다른 세포에 미치는 영향을 하나의 칩을 통해 관찰이 가능하게 된다.Secretory proteins secreted through fibroblast cells are transferred to the incubation chamber 120 through which the other cells, namely, the recipient cells, the vascular cells and the nerve cells, are cultured. Through this, it is possible to observe the influence of secretory protein secreted through fibroin cell inflammation and other cells through a single chip.

예컨대, 분비 단백질 중 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)는 혈관 성장 인자로 혈관 세포의 성장을 유발하게 되고, 성장한 혈관 세포가 염증 매개 인자와 만나게 되면 NGF나 BDNF와 같은 신경정상인자를 분비하게 된다. 그리고, IL-6(interleukin-6)와 같은 통증 전달을 매개하는 단백질의 경우 신경 세포의 통증 수용 인자, 예컨대, ASIC-1, TRVP-1의 발현을 유도하게 된다. 그리고, 섬유륜 세포에서 분비되는 분비 단백질에 의해 신경 세포는 내성장하게 된다.For example, VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) is a vascular growth factor that causes growth of vascular cells. When grown vascular cells meet with inflammatory mediators, they secrete neurotrophic factors such as NGF and BDNF. In addition, proteins that mediate pain transmission such as IL-6 (interleukin-6) induce the expression of pain receptors of neuronal cells, such as ASIC-1 and TRVP-1. In addition, secretory proteins secreted from fibroblast cells cause neuronal cell growth.

상기와 같이, 추간판 구조에서 발생하는 염증 반응에 따른 세포들 간의 기전에 대한 관찰이 하나의 칩을 통해 확인 가능하게 된다. 또한, 섬유륜 세포와 수핵 세포에서 염증 매개 인자의 종류에 따른 분비 단백질의 종류나 량에 대한 평가가 가능할 뿐만 아니라, 명확히 밝혀지지 않은 세포 상호 작용, 예를 들어, 신경 세포의 내성장 과정에서 신경 세포가 염증 매개 인자와 만났을 때의 반응, 혈액 세포와 신경 세포에서 발현되는 물질이 염증 매개 인자와 만났을 때의 반응이나 다른 세포들과의 상호 작용에 대한 관찰이 용이하게 된다.As described above, the observation of the mechanism between the cells due to the inflammatory reaction occurring in the intervertebral disc structure can be confirmed through one chip. In addition, it is possible to evaluate the kind and quantity of secreted proteins depending on the kinds of inflammatory mediators in fibrocyllable cells and nucleus pulposus cells, as well as to evaluate cell interactions such as undifferentiated cell interactions, for example, The interaction of inflammatory mediators, and the interaction of blood cells and nerve cells with other inflammatory mediators.

이하에서는, 도 3을 참조하여 본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩(100)의 제작 방법에 대해 설명한다.Hereinafter, a method of manufacturing the reaction research chip 100 according to the first embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.

본 발명의 제1 실시예에 따른 반응 연구 칩(100)은, 도 3에 도시된 바와 같이, 제1 플레이트(111) 및 제2 플레이트(110)를 포함할 수 있다. 제1 플레이트(111)에는 반응 영역(130)이 형성되고, 제1 플레이트(111)에는 배양 챔버(120) 및 격벽(140)을 구성하기 위한 패턴이 형성된다.The reaction research chip 100 according to the first embodiment of the present invention may include a first plate 111 and a second plate 110 as shown in FIG. A reaction region 130 is formed on the first plate 111 and a pattern for forming the culture chamber 120 and the barrier ribs 140 is formed on the first plate 111.

제1 플레이트(111)에 형성되는 반응 영역(130)의 표면에는 아민기를 포함한 링커가 형성된다. 그리고, 염증 매개 인자는 링커의 아민기와의 아미노 결합을 통해 반응 영역(130)에 표면 처리되어 형성된다.A linker including an amine group is formed on the surface of the reaction region 130 formed on the first plate 111. The inflammatory mediator is formed by surface-treating the reaction region 130 through an amino bond with the amine group of the linker.

본 발명에서는 링커로 APTES-GA 링커, APTMS-GA 링커, APTED-GA 링커, BPEI-GA 링커, GOPS-BPEI-GA 링커 및 LPEI-GA 링커 중 어느 하나가 적용되는 것을 예로 한다.In the present invention, it is exemplified that any one of APTES-GA linker, APTMS-GA linker, APTED-GA linker, BPEI-GA linker, GOPS-BPEI-GA linker and LPEI-GA linker is applied as a linker.

