KR101833428B1 - 구릿대 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

구릿대 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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박은영
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Abstract

본 발명은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린(phellopterin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 구릿대 추출물, 이의 n-헥산 분획물 및 펠로프테린 화합물은 인비트로 및 인 비보 실험에서 GPR119 활성자 활성(agonistic activity)을 나타내고 마우스 혈액 내 글루코스를 감소시키는 것을 확인함으로써, 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 개선용 건강기능식품에 이용할 수 있다.

Description

구릿대 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition or prevention or treatment of diabetes comprising the extract of Angelica dahurica, fractions thereof or compound Phellopterin isolated therefrom as an active ingredient}
본 발명은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린(Phellopterin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 크게 제1형과 제2형 당뇨병으로 나눌 수 있는데 제1형 당뇨병은 유전적 감수성 및 바이러스 감염으로 인해 췌장에 면역학적 반응이 유발되고, β-세포가 선택적으로 손상되어 발생하는 자가면역질환이며, 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성이 선행하는 형으로 주요 병인으로는 비만, 인슐린 수용체의 감소, tyrosine kinase 활성도 감소, 근육조직과 지방조직의 muscle/adipose tissue type transporter의 감소, insulin receptor substrate-1(IRS-1)의 세포 내 결핍 등 복잡한 원인에 의해 발병하는 것으로 보고되고 있다.
제1형 당뇨병은 전형적인 자가면역질환의 하나로 알려져 있고, 췌장 β-세포를 인식하는 자가활성화 T세포에 의해 인슐린을 생성하는 췌장 β-세포가 파괴되는 만성 질환이다(American Diabetes Association, Diabetes Care 2014, 37 Suppl 1, S81-90). 반면 제 2형 당뇨병은 흔한 대사장애로서 전 세계적으로 매우 흔한 질환이며 인슐린 저항성과 고혈당으로 특징 되어진다. 췌장의 베타 세포로부터 인슐린 분비 결함이나 부적절한 간의 포도당 생성 및 말초 인슐린 저항성등 다양한 병리적 특징을 가지며, 이 대사 증후군 치료를 위해서 지금까지 많은 치료적 접근을 시도해 오고 있다.
제2형 당뇨를 치료하기 위한 대표적인 방법으로는 식이요법 및 운동요법과 같은 비약물 요법이 있고, 상기 비약물 요법을 제외한 약물치료법으로 크게 분류된다. 약물치료법은 보통 식이요법과 운동요법과 같은 비약물요법으로 당 조절 목표가 실현되지 않을 때 시작되며, 광범위하게 처방되는 경구용 약물은 약물의 작용기전과 구조적 특징에 따라 분류될 수 있으며 각기 한계와 잠재적 위험성을 보이는 것으로 보고되어 있다(Current Medical Research and Opinion 2007, 23, 945-952).
메트포르민(metformin)은 바이구아나이드(biguanide) 계열 약물로서 주로 간에서의 당 과다생산 억제 및 인슐린 저항성 감소를 통해 작용하며 일반적으로 부작용이 없으나 잠재적 부작용으로서 유산산증(lactic acidosis)이 유도될 수 있는 것으로 보고되어 있다(International Journal of Obesity 2008, 32, 61-72). 싸이아졸리딘디온(thiazolidinedione) 계열 약물은 PPARγ 항진제로서 로지글리타존(rosiglitazone)과 피오글리타존(pioglitazone)을 포함하는데 인슐린 민감성 향상을 통해 작용하며 부종, 체중증가, 간독성 및 심부전과 같은 부작용을 보이는 것으로 보고되어 있다(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106, 18745-18750). 설포닐유레아(설포닐urea) 계열 약물은 췌장의 베타세포의 인슐린 분비를 촉진하는데 당-비의존적 방식으로 작용하므로 저혈당(hypoglycemia)을 유발하며, 체중증가의 원인이 될 수도 있다. 메글리티나이드(meglitinide) 계열 약물 또한 설포닐유레아 계열 약물과 유사한 작용 기전 및 부작용을 가진다. 알파-글루코시데이즈 억제제는 식후 당 급등 억제를 위해 사용되는데 장관에서의 부작용이 나타난다. 인슐린 및 인슐린 유사체는 보통 경구용 약물과 복합요법으로 사용되는데 저혈당 및 체중증가 유도와 같은 부작용과 주사제로서의 한계를 가진다(Current Opinion in Drug Discovery & Development 2009, 12, 519-532).
최근에는 앞선 제2형 당뇨에 대한 약물치료법과 관련한 저혈당 및 체중증가 문제를 해결하기 위하여 당-의존적 방식으로 인슐린 분비를 증가할 수 있는 약물 개발에 많은 노력이 경주되고 있다(Forecast Insight: Antidiabertics, Datamonitor DMHC2447, 08/2008).
