KR101846090B1 - 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 신규한 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 나노 크기의 입도 분포가 좁은 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 리포좀 제제의 약물 봉입률 및 저장 안정성이 우수하므로, 생산성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법{PREPARATION METHOD OF LIPOSOMAL DOXORUBICIN}

본 발명은 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법에 관한 것이다.

독소루비신(doxorubicin, 독소루비신 염산염)은 암 화학요법에서 가장 광범위하게 사용되는 세포독성 안트라사이클린 항생제 중의 하나이며, 다양한 종양에 대해 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 상기 독소루비신은 수많은 고형암과 백혈병의 치료에 유용하며, 그 중에서도 특히 복합치료와 관계 있는 유방암의 치료에 효과적이다. 또한, 독소루비신은 AIDS와 연관된 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma)에 대한 프로토콜 치료제이며 난소암, 폐암, 정소암, 전립샘암, 자궁암, 두경부암, 에스트로겐성 육종 및 에윙 육종 (Ewing's sarcoma)에 대해 탁월한 활성을 보인다.

그러나, 독소루비신은 울혈성 심부전을 초래하는 심장 독성, 골수 독성 등 세포 독성을 나타내는 문제점이 있다. 이에, 독소루비신의 독성을 감소시키고 치료하고자 하는 표적장기(target organ)에 효과적으로 전달, 분비시키기 위하여 독소루비신을 리포좀(liposome)에 봉입한 리포조말 독소루비신 제제가 사용되고 있다.

이러한 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제로서 시판되고 있는 것으로는 케릭스(Caelyx^®)를 들 수 있다. 이들 리포좀 제제는 리포좀 표면이 폴리에틸렌글리콜(PEG) 고분자로 코팅된 리포좀 제제로서, PEG로 인해 약물의 혈액 순환 시간이 증가되는 효과가 있으며 정상 조직으로의 비특이적 운반이 적고 종양 특이성이 우수하다.

상기 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조 방법에 관한 문헌으로는 미합중국 등록특허 제4,927,571호가 있다. 상기 특허문헌은 인지질 및 콜레스테롤을 유기 용매 중에 분산시킨 다음, 용매를 제거하고 독소루비신, 락토오스, 및 염을 포함하는 수용액에 재 분산시키는 박막 수화법(Thin-Film Hydration Method)을 제시한다. 그러나, 상기 방법에 의할 경우 리포좀의 입도가 균일하게 제어되기 어려우며, 95% 이상의 높은 봉입률을 달성할 수 없는 문제점이 있다.

이에, 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 약리 효과를 높이고 균일한 품질을 확보하기 위하여, 입도 분포가 좁고, 저장 안정성이 우수하며, 높은 봉입률을 나타내는 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 새로운 제조방법이 필요한 실정이다.

미합중국 등록특허 제4,927,571호, "Preparation of injectable Doxorubicin/liposome suspension"

본 발명의 목적은 우수한 품질의 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제를 제조할 수 있는 신규한 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

S1) 인지질, 스테롤 및 PEG-접합 지질을 저급 알코올에 첨가하여 지질 용액을 제조하는 단계;

S2) 상기 지질 용액을 무기 염 수용액에 적하하여 공 리포좀 분산 용액을 제조하는 단계;

S3) 상기 공 리포좀 분산 용액을 압출기를 통과시켜 압출성형을 수행하는 단계;

S4) 얻어진 공 리포좀 용액에 투석 공정을 수행하는 단계; 및

S5) 공 리포좀 내에 독소루비신을 봉입하여 리포좀 제제를 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 나노 크기를 가지며 입도 분포가 좁은 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 리포좀 제제는 독소루비신의 봉입률이 매우 높고, 저장 안정성이 우수한 이점이 있다.

이러한 제조방법은 파일롯 스케일(pilot scale)에 최적화된 방법으로 안정적인 원료 수급 및 설비 장치의 확보를 통해 리포좀 제제의 대량 생산을 가능케 한다.

