KR101841924B1 - 암 전이의 억제 방법 - Google Patents

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Abstract

암 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 암 전이는 암 환자에서 치료 실패 및 사망의 가장 일반적인 원인이다. 종양 세포 침입 및/또는 이주는 시험관내에서 섬유상 단백질(rVP1, F-HSA, 및 F-BSA) 치료 후 유의적으로 억제될 수 있다. 또한, rVP1은 생체내에서 쥐 및 사람 유방 암 전이 및 사람 전립선 및 난소 암 전이를 억제하고, 한편 F-HSA는 쥐 유방 암 전이를 유의적으로 억제할 수 있다. 항암 전이 치료제로서의 섬유상 단백질의 조성물 및 이의 사용 방법이 본원에 제공되어 있다.

Description

암 전이의 억제 방법{SUPPRESSION OF CANCER METASTASIS}
암 전이는 일련의 순차적인 단계를 포함하며 숙주-종양 세포 상호작용의 캐스케이드(cascade)를 요하는 공정이다[참조: Steeg PS et al. (2007) Nature 449:671-3]. 이들 단계들은 원발성 종양으로부터의 탈착, 순환계내로의 침입, 순환계내에서의 정지, 기관의 유조직내로의 유출; 및 혈관형성과 관련한 증식을 포함한다[참조: Sawyer TK et al. (2004) Expert Opin Investig Drugs 13:1-19]. 전이 공정의 중요한 단계로 밝혀진 이주 및 침입의 메커니즘을 연구하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 전이 캐스케이드를 차단하기 위한 이들 단계들 중 어느 하나에서의 간섭은 전이성 종양 성장의 형성을 예방하기 위한 매력적인 시도를 나타낸다.
본 발명자들의 기존 데이터는, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus: FMDV)의 재조합체 캡시드 단백질 VP1(rVP1)이 인테그린 시그널링 경로를 통해 몇가지 종류의 암 세포에서 아폽토시스를 유도하였음을 나타내었다[참조: Peng JM et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:52168-74]. rVP1을 수용성 형태로 리폴딩(refolding)하기 위한 동일한 공정을 사용하여, 구상(globular) 소 혈청 알부민(G-BSA)이 rVP1과 같이 인테그린/FAK/Akt 시그널링 경로를 통해 종양 세포 아폽토시스를 유도하는 섬유상 BSA(F-BSA)로 전환될 수 있음이 밝혀졌다[참조: Huang et al. (2009) BMC Biotechnol. 9:2].
본 발명은 암 전이를 억제하기 위한 방법을 제공한다. 암 전이는 암 환자에서 치료 실패 및 사망의 가장 일반적인 원인이다. 종양 세포 침입 및/또는 이주는 종양 세포를 섬유상 단백질(fibrillar protein)과 접촉시킨 후 유의적으로 억제되고, 상기 섬유상 단백질로는 rVP1, F-HSA, 및 F-BSA가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 목적한 종양 세포로는 암종, 예를 들면, 유방 암종, 난소의 상피 선암종, 전립선의 선암종 등이 포함된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 섬유상 사람 혈청 알부민 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암을 지닌 포유동물을 치료하는데 사용하기 위한, 예를 들면, 암 세포를 억제하고, 전이를 억제하는 등에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 종양 세포는 섬유상 단백질과 생체내에서 접촉되며, 이러한 접촉은 국소적, 예를 들면, 종양내 도입 또는 주사이거나, 전신적일 수 있다. 예를 들면, rVP1은 생체내에서 쥐 및 사람 유방암 전이 및 사람 전립선 및 난소 암 전이를 유의적으로 억제함을 본원에 나타낸다. F-HSA는 유방암 전이를 유의적으로 억제하는 것으로 보여진다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 앞서 언급한 바와 같은 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암 및 폐암으로부터 선택된 적어도 하나이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 항암 전이 치료제로서 섬유상 단백질의 조성물이 제공되며, 여기서, 당해 조성물은 전이를 억제하는데 효과적인 용량의 약제학적 제형으로 제공된다. 다른 양상에서, 본 발명은 암을 지닌 환자를 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제조함을 포함하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 섬유상 사람 혈청 알부민을 제조하는 단계, 및 섬유상 사람 혈청 알부민을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 SDS 용액 중에 HSA를 용해시키는 단계; 용해된 HSA를 분자량이 70kDa 이상인 단백질로 분리하기 위한 공극 크기(pore size)를 지닌 겔 여과 컬럼을 통해 적용시키는 단계; 컬럼으로부터 HSA를 용출시키는 단계; 및 포스페이트 완충된 염수에 대해 용액을 투석시켜 SDS를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
도 1. MDA-MB-231 세포, PC-3 세포, 및 22Rv1 세포에서의 세포 침입/이주 및 세포독성에 대한 rVP1의 효과. (A 및 B) 24시간 동안 rVP1 치료된 MDA-MB-231 세포, PC-3 세포 및 22Rv1 세포의 세포 침입/이주를 보이덴 챔버 검정(Boyden chamber assay)을 이용하여 측정하였다. rVP1은 종양 세포 침입/이주를 유의적으로 억제하였다(C). 24시간 동안 rVP1 치료된 MDA-MB-231 세포, PC-3 세포, 및 22Rv1 세포의 세포독성은 MTT 검정을 이용하여 측정하였다. 0.1μM 및 0.2μM rVP1은 종양 세포 생존능에 영향을 미치지 않았다. 데이터는 평균 ± S.D.(n = 3)를 나타낸다. *: P<0.05, **: P<0.01 및 ***: P<0.001은 대조군(0μM rVP1 치료)에 대한 상대치이었다.
도 2. SK-OV-3 세포 및 CaSki 세포에서의 세포 침입 및 세포 독성에 대한 rVP1의 효과. (A) 24시간 동안 rVP1 치료된 SK-OV-3 세포 및 CaSki 세포의 세포 침입을 보이덴 챔버 검정을 이용하여 측정하였다. rVP1은 종양 세포 침입을 유의적으로 억제하였다. (B) 24시간 동안 rVP1 치료된 SK-OV-3 세포 및 CaSki 세포의 세포 독성을 MTT 검정을 이용하여 측정하였다. SKOV-3 세포에서의 0.2μM 내지 0.4μM rVP1 및 CaSki 세포에서의 0.2μM 내지 0.6μM rVP1은 세포 생존능에 영향을 미치지 않았다. 백색 바아(white bar), SKOV-3 세포; 흑색 바아, CaSki 세포. 데이터는 평균 ± S.D.(n = 3)를 나타낸다. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001.
도 3. SK-OV-3ip.1 세포에서의 세포 침입 및 세포 독성에 대한 rVP1의 효과. (A) SK-OV-3ip.1 세포를 상부 챔버 상에 1시간 동안 플레이팅 한 후 24시간 동안 rVP1로 치료하였다. 항온처리 후, 하부 막 표면으로부터의 세포를 용해하여 계수하였다. (B) SK-OV-3ip.1 세포를 rVP1으로 24시간 동안 처리한 후 WST-1 검정을 수행하였다. 세포 생존율은 450 nm(참조로서 690 nm)에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 세포 생존율은 (O.D.치료 / O.D.대조군) x 100%로 계산하였다. 데이터는 평균 ± S.D.(n = 3)를 나타낸다. *, P<0.05 및 **, P<0.01는 대조군에 대한 상대치이다.
도 4. MDA-MB-231 세포의 전이 능력은 생체내에서 rVP1 치료 후 상실되었다. 이어서, 24시간 동안 시험관내에서 0.1μM 및 0.2μM rVP1-치료된 MDA-MB-231 세포를 수거하고 꼬리 정맥을 통해 마우스에게 정맥내 주사하였다. 14일 후, 희생시켰다. 3개의 상이한 그룹의 마우스에서 폐의 전체 외형(A) 및 조직병리학 실험(B 및 C)을 측정하였다. rVP1은 MDA-MB-231 세포의 전이 능력을 유의적으로 억제하였다. ***: P<0.001.
도 5. rVP1는 림프절로 전이된 PC-3 세포를 억제하였고 골반 뼈에서 골 용해를 억제하였다. (A) rVP1 치료된 또는 치료되지 않은 정상 마우스 및 종양을 지닌 마우스의 림프절. (B) rVP1 치료된 또는 치료되지 않은 정상 마우스 및 종양을 지닌 마우스의 골반 뼈(화살표).
도 6. SK-OV-3 이식된 누드 마우스로부터 간 종양 전이의 생체내 조직학적 외형은 rVP1에 의해 예방되었다. rVP1 치료된 마우스 및 치료되지 않은 마우스로부터의 H&E 염색된 대표적인 간 단면. BALB/cAnN-Foxn1 암컷 누드 마우스에게 마우스당 5x106 SK-OV-3 암 세포를 복강내 주사에 의해 이식하였다. (a-b) 60일 후, PBS-치료된 SK-OV-3을 지닌 마우스로부터의 간은 종양 세포로 둘러싸였다. (c-d) SK-OV-3 이식 후 340일째에, rVP1-치료된 마우스로부터의 간은 명백한 침입을 나타내지 않았다. (e-f) 정상 마우스(즉, SK-OV-3 이식되지 않은 마우스)로부터의 간.
도 7. MDA-MB-231 세포, PC-3 세포, 22Rv1 세포, 및 CaSki 세포에서의 세포 이주, 침입 및 세포독성에 대한 F-HSA의 효과. 시험관내 이주 및 침입 검정에서, F-HSA는 세포 침입(흑색 바아) 및 이주(백색 바아)를 MDA-MB-231 세포(A), PC-3 세포(C), 22Rv1 세포(E), 및 CaSki 세포(G)에서 보이덴 챔버 검정을 이용함에 의해 유의적으로 억제하였다. MTT 검정을 사용함에 의한 MDA-MB-231 세포, PC-3 세포, 22Rv1 세포, 및 CaSki 세포에서의 세포독성에 대한 F-HSA의 효과(B, D, F, 및 H). 이주 및 침입은 치료되지 않은 세포의 수의 퍼센트에 대한 치료된 세포의 수의 퍼센트로 나타내었다. 각각 3회의 반복된 3회의 독립적인 실험의 평균 ± S.D.를 나타내었다. **: P<0.01 및 ***: P<0.001은 치료되지 않은 세포에 대한 상대치이다.
도 8. F-HSA는 생체내에서 TS/A 종양 세포 전이를 억제하였다. (A) F-HSA 치료된 또는 치료되지 않은 마우스로부터의 폐의 전체 외관 및 조직학적 시험. (B & C) F-HSA 치료된 또는 치료되지 않은 마우스로부터의 폐에서 관련된 폐 중량 및 종양 중심의 수. ***: P<0.001.
도 9. F-HSA는 생체내에서 MDA-MB-231 종양 세포 전이를 억제하였다. (A) F-HSA 치료된 또는 치료되지 않은 마우스로부터의 폐의 전체 외형 및 조직병리학적 실험. (B & C) F-HSA 치료된 또는 치료되지 않은 폐에서 관련된 폐 중량 및 종양 중심의 수. ***: P<0.001.
도 10. CaSki 세포에서의 세포 침입 및 세포독성에 대한 F-BSA의 효과. (A) 24시간 동안 F-BSA로 치료한 CaSki 세포의 세포 침입을 보이덴 챔버 검정으로 측정하였다. F-HSA는 종양 세포 침입을 유의적으로 억제하였다. (B) 24시간 동안 F-BSA로 치료한 CaSki 세포의 세포독성은 MTT 검정으로 측정하였다. 0.1μM 또는 0.2μM 농도에서의 F-HSA는 CaSki 세포의 세포 생존능에 대해 효과가 없었다. 데이터는 평균 ± S.D.(n = 3)를 나타낸다. *: P<0.05; **: P<0.01.
도 11. rVP1 치료된 종양 이식의 일정.
도 12는 20μM 아밀로이드-특이적인 염료 ThT와 1시간 동안 항온처리한 후 F-HSA, HSA, 및 Aβ(1-42)의 증가하는 농도의 형광성 수준의 비교를 나타내는 실험 데이터의 이행(implementation)이다.
도 13은 유방암 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 14는 유방암 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 15은 난소 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 16은 자궁경부암 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 17은 전립선 암 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 18은 전립선 암 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 시험 데이터의 이행이다.
도 19는 폐 암 세포에 대한 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 20a 내지 20h는 정상 세포의 생존능에 영향을 미치지 않으면서 종양 세포 이주 및 침입을 감소시키는데 있어서 F-HSA의 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 21a 내지 21c는 폐에 대한 마우스 유방 종양 TS/A 세포의 전이를 억제하는데 있어서 F-HSA의 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
도 22a 내지 22c는 폐에 대한 마우스 유방 종양 MDA-MB-231 세포의 전이를 억제하는데 있어서 F-HSA의 효과를 나타내는 실험 데이터의 이행이다.
정의
다음 설명에서, 세포 배양 분야에 통상적으로 사용된 다수의 용어들이 집중적으로 사용된다. 명세서 및 특허청구의 범위, 및 이러한 용어가 제공된 영역의 명확하고 지속적인 이해를 제공하기 위하여, 다음 정의들을 제공한다.
용어 "대상체", "개인" 및 '환자"는 치료에 대해 평가되고/되거나 치료중인 포유동물을 말한다. 하나의 실시형태에서, 포유동물은 사람이다. 따라서, 용어 "대상체", "개인", 및 "환자"는 암성 조직(예를 들면, 암성 결장직장 조직)을 제거하기 위한 절제(수술)를 겪거나 이를 위한 후보대상인 것들을 포함하는, 암(예를 들면, 결장직장암, 난소 또는 전립선의 선암종, 유방 암종 등)을 가진 개인을 포함한다. 대상체는 사람일 수 있지만, 또한 다른 포유동물, 특히 사람 질환을 위한 실험실 모델로서 유용한 포유동물, 예를 들면, 마우스, 래트 등이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 효과를 수득하기 위한 목적을 위한 과정(예를 들면, 방사선, 외과 수술 등)을 수행하거나 제제를 투여함을 말한다. 당해 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전하거나 부분적으로 예방하는 측면에서 예방학적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환의 증상을 위한 부분적이거나 완전한 치료를 달성하는 측면에서 치료학적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 사람에서 임의의 전이성 종양의 치료를 포함하고, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 이를 가진 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 질환의 증상(예를 들면, 원발성 질환과 관련되거나 이에 의해 유발될 수 있는 질환 포함)이 발생하는 것의 예방; (b) 질환의 억제, 즉, 이의 발달의 정지; 및 (c) 질환의 완화, 즉, 질환의 퇴행 유발을 포함한다. 종양(예를 들면, 암)의 치료에서, 치료제는 종양 세포의 전이를 직접 감소시킬 수 있다.
용어 "세포 배양" 또는 "배양"은 인공, 시험관내 환경에서 세포의 유지를 의미한다. 그러나, 당해 용어 "세포 배양"이 일반적인 용어이며 개개 세포뿐만 아니라, 또한 조직 또는 기관의 배양도 포함하도록 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양"은 악성 또는 양성과 상관없이 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다.