엑세나티드(exenatide)와 같은 GLP-1 수용체 항진제는 디펩티딜 펩티데이즈-IV(DPP-IV)에 의해 빠르게 분해되는 GLP-1을 모방한 유사체(GLP-1 mimetics)로서, DPP-IV에 의해 빠르게 분해되지 않으면서 당-의존적 인슐린 분비를 촉진하고 글루카곤 분비, 위 배출 및 식욕을 억제하며, 베타세포 보호효과를 보이는 GLP-1의 효과를 나타내는 약물이다. 따라서 저혈당을 유발하지 않으며 체중감소 효과를 보이고 HbA1c 저하 효과를 보이나 장관 부작용과 췌장염과 같은 부작용 및 주사제로서의 한계를 지닌다. 한편으로, 시타글립틴(sitagliptin)과 빌다글립틴(vildagliptin)과 같은 DPP-IV 억제제는 경구용 약물로서 GLP-1의 분해를 억제함으로서 작용하며 GLP-1 수용체 항진제와 유사한 HbA1c 저하 효과를 보이나 체중감소 효과는 관찰되지 않는다(Current Opinion in DrugDiscovery & Development 2009, 12, 519-532).
이러한 맥락에서 GPR119는 제2형 당뇨치료제 개발을 위한 유망한 표적으로서 주요제약회사들의 집중적인 연구개발 대상이 되고 있다. 성인의 인체에서 GPR119는 주로 췌장과 장관에서 주로 발현되어 있으며, GLP-1 수용체와 유사하게 췌장의 베타세포에서 활성화시 당-의존적 인슐린 분비를 증가시키고 장관의 GLP-1 및/또는 GIP(glucose-dependent insulinotropic peptide) 분비 세포에서 활성화시 해당 인크레틴의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있고, 펩타이드를 리간드로 하는 GLP-1 수용체와는 달리, GPR119는 강하고 선택적이지는 않지만 지질을 리간드로 하므로 경구용 항진제를 발굴하고 개발하기에 비교적 용이한 작용점으로 간주된다(Endocrinology 2007, 148, 2598-2600; Expert Opinion on Drug Discovery 2008, 3, 403-413; Annual Reports in Medicinal Chemistry 2009, 44, 149-170; ; Expert Opinion on Therapeutic Patents 2009, 19, 1339-1359; Current Opinion in Drug Discovery & Development 2009, 12, 519-532).
따라서, GPR119는 GLP-1 수용체 항진제의 효능을 경구용 약물로서 구현할 수 있는 가능성을 지닌 작용점으로서 2006년 초 GPR119 항진제로서 APD-668 화합물(Ortho-McNeil, Arena)이 처음으로 임상 I상에 진입한 이래 APD-597 화합물(Ortho-McNeil, Arena), PSN-821 화합물(OSI), MBX-2982 화합물(Sanofi-Aventis, Metabolex) 및 GSK-1292263A 화합물(GSK)과 같은 GPR119 항진제들이 임상에 진입하였으며, 현재는 PSN-821 화합물(OSI), MBX-2982 화합물(Sanofi-Aventis, Metabolex) 및 GSK-1292263A 화합물(GSK)들이 임상 II상에 진입한 상태이다(Thomson Reuters Integrity).
식물성 허브 추출물들은 지금까지 당뇨병 치료를 위한 보완적 혹은 대체 약물로 크게 주목받아왔다. 구릿대(Angelica dahurica Bentham et Hooker f. (Umbelliferae, AD))는 한국, 중국, 일본에서 감기와 두통 및 치통에 효과적인 전통적 약물로 널리 사용되어왔다. 구릿대는 쿠마린(coumarin; PubChem CID:323), 펠로프테린(phellopterin; PubChem CID:98608), 이소임페라토린(isoimperatorin; PubChem CID:68081), 임페라토린(imperatorin; PubChem CID:10212), 옥시포이세다딘(oxypeucedanin; PubChem CID:33306), 비야크앙겔리신(byakangelicin; PubChem CID:10211), 핌피넬린(pimpinellin; PubChem CID:4825)들을 포함하는 포함하는 것으로 알려져 있으며, 이로부터 유도된 활성 화합물들이 항염, 항돌연변이, 항생, 항암 그리고 항산화에 효과가 있다고 보고되어져왔다.
따라서, 본 발명자들은 효능과 안전성이 보장되는 당뇨 치료제 개발을 위한 노력을 통해, GPR119 항진 활성을 가지는 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물 그리고 이로부터 분리한 화합물이 인비트로 및 인 비보에서 포도당 부하에 따른 GLP-1 및 인슐린 분비, 그리고 GRP119 작용제 효과(agonist effects)를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린(phellopterin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 펠로프테린(phellopterin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린(phellopterin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 구릿대 추출물, 이의 n-헥산 분획물 및 펠로프테린 화합물은 인비트로 및 인 비보 실험에서 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 활성자 활성(agonistic activity)을 나타내고 마우스 혈액 내 글루코스를 감소시키는 것을 확인함으로써, 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 개선용 건강기능식품에 이용할 수 있다.
