KR101844828B1 - 시남알데하이드 유도체를 포함하는 비만 세포 활성화 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 과잉 면역 질환 또는 앨러지 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 본 발명의 화합물은 MKKs-MAPKs 신호 전달 경로를 블럭킹하는 기작에 기반한 비만 세포에 의해 매개되는 앨러지 질환들에 대한 치료제로 사용될 수 있다.

Description

시남알데하이드 유도체를 포함하는 비만 세포 활성화 억제용 조성물{A composition for suppressing activation of mast cell comprising Cinnamaldehyde derivatives}

본 발명은 시남알데하이드 유도체를 포함하는 비만 세포 활성화 억제용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 시남알데하이드 유도체를 포함하는 앨러지 질환, 과잉 면역 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

사이토킨은 면역계 세포에 의해 생성되고 이들 세포에 작용하는 펩티드 메신저 분자이다. 이들은 측분비(paracrine) 또는 자가분비(autocrine) 특성을 보유하며, 세포 결합을 벗어나 림프 또는 혈장을 통하여 전신 순환계로 확산되면 전신적으로 작용한다. 사이토킨이 면역계의 화학적 메신저로서 중요한 역할을 수행하고 정상적인 면역 기능에 필수적이긴 하지만, 특정 면역계 질환에서는 특정 사이토킨의 수준이 비정상적이고 질병 상태를 강화시킨다.

면역계 질환, 예를 들면, 아토피성 질환, 특히, 천식 및 자가면역 질환에서, 특정 종류의 사이토킨 및 이들의 아류 인터루킨은 중요한 역할을 수행한다. 조직에서 이들 케모킨의 존재와 수준은 생리학적 변화를 유도하는데, 이들 변화는 특정 질환을 앓는 개체에서 증폭되고 영속화되어 질병 상태로서 인정되는 표현형을 유발한다. 케모킨은 염증의 개시와 유지의 매개 인자이다.

중화 항-케모킨 항체 또는 케모킨 수용체 길항제로 케모킨-수용체 상호작용을 교란시키면, 염증 반응이 소멸되거나 저해된다. 케모킨에 대한 자가항체(autoantibody)는 케모킨 및 면역계와 질환에 대한 이들의 신호전달과 조절 효과를 효과적으로 중화시킬 수 있다. 표적 케모킨에 대한 환자의 자가항체 수준의 조절을 통한 케모킨의 비정상적 수준과 연관된 질환에 대한 치료 개념은 실제로, 신체에서 질환의 자체 병인 또는 조절에 필적한다.

질환에서 케모킨의 중요한 조절 역할로 인하여, 다수의 산물이 개발되었는데, 이들의 작용 양식은 수용체에 대한 케모킨의 결합을 차단하는 것이다. 대부분의 이들 산물(일부는 임상 시험중이다)은 인간화 단클론 항체(“mAb”), 비-항원성 수용체 길항제, 또는 가용성 수용체 분자 또는 유사체에 기초한다; 이들 산물 모두 수회의 반복 투여를 요하고 장기 요법 또는 예방적 치료에 부적합하다. 가령, 류머티스 관절염과 염증성 장 질환용 인간화 항-TNF 알파 mAb 및 천식 치료용 여러 인간화 항-IL-4, 항-IL-5, 항-IL-8, 항-IL-9 mAb는 급성 질병 상태의 단기 치료에 유효하긴 하지만, 장기적인 유지 요법에는 적합하지 않다. 결과적으로, 현재 임상 시험중인 산물의 단점을 극복하는 수단으로서, 표적 케모킨 수준의 다클론 자가항체 기초한 조절을 가능하게 하는 환자의 자체 면역계의 효과적인 이용을 유도하는 요법이 제안되었다(참조: WO 00/65058; U.S. Patent No. 6,093,405).

현재 개발중인 가장 유망한 사이토킨 중화 방법은 사이토킨에 결합하고 이를 중화시키는 사이토킨 수용체 길항제, 사이토킨 또는 사이토킨 수용체에 대한 인간화 단클론 항체, 또는 상기 수용체의 절두된 형태의 투여이다. 가령 U.S. Patent No.5,912,136; 5,914,110; 5,959,085; 6,168,791 B1; 6,171,590 B1에서 이런 방법을 개시한다. 다른 보고된 사이토킨 중화 방법은 사이토킨 유전자의 코딩 서열에 상보적인 안티센스 분자의 이용인데, 이의 목적은 상기 유전자의 발현을 저해하는 것이다.