도 1은 본 발명에 따른 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 투석 전, 후의 공 리포좀의 입도 분포를 비교한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 리포좀 제제가 담긴 앰플의 사진이다.
도 4는 실시예 1의 리포좀 제제 및 대조제제의 초저온 투과전자현미경 사진이다.
도 5는 실시예 1의 리포좀 제제 및 대조제제의 입도 분포 그래프이다.
도 6은 실시예 1의 리포좀 제제 및 대조제제의 용출 특성을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명은 입도 분포가 좁고 봉입률이 우수하며 저장 안정성이 높은 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조 방법을 제공한다. 페길화된(PEGylated) 리포좀 제제는 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 사슬이 결합된 리포좀 제제로서, 인체 투여 시 면역계로부터 보호될 수 있고, 체내 반감기가 길어 우수한 약리 효과를 나타낸다.

구체적으로 본 발명은

S1) 인지질, 스테롤 및 PEG-접합 지질을 저급 알코올에 첨가하여 지질 용액을 제조하는 단계;

S2) 상기 지질 용액을 무기 염 수용액에 적하하여 공 리포좀 분산 용액을 제조하는 단계;

S3) 상기 공 리포좀 분산 용액을 압출기를 통과시켜 압출성형을 수행하는 단계;

S4) 얻어진 공 리포좀 용액에 투석 공정을 수행하는 단계; 및

S5) 공 리포좀 내에 독소루비신을 봉입하여 리포좀 제제를 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것이다.

독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제는 Doxil^®, Caelyx^® 등의 상표명으로 시판되고 있다. 이러한 리포좀 제제는 세포 독성을 나타내는 독소루비신의 특성상 봉입률이 높을 것이 요구되며, 균일한 품질의 확보를 위하여 입도 분포가 좁을 것, 저장 안정성이 높을 것이 요구된다.

본 발명에 따르면 공 리포좀 분산 용액에 대하여 압출 및 투석을 수행함으로써 공 리포좀의 입도 분포를 균일하게 하고 순도를 높일 수 있으며, 봉입률 및 저장 안정성이 높은 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제를 제조할 수 있다.

이하, 각 단계별로 상세히 설명한다.

S1) 지질 용액 제조 단계

먼저, S1 단계에서는 인지질, 스테롤 및 PEG-접합 지질을 저급 알코올에 첨가하여 지질 용액을 제조한다.

본 발명에서 사용되는 인지질은 소낭 형성 지질로서, 포스파티딜콜린(PC),포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 스핑고미엘린(SM) 등 인산 에스테르기를 가지는 지질이면 특별히 제한되지 않는다.

구체적으로 난황 레시틴, 대두 레시틴, 스핑고마이엘린, 수소화 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 수소화 레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하기로, 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC)을 사용한다.

본 발명에서 스테롤은 리포좀 막의 유동성을 조절하여 리포좀이 보다 안정적으로 구조를 유지할 수 있도록 하기 위하여 첨가된다. 상기 스테롤로는 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 에르고스테롤, 및 라노스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하기로 콜레스테롤을 사용한다.

상기 PEG-접합 지질은 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 중합체가 결합된 지질을 의미한다. PEG-접합 지질을 막의 구성성분으로 포함하는 리포좀 제제는 혈중 단백질과 리포좀 간의 흡착을 감소시켜 체내 반감기가 증가되는 효과를 나타낸다.

상기 PEG-접합 지질은 시판되는 것을 사용하거나, 인지질 및 PEG로부터 직접 제조하여 사용할 수 있다.

PEG-접합 지질을 직접 제조하여 사용할 경우, 사용되는 PEG는 단부에 메톡시, 에톡시 또는 다른 미반응성기가 캡핑되고, 다른 단부는 반응성 화학기를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 PEG는 중량평균 분자량(Mw)이 500~20,000 g/mol 의 것을 시중에서 구입하여 사용하거나, 직접 제조하여 사용할 수 있다.

상기 PEG와 접합되는 지질은 소낭 형성 지질로서, 바람직하게는 두 개의 탄화수소 사슬, 전형적으로 아실 사슬과 극성 헤드기를 갖는 것이다. 이러한 지질의 예로는 두 개의 탄화수소 사슬이 길이가 전형적으로 약 C14~22이며 다양한 불포화도를 갖는 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티드산(PA), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 스핑고미엘린(SM)을 들 수 있으며, 바람직하기로 포스파티딜에탄올아민(PE)이다.