용어 "암", "신생물" 및 "종양"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 자가의, 조절되지 않은 성장을 나타냄으로써, 이들이 세포 증식에 걸쳐 대조군의 유의적인 손실로 특징화되는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포를 언급하기 위해 본원에 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 본원에서 검출, 분석, 분류 또는 치료를 위한 목적한 세포는 췌장(예를 들면, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및 비-전이성 세포를 포함한다. 암의 예로는 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 간세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇨관의 암, 갑상선 암, 신장암, 암종, 흑색종, 두부 및 경부암, 및 뇌암을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
암의 특성에 의존하여, 적절한 환자 시료가 수득된다. 본원에 사용된 바와 같은, 어절 "암성 조직 시료"는 암성 종양으로부터 수득된 임의의 세포를 말한다. 전이되지 않은 고형 종양의 경우에, 외과적으로 제거된 종양으로부터의 조직 시료를 통상적으로 수득하고 통상의 기술에 의한 시험을 위해 제조할 것이다. 달리는, 림프, 혈액 또는 혈청 시료와 같은 체액 시료, 또는 암성 기관 배출물(예: 유방으로부터의 배출물)과 같은 배출액 시료를 수집하여 분석할 시료로서 사용할 수 있다. 백혈병의 경우, 림프구 또는 백혈병 세포를 수득하고 적절히 제조할 것이다. 유사하게, 임의의 전이된 암의 경우에도, 세포를 림프액, 혈액, 혈청과 같은 체액 또는 말단 감염된 기관 또는 이의 배출물로부터 기원할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전이"는 원래의 암성 종양의 기관에 직접 연결되지 않는 기관 또는 신체 부분내 암성 종양의 성장을 말한다. 전이는 원래의 암성 종양의 기관에 직접 연결되지 않는 기관 또는 신체 부분에서 암성 세포의 검출 불가능한 양으로 존재하는, 미세전이를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 전이는 또한 원래의 종양 부위로부터 암 세포의 이탈, 및 암 세포의 신체의 다른 부위로의 이주 및/또는 침입과 같은 공정의 몇가지 단계로서 정의될 수 있다. 따라서, 본 발명은 원래의 암성 종양의 기관에 직접 연결되지 않은 기관 또는 신체 부분에서 하나 이상의 암성 종양의 추가의 성장 위험 및/또는 이러한 성장을 이끄는 공정의 임의의 단계를 측정하는 방법을 고려한다.
암의 "병리학"은 환자의 행복을 절충하는 모든 현상을 포함한다. 이는 비정상적인 또는 조절가능하지 않은 세포 성장, 전이, 이웃하는 세포의 정상적인 기능의 간섭, 비정상적 수준으로의 사이토킨 또는 다른 분비 생성물의 방출, 염증 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화, 신생물 형성, 전암성(premalignancy), 암성, 림프절 등과 같은 주변 또는 원위 조직 또는 기관의 침입을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "암 재발" 및 "종양 재발" 및 이의 문법적 변형은 암의 진단 후 신생물 또는 암성 세포의 추가의 성장을 말한다. 특히, 재발은, 추가의 암성 세포 성장이 암성 조직에서 발생하는 경우 일어날 수 있다. "종양 확산"은 유사하게, 종양의 세포가 국소 또는 원위 조직 및 기관내로 퍼지는 경우 발생하므로; 종양 확산은 종양 전이를 포함한다.
용어 "진단"은 본원에서 유방암, 전립선암 또는 다른 유형의 암의 분자 아형의 확인과 같은, 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태의 확인을 언급하기 위해 사용된다.
용어 "예후"는 본원에서 폐암, 결장암, 피부암 또는 식도암과 같은 신생물 질환의 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 포함하는 암에 기여될 수 있는 사망 또는 진행의 경향성의 예측을 언급하기 위해 사용된다. 용어 "예측"은 본원에서 관찰, 실험 또는 과학적 이유를 기초로 하여, 예언 또는 추정의 작용을 언급하기 위해 사용된다. 하나의 예에서, 의사는, 환자가 암 재발없이 특정 기간 동안 원발성 종양의 수술적 제거 및/또는 화학치료요법 후 생존할 가능성을 예측할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "무질환 생존"은 환자의 수명에 대한 암의 효과와 관련하여, 진단 후 이러한 종양 재발 및/또는 확산 및 환자의 운명의 부족을 말한다. 어구 "전체 생존"은, 환자에서 사망의 원인이 직접적으로 암의 효과로 인한 것이 아닐 가능성에도 불구하고, 진단 후 환자의 운명을 말한다. 어구 "무질환(질환이 없는) 생존의 경향성", "재발 위험" 및 이의 변형은 암의 진단 후 환자에서의 종양 재발 또는 확산 가능성을 말하며, 여기서, 가능성은 본 발명의 공정에 따라 측정된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상호관련되다" 또는 "와 상호관련되다" 및 유사 용어는 2개 현상의 예들 사이의 통계적 연합을 말하며, 여기서, 현상은 수, 데이터 세트 등을 포함한다. 예를 들어, 현상이 수를 포함하는 경우, 양성 상호관계(또한 본원에서 "직접적인 상호관계"로 언급된다)는 하나가 증가함에 따라, 다른 하나도 증가함을 의미한다. 음성 상호관계(또한 본원에서 "역 상호관계"로 언급된다)는, 하나가 증가하면, 다른 하나는 감소함을 의미한다.
용어 "분리된"은, 화합물이 천연적으로 이를 동반한 성분들 중 모두 또는 일부로부터 분리됨을 의미하도록 의도된다. "분리된"은 또한 제조(예를 들면, 화학적 합성, 재조합체 발현, 배양 배지 등) 동안 이를 동반한 성분들 중 모두 또는 일부로부터 분리된 화합물(예를 들면, 단백질)의 상태를 말한다.
"생물학적 시료"는 개인으로부터 수득된 각종 시료 유형을 포함한다. 당해 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 시료, 생검 표본 또는 조직 배양물, 또는 이로부터 기원한 세포 및 이의 후대세포와 같은 고형 조직 시료를 포함한다. 당해 정의는 또한 시약을 사용한 처리; 세척; 또는 암 세포와 같은 특정 세포 집단을 위한 농축과 같이 이들의 조달 후 임의의 방식으로 조작된 시료를 포함한다. 당해 정의는 또한 특정 유형의 분자, 예를 들면, 핵산, 폴리펩타이드 등이 농축된 시료를 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 임상 시료를 포함하며, 또한 외과 수술 절제로 수득된 조직, 생검에 의해 수득된 조직, 배양물 중의 세포, 세포 현탁액, 세포 용해물, 조직 시료, 기관, 골수, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함한다. "생물학적 시료"는 환자의 암 세포로부터 수득한 시료, 예를 들면, 환자의 암 세포로부터 수득된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 시료(예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 세포 용해물 또는 다른 세포 추출물); 및 환자로부터의 암 세포를 포함하는 시료를 포함한다. 환자로부터의 암 세포를 포함하는 생물학적 시료는 또한 비-암성 세포를 포함할 수 있다.
구체적인 실시형태의 설명
본 공개는 섬유상 단백질을 생산하는 공정 및 섬유상 단백질을 사용하여 치료하는 방법에 관한 것이다. 치료 방법은 암 전이의 억제를 포함한다.
치료 방법
암 전이를 억제하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당해 방법은 치료학적 유효량의 섬유상 구조 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함한다. 당해 방법은 또한 단백질을 제공하는 단계, 및 섬유상 단백질을 투여하기 전에 단백질을 섬유상 구조로 변화시키는 단계를 추가로 포함한다. 섬유상 단백질의 투여는 예를 들면, 주변 조직내로의 종양 세포 침입 및/또는 이주를 억제한다.
본 방법은 포유동물 대상체, 특히 사람에서 각종 암 치료요법(암 예방 및 진단 후 암 치료요법 포함)에서의 용도를 발견한다. 종양을 가지거나, 가진 것으로 예측되거나, 종양으로 발달할 위험성이 있는 대상체가 본원에 기술된 치료요법에 대해 고려된다.
본 방법에 따른 항암 치료요법은 특히 전이성이거나 전이성이 될 위험이 높은 암성 세포에 대해 지시될 수 있다. 이와 같이, 섬유상 단백질은 치료학적으로 사용되어 다른 조직내에서 암 세포의 부착 및 침입을 유효화/예방할 수 있다.
예를 들면, 본 기재내용의 방법에 의해 억제될 수 있는 암 전이는 선암종 및 특히 유방 암종, 전립선의 선암종 및 난소의 선암종을 포함하는 암종을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 치료될 수 있는 다른 전이는 신장, 폐, 간, 피부(예를 들면, 흑색종), 결장, 췌장 또는 자궁경부 내에서의 암성 성장으로부터 기원한 것들을 포함한다.
암을 치료하기 위해 사용된 섬유상 구조 단백질은 알부민, 피브로넥틴, rVP1, rVP2, rVP3, P1, 또는 VP1, VP2, VP3, 및/또는 VP4로부터의 일부를 포함하는 키메라 단백질일 수 있다. 알부민 단백질은 임의의 목적한 동물, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 등으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 섬유상 단백질은 Akt 시그널링 경로를 조절함으로써 암 세포 아폽토시스를 추가로 유도한다. 소정예에 있어서, 섬유상 단백질은 Akt의 탈활성화를 초래하는 인테그린 α5β1 또는 αvβ3을 조절한다. 다른 예에서, 섬유상 알부민은 인테그린에 결합하여 인테그린/FAK/Akt/GSK-3β/카스파제-3 경로를 통해 주로 세포의 아폽토시스를 유발한다.
위에서 주목한 바와 같이, 본 방법은 대상체(예를 들면, 사람 환자)에게 섬유상 단백질을 투여하여 예를 들면, 암성 세포의 침입 및 이주를 억제함을 포함한다. 이는 섬유상 단백질을 본원에 기술된 바와 같이 대상체에게 투여함으로써 섬유상 단백질이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 암의 전이를 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 본 방법에 따른 치료요법은 재발을 방지하고, 암 세포의 이주를 감소시키며, 종양 크기를 감소시키고, 종양 부하를 감소시키고/시키거나 환자에서 임상 결과를 개선시키는데 유용할 수 있다.
암의 유형
본원에 고려된 암과 관련된 방법은, 예를 들면, 항암 전이 치료요법으로서의 섬유상 단백질 치료요법의 사용을 포함한다. 당해 방법은 전이될 수 있는 암(예를 들면, 암종 및 육종)과 같은 광범위한 암을 치료하거나 예방하는 것과 관련하여 유용하다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료요법으로 교정될 수 있는 암종은 식도 암종, 간세포 암종, 기저 세포 암종(피부 암의 형태), 편평세포 암종(각종 조직), 방광 암종, 예를 들면, 이행 세포 암종(방광의 악성 신생물), 기관지원성 암종, 결장 암종, 결장직장 암종, 위 암종, 폐 암종, 예를 들면, 폐의 소 세포 암종 및 비-소세포 암종, 부신피질선암종, 갑상선 암종, 췌장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 골수 암종, 신장 세포 암종, 관상 암종 자체 또는 담즙관 암종, 융모막 암종, 고환종, 배아 암종, 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부 암종, 자궁 암종, 고환 암종, 골형성 암종, 상피 암종, 및 비인두 암종을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법에 의한 치료요법에 대해 교정될 수 있는 육종은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 골형성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종, 림프관내피모육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종, 중피종, 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 평활근육종, 횡문근육종, 및 다른 연조직 육종을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료요법에 대해 교정될 수 있는 다른 고형 종양은 신경교종, 성상 세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기신경교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 방법에 따른 치료에 대해 교정될 수 있는 다른 암은 비정형 수막종(뇌), 섬세포 암종(췌장), 속질암종(갑상선), 중간엽종(장), 간세포 암종(간), 간모세포종(간), 투명 세포 암종(신장), 및 종격 신경섬유종을 포함한다.
본원에 기재된 방법을 사용한 치료에 대해 교정될 수 있는 추가의 예시적인 암은 신경외엽성 및 내피 기원의 암을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 신경외엽성 기원의 암의 예로는 유윙 육종(Ewings sarcoma), 척추 종양, 뇌 종양, 유아기의 천막위 원시신경외배엽 종양(supratenbrial primative neuroectodermal tumor of infancy), 요세관낭종 암종(tubulocystic carcinoma), 점액 세관 및 방추상 세포 암종, 신장 종양, 종격 종양(mediastinum tumor), 신경교종, 신경모세포종, 및 청년기 및 청소년에서의 육종을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 상피 기원의 예는 소 세포 폐암, 유방, 접안 렌즈, 결장, 췌장, 신장, 간, 난소 및 기관지 상피의 암을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
다른 암 치료요법과의 조합
섬유상 단백질의 치료학적 투여는 면역치료요법, 화학치료제 및 수술(예를 들면, 하기에 추가로 기술된 것들)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 추가의 표준 항암 치료제와 함께 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 치료 요법 중 일부로서의 투여를 포함할 수 있다.
또한, 섬유상 단백질의 치료학적 투여는 또한 항암 치료요법을 받는 대상체의 치료학적 치료 후 수행될 수 있으며, 여기서, 항암 치료요법은 예를 들면, 수술, 방사선 치료요법, 화학치료제의 투여 등일 수 있다. 본 기재내용의 섬유상 단백질을 사용한 암 치료요법은 또한 면역치료요법과 함께 사용될 수 있다. 다른 예에서, 섬유상 단백질은 하나 이상의 화학치료제(예를 들면, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손(CHOP))와 병용, 및/또는 방사선 치료와 병용 및/또는 수술적 중재(예를 들면, 종양을 제거하기 위한 수술 전 또는 수술 후)와 병용 투여될 수 있다. 섬유상 단백질이 수술적 중재와 병용되는 경우, 섬유상 단백질은 암성 세포를 제거하기 위한 수술 전, 수술시, 또는 수술 후에 투여될 수 있으며, 외과 부위에 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 섬유상 단백질 단독 또는 위에서 기술된 조합은 전신적으로(예를 들면, 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내 경로) 또는 국소적으로(예를 들면, 국소 종양 부위에서, 예를 들면, 종양내 투여(예를 들면, 고형 종양내, 림프종 또는 백혈병에서 관련된 림프절내), 고형 종양에 공급하는 혈관내 투여 등)으로 투여될 수 있다.
광범위한 암 치료요법 중 어느 하나는 본원에 기술된 섬유상 단백질 치료요법과 병용될 수 있다. 이러한 암 치료요법은 수술(예를 들면, 암성 조직의 외과적 제거), 방사선 치료요법, 골수 이식, 화학치료요법적 치료, 생물학적 반응 개질제 치료, 및 앞서의 특정 조합을 포함한다.
방사선 치료요법은 빔(beam)과 같은 외부 적용된 공급원으로부터, 또는 소 방사활성 공급원의 이식에 의해 전달되는 X-선 또는 감마 선을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
화학치료제는 암 세포의 증식을 감소시키고 세포독성제 및 세포증식억제제를 포함하는 비-펩타이드성(즉, 비-단백질성) 화합물이다. 화학치료제의 비-제한적 예는 알킬화제, 니트로소우레아, 항대사물질, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 및 스테로이드 호르몬을 포함한다.