실효적인 면역화로 발생된 자가항체를 이용한 사이토킨 중화는 현재, 병리학적 상태를 치료하는데 유망한 방법으로 간주된다(Zagury et al., "Toward a new generation of vaccines: The anti-cytokine therapeutic vaccines", PNAS, July 3, 2001, Vol. 98, No. 14, 8024-8029, Svenson et al., Journal of Immunological Methods 236(2000) 1-8, Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772. Dalum et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, July 1999,666-669).

사이토킨 중화에 유용한 백신은 사이토킨 분자를 불활화시키고 상기 분자에 면역성을 부여함으로써 생산할 수 있다. 가령, Ciapponi 등("Induction of interleukin-6 (IL-6) autoantibodies through vaccination with an engineered IL-6 receptor antagonist." Nature Biotechnology, Vol. 15, October 1997, pas. 997-1001)은 인간 IL-6의 순환 수준이 높은 외래유전자도입 생쥐에서 항원성, 비-생물학적 활성, 가공된 IL-6 수용체 길항제로 예방접종이후, IL-6의 중화를 성공적으로 입증하였다. Ciapponi 등은 연속적인 장관외 전달을 요하는 단클론 항체(mAb) 또는 수용체 길항제를 이용한 요법에 비하여 면역 또는 신생물 질환의 이런 예방접종 치료의 이점을 주장한다. 대안으로, 사이토킨은 면역원성 담체에 결합시켜 면역원성을 부여할 수 있다(참조: Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772, US Pat.No. 6,482,403, US Pat. No. 6,471,957, US Pat. No. 6,455,504, US Pat. No. 6,420,141, WO 01/43771, WO 00/64397). 항-사이토킨 백신 방식은 천식과 앨러지 질환에 관여하는 인터루킨의 수준을 조절하여 이들 질병 상태를 치료하는 치료법으로 제안되었다(참조: WO 00/65058, WO 01/62287, U.S. Patent No. 6,093,405).

천식은 미국에서만 대략 15백만명이 앓고 있는 가장 중요한 의학적 문제점중의 하나이다. 천식 환자 수는 지난 10년간 50% 이상 증가하였는데, 미국에서만 매년 700,000명의 환자(주로, 어린이)가 새로 발생하고 있다.폐에 침입한 앨러지원에 대한 보호성 면역 반응이 모든 인간에서 나타나긴 하지만, 일부 개체는 앨러지 면역 항체, IgE를 생산하는 세포를 압도적으로 생성함으로써 반응하는데, 상기 항체는 케모킨을 비롯하여 천식 공격(asthma attack)을 유발하는 물질을 방출한다. 천식 증상이 일주일에 적어도 2회 나타나는 만성적 천식은 현재, 2가지 유형의 약물로 치료되고 있다: (1) 염증을 진정시키는 약물, 예를 들면, 코르티코스테로이드; (2) 좁아진 기도를 개방하고 공격이 발생할 때 호흡을 좀더 용이하게 하는 구급 약물. 현재 시판되고 있는 약물은 천식의 증상을 완화시키는데 도움을 줄 뿐이며, 앨러지 및 이에 따른 천식을 유발하는 면역 반응을 제거하거나 억제하지 못한다. 이에 더하여, 현재 사용되고 있는 대부분의 약물은 빈번한 복용을 요하는 알약이거나, 공격동안 빈번하게 또는 흡입기로 투여해야 한다. 주도적인 스테로이드-기초한 치료제로서, 이들은 증가된 용량으로 또는 장기적으로 사용하는 경우에 원치않는 부작용과 감소된 효능을 유발할 수도 있다. 천식 공격을 유발하는 앨러지-유사 반응을 억제하거나 제거하고, 수개월 단위로 투여되는 백신 유형 약물이 매우 바람직하다.