상기 PEG는 시아누르산, 디이미다졸, 무수물 등과 같은 적합한 활성화제의 반응에 의해 한 단부에서 활성화 될 수 있으며, 활성화된 PEG는 소낭 형성지질과 반응하여 PEG-접합 지질을 형성한다. 다르게는, PEG를 활성화시키는 대신에 지질기를 활성화시키는 등의 방법을 이용할 수도 있다.

본 발명에서는 PEG-접합 지질로서 바람직하기로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-메톡시-폴리(에틸렌글리콜-2000) (DSPE-mPEG-2000), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-메톡시-폴리(에틸렌글리콜-5000) (DSPE-mPEG-5000)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종을 사용하며, 보다 바람직하기로 분자량이 2650 내지 3050 g/mol 범위의 DSPE-mPEG-2000을 사용한다.

S1 단계에서 지질 용액 제조 시, 상기 인지질, 스테롤 및 PEG-접합 지질은 3~9:1~3:1~3의 중량비로 포함되는 것이 리포좀 막의 안정성 확보 측면에서 바람직하다.

S1 단계의 저급 알코올로는 에탄올, 이소프로판올 및 프로판올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 이 중 바람직하게는 에탄올을 사용한다.

상기 S1 단계의 수행 온도는 바람직하기로 상온 내지 80 ℃이며, 보다 바람직하기로 60 내지 80 ℃ 이고, 지질 성분의 고른 분산을 위해 교반 하에 진행하는 것이 보다 바람직하다.

S2) 공 리포좀 분산 용액 제조 단계

S2 단계는 상기 인지질, 스테롤 및 PEG-접합 지질이 분산된 에탄올 용액을 무기 염 수용액에 적하하여 공 리포좀(blank liposome) 분산 용액을 제조하는 단계이다.

인지질 등 소낭 형성 지질은 무기 염 수용액에 현탁함으로써 지질 이중층 소낭을 생성하며, 스테롤은 인지질과 함께 리포좀에 삽입되어 리포좀 막의 강도 및 투과성 등의 특성을 부여하게 된다.

S2 단계에서 사용될 수 있는 무기 염으로는 양이온으로 암모늄 이온을 포함하는 것으로서 예를 들어 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 아세테이트, 암모늄 포르메이트, 및 암모늄 카보네이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하기로 암모늄 설페이트를 사용한다. S2 단계의 무기 염 수용액은 농도가 200 내지 300 mM인 것이 바람직하다.

S2 단계의 수행 온도는 바람직하기로 상온 내지 80 ℃이며, 보다 바람직하기로 60 내지 80 ℃ 이고, 고른 입도의 리포좀이 제조될 수 있도록 교반 하에 진행하는 것이 바람직하다.

지질 용액의 적하 속도 및 적하 후 교반 시간은 특별히 제한되지 않으나, 적하 후 교반 시간은 20분 이상이 바람직하고, 30분 내지 1시간인 것이 보다 바람직하다.

S3) 압출 성형 단계

S3 단계에서는 상기 S2 단계에서 제조된 공 리포좀 분산 용액을 압출기에 통과시켜 압출 성형을 수행한다.

압출 성형법은 적절한 크기의 멤브레인 필터가 장착된 압출기(extruder)에 상기 공 리포좀 분산 용액을 주입한 후, 질소 가스로 고압을 작용시켜 리포좀 용액을 통과시켜 적절한 크기의 공 리포좀을 얻을 수 있는 방법이다. 이때 압출기의 멤브레인 필터(기공) 및 인가하는 압출 압력에 의해 공 리포좀의 크기 및 입도 분포의 조절이 가능하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 압출기로는 노던리피드(Northern lipids) 사의 리펙스 압출기(LIPEX extruder)를 들 수 있다. 이때 사용되는 필터는 공극 직경이 40 내지 400 nm의 폴리카보네이트 멤브레인 필터일 수 있고, 압출 압력은 필요에 따라 조절될 수 있으나, 바람직하기로 350 내지 850 psi이다.

상기 필터 공극의 직경 및 압출 압력이 상기 제시한 범위 미만이거나 초과할 경우 나노 수준의 직경을 갖는 공 리포좀의 제조가 어려우며, 공 리포좀의 입도 분포가 매우 넓어지는(broad) 문제가 발생한다.