세포 증식을 감소시키기 위해 작용하는 제제는 당해 분야에 공지되어 있으며 광범위하게 사용되다. 이러한 제제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 및 트리아젠과 같은 알킬화제, 예를 들면, 메클로르에타민, 사이클로포스파미드(CYTOXANTM), 멜팔란(L-사르코라이신), 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 세무스틴(메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 우라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파미드, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 부설판, 다카르바진 및 테모졸로마이드를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
항대사물질제로는 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 및 아데노신 데아미나제 억제제가 포함되고, 시타라빈(CYTOSAR-U), 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실(5-FU), 플록스우리딘(FudR), 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린(6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트, 10-프로파르길-5,8-디데아자폴레이트(PDDF, CB3717), 5,8-디데아자테트라하이드로폴릭산(DDATHF), 류코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴 및 겜시타빈을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
적합한 천연 생성물 및 이들의 유도체(예를 들면, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포카인 및 에피포도필로톡신)은 Ara-C, 파클리탁셀(TAXOL®), 도세탁셀(TAXOTERE®), 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드, 예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 등; 포도필로톡신, 예를 들면, 에토포시드, 테니포시드 등; 항생제, 예를 들면, 안트라사이클린, 다우노루비신 하이드로클로라이드(다우노마이신, 루비도마이신, 세루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 모르폴리노 유도체 등; 페녹시존 비스사이클로펩타이드, 예를 들면, 닥티노마이신; 염기성 당펩타이드, 예를 들면, 블레오마이신; 안트라퀴논 글리코사이드, 예를 들면, 플리카마이신(미트라마이신); 안트라센디온, 예를 들면, 미토크산트론; 아지리노피롤로 인돌디온, 예를 들면, 미토마이신; 마크로사이클릭 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, FK-506(타크롤리무스, 프로그라프), 라파마이신 등; 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
다른 항-증식성 세포독성제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카펙시타빈, 렐록사핀, 사이클로포스파미드, 이포스아미드, 및 드롤록사핀이다.
항증식 활성을 갖는 미세관에 영향을 미치는 제제가 또한 사용하기에 적합하며 알로콜히친(NSC 406042), 할리콘드린 B(NSC 609395), 콜히친(NSC 757), 콜히친 유도체(예를 들면, NSC 33410), 돌스타틴 10(NSC 376128), 마이탄신(NSC 153858), 리족신(NSC 332598), 파클리탁셀(TAXOL®), TAXOL® 유도체, 도세탁셀(TAXOTERE®), 티오콜히친(NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 디스코데르몰리드를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 천연 및 합성 에포틸론; 에스트라무스틴, 노코다졸 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적합한 호르몬 조절인자 및 스테로이드(합성 유사체 포함)는 아드레노코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니손, 덱사메타손 등; 에스트로겐 및 프레게스틴, 예를 들면, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라디올, 클로미펜, 타목시펜 등; 및 아드레노코르티칼 억제제, 예를 들면, 아미노글루테티미드; 17α-에티닐에스트라디올; 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스톨락톤, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 하이드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤라이드, 플루타미드(드로게닐), 토레미펜(파레스톤), 및 ZOLADEX®을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 에스트로겐은 증식 및 분화를 자극하므로, 에스트로겐 수용체에 결합하는 화합물을 사용하여 당해 활성을 차단시킨다. 코르티코스테로이드는 T 세포 증식을 억제할 수 있다.
다른 화학치료제는 금속 복합체, 예를 들면, 시스플라틴(시스-DDP), 카르보플라틴 등; 우레아, 예를 들면, 하이드록시우레아; 및 하이드라진, 예를 들면, N-메틸하이드라진; 에피도필로톡신; 토포이소머라제 억제제; 프로카르바진; 미토크산트론; 류코보린; 테가푸르 등을 포함한다. 목적한 다른 항-증식제는 면역억제제, 예를 들면, 미코페놀산, 탈리도미드, 데스옥시스페르구알린, 아자스포린, 레플루노미드, 미조리빈, 아자스피란(SKF 105685); IRESSA®(ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-(3-(4-모르폴리닐)프로폭시)퀴나졸린 등을 포함한다.
"탁산"은 파클리탁셀, 및 특정의 활성 탁산 유도체 또는 전구-약물을 포함한다. "파클리탁셀"[이는 본원에서 예를 들면, 도세탁셀, TAXOL, TAXOTERE(도세탁셀의 제형), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카보닐 유사체 등의 유사체, 제형 및 유도체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다]은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
파클리탁셀은 파클리탁셀의 일반적인 화학적으로 이용가능한 형태 뿐만 아니라 유사체 및 유도체(예를 들면, 위에서 주목한 바와 같은 TAXOTERETM 도세탁셀) 및 파클리탁셀 접합체(예를 들면, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-크실로즈)도 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
본 기재내용의 방법에 따른 일부 개인의 치료시, 비-악성 세포에 대한 구조제(rescue agent)와 병용하여 고 용량 요법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 치료에서, 비-악성 세포의 구조가 가능한 임의의 제제, 예를 들면, 시트로보룸 인자, 폴레이트 유도체 또는 류코보린을 사용할 수 있다. 이러한 구조제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 구조제는 세포 기능을 조절하는 본 발명의 화합물의 능력을 방해하지 않는 것들을 포함한다.
섬유상 단백질의 투여
섬유상 단백질의 투여는 종양내, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들면, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막, 복강내, 동맥내, 및 직장 투여를 포함하는, 신체의 상이한 부위에 각종 방법을 통해 달성할 수 있다. 다른 적합한 경로는 조성의 경구적, 볼내, 비강내, 비강인두, 비경구, 장내, 위장, 국소, 경피, 피하, 근육내로 정제, 고체, 산제, 액체, 에어로졸 형태로, 종양내로의 병변내 주사, 종양에 인접한 병변내 주사, 정맥내 주입, 및 동맥내 주입에 의한 투여를 포함한다. 투여는 첨가된 부형제의 존재 또는 부재하에서 국소적으로 또는 전신적으로 수행할 수 있다. 투여는 또한 대상체의 종양 부위에서 또는 주변에서 서방 방식을 통해 수행할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는, 본 기재내용의 제형을 이를 필요로 하는 대상체 또는 숙주, 예를 들면, 환자에게 투여하는 각종의 적합한 방법이 이용가능하며, 비록 하나 이상의 경로를 사용하여 특정 제형을 투여할 수 있다고 해도, 특정 경로는 다른 경로보다 더 즉각적으로 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인식할 것이다.
어구 "치료학적 유효량"은 어떠한 의학적 치료에도 적용가능한 충분한 이익/위험 비에서 일부 바람직한 효과를 생산하는 양을 말한다. 유효량은 치료하는 질환 또는 상태, 투여되는 특정 표적화된 작제물, 대상체의 크기, 또는 질환 또는 상태의 중증도와 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자는 과도한 실험의 요구없이 특정 화합물의 유효량을 실험적으로 결정할 수 있다.
예시적인 실행에 따라서, 단백질은 하기 보다 상세히 기술된 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 조성물은 산제, 크림제, 겔제, 살브(salve), 연고제, 액제, 정제, 캅셀제, 분무제 및 패치를 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 비히클 및 담체는 환자에게 조성물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 담체는 가용화제, 희석제 및 분산 매질을 포함한다. 이들 담체는 생적합성이고, 약제학적으로 허용되며, 섬유상 단백질의 치료 특성을 변경시키지 않는다. 부형제, 보조제 및 다른 성분들도 또한 조성물 중에 포함될 수 있다.
용량
방법들에서, 섬유상 단백질의 유효량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 특히, 특수 목적의 섬유상 단백질은, 섬유상 단백질이 유효량으로 투여되는 경우 숙주내에서 암의 전이를 억제하는 것들이다. 투여된 양은 투여 목적, 치료하는 개인의 건강 및 신체적 상태, 치료될 개인(예를 들면, 사람, 비-사람 영장류, 영장류 등)의 연령, 분류학적 그룹, 바람직한 해결법, 섬유상 단백질 조성물의 제형, 의학적 상황의 치료하는 임상의의 평가, 및 다른 관련 인자에 따라 변한다. 당해 양은 통상의 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위내에 속할 것으로 예측된다. 예를 들면, 암 전이를 억제하기 위해 사용된 섬유상 단백질의 양은 한편 대상체에게 비가역적으로 독성일 수 있는 대략적인 양(즉, 최대 내성 용량) 이하이다. 다른 경우에, 당해 양은 독성 한계(threshold) 주변 또는 심지어 충분히 미만이지만, 여전히 면역유효 농도 범위내이거나 심지어 한계 용량 만큼 낮다.
개개 용량은 통상적으로 대상체에서 측정가능한 효과를 생산하는데 요구되는 양 이상이며, 이의 부산물의 섬유상 단백질의 흡수, 분포, 대사 및 배출("ADME")에 대한 약동학 및 약력학을 기준으로, 및 따라서 대상체내에서 조성물의 배치를 기준으로 측정할 수 있다. 이는 국소(작용이 주로 국소 효과를 위해 요구되는 경우 직접 적용됨), 장(소화관의 일부에 유지되는 경우 전신적 또는 국소 효과를 위한 소화관을 통해 적용됨), 또는 비경구(전신적 또는 국소 효과를 위한 소화관 이외의 경로에 의해 적용됨) 적용을 위해 조절될 수 있는 투여 경로, 및 용량의 고려를 포함한다. 예를 들면, 섬유상 단백질의 투여는 통상적으로 주사, 및 흔히 정맥내, 근육내, 종양내, 또는 이의 조합을 통한다.
섬유상 단백질은 주입 또는 국소 주사에 의해, 예를 들면, 약 50 mg/h 내지 약 400 mg/h, 예를 들면, 약 75 mg/h 내지 약 375 mg/h, 약 100 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 150 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 200 mg/h 내지 약 300 mg/h, 약 225 mg/h 내지 약 275　mg/h의 속도로의 주입에 의해 투여될 수 있다. 예시적인 주입 속도는 예를 들면, 약 0.5　mg/m2/일 내지 약 10 mg/m2/일, 예를 들면, 약 1　mg/m2/일 내지 약 9 mg/m2/일, 약 2　mg/m2/일 내지 약 8 mg/m2/일, 약 3　mg/m2/일 내지 약 7 mg/m2/일, 약 4　mg/m2/일 내지 약 6 mg/m2/일, 약 4.5　mg/m2/일 내지 약 5.5 mg/m2/일의 바람직한 치료학적 용량을 달성할 수 있다. 투여(예를 들면, 주입에 의한 투여)는 목적하는 기간에 걸쳐 반복될 수 있는데, 예를 들면, 약 1일 내지 약 5일 또는 매 수일, 예를 들면, 약 5일에 1회씩, 약 1개월, 약 2개월에 걸쳐 1회 등의 기간에 걸쳐 반복될 수 있다. 이는 또한 암성 세포를 제거하기 위한 외과적 중재와 같은, 다른 치료학적 중재 전, 중재시, 또는 중재 후 투여될 수 있다. 섬유상 단백질은 또한 조합 치료요법의 일부로서 투여될 수 있으며, 여기서, 면역치료요법, 암 화학치료요법 또는 방사선 치료요법 중 적어도 하나를 대상체에게 투여한다(하기에 보다 상세히 기술됨).
대상체내에서 섬유상 단백질의 배치 및 이의 상응하는 생물학적 활성은 전형적으로 목적한 표적에 존재하는 섬유상 단백질의 분획에 대해 판단된다. 예를 들어, 1회 투여된 섬유상 단백질은 암 세포 및 암성 조직 내의 물질을 농축시키는 다른 생물학적 표적 또는 당접합체와 함께 축적시킬 수 있다. 따라서, 섬유상 단백질이 투여되어 시간에 걸쳐 목적한 표적내에서 축적되도록 하는 투약 요법은 보다 낮은 개별 용량을 허용하는 전략 중 일부일 수 있다. 이는 또한 예를 들면, 생체내에서 보다 서서히 청소되는 섬유상 단백질의 용량이 시험관내 검정으로부터 계산된 유효 농도(예를 들면, 시험관내 유효량은 생체내에서 mM 미만 농도에 대한 mM 농도에 가깝다)에 비해 낮을 수 있다.
예로서, 용량 또는 투약 요법의 유효량은 세포 이주를 억제하기 위해 제공된 섬유상 단백질의 IC50으로부터 판단될 수 있다. "IC50"은 시험관내에서 50% 억제에 요구되는 약물의 농도를 의도한다. 또한, 유효량은 제공된 섬유상 단백질 농도의 EC50으로부터 판단될 수 있다. "EC50"은 생체내에서의 최대 효과의 50%를 수득하는데 요구되는 혈장 농도로 의도된다. 관련 실시형태에서, 용량은 또한 ED50(유효 용량)을 기준으로 측정될 수 있다.
일반적으로, 본 기재내용의 섬유상 단백질과 관련하여, 유효량은 일반적으로 계산된 IC50의 200X 이하이다. 전형적으로, 투여되는 섬유상 단백질의 양은 계산된 IC50의 약 200X 미만, 약 150X 미만, 약 100X 미만이고, 많은 실시형태에서 약 75X 미만, 약 60X, 50X, 45X, 40X, 35X, 30X, 25X, 20X, 15X, 10X 미만 및 심지어 약 8X 또는 2X 미만이다. 하나의 실시형태에서, 유효량은 계산된 IC50의 약 1X 내지 50X이고, 때때로 계산된 IC50의 약 2X 내지 40X, 약 3X 내지 30X 또는 약 4X 내지 20X이다. 다른 실시형태에서, 유효량은 계산된 IC50와 동일하며, 특정 실시형태에서 유효량은 계산된 IC50 초과인 양이다.
유효량은 계산된 EC50의 100X 이하일 수 있다. 예를 들면, 투여되는 섬유상 단백질의 양은 계산된 EC50 보다 약 100X 미만, 약 50X 미만, 약 40X, 35X, 30X, 또는 25X 미만이고, 많은 실시형태에서, 계산된 EC50의 약 20X 미만, 약 15X 미만 및 심지어 약 10X, 9X, 9X, 7X, 6X, 5X, 4X, 3X, 2X 또는 1X 미만이다. 유효량은 계산된 EC50의 약 1X 내지 30X 및 때때로 계산된 EC50의 약 1X 내지 20X, 또는 약 1X 내지 10X일 수 있다. 유효량은 또한 계산된 EC50과 동일할 수 있거나 계산된 EC50 이상일 수 있다. IC50은 시험관내에서의 세포 이주/침입을 억제함으로써 계산될 수 있다. 공정은 당해 분야에 공지된 방법들 또는 하기 실시예에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
용량 및/또는 투약 요법의 유효량은 검정, 안전성 및 단계적 확대 및 용량 범위 시도, 개별적 임상의-환자 관계, 및 본원에 기술되고, 하기 실시예 단락에서 나열된 것들과 같은 시험관내 및 생체내 검정으로부터 실험적으로 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면, 마우스에서 대상 방법을 수행하기 위해 사용된 농도는 마우스의 체중을 기준으로 하여, 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg의 범위이다. 당해 데이터를 기준으로 하여, 사람에서 사용될 수 있는 섬유상 단백질의 농도의 예는 약 0.083 mg/kg 내지 약 2.08 mg/kg의 범위일 수 있다. 다른 용량은 당해 분야에 공지된 방법[참조: Reagan-Shaw et al. (2007) The FASEB Journal 22:659-661]을 이용하여 동물 모델을 사용한 실험으로부터 측정될 수 있다.