T-보조 세포는 면역 반응의 핵심적인 기능을 수행한다. 일반적으로, T-보조 전구(Th-p) 세포는 면역 반응의 일부로서,T-보조 1(Th-l) 또는 T-보조 2(Th-2) 작용 세포(effecter cell)로 분화되는데, 이들 각각은 중요한 생물학적 역할을 갖는다. 폐에 침입한 항원에 대한 반응으로, 개체에 보호성 Th-1 또는 앨러지성 Th-2 반응이 나타날 수 있다. Th-2 반응은 IgE 항체와 앨러지 증상을 발생시킨다. 앨러지와 천식 환자는 흡입된 항원에 대하여 IgE의 상승된 수준과 연관된 Th-2 반응을 압도적으로 보인다.

새로운 천식 치료제의 연구와 개발을 위하여 상당한 노력이 현재 경주되고 있다. 여기에는 일차적으로 이오탁신, IL-4,IL-5, IL-13에 대한 케모킨 중화 요법; IgE에 대하여 면역시키는 인간화 항-IgE mAb 또는 백신을 이용한 직접적인 차단IgE 항체의 중화를 목적하는 다른 전략 등이 포함된다. 다른 좀더 통상적인 앨러지 백신 전략은 특정 펩티드 앨러지원,예를 들면, 고양이 비듬(cat dander) 또는 두드러기 쑥(ragweed pollen)으로 면역화 또는 탈감작화(desensitization)에 중심한다. 새로운 전달 방법 및 DNA 백신 기술의 앨러지원 예방접종으로의 적용에 관련된 연구가 계속되고 있긴 하지만, 앨러지-특이적 전략은 천식에 대한 포괄적인 치료를 제공하지 못한다.

피부질환 중, 특히 아토피 피부염은 앨러지 반응으로 인한 질환으로 이러한 앨러지 반응은 초기의 특이적 면역반응과 후기의 염증반응으로 나뉜다. 앨러지 반응은 거의 대부분 비만세포를 매개로 하여 일어나며, 세포막에 존재하는 고친화성의 IgE 수용체(FcεRI)를 통해서 활성화된다. IgE 수용체에 결합되어 있는 IgE 항체가 항원에 의하여 가교(bridge)를 형성하면 포스포리파아제 C, 단백질 인산화효소 C, 칼슘 이온의 작용을 거쳐 과립에 저장되어 있던 히스타민(histamine), 콘드로이틴(chondroitin) 황산염, 헤파린(heparin), 단백질 분해효소 등이 유리됨으로써 반응 초기 단계를 매개한다. 히스타민을 포함한 화학 전달물질들은 앨러지 반응의 초기에 볼 수 있는 여러 가지 임상증상을 유발하는 원인물질들이며, 가장 많은 양을 차지하는 것은 히스타민이다. 따라서 앨러지 반응에서 히스타민에 의한 작용이 중요하며, 그 증상으로는 혈관 확장, 부종 등이 있다.

프로스타글란딘(prostaglandin), 혈소판 활성인자(platelet-activating factor) 등도 앨러지 반응에서 주목받고 있는 화학 전달물질들이다. 화학 전달물질의 작용으로 인하여 나타나는 증상으로는 담마진, 소양증, 피부발적 등의 피부증상을 들 수 있다.

현재 환경오염, 식생활 습관 및 유전적인 원인 등으로 피부 트러블 및 피부질환 환자수가 계속적으로 증가하고 있다.미국의 경우 전 인구의 5∼12%가 피부질환으로 고통 받고 있으며 우리나라의 경우에도 약 200∼300만 명의 피부질환 환자가 있다. 그럼에도 불구하고 현재 그 치료제나 개선제로는 심각한 부작용을 나타내는 스테로이드 제제가 대부분이고, 최근에는 면역억제제가 개발되어 있으나, 아직까지는 부작용 염려 없이 완치 효과를 발휘하는 특별한 치료제나 개선제는 개발되어 있지 않은 실정이다. 이러한 피부질환 치료제의 세계 시장규모는 13억 달러에 달하고 있지만,면역기능 저하, 피부위축, 어린이 성장방해, 모세혈관 확장, 여드름, 부신피질기능 억제 등 부작용이 수반되므로 임상적 사용에 매우 주의하지 않으면 안 된다. 또한, 현재 항염증 또는 피부질환 치료효과 등이 알려진 생약들 의 유효성분을 추출하여 피부질환 치료제로 개발된 예들이 알려져 있으나, 대부분 가려움증이나 염증 등을 경감시켜 줄 뿐 질병을 완치시키지는 못한다.