상기 압출 성형은 리포좀의 평균 입경(D90)이 150nm 이하를 만족할 때까지 수회 반복될 수 있다. 이때 D90의 의미는 공 리포좀 총 100 중량% 중 90 중량%의 공 리포좀이 150nm 이하의 입경을 갖는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 압출 성형은 사용 필터의 직경을 점차 작은 것으로 교환하며 수행되거나, 압출진행방향에 따라 필터 직경이 줄어들도록 여러 개의 필터를 겹쳐놓은 다음 수행될 수 있으며, 이때 최종적으로 사용되는 필터는 직경 40 내지 50 nm인 것이 바람직하다. 또한, 상기 압출 성형 시, 필요에 따라 압출 압력을 증가시키는 과정을 더욱 수행할 수 있다.

S4) 투석 공정 단계

S4 단계에서는 상기 압출 공정이 완료된 공 리포좀 용액에 대하여 투석 공정을 수행한다. 상기 투석 공정은 제조된 공 리포좀에 잔류하는 무기 염 등 불순물을 제거하기 위하여 수행된다.

상기 투석 공정에서 사용되는 투석 용액으로는 백당을 포함하는 완충제 용액을 사용한다.

백당(수크로오스, sucrose)은 등삼투압제로서, 리포좀과 반응하지 않으며 리포좀 막의 내부 및 외부 표면에 잔류함으로써 막을 강화시킨다. 본 발명에서는 특히 리포좀 제제의 유통기간에 대한 장기간의 안정성을 확보하기 저온 보호물질로서 사용한다. 또한, 독소루비신 봉입 후 약물의 누출을 감소시키는 효과가 있다. 상기한 효과를 확보하기 위하여, 수용액 내에 포함되는 백당의 농도는 바람직하기로 5 내지 15%(w/v)이며, 보다 바람직하기로 10%이다.

상기 완충제로서는 글리신, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 히스티딘이 바람직하며, 보다 바람직하기로 히스티딘이다.

가장 바람직하기로, 투석 용액은 10% 백당이 함유된 L-히스티딘 용액을 사용한다.

이때 사용되는 투석 막은 분획 분자량(MWCO, molecular weight cut-off)이 10,000 내지 20,000 달톤, 바람직하기로 10,000 내지 14,000 달톤인 것으로서, 그 소재는 특별히 제한되지 않는다.

예를 들어 상기 투석 막은 셀룰로오스, 에틸렌-비닐알코올 공중합체, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 소재로 이루어진 것일 수 있다.

상기 투석 공정은 0 내지 10℃, 바람직하기로 3 내지 5℃에서 수행되며, 12시간 이상 수행하되, 4시간 간격으로 투석용액을 교환하도록 하는 것이 바람직하다. 이와 같은 조건에서 리포좀의 구조, 안정성 및 입도 분포에 영향을 미치지 않으면서 정제 효과를 얻을 수 있다.

S5) 리포좀 제제(독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제) 제조 단계

S5 단계에서는 상기와 같이 제조 및 정제된 공 리포좀에 pH 구배 또는 화학 구배를 이용하여 독소루비신을 봉입한다.

상기 S5 단계에서 공 리포좀에 봉입되는 독소루비신은 독소루비신 염산염을 사용하는 것이 바람직하다.

독소루비신의 봉입은 독소루비신 염산염을 S4 단계의 투석 용액에 용해한 후 55 내지 60℃에서 공 리포좀 분산 용액과 혼합하여 0.5 내지 5시간 동안 방치함으로써 이루어질 수 있다. 이후, 염산과 수산화 나트륨을 이용하여 pH를 6.0~7.0으로 조정하여 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제를 제조한다.

S5 단계를 거쳐 제조된 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제는 2 내지 8 ℃의 저온에서 보관된다.

본 발명에 따라 제조된 리포좀 제제는 스테롤을 포함하여 저온에서 우수한 저장 안정성을 나타낸다. 이때 저장 안정성이란 제조된 리포좀 제제의 저장 기간 또는 사용 기간 중 리포좀의 자기 부착으로 인한 엉김 현상이 방지되는 특성을 의미한다. 저장 안정성이 향상된 리포좀 제제는 리포좀 입자가 커지는 것을 방지하며 고른 입도 분포를 유지할 수 있도록 하는 바, 환자에게 정맥 투여 시 혈관 막힘 현상을 방지할 수 있고 균일한 품질이 확보될 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따라 제조된 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제는 평균 입도(D50)가 약 100nm, 스팬(span)값이 약 0.03이며, 봉입률이 96% 이상인 것을 확인하였다.