약제학적 제형
또한, 상기 기재된 치료 방법에 사용된 섬유상 단백질을 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 용어 "섬유상 단백질 조성물"은 본원에서, 본 기재내용의 섬유상 단백질을 포함하는 조성물, 접합된 섬유상 단백질을 포함하는 조성물 또는 모두를 일반적으로 언급하기 위한 편의성 이유로 본원에서 사용된다. 암 세포의 성장 및/또는 전이를 억제하는데 유용한 조성물은 하기 기술되어 있다.
예를 들면, 약제학적으로 허용되는 염의 형태인, 섬유상 단백질 조성물은 위에서 기술한 바와 같이, 경구, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들면, 섬유상 단백질이 주사가능한(이들이 정맥내 또는 조직내로 직접 투여되는 경우의 실시형태에서와 같이) 액체로 투여되는 경우, 섬유상 단백질 제형은 사용할 준비가 된 용량형, 또는 재구성가능한 저장-안정성 분말 또는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 액체로 제공된다.
대상체(예를 들면, 사람 대상체)에게 투여하기에 적합한 섬유상 단백질을 생산하는 방법은 하기 기술되어 있으며, 또한, 이의 기재내용이 참조로 인용된 미국 특허 공보 제2008/0300186호에 기술되어 있다. 섬유상 단백질을 제형화하는 방법의 예는 유효량의 섬유상 단백질 및 약제학적 부형제(예를 들면, 염수)를 함유하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 임의로 다른 첨가제(예를 들면, 완충제, 안정화제, 방부제 등)를 포함할 수 있다. 섬유상 단백질의 유효량은 암 전이(예를 들면, 암 이주 및/또는 침입)를 감소시키기 위해 제공하는 유효량일 수 있다. 치료학적 목적(예를 들면, 종양 부하에 있어서의 감소 및/또는 암 성장의 제한)은 변화하는 용량 요법 하에서 단일 또는 다중 용량으로 달성할 수 있다.
약제학적 제형 중 섬유상 단백질의 농도는 약 0.1 중량% 미만, 일반적으로 약 2 중량%에서 또는 약 2중량% 이상 내지 20 중량% 내지 50 중량%에서 변할 수 있으며, 선택된 특수한 투여 양식 및 환자의 요구도에 따라서 유액 용적, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다. 수득되는 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 겔제, 크림제, 로션제, 연고제, 에어로졸 등의 형태일 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되거나 명백할 것이며 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., Mack Publishing Company, NY (1995)]과 같은 출판물에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 기재내용의 다른 양상에 따라서, 섬유상 HSA가 본 기재내용의 판독시 당해 분야의 숙련가가 확인할 수 있는 추가의 활성제, 담체, 비히클, 부형제 또는 보조제와 함께 약제학적 또는 영양학적 조성물 중에 포함될 수 있다.
약제학적 또는 영양학적 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 약제학적 조성물에서, 섬유상 HSA 또는 섬유상 HSA 등량체는 "활성제"로서도 언급되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 혼용성인 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충적 활성 화합물을 또한 조성물내로 혼입시킬 수 있다. 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 혼용성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들면, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용된 용액 또는 현탁액은 다음 성분들을 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제를 포함한다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알(vial) 중에 봉입시킬 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 산제를 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수, Cremophor® EL[제조원: 바스프(BASF), Parsippany, N.J. 소재], 또는 인산염 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야만 하며 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유액이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정성이어야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복제의 사용, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 각종 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 실시형태들에 따라서, 조성물 중 등장성 제제, 예를 들면, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가알코올, 또는 염화나트륨을 첨가한다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 적절한 용매 중에 필요에 따라 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 조합물과 함께 혼입시킨 후 여과된 멸균으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질과 위에 열거한 것들로부터의 요구된 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클내로 혼입시킴에 의해 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제제는 활성 성분의 분말과 이의 사전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분을 생성하는 진공 건조 또는 동결-건조에 의해 제조된다.
경구 투여하는 경우, 섬유상 단백질은 소화로부터 보호되어야 함이 인식된다. 이는 전형적으로 섬유상 단백질을 조성물과 착화(complexing)시켜 이것이 산성 및 효소적 가수분해에 대해 내성이 되도록 하거나 리포솜과 같은 적절하게 내성인 담체 중에 패키징시킴으로써 달성한다. 소화로부터 목적한 화합물을 보호하는 수단은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용가능한 담체를 포함한다. 경구 치료학적 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있으며, 정제, 트로키제 또는 캅셀제, 예를 들면, 젤라틴 캅셀제의 형태로 사용된다. 경구 조성물은 또한 구강세척제로 사용하기 위한 유액 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 혼용성인 결합제, 또는 보조제 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은 다음 성분들 중 어느 것 또는 유사한 특성의 화합물: 미세결정성 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활주제; 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 딸기, 체리, 포도, 레몬 또는 오렌지 향과 같은 풍미제를 함유할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 이산화탄소와 같은 가스 또는 분무기를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터의 에어로졸 분무의 형태로 전달된다.
혈청 반감기를 향상시키기 위하여, 주사되는 섬유상 단백질 제제는 또한 봉입될 수 있거나, 리포솜의 관광(lumen)내로 도입될 수 있거나, 콜로이드로서 제조되거나, 페길화되거나(PEGylate)[참조: Greenwald et al. (2003) Advanced Drug Delivery Rev. 55:217-250; Pasut et al. (2004) Expert Opin. Ther. Patents 14:859-894] 또는 연장된 혈청 반감기를 제공하는 다른 통상 기술을 사용할 수 있다. 각종 방법이 문헌[참조: 예를 들면, Szoka et al. (1980) Ann . Rev . Biophys . Bioeng . 9:467, 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호]에 기술된 바와 같은 리포솜을 제조하기 위해 이용가능하다. 제제는 또한 혼합물 또는 일련의 양식으로서 섬유상 단백질 조성물의 방출 및 투여를 위한 조절된 방출 또는 서방출 형태로 제공될 수 있다.
실시형태들에 따라서, 유리체내 주사는 PLGA-계 미세입자 또는 나노입자(리포솜)을 사용하여 달성한다. PEG-계 제형도 사용할 수 있다. 따라서, 주사가능한 약제학적 조성물에 대한 다른 방법이 유리체내 주사를 위해 특별히 고려된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 적절한 침투제를 제형에 사용한다. 이러한 침투제는 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여의 경우, 세제, 담즘 염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고제, 살브제, 겔제 또는 크림제로 제형화된다. 화합물은 또한 좌제(예를 들면, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌제 기재) 또는 직장 전달용 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.
다른 형태의 전달 외에, 화합물은 점안제 또는 안구내 주사를 통해 전달가능하다. 점안제와 관련하여, 본 기재내용의 조성물은 임의로 눈 또는 코에 국소 적용을 위해 의도된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 국소 적용을 위해 의도된 약제학적 조성물에 일반적으로 사용된 부형제, 예를 들어, 용액 또는 분무액은 등장화제, 방부제, 킬레이트제, 완충제, 계면활성제 및 항산화제를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 적합한 등장성-조절제로는 만니톨, 염화나트륨, 글리세린, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 방부제로는 p-하이드록시벤조산 에스테르, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조도데시늄 브로마이드, 폴리쿼터늄-1 등이 포함된다. 적합한 킬레이트제는 나트륨 에데테이트 등이 포함된다. 적합한 완충제로는 포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 아세테이트 등이 포함된다. 적합한 계면활성제로는 이온성 및 비이온성 계면활성제가 포함되나, 폴리소르베이트, 폴리에톡실화된 카스터 오일 유도체 및 옥시에틸화된 3급 옥틸페놀 포름알데하이드 중합체(틸록사폴)과 같은 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 적합한 항산화제로는 설파이트, 아스코르베이트, BHA 및 BHT가 포함된다. 본 기재내용의 조성물은 임의로 추가의 활성제를 포함한다. 임의의 방부성 성분(예를 들면, 폴리쿼터늄-1)을 제외하고, 본 기재내용의 조성물은 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리스티렌 설폰산 이외에 어떠한 중합체성 성분도 함유하지 않는다.
본 기재내용의 조성물이 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 경우, 폴리비닐피롤리돈 성분은 바람직하게는 과산화물 함량을 최소화하도록 선택되거나 가공된다. 새로이 생산된 폴리비닐피롤리돈의 뱃치(batch)가 노화된 뱃치보다 바람직하다. 또한, 구체적으로 조성물이 0.5% 이상의 폴리비닐피롤리돈을 함유할 경우, 폴리비닐피롤리돈 성분내 과산화물의 양을 감소시키고 올로파타딘의 화학적 안정성에 있어서 과산화물의 효과를 최소화시키기 위해 폴리비닐피롤리돈 성분은 올로파타딘과 혼합 전에 열적으로 처리(즉, 실온 초과의 온도로 가열시킴)하여하 한다. 연장된 기간 동안 폴리비닐피롤리돈의 수용액을 열적으로 처리하는 것이 실질적으로 과산화물의 양을 감소시킬 것이라고 해도, 이는 폴리비닐피롤리돈 용액의 변색(황색 내지 황갈색)을 초래할 수 있다. 폴리비닐피롤리돈 용액의 변색없이 과산화물을 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위하여, 폴리비닐피롤리돈의 수용액의 pH를 열에 적용시키기 전에 pH 11 내지 13으로 조절해야만 한다. 폴리비닐피롤리돈 용액의 pH가 상승하는 경우 과산화물 수준에 있어서 유의적인 감소를 달성하기 위해 훨씬 더 짧은 가열 시간이 요구된다.
폴리비닐피롤리돈 성분을 열적으로 처리하는 한가지 적합한 방법은 다음과 같다. 첫째로, 폴리비닐피롤리돈 성분을 정제수에 용해하여 4 내지 6% 용액을 제조한 후, 당해 용액의 pH를 pH 11 내지 13(pH의 유효 범위는 11 내지 11.5이다)으로 상승시킨 후, 60 내지 121℃, 바람직하게는 65 내지 80℃ 및 가장 바람직하게는 70 내지 75℃의 범위의 온도로 가열한다. 승온은 대략 30 내지 120분(바람직하게는 30분) 동안 유지하여야 한다. 가열된 용액이 실온으로 냉각된 후, HCl을 첨가하여 올로파타딘 조성물의 경우 표적 pH에 따라 pH를 3.5 내지 8로 조절한다.
특히 점안제로 투여되도록 의도된 조성물의 경우, 조성물은 바람직하게는 등장성-조절제를 최종 조성물이 안과적으로 허용되는 삼투압(일반적으로 150-450 mOsm, 바람직하게는 250-350 mOsm)을 갖도록 하기에 충분한 양의 등장성-조절제를 함유한다. 본 기재내용의 안과 조성물은, 바람직하게는 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 pH가 6.5-7.5, 및 가장 바람직하게는 pH가 6.8 내지 7.2이다.
본 기재내용의 점안제 조성물은 바람직하게는 불투명 플라스틱 용기 중에 패키징된다. 안과용 제품을 위한 바람직한 용기는 감마-조사 대신 에틸렌 옥사이드를 사용하여 멸균시킨 저밀도 폴리에틸렌 용기이다.
안과 주사가능성과 관련하여, 본 기재내용의 약제학적 조성물은 결막하 투여에 의해 치료가 요구되는 부위에 투여된다. 눈에 대한 결막하 투여의 한가지 바람직한 방법은 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 주사가능한 제형에 의한다. 결막하 투여의 다른 바람직한 방법은 서방성 조성물을 포함하는 이식에 의한다.
결막하로 전달되는 조성물은 실시형태들에 따라서, 결막하 투여용의 활성제를 포함하는 안과용 데포(depot) 제형을 포함한다. 실시형태들에 따라서, 안과용 데포 제형은 필수적으로 순수한 활성제의 미세입자를 포함한다. 미세입자는 생적합성의 약제학적으로 허용되는 중합체 또는 지질 봉입제 중에 봉매시킬 수 있다. 데포 제형은 연강된 기간에 걸쳐 실질적으로 모든 활성 물질을 방출하도록 조절될 수 있다. 중합체 또는 지질 매트릭스는, 존재하는 경우 모든 또는 실질적으로 모든 활성제의 방출 후 투여 부위로부터 수송되기에 충분한 등급으로 조절될 수 있다. 데포 제형은 약제학적으로 허용되는 중합체 및 용해되거나 분산된 활성제를 포함하는 액체 제형일 수 있다. 주사시, 중합체는 예를 들면, 겔화 또는 침전에 의해 주사 부위에서 데포를 형성한다.
눈에 이식하기 적합한 고체 물품은 또한 중합체를 포함하는 양식으로 설계될 수 있으며 생침식성(bioerodible)화되거나 비-생침식성화될 수 있다. 본 기재내용의 조성물을 수반하는 눈 이식체의 제조시 사용될 수 있는 생침식성화된 중합체는 폴리(글리콜라이드), 폴리(락타이드), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(하이드록시부티레이트) 및 폴리(하이드록시발러레이트)의 중합체 및 공중합체, 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르, 다가무수물, 지방족 폴리카보네이트 및 폴리에테르 락톤을 포함하나, 이들에 제한되지 않는다. 적합한 비-생침식성 중합체의 예는 실리콘 탄성중합체이다.
실시형태들에 따라서, 활성 화합물은 이식체 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제형과 같이, 신체로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해가능한, 생적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 물질들은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액(세포-특이적인 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용한 감염된 세포에 대해 표적화된 리포솜 포함)을 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용할 수 있다.
섬유상 단백질 조성물은 단일 약제학적 제형으로서 투여될 수 있다. 이는 또한 다른 적합한 화합물 및 담체를 포함하는 유효량의 다른 제제와 함께 투여될 수 있으며, 또한 다른 활성제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 기재내용은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 부형제는 예를 들면, 임의의 적합한 비히클, 보조제, 담체 또는 희석제를 포함하며, 공공에게 용이하게 이용가능하다. 본 기재내용의 약제학적 조성물은 또한 당해 분야에 잘 공지된 다른 활성제를 추가로 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 또한 당해 분야의 숙련가들에게 잘 공지되어 있으며, 용이하게 이용가능하다.