APTES-GA 링커를 예로 하여 설명하면, 제1 플레이트(111)의 표면을 플라즈마 처리한 후, APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)에 의해 아미노산 활성화 처리가 진행된다. 그런 다음, 아미노산 활성화 처리가 진행된 후 그 표면에 GA(Glutaraldehyde) 처리가 진행되면, GA에 의해 카르복실화되면서 APTES-GA 링커가 형성된다. 그런 다음, 염증 매개 인자와 APTES-GA 링커 간의 아미노 결합을 통해 염증 매개 인자가 반응 영역(130)에 형성된다.Taking the APTES-GA linker as an example, the surface of the first plate 111 is subjected to plasma treatment, and then the amino acid activation treatment is carried out by APTES (3-aminopropyltriethoxysilane). Then, GA (Glutaraldehyde) treatment proceeds on the surface after the amino acid activation treatment, and APTES-GA linker is formed by carboxylation by GA. An inflammatory mediator is then formed in the reaction zone 130 through the amino linkage between the inflammatory mediator and the APTES-GA linker.

제2 플레이트(110)를 제1 플레이트(111)에 결합시키는 과정은 APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)에 의해 아미노산 활성화 처리 직후에 진행될 수 있으며, 염증 매개 인자를 형성한 후에 결합되어도 무방할 것이다.The process of binding the second plate 110 to the first plate 111 may be performed immediately after the amino acid activation treatment by APTES (3-aminopropyltriethoxysilane), or may be bonded after forming the inflammatory mediator.

상기와 같은 과정을 통해 반응 연구 칩(100)이 완성되면, 각각의 배양 챔버(120)에 관찰을 원하는 세포들을 각각 배양시킨 후, 염증 반응을 관찰하게 된다. 여기서, 배양 챔버(120)에는 세포들의 배양을 위한 입구(151) 및 출구(152)가 형성될 수 있다. 또한, 도 1 내지 도 3에는 도시되지 않았으나, 제2 플레이트(110)의 상부는 투명한 재질의 커버로 차단될 수 있다.When the reaction research chip 100 is completed through the above process, the cells to be observed are cultured in the respective culture chambers 120, and the inflammatory reaction is observed. Here, in the culture chamber 120, an inlet 151 and an outlet 152 for culturing the cells may be formed. Also, although not shown in FIGS. 1 to 3, the upper portion of the second plate 110 may be shielded by a cover made of a transparent material.

도 4 내지 도 6은 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩(100a)의 구성을 나타낸 도면으로, 도 4는 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩(100a)의 사시도이고, 도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩(100a)의 평면도이고, 도 6은 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩(100a)의 단면도이다. 도 4 내지 도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 제2 실시예에 따른 반응 연구 칩(100a)은 반응 영역(130a)과, 3개의 배양 챔버(120a)를 포함하고 있다.4 to 6 are views showing the construction of a reaction research chip 100a according to a second embodiment of the present invention. FIG. 4 is a perspective view of a reaction research chip 100a according to a second embodiment of the present invention, FIG. 5 is a plan view of a reaction research chip 100a according to a second embodiment of the present invention, and FIG. 6 is a cross-sectional view of a reaction research chip 100a according to a second embodiment of the present invention. 4 to 6, the reaction research chip 100a according to the second embodiment of the present invention includes a reaction region 130a and three culture chambers 120a.

복수의 배양 챔버(120a)는 반응 영역(130a)을 중심으로 방사상으로 배치되는데, 반응 영역(130a)이 삼각형 형태로 형성되고, 각각의 배양 챔버(120a)가 삼각형 형태의 반응 영역(130a)의 각 변에 각각 배치되는 것을 예로 하고 있다.The plurality of culture chambers 120a are arranged radially around the reaction region 130a so that the reaction region 130a is formed in the shape of a triangle and each culture chamber 120a is formed in the shape of a triangular reaction region 130a And are respectively disposed on the respective sides.

제1 실시예에서와 마찬가지로, 각각의 배양 챔버(120a)에는 조직을 구성하는 이기종의 세포들이 각각 배양되며, 반응 영역(130a)에는 반응 매개 인자가 형성되어 세포와 염증 반응과 같은 생체 반응이 발생한다.As in the first embodiment, the heterogeneous cells constituting the tissue are cultured in the respective culture chambers 120a, and a reaction mediator is formed in the reaction region 130a to generate a biological reaction such as a cell and an inflammatory reaction do.