상기 스팬 값은 리포좀의 입도 분포 정도를 나타내는 값으로서, 수치가 작을수록 리포좀이 더 균일하고 좁은 입도 분포를 가지고 있다는 것을 의미한다. 상기 스팬 값은 하기 수학식 1로 나타낼 수 있다.

[수학식 1]

스팬(span) 값=(D90 - D10)/D50

상기 수학식 1에서 D90, D10은 리포좀 입자의 입경을 측정하여 작은 입자부터 부피를 누적할 때 각각 총 부피의 90%, 10%에 해당되는 입경을 의미한다. 본 발명의 리포좀 제제는 스팬 값이 0.05 이하로 균일한 입도 분포를 가지는 바, 예측 가능한 약동학적(pharmacokinetics) 특성을 나타낼 수 있다.

이에, 본 발명에 따라 제조된 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제는 인체 독성이 저감된 항암제로서 사용될 수 있으며, 난소암 또는 유방암 등의 예방 및 치료 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제는 정맥 주사제, 경피, 경비 및 폐로의 약물 송달에 사용될 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있는 것을 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[실시예]

실시예 1: 리포좀 제제의 제조

수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC) 479mg, 콜레스테롤 159.5mg, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-메톡시-폴리(에틸렌글리콜-2000) (DSPE-mPEG-2000) 159.5mg을 에탄올 3.25ml에 분산시키고 65℃에서 교반하였다. 상기 지질 용액을 250mM 암모늄 설페이트 용액 50ml에 적하하여 혼합시키고 65℃에서 1시간 동안 교반하여 공 리포좀을 제조하였다. 압출기(LIPEX extruder 100ml, Northern lipids)에 47mm 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 장착하고, 상기 리포좀 분산 용액을 투입하여 500psi 압력으로 압출하였다. 상기 압출은 리포좀의 크기(D90)이 150nm 이하가 될 때까지 반복하였다.

상기 압출에 의하여 원하는 크기로 입도분포가 조절된 리포좀 용액을 분획 분자량(MWCO)이 12,000 달톤인 투석 막에 투입하고, 10% 백당이 함유된 L-히스티딘 용액에 담지하여 4시간 간격으로 투석 용액을 교환해주면서 4℃에서 12시간 동안 투석하였다. 도 2는 투석 전/후의 입도 분포 그래프이며, 이로부터 공 리포좀의 입도 분포는 투석 전/후에 따라 차이가 없음을 알 수 있다.

다음으로, 독소루비신 봉입을 수행하였다. 투석 시 사용한 10% 백당이 함유된 L-히스티딘 용액 5ml에 독소루비신염산염 20mg을 용해시키고, 여기에 상기 투석으로 정제된 리포좀 분산 용액을 혼합시켜 65℃에서 1시간 동안 방치하여, 리포좀 내부에 독소루비신을 봉입하였다. 봉입이 완료된 리포좀 용액의 pH를 6.0~7.0으로 조정하였다. 완성된 리포좀 제제는 도 3과 같이 앰플 상태로 2~8℃에서 보관하였다.

실험예 1: 리포좀 제제의 분석

실시예 1에서 제조된 리포좀 제제의 물리화학적 특성을 평가하기 위하여, 성상, 삼투압, 입도 분포, 봉입된 독소루비신의 함량 등을 분석하였다. 본 실험예에서 대조제제로는 시판되는 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제 중 하나인 얀센 사의 케릭스(Caelyx^®) 주사를 사용하였다.

(1) 성상 분석

초저온 투과전자현미경(FE사의 Tecnia F20 G2)을 사용하여 실시예 1에서 제조된 리포좀 제제의 성상을 관찰하였다. 이때, 백당을 제거하지 않은 리포좀 제제 원액을 1/5 농도로 희석한 다음, 3 μl를 퀀티포일 그리드(quantifoil^® grid)위에 올리고 비트로봇(Vitrobot)을 이용하여 액화 에탄에서 냉동하고 측정 전까지 액화 질소에서 보관한 시료를 이용하였다.