예를 들면, 섬유상 단백질 조성물은 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제(즉, 비히클)와 혼합되어 수용액, 정제, 캅셀제, 엘릭서르제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제(wafer). 패치제 등의 형태로 사용되나, 일반적으로 섬유상 단백질은 주사가능하게 제공될 것이다. 약제학적 조성물은 일반적인 담체 및 부형제, 예를 들면, 옥수수 전분 또는 젤라틴, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 미세결정성 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 인산이칼슘, 염화나트륨 및 알긴산을 함유할 수 있다. 제형 중에 일반적으로 사용된 붕해제는 크로스카멜로스, 미세결정성 셀룰로스, 옥수수 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 알긴산을 포함한다. 방부제 등을 또한 포함시킬 수 있다. 이들 성분들 각각은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 약제학적 조성물은 특정 실시형태에서, 약 0.1 내지 약 90중량%의 활성 성분, 및 보다 일반적으로 약 1 내지 약 30중량%의 활성 성분을 함유한다. 예를 들면, 이의 기재내용이 본원에서 참조로 인용된 미국 특허 제5,985,310호를 참조한다.
섬유상 단백질 조성물은 수용액, 흔히 염수 용액일 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 제공될 수 있거나, 이들은 분말 형태로 제공될 수 있다. 섬유상 단백질 조성물은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탤컴, 셀룰로스, 글루코즈, 슈크로스, 마그네슘, 카보네이트 등과 같은 다른 성분들을 함유할 수 있다. 조성물은 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들면, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등과 같이 적절한 생리학적 상태에 요구되는 것으로서 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다.
부형제의 선택은 부분적으로 특수 화합물에 의해, 및 조성물을 투여하기 위해 사용된 특수 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 기재내용의 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 다음 방법 및 부형제는 단지 예이며 이들에 제한되는 것이 아니다.
액체 조성물은 일반적으로 적합한 액체 담체(들), 예를 들면, 에탄올, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비수성용매, 오일 또는 물 중에 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 염의 현탁액 또는 용액과 현탁화제, 방부제, 계면활성제, 습윤제, 풍미제 또는 착색제로 구성될 것이다. 또한, 액체 제형은 재구성가능한 분말로부터 제조될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항-산화제, 완충제, 세균정지제, 및 제형이 의도된 수용체의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉된 용기, 예를 들면, 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 사용 직전 주사하기 위한 멸균 액체 부형제, 예를 들면, 물의 첨가만이 요구되는, 냉동-건조된(동결건조된) 조건에서 저장할 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기술한 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다.
비경구 제공되는 경우 활성인 본 기재내용의 섬유상 단백질 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 근육내, 경막내 또는 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 근육내 또는 경막내 투여용의 대표적인 조성물은 오일, 예를 들면, 아라키스 오일 또는 참깨 오일 중의 활성 성분의 현탁액 또는 용액일 것이다. 정맥내 또는 경막내 투여용의 대표적인 조성물은 예를 들면, 활성 성분 및 덱스트로스 또는 염화나트륨을 함유하는 멸균 등장성 수용액, 또는 덱스트로스와 염화나트륨의 혼합물일 것이다. 다른 예는 락테이트화된 링거 주사액(Ringer's injection), 락테이트화된 링거 및 덱스트로스 주사액, 노르모솔-M 및 덱스트로스, 이솔라이트(Isolyte) E, 아실화된 링거 주사액 등이다. 임의로, 공-용매, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 킬레이트제, 예를 들면, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 및 항-산화제, 예를 들면, 나트륨 메타비설파이트가 제형 중에 포함될 수 있다. 또한, 용액은 동결 건조된 후 투여 직전에 적합한 용매와 함께 재구성될 수 있다.
직장 투여시 활성인 본 기재내용의 섬유상 단백질 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 좌제로서 제형화될 수 있다. 대표적인 좌제 제형은 일반적으로 활성 성분과 결합제 및/또는 윤활제, 예를 들면, 젤라틴 또는 코코아 버터 또는 다른 저 융점 식물성 또는 합성 왁스 또는 지방으로 이루어질 것이다.
국소 투여시 활성인 본 기재내용의 섬유상 단백질 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 경피 조성물 또는 경피 전달 장치("패치")로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들면, 배킹(backing), 활성 화합물 저장기(reservoir), 조절 막, 라이너(liner) 및 접촉 부착제를 포함한다. 이러한 경피 패치제는 조절된 양의 본 기재내용의 화합물의 연속적이거나 불연속적인 주입을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 약제학적 제제를 전달하기 위한 경치 패치의 작제 및 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 미국 특허 제5,023,252호를 참조한다. 이러한 패치제는 약제학적 제제의 연속, 박동, 또는 요구된 전달시 작제될 수 있다.
본 기재내용의 제형은 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형으로 제조될 수 있다. 이들 에어로졸 제형은 가압된 허용되는 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 위치할 수 있다. 이들은 또한 분무기(nebulizer 또는 atomizer)에서 사용하기 위한 것과 같은 비-가압된 제제용 약제로서 제형화될 수 있다.
국소 투여에 적합한 제형은 활성 성분 외에, 당해 분야에서 적절한 것으로 공지된 담체를 함유하는 크림제, 겔제, 페이스트제 또는 발포제로 제공될 수 있다.
좌제 제형은 또한 유화 기재(emulsifying base) 또는 수용성 기재와 같은 각종 기재와 혼합시킴에 의해 제공된다. 질 투여용에 적합한 제형은 페서리제, 탐폰제, 크림제, 겔제, 페이스트제, 발포제로 제공될 수 있다.
각각의 용량 단위, 예를 들면, 티스푼 양의, 테이블 스푼 양의, 정제 또는 좌제가 하나 이상의 섬유상 단백질을 함유하는 예정된 양의 조성물을 함유하는 경구 또는 직장 투여용 단위 용량형, 예를 들어, 시럽제, 엘릭서르제 및 현탁제가 제공될 수 있다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여용 단위 용량형은 멸균수, 정상 염수 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체 중에 용액으로서 조성물 중에 섬유상 단백질(들)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "단위 용량형"은 사람 및 동물 대상체용 단일 용량으로 적합한 생리학적으로 별개의 단위를 말하며, 각각의 단위는 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 바람직한 효과를 생산하기에 충분한 양으로 계산된 본 기재내용의 예정된 양의 화합물을 함유한다. 본 기재내용의 신규한 단위 용량형에 대한 상세는 사용된 특수 화합물 및 달성될 효과, 및 숙주내에서 각각의 화합물과 연합된 약력학제에 의존한다.
당해 분야의 숙련가는, 용량 수준이 특수 섬유상 단백질의 기능, 전달 비히클의 특성 등의 함수로서 변할 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 제공된 화합물에 대한 적합한 용량은 다양한 수단에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
이러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해, 예를 들면, LD50(집단의 50%에 대해 치사인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 대해 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위해 측정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이며 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료학적 지수를 나타낸 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타낸 화합물이 사용될 수 있다고 해도, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위하여, 영향받은 조직의 부위에 이러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 설계하기 위해 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 순환하는 농도 범위내에 있다. 용량은 사용된 용량형 및 이용된 투여 경로에 따라 당해 범위내에서 변할 수 있다. 기재내용의 방법에서 사용된 특정 화합물의 경우, 치료학적 유효 용량을 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정할 수 있다. 용량은 세포 배양에서 측정되는 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 1/2을 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환하는 혈장 농도를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에서 유용한 용량을 보다 정밀하게 측정할 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들면, 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
용어 "유효량"은, 본 발명의 방식으로 사용된 경우 합리적인 이익/위험 비와 어울리는 과도한 부작용 효과(예: 독성, 자극 및 알레르기 반응)없이 검출가능한 치료학적 효과를 나타내기에 충분한 생물학적으로 활성인 분자 또는 이의 접합체 또는 유도체의 양을 말한다. 치료학적 효과는 예를 들면, 암 세포에 실질적으로 세포독성이지만 천연 세포에 대해 거의 세포독성이 아닌 것들을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 대상체의 유효량은 대상체의 유형, 대상체의 크기 및 건강, 치료될 상태의 특성 및 중증도, 투여 방법, 치료 기간, 현채 치료요법의 특성(존재하는 경우), 사용된 특수 제형 등에 의존할 것이다. 따라서, 먼저 정확한 유효량을 규정하는 것은 불가능하다. 그러나, 제공된 상황에 대한 유효량은 당해 분야의 통상의 기술자가 본원에서 제공된 정보를 바탕으로 한 통상의 실험을 이용함으로써 결정할 수 있다.
섬유상 단백질의 제조 방법
본 기재내용에 따라서, 섬유상 단백질을 투여함으로써 암 전이를 치료하기 위한 방법이 기재되어 있다. 섬유상 단백질은 천연적으로 존재하며, 이와 같이 상술한 치료 방법에서 사용하기 위해 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 섬유상 단백질은 또한 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 구상 단백질 구조를 섬유상 단백질 구조로 변화시킴으로써 인공적으로 제조할 수 있다. 하나의 예에서, 단백질의 섬유화는, 이의 기재내용이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 공보 제2008/0800186호에 기재된 바와 같이, 섬유 종자(fibril seed)의 보조없이, 공정에 의해 유도시킬 수 있다. 당해 공정은 조절의 용이성, 생산의 균질성, 및 확장의 용이성을 포함하는, 이점을 갖는다. 또한, 단백질의 섬유화는 당해 공정에 의해 섬유 종자의 보조없이 유도시킬 수 있다. 심지어 미량의 단백질도 당해 공정에 적용가능하다. 본원에 사용된 것으로서, "단백질"은 하나 이상의 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드를 포함한다. 단백질은 합성 및 천연적으로 존재하는 단백질 둘다를 포함한다.
미국 특허 공보 제2008/0800186호에 앞서 기재된 방법에 따라서, 심지어 미량의 단백질이 당해 공정에 적용가능할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "단백질"은 하나 이상의 단백질, 단백질 단편, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한다. 단백질은 합성 및 천연적으로 존재하는 단백질 둘다를 포함한다. 당해 방법은 천연 단백질을, 이들의 서열에 관계없이 단순하고 신속한 방식으로 섬유 형태로 전환시키기 위해 사용될 수 있다. 당해 방법은 구상 단백질을 세제를 함유하는 용액 중에 용해시키는 단계 및 당해 용액을 70 kDa 분자량 이상의 단백질을 분리할 수 있는 분자 크기 컬럼에 적용시키는 단계, 및 단백질을 세제를 함유하는 용액을 사용하여 용출시키는 단계를 포함한다. 예시적인 시행에서, 당해 방법은 구상 단백질을 제공하는 단계, 구상 단백질을 함유하는 용액을 형성시키는 단계, 세제를 구상 단백질을 함유하는 용액에 가하는 단계, 및 임의로 저 농도의 세제의 존재하에서 당해 용액을 70kDa 이상의 분자량의 단백질을 분리할 수 있는 공극 크기를 지닌 분자 크기 컬럼에 적용시키는 단계를 포함한다.
또한 구체 단백질로 공지된 구상 단백질은 단백질의 2개의 주요 3차 구조 부류 중 하나이다. 구상 단백질은 일반적으로 가용성이며 물 중에서 구체 분자를 형성한다. 이들은 2차 구조 모티프(motif), 예를 들면, α-나선, β-시트, 및 루프 구조의 혼합물을 포함하는 복잡한 2차 구조를 갖는다. 단백질의 다른 주요 3차 구조 부류는 섬유상 단백질, 또는 섬유성 단백질이다. 섬유상 단백질은 일반적으로 불용성이며 연장된 형태를 갖는다. 이들은 단순한 2차 구조를 가지며 흔히 2차 구조 모티프의 단지 하나의 유형을 기초로 한다. 이행의 예에서, 구상 단백질은 알부민, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 피브로넥틴 등이다. 8M 우레아와 이. 콜라이(E. coli)의 봉입체로부터 추출된 재조합체 폴딩되지 않은 단백질, 예를 들면, 구제역 바이러스의 재조합체 캡시드 단백질 VP1(rVP1), 구제역 바이러스의 재조합체 캡시드 단백질 VP2(rVP2), 구제역 바이러스의 재조합체 캡시드 단백질 VP3(rVP3), 또는 VP1, VP2, VP3, 및 VP4의 전구체 단백질 P1이 사용될 수 있다. 당해 단백질은 또한 VP1, VP2, VP3, 및/또는 VP4로부터의 일부를 포함하는 키메라 단백질, 예를 들면, VP2 및 VP4 둘다 중 일부를 포함하는 VP42일 수 있다. 천연적으로 존재하는 단백질 및 합성 올리고펩타이드를 포함하는, 다른 구상 단백질(예를 들면, 소 혈청 알부민)을 또한 사용할 수 있다.
또한 본원에서 세제로 언급된 계면활성제는 물의 표면 장력을 저하시키고 유기 화합물의 용해도를 증가시키는 물질이다. 세제는 이온성일 수 있으며, 이는 양이온성, 음이온성 및 양쪽성 세제, 및 비-이온성을 포함한다. 세제는 단백질내 비-공유결합을 파괴하는 역할을 함으로서 단백질을 변성시켜 이들이 이들의 천연 형태 또는 구조를 상실하도록 한다. 예시적인 이행시, 사용된 세제는 시그마(Sigma)로부터 입수한 나트륨 도데실 설페이트(SDS)이다. 다른 예시적인 이행시, 사용된 세제는 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 입수된 Zwittergent 3-14이다.
아밀로이드는 섬유성 가교-β 단백질 응집체이다. 다수의 단백질이 섬유상 형태, 프로토필라멘트 구조, 가교-β 회절 패턴, β-구조에 있어서의 증가, 콩고 레드 결합(Congo red binding), 및 ThT 결합을 포함하는 특징을 지닌 아밀로이드-유사 섬유로 전환될 수 있다. 예시적인 이행에서, 구상 단백질은 아밀로이드-유사 섬유를 형성하도록 전환되며, 이는 전환된 단백질이 이의 아밀로이드-유사 특성에 의해 확인되도록 한다.
암을 치료하기 위한 단백질은 질환의 중증도 및 암 세포에 대한 바람직한 세포독성을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예시적인 이행에 있어서, 암 세포에 대해 보다 큰 세포독성을 선택한다. 섬유상 단백질은 동일한 단백질 유형 또는 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상의 유형으로부터 유도된 섬유상 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 위에서 기술된 치료 방법은 rVP1 섬유상 단백질 및 섬유상 BSA를 하나의 용량 중에 또는 별도로 투여할 수 있다.
이행에 따라서, 크로마토그래피를 공정에 사용하여 구상 단백질 구조를 섬유상 단백질 구조로 전환시키고 이들을 분리할 수 있다. 일반적으로, 크로마토그래피는 박층 크로마토그래피에 사용된 것들과 같은 다른 방법이 또한 가능할 수 있지만, 컬럼을 사용하여 달성한다. 크로마토그래피 기술은 크기 배제, 친화성 및 이온-교환을 포함한다. 섬유상 단백질의 뱃치-유형 생산이 가능하지만, 컬럼 공정의 이용은 구상 단백질이 섬유 형태로 신속하고, 꾸준하고, 효율적이며 연속적인 방식으로 전환되도록 한다. 컬럼을 사용함으로써 당해 공정의 확장도 가능하다.