여기서, 반응 영역(130a)은 배양 챔버(120a)의 일부 영역과 중첩되는 중첩 영역(131a)을 포함하는데, 중첩 영역(131a)에 위치하는 세포와 반응 매개 인자 간의 반응을 통해 다양한 분비 단백질이 분비된다. 제1 실시예에서와 마찬가지로, 반응 영역(130a)과 배양 챔버(120a) 사이에는 격벽(140a)이 마련될 수 있다. 여기서, 본 발명의 제2 실시예에 따른 각 구성요소, 예를 들어, 제1 플레이트(111a), 제2 플레이트(110a), 격벽(140a), 입구(151a) 및 출구(152a) 등의 구성은 전술한 제1 실시예의 구성에 대응하는 바, 그 상세한 설명은 생략한다.Here, the reaction region 130a includes an overlapping region 131a overlapping with a partial region of the culture chamber 120a. Through the reaction between the cells located in the overlapping region 131a and the reaction mediator, various secreted proteins are secreted do. As in the first embodiment, a partition wall 140a may be provided between the reaction region 130a and the culture chamber 120a. Here, the constitution of each component according to the second embodiment of the present invention, for example, the first plate 111a, the second plate 110a, the partition wall 140a, the inlet 151a and the outlet 152a Corresponds to the configuration of the first embodiment described above, and a detailed description thereof will be omitted.

전술한 실시예에서, 본 발명에 따른 반응 연구 칩(100,100a)을 통해 추간판 조직에서의 염증 반응을 실험하는 예에 대해 설명하였으나, 본 발명의 기술적 사상이 이에 국한되지 않으며, 디스크 조직을 구성하는 섬유 아세포(Fibroblast)와 연골 세포(Chondrocyte) 간의 상호 작용과 이와 관련된 류마티스 질병의 연구에도 적용 가능하다.In the above-described embodiment, the example of experimenting the inflammatory reaction in the intervertebral disc tissue through the reaction research chip 100 or 100a according to the present invention is explained. However, the technical idea of the present invention is not limited to this, It is also applicable to the study of the interaction between fibroblasts and chondrocytes and related rheumatic diseases.

본 실시예는 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 명확하게 나타낸 것에 불과하며, 본 발명의 명세서에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시예는 모두 본 발명의 기술적 사상에 포함되는 것은 자명하다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description of the present invention are exemplary and explanatory and are intended to be exemplary and explanatory only and are not to be construed as limiting the scope of the inventive concept. And it is obvious that it is included in the technical idea of the present invention.

100,100a : 반응 연구 칩 110,110a : 제2 플레이트
111,111a : 제1 플레이트 120,120a : 배양 챔버
130,130a : 반응 영역 131,131a : 중첩 영역
140,140a : 격벽 151,151a : 입구
152,152a : 출구100, 100a: reaction research chip 110, 110a: second plate
111, 111a: first plate 120, 120a: culture chamber
130, 130a: reaction zone 131, 131a: overlap zone
140, 140a: partition 151, 151a: inlet
152, 152a:

Claims (8)