도 4를 참조하면, 대조제제와 마찬가지로 본 발명의 리포좀 제제는 입도가 100nm 이하인 구형의 형상을 가지고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 케릭스 주사에 비하여 본 발명의 리포좀 제제의 입도가 보다 고른 것을 알 수 있다.

(2) 삼투압 분석

빙점삼투압 측정기(Osmomat 3000, Gonotec)를 이용하여 실시예 1의 리포좀 제제의 삼투압을 측정한 결과, 평균 365mOsmol/kg으로, 대조제제(362mOsmol/kg)와 유사한 값을 나타내었다.

(3) 입도 분석

리포좀의 입도는 체내 약물 동태에 영향을 줄 수 있다. 즉, 입도가 너무 작을 경우 체내 소실 속도가 빨라 원하는 시간만큼의 약물 효능을 발휘할 수 없으며, 반대로 너무 클 경우 신장 또는 다른 장기의 모세혈관에 영향을 주어 신독성과 같은 부작용을 초래할 수 있다.

말번(Malvern)사의 입도 분석기 제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS)를 이용하여 실시예 1 및 대조제제의 입도를 분석하였다. 상기 입도 분석기는 나노입자의 브라운 운동을 수식으로 계산하여 입자 크기를 분석하는 바, 주사전자현미경 분석에 비하여 입자 크기가 큰 값으로 나타난다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

입도 분석 결과, 실시예 1의 제제와 대조제제 모두 평균 입자 크기(D50)은 약 100nm로 나타났으며, 스팬(span)값은 대조제제 0.07, 실시예 1의 제제 0.03으로, 실시예 1의 제제가 더 좁은 입도 분포를 나타내는 것을 알 수 있었다. 이로부터, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 리포좀 제제는 입도의 균일성 측면에서 기존 케릭스 주사에 비하여 더욱 우수함을 확인할 수 있다.

(4) 봉입률 측정

리포좀 내부에 봉입된 독소루비신의 함량을 측정하기 위하여, 대한약전에 기재된 시험법으로 HPLC 분석을 수행하였다. 분석 조건은 다음과 같다.

* 컬럼: 안지름 4.6mm, 길이 50mm인 스테인레스 강관에 5㎛의 옥티실릴실리카겔 충전

* 이동상: 0.02M 아세트산암모늄 완충액(pH4.0):0.02M 아세트산암모늄시액 =50:50 (부피비)혼합액

* 검출기: 자외부흡광광도계(측정파장: 254nm)

* 유속: 1.0ml/분

HPLC 분석 결과, 대조제제와 실시예 1의 제제의 크로마토그램은 유사한 것으로 확인되었으며, 표준품과 대비하여 독소루비신 염산염의 함량이 각각 101.3%, 99.7%로, 시험규격(90.0~120.0%)에 적합한 것을 알 수 있었다.

한편, 초고속 원심 분리기로 100,000G에서 2시간 동안 원심 분리하여 상층액을 수득하고, 상층액과 원심분리 전의 리포좀 제제 원액을 자외선 분광계(UV spectrometer)를 이용하여 분석하였으며 이로부터 봉입률을 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

	원심분리 전 독소루비신 함량	상층액의 독소루비신 함량	봉입률
실시예 1	100.2%	4.1%	96.1%
대조제제	100.4%	5.7%	94.7%

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 제제는 봉입률이 96.1%로, 대조제제에 비하여 높은 봉입률을 나타내었다. 이와 같이 봉입률이 높아짐에 따라, 본 발명에 의하여 제조된 리포좀 제제는 생체 내에서의 독성이 감소하여 안전성이 증가할 것으로 기대할 수 있다.

(5) 초음파 처리 후 봉입률 측정

리포좀 내에 봉입된 독소루비신의 안정성을 확인하기 위하여, 미국 FDA 가이던스에 기재된 시험법을 이용하여 약한 초음파(20kHz)를 처리한 후의 봉입률을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

	초음파 처리 전 봉입률	초음파 처리 후 봉입률
실시예 1	96.1%	93.2%
대조제제	94.7%	92.1%

초음파 처리 후, 실시예 1의 제제는 봉입률이 93% 이상으로 높게 유지되는 것으로 나타났다. 이로부터 본 발명의 리포좀 제제는 초음파 처리에도 봉입된 약물의 유출이 적으며, 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있다.