비만 세포(Mast cells)는 앨러지 질환에서 중요한 역할을 한다. 따라서 비만세포의 활성화를 억제하는 치료제의 개발은 앨러지 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 것이다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 비만세포의 활성화를 억제하는 신규한 치료제 후보물질을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 앨러지 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 전-염증성 매개자를 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고,

상기 전-염증성 매개자는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-4(interleukin-4), 및 COX-2(cyclooxygenase-2) 중 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물의 유효 농도는 40 내지 60 μM 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 질환은 비만 세포에 의해 매개되는 앨러지 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 과잉 면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질환은 아토피성 질환 또는 천식인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 유효 농도는 40 내지 60 μM 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 세포의 탈과립화 저해용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 인 비트로에서 비만 세포에 처리하여 비만 세포의 탈과립화를 저해하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전-염증성 매개자의 발현 저해용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 인 비트로에서 비만 세포에 처리하여 비만 세포 내의 전-염증성 매개자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카복실산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등을 사용할 수 있고, 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 등의 할로겐산 또는 인산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화합물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 유도체는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 유도체를 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등이 포함된다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등과 같은 주사 투여가 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

비경구투여를 위해서는 점막 투여, 정맥 투여, 근육 주사, 외용물약, 크림, 젤, 연고, 스프레이, 분무제, 현탁제, 패치 등으로 투여될 수 있다.

본 발명의 유도체는 상기의 방법을 이용하여 단독 투여하거나, 수지상 세포 및 B세포를 포함한 세포에 적재하여 투여할 수 있다. 이러한 경우, 항원 및 여타의 면역 보조제와 병용 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 유도체는 면역 반응을 조절하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유도체는 인간에게 일 회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 1~1000 ㎍이고, 더욱 바람직하게는 10~500 ㎍이다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 항-앨러지 효과를 RBL-2H3 세포에서 조사하였다. β-Hexosaminidase 어세이는 RBL-2H3 세포의 탈과립화는 60 μM 4-chlorocinnamaldehyde 또는 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde로 처리함에 따라 감소한다는 것을 확인하였다.

게다가 정량적인 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응은 tumor necrosis factor-α, interleukin-4, 및 cyclooxygenase-2 mRNAs의 상대적인 발현 수준은 농도-의존적으로 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde로 처리된 RBL-2H3 세포에서 감소한다는 것을 나타내었다. 또한, 4-chloro-cinnamaldehyde는 MKKs 및 MAPKs의 인산화를 블럭킹하였다. 이 데이터는 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde를 mast 세포의 염증성 반응에 대한 저해를 효과를 가진다는 것을 시사하고 앨러지 질환의 예방 또는 치료용 약제로 가능성을 가질 수 있다.

본 발명은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 RBL-2H3 세포에서 탈과립화 및 MKKs-MAPKs 신호전달을 블럭킹하여 전-염증성 매개자의 유전자 발현을 저해하였다는 것을 나타내었다. 과잉 염증은 아토피성 피부염이나 천식과 같은 염증성 질환을 유도하고 따라서 이러한 염증성 매개재의 완화된 수준의 결과는 본 발명의 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 MKKs-MAPKs 신호 전달 경로를 블럭킹하는 기작에 기반한 비만 세포에 의해 매개되는 앨러지 질환들에 대한 치료제로 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