예시적인 이행에 따라서, 비드 공극 크기가 적어도 약 70kDa인 크기 배제 크로마토그래피가 사용된다. 사용된 비드 공극 크기는 구상 단백질의 각종 특징, 예를 들면, 이의 크기에 따라 변할 수 있다. 공극 크기는, 단백질이 비드 매트릭스로 도입되도록 함으로써 단백질 비폴딩/폴딩에 기여하여 원섬유형성 총체를 향상시키는 기계적 힘을 생성시키는 역할을 한다. 예시적인 이행에서, 사용된 분자 크기 컬럼은 슈퍼덱스 200이다. 다른 예시적인 이행에서, 사용된 분자 크기 컬럼은 HW55S이다.
컬럼 크로마토그래피의 경우, 저 농도(들)의 세제를 함유하는 완충제 용액을 사용하여 컬럼을 용출시킬 수 있다. 예시적인 이행에서, 분자 크기 컬럼은 25 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 및 0.05% SDS를 함유하는 완충제 용액으로 용출시킨다. 다른 예시적인 이행에서, 분자 크기 컬럼은 25 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 및 0.05% Zwittergent 3-14를 함유하는 완충제 용액으로 용출시킨다. 용출제는 분획으로서 수집할 수 있으며, 분획은 후속적으로 함께 혼주되는 섬유상 단백질을 함유한다. 혼주된 분획은 이후 추가로 여과하여 섬유상 단백질를 정제하고 분리할 수 있는데, 예를 들면, PBS에 대해 투석하여 SDS 또는 Zwittergent 3-14를 제거할 수 있다.
이행에 따라서, 사람 혈청 알부민(HSA)은 섬유상 단백질을 생성하기 위해 본원에 기재된 공정에 의해 섬유상 사람 혈청 알부민으로 제조할 수 있다. 이행에 따라서, 사람 혈청 알부민은 본원에 기재된 공정에 의해 섬유상 형태로 전환됨을 확인하였다. 섬유상 단백질의 생성과 관련하여 미국 특허 제7,488,800호가 참조로 인용된다.
섬유상 HSA(F-HSA)는 각종 암 세포에서 아폽토시스를 유발하는데 있어서 구제역 바이러스의 재조합체 캡시드 단백질(rVP1)과 적어도 동등한 정도로 강력함이 예상치 않게도 밝혀졌다. 암 치료제로서 rVP1 대신에 F-HSA를 사용하는 이점 중에는, HSA가 사람 내인성 단백질이라는 것이 있다. 따라서, HSA 또는 유사한 서열 및 조성을 갖는 이의 유도체는 rVP1과 같은 외부 단백질보다 거의 유사하지 않아서 임상 적용 동안 면역원성 및 중화 항체를 유도한다.
이행에 따라서, F-HSA는 HSA를 1% SDS 용액 중에 용해시키고, 슈퍼덱스(Superdex)-200 겔 여과 컬럼을 통과시키고, 25 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 및 0.05% SDS를 함유하는 완충제 용액으로 용출시켜 생성하였다(도 1). PBS에 대해 투석하여 SDS를 제거한 후, HSA와는 달리 슈퍼덱스-200 컬럼으로부터 용출된 F-HSA는 용량-의존적 방식으로 아밀로이드-특이적인 염료 ThT의 향상된 형광성 수준을 나타냄이 밝혀졌다.
이후에, F-HSA는 암 세포에서 세포독성을 유도하였음이 측정되었다. 섬유상 혈청 알부민은 세포 표면에서 인테그린과 같은 수용체에 결합하지만 구상 혈청 알부민은 결합할 수 없기 때문에, 구상으로부터 섬유상 형태로의 혈청 알부민의 구조의 변화는, 단백질이 정상 세포보다 인테그린 α5β1을 보다 더 발현하는 암세포를 선택적으로 표적화할 수 있도록 하는 것으로 여겨진다. F-HSA는 TS/A(쥐 유방 선암종) 및 MDA-MB-231(사람 유방 선암종) 세포를 독립적으로 포함하는 유방 암 세포 성장 용량을 각각 0.15(도 13) 및 0.48μM(도 14)의 IC50로 억제하였다. F-HSA는 0.6μM의 IC50으로 난소 암 세포 SKOV3 성장을 억제하였고(도 15), 자궁경부 암 세포 CaSki 성장을 1.1μM의 IC50으로 억제하였다(도 16). F-HSA는 또한 전립선 암 세포 PC-3 및 22Rv1에서 각각 0.35(도 17) 및 0.2μM(도 18)의 IC50으로 전립선 암 세포독성을 유도하였다. 또한, F-HSA는 다수의 폐암 세포주에서 세포독성을 유도한다(도 19).
따라서, 이행에 따라서, 암을 치료하는 방법이 기재되어 있다. 당해 방법은 HSA를 제공하는 단계, HSA를 섬유상 구조로 변화시키는 단계, 및 치료학적 유효량의 F-HSA를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. HSA에서 섬유상 형태로의 전환은 표적 세포에 대한 이의 세포독성 효과를 증가시킨다.
예시적인 이행에서, 암은 신장, 유방, 폐, 전립선, 간, 자궁경부 또는 난소 암이다. 예시적인 이행에서, 섬유상 HSA는 Akt 시그널링 경로를 조절함으로써 암 세포 아폽토시스를 유도하는 역할을 담당한다. 일부 예에서, 섬유상 HSA는 Akt의 탈활성화를 초래하는 인테그린 α5β1 또는αvβ3을 조절한다. 다른 경우에, 섬유상 HSA는 인테그린에 결합하여 인테그린/FAK/Akt/GSK-3β/카스파제-3 경로를 통해 주로 세포의 아폽토시스를 유발한다.
암을 치료하기 위한 섬유상 HSA 단백질, 유도체, 상동체, 또는 HSA에 대해 실질적인 동일성을 갖는 다른 단백질은 질환의 중증도 및 암 세포에 대한 목적하는 세포독성을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예시적인 이행에서, 암 세포에 대한 보다 큰 세포독성을 위해, RGD 모티프 또는 보다 큰 분자량을 갖는 단백질이 선택된다. RGD 모티프는 인테그린에 대한 리간드이다. 섬유상 단백질은 인테그린/Akt 시그널링 경로의 조절을 통해 세포 사멸을 유도하였음이 밝혀져 있다. rVP1-S200 및 FN-S200과 같이 RGD 모티프를 갖는 섬유상 단백질은 BSA-S200 및 rVP3-S200과 같은 RGD 모티프가 없는 것들보다 더 세포독성이었다는 것을 발견하였다.
"변이체"는 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와는 상이하지만 필수적인 특성을 보유한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드의 대표적인 변이체는 다른 참조 폴리뉴클레오타이드와는 뉴클레오타이드 서열에 있어서 상이하다. 변이체의 뉴클레오타이드 서열내 변화는 참조 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경시킬 수 있거나 변경시키지 않을 수 있다. 뉴클레오타이드 변화는 본원에 논의된 바와 같이 참조 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드내 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 트렁케이션(truncation)을 생성할 수 있다.
폴리펩타이드의 대표적인 변이체는 다른 참조 폴리펩타이드와는 아미노산 서열에 있어 상이하다. 일반적으로, 차이들은, 참조 폴리펩타이드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역내에서 동일하도록 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩타이드는 하나 이상의 치환, 첨가 및 결실에 의해 어떠한 조합으로도 아미노산 서열내에서 상이할 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 암호화된 것이거나 암호화되지 않은 것일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체는 대립형질 변이체와 같은 천연적으로 존재하는 것일 수 있거나, 또는 천연적으로 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 비-천연적으로 존재하는 변이체는 직접적인 합성에 의해 또는 돌연변이유발 기술에 의해 제조될 수 있다.
"상동체"는 상이한 종으로부터의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 기능적 대응물인 다른 종으로부터 수득된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 상동체들 중의 서열 차이는 종 분화의 결과이다.
본원에 사용된 것으로서, 20개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 통상의 용도를 따른다. 본원에 참조로 인용된 문헌[Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)]을 참조한다. 20개의 통상적인 아미노산, α-,α-이치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산의 입체이성체(예를 들면, D-아미노산)가 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 적합한 성분들일 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예는 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, δ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예: 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에 사용된 폴리펩타이드 주목에 있어서, 표준 용도 및 관례에 따라, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카복시-말단 방향이다.
폴리뉴클레오타이드에 적용된 것으로서, 용어 "실질적인 동일성"은, 2개의 펩타이드 서열이 데폴트 갭 중량(default gap weight)을 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬된 경우, 적어도 80퍼센트의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 가진 잔기의 상호교환가능성을 말한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이며; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산, 및 아스파라긴-글루타민이다.
본원에 논의된 바와 같이, 세포독성 활성을 갖는 조성물의 아미노산 서열내 약간의 변화는 본 발명에 포함되는 것으로 고려되며, 단, HSA 서열의 아미노산내 변이는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 유지한다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 대체는 이들의 측쇄내에서 관련된 아미노산의 계열내에서 일어나는 것들이다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 계열들: (1) 산성 = 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 하전되지 않은 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신으로 유전적으로 분할된다. 보다 바람직한 계열은 세린이며 트레오닌은 지방족-하이드록시 계열이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드-함유 계열이고; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 계열이고; 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 방향족 계열이다. 예를 들면, 류신의 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트의 글루타메이트로, 트레오닌의 세린으로의 분리된 대체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체는 특히 이러한 대체가 골격 부위내 아미노산을 포함하지 않는 경우 수득되는 분자의 결합 또는 특성에 중요한 영향을 가지지 않을 것이다. 아미노산 변화가 기능성 펩타이드를 생성하는지의 여부는 폴리펩타이드 유도체의 특이적인 활성을 평가함으로써 용이하게 측정될 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 단편 또는 유사체는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능성 도메인의 경계부 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 데이터를 공공의 또는 일반적인 서열 데이터베이스와 비교하여 확인할 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터처리된 비교 방법을 사용하여 공지된 구조 또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 구조를 확인한다. 공지된 3-차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다. Bowie et al. Science 253:164 (1991)을 참조한다. 따라서, 상기 실시예는, 당해 분야의 숙련가가 본 발명에 따라서 구조적 및 기능적 도메인을 확인하는데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태(conformation)를 인식할 수 있음을 입증한다.
효과적인 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키며, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경시키고, (4) 결합 친화성을 변경시키며, (5) 이러한 유사체의 다른 생리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 수정하는 것들이다. 유사체는 천연적으로 존재하는 펩타이드 서열외에 서열의 각종 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 또는 다수의 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)을 천연적으로 존재하는 서열(바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩타이드의 일부내)내에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들면, 대체 아미노산은 모 서열내에 존재하는 나선을 파괴하거나, 모 서열을 특징화하는 2차 구조의 다른 유형을 파괴하는 경향이 없어야 한다). 당해 분야에 인식된 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조의 예는 각각 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et at. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드 단편"은 아미노-말단 또는 카복시-말단 결실을 가지나, 나머지 아미노산 서열이 예를 들면, 전장의 cDNA 서열로부터 유추된 천연적으로 존재하는 서열내 상응하는 위치와 동일한 경우를 말한다. 전형적으로 단편은, 길이가 적어도 5, 6, 8 또는 10개 아미노산, 바람직하게는 길이가 적어도 14개 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 적어도 20개 아미노산, 일반적으로 길이가 적어도 50개 아미노산, 및 심지어 보다 바람직하게는 길이가 적어도 70개 아미노산이다.
일반적으로, 섬유상 단백질을 제조하는 방법은 SDS 또는 다른 적합한 세제 용액 중에 단백질을 용해하는 단계; 용해된 단백질을 70kDa 이상의 분자량의 단백질을 분리할 수 있는 공극 크기를 갖는 겔 여과 컬럼을 통해 적용시키는 단계; 단백질을 컬럼으로부터 용출시키는 단계; 및 용출물을 완충된 염수에 대해 투석시켜 SDS 또는 세제를 제거하는 단계를 포함한다.
제1 단계에서, 구상 단백질은 일반적으로 용액 형태로 용해된다. 하나의 예에서, 구상 단백질은 PBS와 계면활성제 중에 용해된다. 본원에서 또한 세제로 언급된 계면활성제는 물의 표면 장력을 저하시키고 유기 화합물의 가용성을 증가시키는 물질이다. 세제는 이온성일 수 있으며, 이는 양이온성, 음이온성, 및 양쪽성 세제, 및 비-이온성일 수 있다. 세제는 단백질내 비-공유결합을 파괴함으로써 이들이 이들의 천연 형태 또는 구조를 상실하도록 단백질을 변성시킨다. 예시적인 이행에서, 사용된 세제는 시그마(Sigma)로부터 입수한 나트륨 도데실 설페이트(SDS)이다. 다른 예시적인 이행에서, 사용된 세제는 칼바이오켐으로부터 구입한 Zwittergent 3-14이다.
방법의 일부 양상에서, 비드 공극 크기가 적어도 약 70kDa인 크기 배제 크로마토그래피가 사용된다. 사용된 비드 공극 크기는 구상 단백질의 각종 특성, 예를 들면, 이의 크기에 따라 변할 수 있다. 공극 크기는, 단백질을 비드 매트릭스로 도입하도록 하는 역할을 함으로써 단백질 비폴딩/폴딩에 기여하고 원섬유형성 총체를 향상시키는데 역할을 한다. 예시적인 이행에서, 사용된 분자 크기 컬럼은 슈퍼덱스 200이다. 다른 예시적인 이행에서, 사용된 분자 크기 컬럼은 HW55S이다. 섬유상 단백질을 생산하는 방법의 다른 세부사항은 이의 기재내용이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 공보 제2008/0800186호에서 찾을 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 기재내용 및 설명을 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 제공하기 위해 나타낸 것이며, 본 발명으로서 고려되는 영역을 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.
실험 실시예 1
방법
세포주 및 배양. SK-OV-3 세포(사람 난소 암종 세포주; ATCC HTB-77) 및 SK-OV-3ip.1 세포, 및 CaSki 세포(사람 자궁경부 암종 세포주; ATCC CRL-1550)를 37℃에서 McCoy's 5A 및 RPMI-1640 배지에 각각 유지시켰다. MDA-MB-231 세포(사람 유방 선암종 세포주; ATCC HTB-26) 및 TS/A 세포(쥐 유방 선암종 세포주)를 37℃에서 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)/F12 배지 및 DMEM 중에 각각 유지시켰다. PC-3 세포(사람 전립선 선암종 세포주; ATCC CRL-1435) 및 22Rv1 세포(사람 전립선 암종 세포주; ATCC CRL-2505)를 37℃에서 RPMI-1640 배지 중에 유지시켰다. 모든 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 보충하였다.