(6) 용출 시험

실시예 1에서 제조된 리포좀 제제의 시험관 내(in vitro) 방출 특성을 확인하기 위하여, 소택스(Sotax)사의 USP-4법 용출 시험기를 사용하여 용출 시험을 진행하였다. 상기 용출 시험은 pH 6.5의 인산 완충액에 리포좀 제제를 담지하고, 37℃에서 4일간 용출량을 측정하는 방식으로 수행되었다.

도 6은 상기 용출시험의 결과를 나타낸 그래프이다. 실시예 1의 리포좀 제제는 기존 케릭스 주사와 유사한 용출량을 나타내는 바, 체내에서의 방출 특성 역시 유사할 것으로 판단할 수 있다.

실험예 2: 콜레스테롤 함량 분석

콜레스테롤은 리포좀의 안정성에 가장 큰 영향을 미치는 성분이다. 즉, 콜레스테롤의 함량은 리포좀에 봉입된 독소루비신의 리포좀 밖으로의 방출 및 저장 안정성에 가장 큰 영향을 미치며, 따라서 리포좀 제제에 함유된 콜레스테롤의 함량이 이상적인 범위에 포함되는지 확인하는 것은 중요하다. 이에, 실시예 1에서 제조된 리포좀 제제가 적정량의 콜레스테롤을 포함하고 있는지 확인하기 위하여 HPLC를 수행하였다. 분석 조건은 다음과 같다.

* 컬럼: 안지름 4.6mm, 길이 50mm인 스테인레스 강관에 3㎛의 ODS 충전

* 이동상: 메탄올:테트라하이드로퓨란:개미산완충액=45:3:2 (부피비)혼합액

(개미산완충액의 제조: 개미산 184g을 칭량하여 물 900ml에 녹였다. 암모니아수로 pH 3.0으로 조정한 뒤 물을 넣어 1L로 맞추었다.)

* 검출기: 시차굴절검출기(40℃)

* 유속: 1.0ml/분

독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 적정 콜레스테롤 함량 범위는 15% 내지 20%이다. 상기 실시예 1에서 제조된 리포좀 제제의 콜레스테롤 함량은 17.7%로, 상기 적정 함량 범위를 만족하는 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 리포좀 제제는 우수한 저장안정성을 나타낼 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법에 따르면, 공 리포좀의 제조, 압출 성형 및 투석으로 이어지는 일련의 과정을 통하여 나노 크기를 가지며 입도 분포가 좁은 리포좀을 제조할 수 있고, 이에 따라 저장 안정성 및 봉입률이 우수한 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 리포좀 제제는 인체 독성이 저감된 항암제로서 사용될 수 있으며, 난소암 또는 유방암 등의 예방 및 치료 목적으로 사용될 수 있다.

Claims (12)

1. S1) 수소화대두 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-메톡시-폴리(에틸렌글리콜-2000) (DSPE-mPEG-2000)을 3:1:1의 중량비로, 에탄올에 첨가하여 지질 용액을 제조하는 단계;
   S2) 상기 지질 용액을 250mM 암모늄 설페이트에 적하하여 공 리포좀 분산 용액을 제조하는 단계;
   S3) 상기 공 리포좀 분산 용액을 350 내지 850 psi의 압력 하에서 압출기를 통과시켜 리포좀의 스팬 (span)값이 0.03이하이며, 평균입경(D90)이 150nm이하가 되도록 압출성형을 수행하는 단계;
   S4) 얻어진 공 리포좀 용액에 리포좀 입자의 입도 분포(PDI)가 0.03 이하가 되도록 투석 공정을 수행하는 단계; 및
   S5) 공 리포좀 내에 독소루비신을 봉입하여 리포좀 제제를 제조하는 단계;를 포함하되,
   상기 콜레스테롤은 전체 리포좀 제제에 대해 15 중량% 내지 20 중량% 로 함유되고,
   상기 투석 공정은 분획 분자량(MWCO, molecular weight cut-off)이 12,000 달톤인 투석 막이 구비된 투석기 내 투석 용액을 사용하여 4℃에서 12시간 동안 수행하고, 3 내지 5시간 간격으로 투석 용액을 교환하여 수행하되,
   상기 투석 용액은 10 중량%의 백당을 포함하는 완충제 용액인 것을 특징으로 하는 독소루비신 함유 페길화된 리포좀 제제의 제조방법.
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