도 1은 cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체의 구조. C1: Cinnamaldehyde. C2: 4-Methoxy-cinnamaldehyde. C3: 3.4-Dimethoxy-cinnamaldehyde. C4: 4-Trifluoromethyl-cinnamaldehyde. C5: 2.4-Fluoro-cinnamaldehyde. C6: 4-Chloro-cinnamaldehyde. C7: 3-Chloro-cinnamaldehyde. C8: 2-Bromo-cinnamaldehyde.
도 2는 cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체들의 RBL-2H3 세포에서 세포 생존률 및 β-hexosaminidase 분비에 대한 효과. A: 60 μM cinnamaldehyde 또는 cinnamaldehyde 유도체들로 처리된 RBL-2H3 세포에서 베타-헥소사미니데이즈 분비. RBL-2H3 세포를 60 μM cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체들로 1시간 동안 처리한 후 PMA 및 A23187로 자극하였다. 데이터는 β-hexosaminidase 활성의 퍼센트로 나타냄. B: cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체들을 처리하고 자극한 RBL-2H3 세포의 생존률. 결과들을 3회 독립 실험의 평균±SD로 나타냄. **P 〈 0.01. C1: Cinnamaldehyde. C2: 4-Methoxy-cinnamaldehyde. C3: 3.4-Dimethoxy-cinnamaldehyde. C4: 4-Trifluoromethyl-cinnamaldehyde. C5: 2.4-Fluoro-cinnamaldehyde. C6: 4-Chloro-cinnamaldehyde. C7: 3-Chloro-cinnamaldehyde. C8: 2-Bromocinnamaldehyde.
도 3은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase 분비의 농도-의존적 효과. RBL-2H3 세포를 10,20, 40 및 60 μM 4-chloro-cinnamaldehyde (C6) 또는 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde (C4)로 1시간 동안 처리하고 PMA 및 A23187로 자극하였다. 데이터는 자극된 대조군과 비교한 β-hexosaminidase 활성의 퍼센트로 표현. 결과를 3회 독립적인 실험의 평균±SD으로 나타냄. 자극된 RBL-2H3 세포와 비교된 *P 〈 0.05, **P 〈 0.01
도 4는 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 TNF-α, IL-4, 및 COX-2 유전자 발현에 대한 효과. RBL-2H3 세포를 10, 20, 40 및 60 μM 4-chlorocinnamaldehyde(C6) 또는 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde (C4)로 1시간 처리하고 PMA 및 A23187로 자극하였다. TNF-α, IL-4, 및 COX-2의 상대적인 유전자 발현을 qRT-PCR로 결정하였다. The RPLPO 유전자를 내부 대조군으로 사용. A: TNF-α mRNA의 상대적 발현. B: IL-4 mRNA의 상대적 발현. C: COX-2 mRNA의 상대적 발현. 결과들은 3회 독립적 실험의 평균± SD로 나타냄. 자극된 RBL-2H3 세포와 비교된 *P 〈 0.05, **P 〈 0.01
도 5는 4-chloro-cinnamaldehyde (4-CA)의 MAPKs 및 MKKs의 인산화에 대한 효과. A: MAPKs 및 MKKs 인산화의 면역블럿팅 분석. B: 4-chloro-cinnamaldehyde의 U0126과 비교한 ERK 인산화에 대한 농도 의존적 효과. C: 4-chloro-cinnamaldehyde 및 U0126의 ERK 인산화에 대한 조합 효과.
RBL-2H3 세포를 몇 가지 농도의 4-chloro-cinnamaldehyde로 1시간 처리하고 PMA (50 nM) 및 A23187 (1 μM)로 자극하였다. MAPKs 및 MKKs (A)를 동일한 PVDF 막으로 측정하였다.
도 6은 RBL-2H3 세포에서 4-chlorocinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde로 억제된 신호전달 경로의 개략도.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명은 PMA 및 A23187로 자극한 RBL-2H3 세포에서 염증 매개자에 영향을 미치는 기작을 분석하여 4-chlorocinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 항-앨러지 활성을 기재한다.

실시예 1. 재료들

Cinnamldehyde 유도체는 [G. Battistuzzi, S. Cacchi, G. Fabrizi, Org.Lett. 5 (2003) 777-.780;B.P. Joshi, A. Sharma, A.K. Sinha, Tetrahedron 62 (2006) 2590-2593]에 기재된 것과 같이 합성하고 정제하였다.

Cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체들은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹이고 Siraganian 버퍼(25 mM PIPES, 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0.4 mM MgCl₂, 0.1% 우 혈청 알부민(BSA), 5.6 mM 포도당,pH 7.2)에서 희석하였다. DMSO의 최종 농도는 0.5%이었다.

Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), A23187 (칼슘 ionophore) 및 U0126는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 전체 및 인산화된 c-Jun. N-terminal kinase(JNK), p38, 세포외 signal-regulated kinase (ERK), MKK4, MKK3, 및 MEK1/2의 1차 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. Anti-β-actin 항체들은 Abcam (Cambridge, UK)으로부터 구입하였다.