세포독성 검정. 세포 생존을 MTT 검정 또는 WST-1 검정으로 측정하였다. 요약하면, 1x105 세포/웰의 종양 세포를 96-웰 플레이트 중의 무혈청 배지 중에 씨딩하고 1시간 동안 항온처리하였다. 일련의 농도의 rVP1, F-BSA, 또는 F-HSA를 사용한 세포의 처리는 무혈청 배지 중에서 24시간 동안 37℃에서 수행하였다. 처리 후, MTT 용액을 각각의 웰에 첨가한 후(0.5 mg/ml), 4시간 동안 항온처리하였다. 생존가능한 세포 수는 포르마잔의 생산에 직접 비례하며, 이는 이소프로판올로 가용화시킨 후 ELISA 플레이트 판독기에 의해 570 nm에서 분광광도계적으로 측정할 수 있다. 데이터는 미처리 상태의 퍼센트로 나타내고 평균 ± S.D.로 나타낸다.
WST-1 검정을 제조업자의 지시[제조원: 로슈(Roche), 독일 만하임 소재]에 따라 수행하였다. 요약하면, 2 x 104 세포를 96 웰 플레이트 상의 웰당 100 μl 배지에 첨가하고 37℃에서 5% CO2로 밤새 습윤화된 항온처리기 중에서 항온처리하였다. 웰에 부착된 세포를 무혈청 배지 중에서 항온처리하고 rVP1의 일련 희석물로 처리하였다. 37℃에서 5% CO2 중에서 16시간 동안 항온처리하여 약물이 효과를 발휘하도록 한 후, 10μl의 WST-1 시약을 각각의 웰에 첨가한 후, 플레이트를 진탕 테이블 위에서 150 rpm으로 1분 동안 혼합하였다. 37℃에서 5% CO2 중에서 2시간 동안 더 항온처리하여 WST-1 시약이 대사되도록 한 후, 생존하는 세포의 비를 광학 밀도(450 nm 시험 파장, 690 nm 참조 파장)로 측정하였다. 생존하는 세포의 퍼센트는 (O.D.처리 / O.D.대조군) x 100%으로 계산한 반면, 성장 억제의 퍼센트는 [1 - ( O.D.처리 / O.D.대조군 )] x 100%으로 계산하였다. IC50은, 시약이 세포 생존능의 50% 억제를 수득하는 농도이다.
세포 이주 및 침입 검정. 세포 이주 및 침입 검정은 다음 보이덴 챔버 이주 및 침입 검정[제조원: 코닝(Corning)]에 따라 수행하였다. 상부 챔버의 8μm 공극 막에 20㎍/ml의 피브로넥틴을 세포 이주 검정을 위해 피복하거나 40㎍/ml의 매트리겔(Matrigel)을 세포 침입 검정을 위해 피복하고 1ml의 PBS가 들어있는 웰 중에 두고 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 암 세포(1 x 105)를 무혈청 배지 중에 재-현탁시키고 상부 챔버에 1시간 동안 플레이팅하였다. rVP1과 같은 섬유상 단백질의 각종 농도를 상부 챔버에 첨가한 후 배양 배지(10% FBS 배지)를 하부 챔버에 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 종료점에서, 막의 상부 측 상의 세포를 면봉으로 닦아 제거하고, 하부 막 표면으로 이주한 세포를 세포 해리 용액[제조원: 시그마(Sigma)]을 사용하여 해리시키고 유동 세포분석기[제조원: 비디 캄파니(BD company)]로 계수하였다.
BALB/c 마우스에서 TS/A 유방 선암종의 쥐 모델에서 전이성 이식의 확립. 쥐 TS/A 유방 선암종 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 95% 공기 및 5% CO2의 습윤된 대기 중에서 37℃로 배양하였다. 수거한 후, TS/A 세포(3 x 105/100μl PBS/마우스)를 그룹당 9마리의 마우스의 측면 꼬리 정맥내로 정맥내 주사하였다. F-HSA와 같은 섬유상 단백질 또는 대조군 배지를 10회 동안 매 2일마다 1회 정맥내 경로로 제공하였다. 최종적으로, 그룹당 3마리 마우스를 희생시키고 다른 것은 생존 검정을 위해 사용하였다.
다른 실험에서, 쥐 TS/A 유방 선암종 세포를 우선 0% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 중에서 rVP1(0.1 내지 0.2μM) 처리와 같은 섬유상 단백질의 존재 또는 부재하에 95% 공기 및 5% CO2의 습윤화된 대기 중에서 37℃로 배양하였다. 수거 후, rVP1를 사용하거나 사용하지 않고 예비처리한 TS/A 세포를 그룹당 9마리의 마우스의 측면 꼬리 정맥내에 각각 정맥내 주사(3x105/100μl PBS/마우스)하였다. 14일 후, 모든 마우스를 희생시키고 폐를 수거하였다.
사람 유방암의 쥐 모델에서 전이성 이종이식체 이식의 확립. 사람 MDA-MB-231 유방 선암종 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 중에서 95% 공기 및 5% CO2의 습윤화된 대기 중에서 37℃로 배양하였다. 수거 후, MDA-MB-231 세포(3X105/100 μl PBS/마우스)를 그룹당 9마리 마우스의 측면 꼬리 정맥내로 정맥내 주사하였다. 종양 주사 후 1일째에, F-HSA(1mg/Kg BW)와 같은 섬유상 단백질을 10회 동안 매 2일 마다 1회 정맥내 경로로 제공한 반면 대조군 그룹에는 배지만을 주사하였다. 그룹당 3마리의 마우스를 당해 시점에서 희생시키고 나머지 마우스를 생존율을 측정하기 위해 유지시켰다.
사람 전립선 암의 쥐 모델에서 직립성 이종이식제 이식( orthotropic xenograft implantation )의 확립. 사람 PC-3 전립선 암 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 중에서 95% 공기 및 5% CO2의 습윤화된 대기 중에서 37℃로 배양하였다. 수거 후, PC-3 세포를 세척하고 전립선에 직립으로 주사하였다((1 x 105/20μL PBS/마우스). 하나의 그룹에서, PC-3 이식 후 4주 째에, rVP1(25 mg/kg)과 같은 섬유상 단백질을 정맥내 경로로 제공한 반면 다른 그룹에서는 rVP1을 암 이식 후 10주 동안 제공하였다. 동일한 양의 rVP1을 6주 동안 주당 3회 투여하고 rVP1 치료 말기에, 3마리 마우스를 각각의 그룹에서 희생시켜 암 전이를 검출하였다. 나머자 마우스를 생존율을 측정하기 위해 유지시켰다.
사람 SK - OV -3 난소 암의 쥐 모델에서 전이성 이종이식체 이식의 확립. 동물 연구를 타이완 소재의 국립 방어 의학 센터(National Defense Medical Center)의 실험실 동물의 보호 및 사용에 대한 안내서에 부합하게 수행하였다. 타이완 소재의 국립 동물 센터(National Animal Center)로부터 구입한 8주 생, BALB/cAnN-Foxn1 암컷 누드 마우스를 SK-OV-3 이식 후 6일째에 복강내 주사에 의해 마우스당 5 x 106 SK-OV-3 암세포를 접종하고, 마우스를 섬유상 단백질(예를 들면, rVP1, 15 mg/Kg BW) 또는 PBS(대조군)로 치료하고 60일 동안 매 격일로 치료를 반복하였다. 생존율 및 체중을 마우스가 죽을 때까지 또는 종양 이식 후 340일까지 기록하였다.
SK-OV-3ip.1 세포의 분리. 마우스를 SK-OV-3 세포 이식 후 60일 째에 즉시 경구 탈구하여 희생시켰다. 3ml의 PBS를 이후에 배에 주사하고 복강내 세포를 5-ml 주사기와 25 게이지(gauge) x 1" 침을 사용하여 제거(약 2 ml)하였다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 4℃로 원심분리하고 세포 펠렛을 수집하였다. 적혈구 세포를 제거하기 위해, NH4Cl(0.144 M)의 5배 세포 펠렛 용적 및 NH4HCO3 (0.01M)의 1/2배 세포 펠렛 용적을 가하고 4℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 4℃로 원심분리하고 세포 펠렛을 수집하였다. 세포를 20% FBS가 들어있는 McCoy's 5A 배지 중에서 5% CO2-습윤화된 대기 중에서 37℃에서 3일 동안 배양한 후 표준 웨스턴 블롯 기술에 이어서 8 내지 16% 구배 겔[제조원: 인비트로겐(invitrogen)] 상의 SDS-PAGE에 의한 분해능을 이용하여 HER-2 수용체 수준의 웨스턴 블롯 분석을 행하였다.
조직병리학. 기관을 10% 중성 완충된 포르말린 중에 고정시켰다. 조직을 추가로 파라핀 중에 봉매하고, 4μm 단면으로 절단하고, 광학 현미경을 위해 헤마톡실린 및 에오신[제조원: 에이치 앤드 이(H&E)]으로 염색하였다.
통계적 분석. 모든 데이터는 평균 ± 표준 오차로 나타내고 마이크로소프트 엑셀로 추정하였다. 생존 데이터를 위해, 로그-랭크(log-rank) 시험을 사용하여 약물로 처리된 그룹 또는 약물로 처리되지 않은 그룹 사이의 차이점을 측정하였다. 스튜던트 t-시험(Student's t test) 및 ANOVA를 수행하여 상이한 치료들 사이의 전체적 차이점을 평가하였다. P<0.05, P<0.01, 및 P<0.001의 값은 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.
rVP1은 시험관내에서 MDA-MB-231 세포, PC-3 세포, 22Rv1 세포, SK-OV-3 세포, CaSki 세포, 및 SK-OV-3ip.1 세포에서 세포 침입 및/또는 이주를 억제하였다.
rVP1이 종양 세포 침입 및/또는 이주를 억제하는지를 조사하기 위해, 세포 침입 및/또는 이주를 보이덴 챔버 검정을 사용하여 측정하였다. 다양한 농도(사람 유방 선암종 세포주 MDA-MB-231 세포, 사람 전립선 선암종 세포주 PC-3 세포, 사람 전립선 암종 세포주 22Rv1 세포내에서 0.1 μM 내지 0.2μM rVP1; 사람 난소 암종 세포주 SK-OV-3 세포 및 SK-OV-3ip.1 세포에서 0.2μM 내지 0.4μM rVP1; 사람 자궁경부 암종 세포주 CaSki 세포내에서 0.2μM 내지 0.6μM rVP1)의 rVP1 치료 후, 세포 침입 및/또는 이주는 유의적으로 억제되었다. 물론, rVP1의 이들 농도는 MTT 검정 또는 WST-1 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 세포 생존능에 영향을 주지 않았다(도 1 내지 도 3). 따라서, rVP1은 시험관내에서 사람 유방암, 전립선 암, 자궁경부암, 및 난소 암 세포주의 전이를 유의적으로 억제할 수 있다.
실시예 2
rVP1은 생체내에서 종양 세포 전이를 억제하였다.
A. 시험관내 rVP1-처리된 MDA-MB-231 세포를 BALB/c 마우스내로 정맥내 주사하였다. 이어서, 본 발명자들은 시험관내에서 전이 능력을 억제하기 위해 rVP1으로 24시간 동안 예비치료하고, 이어서 마우스에 세포를 정맥내 주사한 MDA-MB-231 사람 유방 선암종 세포가, rVP1 예비치료하지 않은 MDA-MB-231 세포와 비교하여 마우스 폐에서 이들의 전이를 감소시킬 수 있는지를 실험하였다. 데이터는, 0.1 내지 0.2μM rVP1-처리된 MDA-MB-231 세포가 마우스 폐 조직내에서 암 세포 전이를 유의적으로 감소시켰음을 나타내었다(도 4a). 관련된 폐 중량 및 폐내 종양 위치의 수는 또한 rVP1 치료하지 않은 종양 그룹과 비교하여 또한 유의적으로 감소시켰다(도 4b, 도 4c).
B. 직립성 PC -3 이종이식체 모델. 또한, 발명자들은 rVP1이 생체내에서 전립선 암 전이를 억제하는지를 시험하였다. PC-3 사람 전립선 선암종 세포를 우선 누드 마우스 전립선에 직립하여 이식시키고 이식 후 4주 또는 10주째에 rVP1(25 mg/kg)을 6주 동안 매주 3회 정맥내 주사하였다. rVP1 치료 종료시에, 본 발명자들은 마우스를 희생시켜 부검하였다. 본 발명자들의 데이터는, rVP1이 림프절(표 1, 도 5a) 및 골반 뼈로 전이된 PC-3 세포를 유의적으로 억제하였으며 골반 뼈내에서 골분해를 억제하였음(도 5b)을 나타내었다.
PC-3 이식된 누드 마우스에서 rVP1 처리를 사용한 전이성 림프절의 퍼센트 및 위치
종양 rVP1(종양 이식 후 4주째에 제공) 종양 rVP1(종양 이식 후 10주 째에 제공)
신장 절 66.67% (2/3) 0% (0/3) 100% (3/3) 0% (0/3)
허리 절 100% (3/3) 0% (0/3) 100% (3/3) 0% (0/3)
천골 절 0% (0/3) 0% (0/3) 66.67% (2/3) 0% (0/3)
좌골 절 0% (0/3) 0% (0/3) 66.67% (2/3) 0% (0/3)
서혜 절 33.33% (1/3) 0% (0/3) 33.33% (1/3) 0% (0/3)
C. 전이 SK - OV -3 이종이식체 모델. 본 발명자들의 시험관내 데이터는, rVP1 이 SK-OV-3 사람 난소 암종 세포 침입을 억제하였음을 나타내었다. rVP1이 또한 생체내에서 SK-OV-3 난소 암 전이를 억제할 수 있는지를 실험하기 위해, 사람 SK-OV-3 난소 암의 쥐 모델에서 전이성 이종이식체 이식을 확립하였다. 본 발명자들은 60일 후, PBS-치료된 SK-OV-3를 지닌 마우스로부터의 간이 종양 세포로 둘러싸였음을 발견하였다. 한편, rVP1(15 mg/kg)을 60일 동안 매 격일마다 복강내 주사한 SK-OV-3을 지닌 마우스에서는, 이들 간의 어떠한 명백한 종양 침입도 관찰되지 않았다(도 6).
실시예 3
F-HSA는 시험관내 MDA-MB-231 세포, PC-3 세포, 22Rv1 세포 및 CaSki 세포에서 종양 세포 침입 및/또는 이주를 억제하였다.
F-HSA와 같은 다른 섬유상 단백질이 또한 암 세포 침입 및/또는 이주를 억제하는지를 실험하기 위해, 암세포 침입 및/또는 이주에 대한 F-HSA의 효과를 보이덴 챔버 검정을 사용하여 측정하였다. 각종 농도의 F-HSA(MDA-MB-231 세포에서 0.1 μM 내지 0.2 μM F-HSA; PC-3 세포에서 0.025 내지 0.1μM F-HSA; 22Rv1 세포에서 0.025 내지 0.05μM F-HSA; CaSki 세포에서 0.2 내지 0.4μM F-HSA)로 처리한 후, 각종 암 세포의 침입 및/또는 이주 능력은 유의적으로 억제되었다. 이들 농도에서, F-HSA는 MTT 검정을 사용함에 의해 세포 생존능에 영향을 미치지 않았다는 것을 알 수 있다(도 7).