조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩에 있어서,
반응 영역과,
상기 반응 영역을 중심으로 방사상으로 배치되고, 복수의 상기 세포가 각각 배양되는 복수의 배양 챔버를 포함하고;
상기 반응 영역은 각각의 상기 배양 챔버 내에 각각의 상기 배양 챔버의 일부 영역과 중첩되는 중첩 영역을 형성하고;
상기 반응 영역에는 복수의 상기 세포 중 적어도 하나와 반응하는 반응 매개 인자가 형성되어 상기 중첩 영역에서 해당 세포와 반응하는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.A reaction study chip for studying the reaction between heterogeneous cells constituting tissues,
A reaction zone,
A plurality of culture chambers radially arranged around the reaction region and in which a plurality of the cells are cultured, respectively;
Wherein the reaction zone forms an overlapping area overlapping with a part of each of the culture chambers in each of the culture chambers;
Wherein the reaction region is formed with a reaction mediator that reacts with at least one of the plurality of cells to react with the cell in the overlapping region. 제1항에 있어서,
하나의 상기 배양 챔버 내의 해당 중첩 영역에서 해당 세포와 상기 반응 매개 인자와의 반응에 의해 발현되는 분비 단백질이 상기 반응 영역을 통해 나머지의 배양 챔버로 이동 가능하여, 상기 중첩 영역에서의 반응에 따른 상기 세포 간의 상호 작용의 관찰이 가능한 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.The method according to claim 1,
A secretory protein expressed by a reaction between the cell and the reaction mediator in the overlap region of one culture chamber is allowed to move to the remaining culture chamber through the reaction region, A reaction study chip for studying the reaction between heterologous cells constituting the tissue characterized by the observation of intercellular interactions. 제2항에 있어서,
상기 세포는 추간판 조직을 구성하는 섬유륜 세포, 수핵 세포, 대식 세포, 혈관 세포 및 신경 세포 중 적어도 2 이상을 포함하며;
상기 반응 매개 인자는 상기 섬유륜 세포, 상기 수핵 세포, 상기 대식 세포 및 상기 혈관 세포 중 적어도 하나에 염증 반응을 유발하는 염증 매개 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.3. The method of claim 2,
Wherein the cell comprises at least two of fibrocylindrical cells, nucleus pulposus cells, macrophages, vascular cells and nerve cells constituting the intervertebral disc tissue;
Wherein the response mediator comprises an inflammatory mediator that induces an inflammatory reaction in at least one of the fibrocystic cell, the nucleus pulposus cell, the macrophage cell, and the blood vessel cell. Reaction research chip. 제3항에 있어서,
상기 염증 매개 인자는 IL-1beta, TGF-beta 및 TNF-alpha 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.The method of claim 3,
Wherein the inflammatory mediator comprises at least one of IL-1beta, TGF-beta and TNF-alpha. 제4항에 있어서,
상기 섬유륜 세포, 상기 수핵 세포, 상기 대식 세포 및 상기 혈관 세포 중 적어도 하나와 상기 염증 매개 인자와의 염증 반응에 의해 발현되는 분비 단백질은 상기 반응 영역을 통해 상기 신경 세포가 배양된 상기 배양 챔버로 이동하는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.5. The method of claim 4,
Secretory proteins expressed by the inflammatory reaction of at least one of the fibroblast cell, the nucleus pulposus cell, the macrophage cell, and the blood vessel cell with the inflammatory mediator are transferred to the culture chamber through which the nerve cell is cultured through the reaction zone A reaction study chip for studying the reaction between heterologous cells constituting the tissue. 제5항에 있어서,
상기 반응 영역의 표면에는 아민기를 포함한 링커가 형성되고;
상기 염증 매개 인자는 상기 링커의 상기 아민기와의 아미노 결합을 통해 상기 반응 영역에 표면 처리되는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.6. The method of claim 5,
A linker including an amine group is formed on the surface of the reaction region;
Wherein the inflammatory mediator is surface-treated in the reaction zone through an amino bond with the amine group of the linker. 제6항에 있어서,
상기 링커는 APTES-GA 링커, APTMS-GA 링커, APTED-GA 링커, BPEI-GA 링커, GOPS-BPEI-GA 링커 및 LPEI-GA 링커 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.The method according to claim 6,
Wherein the linker comprises any one of APTES-GA linker, APTMS-GA linker, APTED-GA linker, BPEI-GA linker, GOPS-BPEI-GA linker and LPEI-GA linker. Reaction study chip for study of reaction between. 제2항에 있어서,
각각의 상기 배양 챔버와 상기 반응 영역 사이에는 상기 배양 챔버 내의 상기 세포의 상기 반응 영역으로의 이동을 차단하고, 상기 중첩 영역에서 발현되는 상기 분비 단백질의 상기 반응 영역으로의 이동을 허용하는 복수의 격벽이 형성되는 것을 특징으로 하는 조직을 구성하는 이기종 세포 간의 반응 연구를 위한 반응 연구 칩.3. The method of claim 2,
Between each of said culture chambers and said reaction zone to block movement of said cells in said incubation chamber into said reaction zone and to allow movement of said secretory protein expressed in said overlap zone into said reaction zone, And a reaction chip for studying the reaction between heterologous cells constituting the tissue.
KR1020170029951A 2017-01-04 2017-03-09 Reaction research chip for research of reaction between different kind of cells which compose tissue KR101848201B1 (en)

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