실시예 2. 세포 배양

RBL-2H3 세포를 Dulbecco's modified Eagle 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)[10% 열 불활성화된 우태아 혈청(FBS), 1% penicillin, 및 1% streptomycin (Hyclone)으로 보충된]에서 5% CO2의 분위기에서 37 ℃에서 배양하였다.

실시예 3. 탈과립화 및 세포 생존률 어세이

cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체들의 탈과립화의 효과를 확인하기 위하여, β-hexosaminidase 활성을 측정하였다.

cinnamaldehyde 및 cinnamaldehyde 유도체들로 처리된 RBL-2H3 세포의 세포 생존률을 MTT 어세이를 사용하여 결정하였다. 그 세포를 24-웰 플레이트(2 X 10⁵ 세포/mL)에서 24시간 동안 성장시켰다. 기재된 화합물로 1시간 동안 처리 후, 세포를 PMA (50 nM) 및 A23187 (1 μM)로 30분간 자극하였다.

자극 후, 상등액을 β-hexosaminidase 어세이에 사용하였고, 세포들은 MTT 어세이에 사용하였다. 상등액을 기질 버퍼(2 mM 4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide in 0.05 M sodium citrate buffer, pH 4.5)에서 30분간 37 ℃에서 배양하였다. 효소 반응을 정지 버퍼(0.1 M NaHCO3, pH 10)로 종결하고, 405 nm에서 흡광도를 Epoch 분광계(Biotek, Santa Barbara, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 자극 후, 세포 배지를 500 μL MTT 용액(5 mg/mL)으로 대체하고 4시간 동안 배양하였다. 다음 MTT 용액을 버리고 불용성 formazan 산물을 200 μL DMSO에 녹였다. 흡광도를 550 nm에서 Epoch 분광계(Biotek)를 사용하여 측정하였다.

실시예 4. 정량적 실시간 역 전사 중합효소 연쇄 반응( qRT - PCR )

전체 RNA를 X-zol RNA 시약(PhileKorea, Seoul,Republic of Korea)을 사용하여 분리하고, RNA 농도를 Epoch 분광계(Biotek)로 결정하였다. tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4), 및 cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNAs의 상대적인 유전자 발현 수준을 결정하기 위하여, 500 ng의 전체 RNA를 ReverTra Ace qPCR RTMasterMix (TOYOBO,Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA으로 역전사하였다. 상대적인 유전자 발현을 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO)로 결정하였고, house-keeping gene large ribosomal protein (RPLPO)를 표준화에 사용하였다.

프라이머 쌍들을 Macrogen (Seoul, Republic of Korea)에서 아래와 같이 합성하였다: TNF-α (sense, 5′-TGAACTTCGGGGTGATCG-3′ 및 antisense, 5′-GGGCTTGTCACTCGAGTTTT-3′), IL-4 (sense, 5′-TACGGCAACAAGGAACAC-3′ 및 antisense, 5′-TCTTCAAGCACGGAGGTA-3′), COX-2 (sense, 5′-TGGTGCCGGGTCTGATGATG-3′ 및 antisense, 5′-GCAATGCGGTTCTGATACTG-3′), 및 RPLPO (sense, 5′-GTGTTTGACAATGGCAGCAT-3′및 antisense, 5′-ACAGACGCTGGCCACATT-3′). qRT-PCR을 StepOne Plus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.

실시예 5. 면역불럿팅

RBL-2H3 세포를 protease 저해제(quartett Immunodiagnostika + Biotechnologie Vertriebs Gmbh, Berlin, Germany)를 포함하는 RIPA 버퍼(시그마-알드리치)에서 파쇄하였다. 각 샘플에서 동량의 단백질(30 μg)을 10% 젤 상에서 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동하고 polyvinylidene difluoride 막(Amersham Hybond-P; GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)으로 옮겼다. 블럿된 막들을 0.05% Tween 20을 포함하는 TBS에서 1% 탈지 우유로 블럿킹하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 TBS에서 3회 세척 후, 막을 1차 항체로 4 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 0.05% Tween 20을 함유한 TBS에서 3회 세척 후, 막을 horseradish peroxidase-linked 2차 항체로 상온에서 1시간 배양하였다. 0.05% Tween 20을 포함한 TBS에서 3회 세척 후, 화학발광 신호들을 WesternBright Peroxide chemiluminescent 검출 시약(Advansta, Menlo Park,CA, USA)을 사용하여 검출하였다. 막을 리-프로빙(re-probing)하기 위하여, 항체들을 stripping 버퍼(10% SDS, 0.5 M Tris-Cl 및 0.8% β-mercaptoethanol)로 떼어내었다.