실시예 4
F-HSA는 생체내에서 종양 세포 전이를 억제하였다.
F-HSA가 생체내에서 종양 세포 전이를 억제할 수 있는지를 추가로 시험하기 위하여, 쥐 유방 선암종 TS/A 세포를 BALB/c 마우스의 측면 꼬리 정맥내로 정맥내 주사하거나 사람 유방 선암종 MDA-MB-231세포를 누드 마우스에 각각 주사하였다. 이후에, F-HSA (1 mg/kg)를 다음날 및 이후에 10회 동안 매 2일마다 1회씩 정맥내 주사하였다. F-HSA 치료의 종료시, 마우스를 희생시켜 폐의 전이를 검출하였다. 본 발명자들의 결과는, F-HSA가 대조군 배지만으로 치료한 TS/A 또는 MDA-MB-231을 지닌 마우스와 비교하여 TS/A 세포 및 MDA-MB-231 세포의 폐로의 전이를 유의적으로 억제하였음(도 8a 및 9a)을 나타내었다. F-HSA 치료된 TS/A 또는 MDA-MB-231을 지닌 마우스의 폐에서 종양 위치의 수 및 상대적인 폐 중량은 유의적으로 어떠한 약물 치료도 하지 않은 TS/A 또는 MDA-MB-231을 지닌 마우스의 것의 미만이었다(도 8의 b 및 c, 및 도 9의 b 및 c).
실시예 5
F-BSA는 시험관내에서 CaSki 세포 침입을 억제하였다.
본 발명자들은 또한 F-BSA와 같은 다른 섬유상 단백질이 CaSki 사람 자궁경부 암종 세포 침입을 억제하는지를 실험하였다. 세포 침입은 보이덴 챔버 검정을 사용하여 측정하였다. 본 발명자들은, 0.1μM 내지 0.2μM에서, 비록 F-BSA가 MTT 검정에 의해 나타난 바와 같이 세포 생존능에 영향을 미치지 않았지만, 이는 CaSki 세포 이주/침입을 유의적으로 억제하였음을 발견하였다(도 10).
실시예 6
F-HSA는 아밀로이드-특이적인 염료 ThT의 향상된 형광성 수준을 용량-의존적 방식으로 나타낸다.
도 12는, 실험 데이터의 이행이 아밀로이드 섬유 Aβ(1-42)와 같이 F-HSA가 슈퍼덱스-200 컬럼에 의해 진행되지 않은 BSA와 비교하여 용량-의존적 방식으로 아밀로이드-특이적인 염료 ThT의 형광성 수준을 향상시켰음을 나타낸다. 당해 결과는, F-HSA가 Aβ(1-42)와 같은 섬유상 구조를 가지는 반면, HSA는 구상 구조를 가짐을 나타낸다(ThT에 대한 결합은 아밀로이드-유사 단백질의 특징 중 하나이다).
실시예 7
F-HSA는 유방 암 세포에서 세포독성 효과를 갖는다.
도 13은 TS/A 세포에서 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내고, 도 14는 MDA-MB-231 세포에서 F-HSA의 세포독성 효과를 나타낸다. 각각의 세포 유형은 각종 농도의 F-HSA을 갖는 무혈청 배양 배지 중에서 16시간 동안 처리하였다. 세포 생존능은 MTT 검정으로 측정하였다. 구상 HSA는 정상 세포 또는 암 세포에서 세포독성 효과를 가지지 않는다.
실시예 8
F-HSA는 난소 및 자궁경부 암 세포에서 세포독성 효과를 갖는다.
도 15는 SKOV-3 세포에서 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내고, 도 16은 CaSki 세포에서 F-HSA의 세포독성 효과를 나타낸다. 각각의 세포 유형은 각종 농도의 F-HSA를 갖는 무혈청 배양 배지 중에서 16시간 동안 처리하였다. 세포 생존능은 MTT 검정으로 측정하였다.
실시예 9
F-HSA는 전립선 암 세포에서 세포독성 효과를 갖는다.
도 17은 PC-3 세포에서 F-HSA의 세포독성 효과를 나타내고 도 7은 22 Rv1 세포에서 F-HSA의 세포독성 효과를 나타낸다. 각각의 세포 유형을 각종 농도의 F-HSA를 갖는 무혈청 배양 배지 중에서 16시간 동안 처리하였다. 세포 생존능은 MTT 검정으로 측정하였다.
실시예 10
F-HSA는 폐암 세포주에서 세포독성 효과를 갖는다.
도 19에 나타낸 이행에 따라서, F-HSA는 선암종 세포주 A549, CL1-0, Cl1-5, H1299, PC13, 및 PC14; 편평 세포 암종 폐암 세포주 H520; 및 거대 세포 폐암 암종 세포주 H661에서 세포독성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 도 19는 각각의 세포주의 각각의 IC50을 나타낸다.
실시예 11
F-HSA는 시험관내에서 종양 세포 침입 및 이주를 억제한다.
F-HSA는 또한 도 20에서의 실험 데이터의 이행에 따라서 밝혀진 바와 같이, 시험관내에서 종양 세포 침입 및 이주를 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 도 9a, 9c, 9e 및 9g에 나타낸 바와 같이, F-HSA는 종양 세포 침입/이주 능력을 암세포 또는 정상 세포의 생존능에 영향을 미치지 않았던 농도에서 유의적으로 감소시켰다.
실시예 12
F-HSA는 생체내에서 종양 세포 전이를 억제하였다.
F-HSA는 생체내에서 유방암 종양 세포주 TS/A 및 MDA-MB-231을 억제하였다. 도 21a 및 22a는, F-HSA가 F-HSA 치료되지 않은 TS/A 또는 MDA-MB-231을 지닌 마우스와 비교하여 유방암 TS/A 세포 및 MDA-MB-231 세포의 폐로의 전이를 유의적으로 억제하였음을 나타낸다. 도 21b, 21c, 22b, 및 22c는 폐 조직내에서 다수의 종양 세포 병소(foci) 및 중량을 측정하며, 이는 또한 생체내에서 F-HSA의 효능을 확인하였다.
이행에 따라서, 유방암 세포는 대상체의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 폐 조직에서 검출된 종양 세포 병소(foci)는, 유방암 세포가 폐로 전이되었음을 나타내었다.
물질 및 방법
F-HSA의 제조. 20mg의 HSA를 10 ml의 PBS 중에 1% SDS (w/v)와 함께 용해시켰다. HSA 용액을 5분 동안 초음파처리한 후 용출 용액[25 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 및 0.05% SDS]으로 미리 평형화시킨 슈퍼덱스-200에에 적용하였다. 컬럼을 1 ml/분의 속도로 용출시키고 HSA를 함유하는 분획 C3 내지 C7을 혼주시켰다. 혼주된 분획을 2 내지 3 mg/ml로 농축시키고 PBS에 대해 Cellu-Sep T4/Nominal(MWCO:12,000-14,000 Da) 투석 막을 사용하여 투석하였다. 새로운 PBS 완충액을 매 2시간마다 실온에서 3회 교환하였다. HSA-S200의 수율은 약 75%이었다.
티오플라빈 T(ThT) 형광성 검정. ThT에 대한 결합은 아밀로이드-유사 단백질의 특징 중 하나이다. 형광성 측정을 위해, 증가하는 농도의 단백질을 20μM ThT와 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리한 후, 형광성을 Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter[제조원: 퍼킨 엘머 라이프 사이언스(Perkin Elmer Life Science), 미국 워싱턴주 왈탐 소재] 위에서 3회 측정하였다. 여기 및 방사 파장은 각각 430 nm 및 486 nm이었다. 완충제 용액으로부터 ThT 배경 시그널을 상응하는 측정으로부터 감하였다.
세포 생존을 MTT 비색계 검정으로 측정하였다. 대수적으로 성장하는 세포(TS/A의 경우 2 x 104 세포/웰)을 96-웰 플레이트에서 10% FBS를 갖는 배지 중에 씨딩하고 24시간 동안 항온처리하였다. 일련의 농도의 단백질을 사용한 세포의 처리는 무혈청 배지 중에서 16시간 지시 동안 37℃에서 수행하였다. 처리 후, MTT 용액을 각각의 웰에 가한 후(0.5 mg/ml), 4시간 동안 항온처리하였다. 생존하는 세포 수는 포르마잔의 생산에 직접적으로 비례하며, 이후, 이소프로판올을 사용한 가용화는 570 nm에서 ELISA 플레이트 판독기에 의해 분광광도계적으로 측정할 수 있다.
세포 생존능 검정. 세포 생존능을 제조업자의 지시[제조원: 로슈(Roche), 독일 만하임 소재]에 따라서 WST-1 검정으로 측정하였다. 요약하면, 2 x 104 세포를 96웰 플레이트 상의 웰당 100μl의 배지에 첨가하고 37℃에서 5% CO2 중에서 밤새 습윤화된 항온처리기 중에서 항온처리하였다. 웰에 부착된 세포를 무혈청 배지 중에서 항온처리하고 각종 농도의 F-HSA로 처리하였다. 37℃에서 5% CO2 중에서 16시간 동안 항온처리하여 약물이 효과를 발휘하도록 한 후, 10μl WST-1 시약을 각각의 웰에 가하였다. 이후에, 플레이트를 진탕 테이블 위에 두고 150 rpm에서 1분 동안 진탕하였다. 37℃에서 5% CO2 중에서 2시간 동안 더 항온처리하여 WST-1 시약이 대사되도록 한 후, 생존하는 세포의 비율을 광학 밀도(450 nm 시험 파장, 690 nm 참조 파장)로 측정하였다. 생존하는 세포의 퍼센트는 (O.D. 처리 / O.D. 대조군) x 100%으로 계산한 반면 성장 억제의 퍼센트는 [1 - (O.D. 처리 / O.D. 대조군)] x 100%으로 계산하였다. 당해 실험에 따라서, IC50은, 시약이 세포 생존능의 50% 억제를 수득하는 농도이다.
세포 이주 및 침입 검정. 세포 이주 및 침입은 보이덴 챔버 이주 및 침입 검정[제조원: 코닝(Corning)]을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 상부 챔버의 8μm 공극 막을 20㎍/ml 피브로넥틴(세포 이주 검정의 경우)으로 또는 40㎍/ml 마트리겔(세포 침입 검정의 경우)로 피복하고 웰 중에 1 ml의 PBS와 함께 두고 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 100μl의 무혈청 배양 배지 중 암 세포 (1 x 105)를 상부 챔버 중에 1시간 동안 씨딩하였다. 일련 희석된 농도의 F-HSA를 상부 챔버에 가한 후 10% FBS를 함유하는 배양 배지를 하부 챔버에 가하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리한 후, 막의 상부 측 상의 세포를, 이를 면봉으로 닦아 제거하고, 하부 막 표면으로 이주된 세포를 세포 해리 용액(제조원: 시그마)을 사용하여 해리하고 유동 세포분석기[제조원: 비디 캄파니(BD company)]로 계수하였다. 그러나, 당해 농도에서, F-HSA는 MTT 검정으로 측정한 경우, 도 9b, 9d, 9f 및 9h에 나타난 바와 같이 세포 생존능에 영향을 미치지 않았다. 생존능 및 세포독성을 MTT 또는 WST-1 검정을 사용하여 측정하였다. 이들 키트(kit)는 살아있는 세포(제조원: 로슈)에서 미토콘드리아 활성의 함수로서 세포 성장의 분광광도계적 측정을 위해 설계되어 있다.
생체내에서 유방 암 세포 전이. TS/A 쥐 유방 선암종 세포를 BALB/c 마우스의 측면 꼬리 정맥내로 정맥내 주사하거나 MDA-MB-231 사람 유방 선암종 세포를 누드 마우스내로 주사하였다. 이후에, F-HSA(1 mg/kg)를 다음날 및 이후에 10회 동안 매 2일에 1회씩 정맥내 주사하였다. F-HSA 처리의 종료시 마우스를 희생시켜 폐의 전이를 검출하였다.

Claims (41)

  1. 섬유상 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 대상체에서 암 전이를 억제하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 섬유상 단백질은 섬유상 알부민 또는 섬유상 사람 혈청 알부민인, 약제학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 치료학적 유효량의 섬유상 사람 혈청 알부민 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상체에서 암 전이를 억제하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물로서, 상기 섬유상 사람 혈청 알부민이
    사람 혈청 알부민을 세제 용액 중에 용해시키는 단계;
    상기 용해된 사람 혈청 알부민을 분자량 70kDa 이상의 단백질을 분리하는 공극 크기를 갖는 겔 여과 컬럼을 통과시키는 단계; 및
    상기 컬럼으로부터 상기 사람 혈청 알부민을 용출시키는 단계로 제조되는, 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암이 α5β1 및/또는 αvβ3 인테그린의 과발현을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 따른 약제학적 조성물의 제조 방법으로서,
    섬유상 사람 혈청 알부민을 제조하는 단계; 및
    치료학적 유효량의 섬유상 사람 혈청 알부민을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 섬유상 사람 혈청 알부민을 제조하는 단계가
    사람 혈청 알부민을 세제 용액 중에 용해시키는 단계;
    상기 용해된 사람 혈청 알부민을 분자량 70kDa 이상의 단백질을 분리하는 공극 크기를 갖는 겔 여과 컬럼을 통과시키는 단계; 및
    상기 컬럼으로부터 상기 사람 혈청 알부민을 용출시키는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조 방법.
  9. 치료학적 유효량의 섬유상 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 대상체에서 암 전이를 억제하기 위한, 약제학적 조성물로서, 상기 섬유상 단백질은 섬유상 알부민 또는 섬유상 사람 혈청 알부민인, 약제학적 조성물.
  10. 유효량의 섬유상 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물이 암 전이를 감소시키고 상기 섬유상 단백질은 섬유상 알부민 또는 섬유상 사람 혈청 알부민인, 약제학적 조성물.
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  14. 제10항에 있어서, 상기 섬유상 단백질이 키메라 단백질인, 약제학적 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 상기 암이 α5β1 및/또는 αvβ3 인테그린의 과발현을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사, 동맥내 주사, 근육내 주사, 종양내로의 병변내 주사, 종양 근처의 병변내 주사, 정맥내 주입, 및 동맥내 주입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 투여 방식을 위한 것인, 약제학적 조성물.
  17. 제10항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 제2 치료제 및/또는 방사선 치료요법과 병용되는, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 치료제가 화학치료제인, 약제학적 조성물.
  19. 제10항에 있어서, 상기 섬유상 단백질이,
    단백질을 세제 용액 중에 용해시켜 용해된 단백질을 제공하는 단계;
    상기 용해된 단백질을 분자량 70kDa 이상의 단백질을 분리할 수 있는 공극 크기를 갖는 겔 여과 컬럼을 통과시키는 단계;
    상기 겔 여과 컬럼으로부터 상기 용해된 단백질을 용출시켜 용출물을 제공하는 단계; 및
    상기 용출물로부터 상기 세제를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 약제학적 조성물.
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