상기 각 실험은 적어도 3회 독립적으로 수행하였다. 데이터를 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 대조군 및 샘플 군들을 SPSS (v.21, for Windows)를 사용한 Dunnett 테스트에 의해 수반된 일원 분산분석(ANOVA)으로 비교하였다.

〈0.05들을 가지는 P 값의 차이를 통계적으로 유의적으로 간주하였다.

상기 실시예의 결과는 하기와 같다.

4-Chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 RBL-2H3 세포의 탈과립화를 저해함

cinnamaldehyde 유도체들의 RBL-2H3 세포의 탈과립화의 효과를 평가하기 위하여, β-hexosaminidase 어세이를 수행하였다.

RBL-2H3 세포들을 A23187 및 PMA로 자극하였다. RBL-2H3 세포들을 cinnamaldehyde 및 7종의 cinnamaldehyde 유도체들로 60 μM의 농도에서 1시간 동안 처리하고 PMA 및 A23187으로 자극하였다(도 2A). 7 종의 cinnamaldehyde 유도체들 중에서, 4-chlorocinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde가 β-hexosaminidase의 분비를 RBL-2H3 세포에서 현저하게 감소시켰다(도 2A). 또한, RBL-2H3 세포의 생존률은 cinnamaldehyde 유도체들을 60 μM 농도에서 사용할 때 영향이 없었다(도 2B).

이 결과들은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 탈과립화를 저해하고, RBL-2H3 세포에 대한 세포독성 효과는 없다는 것을 시사하였다.

다음 본 발명자들은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 RBL-2H3 세포의 탈과립화에 대한 농도 의존적 효과를 조사하였다(도 3).

60 μM의 농도에서,4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 자극된 대조군에 비하여 RBL-2H3 세포의 탈과립화를 현저하게 감소시켰다. 이 결과들은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde가 RBL-2H3 세포의 농도 의존적인 형태의 탈과립화를 저해하였다는 것을 시사한다.

4-Chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 RBL-2H3 세포에서 전-염증성 매개자의 유전자 발현을 저해함

TNF-α, IL-4, 및 COX-2와 같은 전-염증성 매개자는 앨러지 및 염증 반응에 중요하다.

본 발명자들은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 RBL-2H3 세포에서 전-염증성 매개자의 상대적인 유전자 발현에 대한 효과를 측정하였다(도 4).

4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde의 전-염증성 매개자의 발현의 효과를 평가하기 위하여, qRT-PCR를 수행하였다(도 4). PMA 및 A23187에 의하여 자극된 RBL-2H3 세포에서, TNF-α, IL-4, 및 COX-2 mRNAs의 발현 수준은 증가하였다. 그러나, 이들 mRNAs의 유도된 발현은 농도-의존적인 형태의 4-chloro-cinnamaldehyde 또는 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde로 처리된 자극된 RBL-2H3 세포에서 블럭킹되었다(도 4A.C).

이 결과들은 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 TNF-α, IL-4, 및 COX-2와 같은 전-염증성 매개자 유전자들의 발현을 PMA 및 A23187로 자극된 RBL-2H3 세포에서 저해한다는 것을 시사한다.

4- Chloro - cinnamaldehyde는 RBL - 2H3 세포에서 MKKs - MAPKs 경로의 활성화를 저해함

도 1-4에서 나타낸 것과 같이, 4-chloro-cinnamaldehyde 및 4-trifluoromethyl-cinnamaldehyde는 RBL-2H3 세포 활성화에 대한 저해 효과를 나타내었다.

따라서, 다음 실험에서, RBL-2H3 세포에서 본 발명의 유도체로 처리된 전-염증성 매개자의 발현을 중재하는 기작을 조사하기 위하여 대표적으로 4-chloro-cinnamaldehyde를 선택하였다.

전-염증성 매개자들의 유전자 발현에 대한 4-chloro-cinnamaldehyde의 저해 효과를 중재하는 신호 전달 경로를 동정하기 위하여, 인산화된 형태의 MAPKs를 면역블럿팅 분석으로 결정하였다(도5A). ERK, JNK, 및 p38를 RBL-2H3 세포에서 PMA 및 A23187에 의하여 자극 후 인산화하였다. 그러나, PMA 및 A23187로 자극에도 불구하고, MAPKs의 인산화는 대조군과 비교하여 60 μM 4-chloro-cinnamldehyde로 처리된 RBL-2H3 세포에서 현저하게 감소하였다. p38의 인산화는 60 μM 4-chloro-cinnamaldehyde에서만 저해된 반면, ERK 및 JNK의 인산화는 40 및 60 μM 4-chlorocinnamaldehyde 모두에서 저해되었다.

또한, 4-chlorocinnamaldehyde의 ERK 인산화에 대한 저해 효과를 U0126의 효과와 비교하였다(도 5B 및 C). U0126는 ERK1/2 인산화의 저해를 MEK 1/2 활성의 특이적 저해를 통하여 유도하는 것으로 알려져 MKK-MAPK 경로 분석에 많이 사용된다. 4-chlorocinnamaldehyde 및 U0126 사이의 효과의 비교분석을 위하여, 본 발명자들은 농도 의존적(도 5B) 및 조합 형태(도 5C) 모두에서 면역블럿팅 분석을 수행하였다.

도 5B에 나타낸 것과 같이, ERK 인산화는 2 μM 및 5 μM의 U0126 처리된 RBL-2H3 세포에서 현저하게 감소하였다. 4-chlorocinnamaldehyde 처리된 RBL-2H3 세포의 경우에는, ERK 인산화는 30 μM 및 60 μM 농도에서 강하게 저해되었다. Both U0126 및 4-chlorocinnamaldehyde 모두는 농도 의존적 형태로 ERK의 인산화를 약화시켰다.

본 발명자들은 도 5C에서 조합의 결과를 나타내었다. 15 μM 4-chlorocinnamaldehyde의 단독 처리의 경우, ERK 인산화는 크게 변하지 않았다. 반면, 15 μM 4-chlorocinnamaldehyde 및 2 μM U0126의 동시 처리의 경우에는, ERK 인산화의 약한 완화가 관찰되었다. 이들 결과와 유사하게, 30 μM 4-chlorocinnamaldehyde 및 2 μM U0126의 동시 처리의 경우, ERK 인산화는 30 μM 4-chlorocinnamaldehyde의 단독 처리의 경우와 비교하면 크게 감소하였다. 이들 결과들은 4-chloro-cinnamaldehyde은 PMA 및 A23187로 자극된 RBL-2H3 세포에서 MAPKs의 인산화를 현저하게 저해한다는 것을 시사한다.

이 효과를 확인하기 위하여, MKKs의 인산화를 MAPKs의 면역블럿팅 분석에 사용된 것과 동일한 PVDF 막의 면역블럿팅 분석으로 결정하였다 (도5A). RBL-2H3 세포를 PMA 및 A23187로 자극할 때,MKKs는 인산화되었다. 40에서 60 μM 4-chloro-cinnamldehyde로 처리된 RBL-2H3 세포에서, MEK1/2 및 MKK4의 인산화는 자극된 대조군과 비교하여 저해된 반면, MKK3/6의 인산화는 60 μM 4-chloro-cinnamldehyde의 농도에서만 저해되었다. 따라서, 이 결과들은 4-chloro-cinnamaldehyde가 MKKs-MAPKs 신호 전달 경로를 PMA 및 A23187로 자극된 RBL-2H3 세포에서 현저하게 저해한다는 것을 시사한다(도 6).

Claims (12)

1. 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 앨러지 질환 예방 및 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 전-염증성 매개자를 저해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 전-염증성 매개자는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-4(interleukin-4), 및 COX-2(cyclooxygenase-2) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 유효 농도는 40 내지 60 μM 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 질환은 비만 세포에 의해 매개되는 앨러지 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 4-클로로-시남알데하이드(cinnamaldehyde) 및 4-트리플루오로메틸-시남알데하이드 중 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 과잉 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 질환은 아토피성 질환 또는 천식인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제6항에 있어서, 상기 조성물의 유효 농도는 40 내지 60 μM 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
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