도 1은, 인비트로에서 구릿대(Angelica dahurica) 추출물 처리에 따른 GPR119 활성자 활성을 측정한 도이다:
A: GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포에서 구릿대 추출물 처리에 따른 리포터로써 베타-락타메이즈 활성(β-lactamase activity)을 측정한 결과;
B: GLUTag 및 INS-1 세포주에서 구릿대 추출물 처리에 따른 cAMP 활성을 측정한 결과;
C: GLUTag 세포주에서 구릿대 추출물 처리에 따른 활성 GLP-1 분비를 측정한 결과;
D: INS-1 세포주에서 구릿대 추출물 처리에 따른 글루코스 자극으로 인한 인슐린의 분비를 측정한 결과;
n=3-4/group; *p<0.05, **p<0.01 (용매대조군 비교), ##p<0.01 (글루코스 존재 하의 용매대조군 비교).
도 2는, 마우스에서 구릿대 추출물 처리에 따른 경구부하시험(oral glucose tolerance test) 및 인슐린 분비를 나태낸 도이다:
A: C57BL6 마우스에서 경구부하시험;
B: C57BL6 마우스 글루코스 투여 후 혈청 인슐린 측정;
C: db/db 마우스에서 경구부하시험;
n=7-9/group; *p <0.05, **p <0.01 (대조군 비교).
도 3은, 인비트로에서 구릿대(Angelica dahurica) 분획물 처리에 따른 GPR119 활성자 활성을 측정한 결과이다:
A: GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포에서 구릿대 total crude (MeOH), n-hexane, ethyl acetate (EA), n-butanol (BuOH), or water extract 처리에 따른 리포터로써 베타-락타메이즈 활성(β-lactamase activity)을 측정한 결과;
B: GLUTag 세포에서 구릿대 total crude (MeOH), n-hexane 처리를 통한 활성 GLP-1 분비를 측정한 결과;
C: INS-1 세포에서 구릿대 total 또는 n-hexane extract 처리에 따른 글루코스 자극에 의한 인슐린 분비를 측정한 결과;
n=3-4/group; *p <0.05, **p <0.01 (대조군 비교).
도 4는, 마우스에서 구릿대 n-hexane 분획물 처리에 따른 경구부하시험 및 인슐린 분비를 나태낸 도이다:
A: C57BL6 mice (n=15/group) 경구부하시험;
B: C57BL6 마우스 글루코스 투여 후 혈청 인슐린 측정;
C: db/db mice (n=10-11/group) 경구부하시험;
*p <0.05, **p <0.01 (대조군인 PBS-처리군 비교).
도 5는, 구릿대 추출물로부터 분리된 화합물의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 6은, 인비트로에서 구릿대로부터 분리한 화합물 처리에 따른 GPR119 활성자 활성을 측정한 도이다:
A: GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포에서 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin) 또는 이소임페라토린(isoimperatorin) 처리에 따른 리포터로써 베타-락타메이즈 활성(β-lactamase activity)을 측정한 결과;
B: GLUTag 세포주에서 임페라토린(imperatorin) 또는 펠로프테린(phellopterin) 처리에 따른 활성 GLP-1 분비를 측정한 결과;
C: INS-1 세포주에서 임페라토린(imperatorin) 또는 펠로프테린(phellopterin) 처리에 따른 글루코스 자극으로 인한 인슐린의 분비를 측정한 결과;
n=3-4/group; *p <0.05, **p <0.01 (대조군 비교); #p<0.05, ##p<0.01 (글루코스 존재 하의 용매대조군 비교).
도 7은, 마우스에서 임페라토린(imperatorin) 또는 펠로프테린(phellopterin) 처리에 따른 경구부하시험 결과를 나타낸 도이다:
A: C57BL6 마우스에 임페라토린 투여 후 경구부하시험;
B: C57BL6 마우스 펠로프테린 투여 후 경구부하시험;
C: 당뇨 db/db 마우스에 펠로프테린 투여 후 경구부하시험;
n=8-12/group; *p <0.05, **p <0.01 (대조군인 PBS-처리군 비교).
도 8은, 당뇨 마우스에서 장시간 구릿대 추출물 또는 n-핵산 분획물 처리 후 글루코스의 감소 효과를 확인한 도이다:
A: 처리 3주 후 혈액 내 글루코스 농도를 나타낸 결과;
B: 경구부하시험 결과;
C: 처리 3주 후 몸무게 변화
D: 식이 섭취량(Food intake) 변화;
*p < 0.05, **p < 0.01 (대조군인 PBS-처리군 비교); #p < 0.05 (처리 3주 후 대조군인 PBS-처리군 비교).
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 질환의 증세를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "환자"는 본 발명의 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 구릿대 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출할 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 구릿대 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
1) 구릿대에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 구릿대는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 구릿대는 꽃, 줄기, 잎 또는 열매가 모두 이용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 구릿대 추출물의 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출 및 초음파 추출 등, 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출 용매는 건조된 구릿대 분량의 2 내지 20 배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 50℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 100 시간인 것이 바람직하며, 구체적으로 24 내지 96 시간이 더욱 바람직하고, 보다 구체적으로 72 시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전 증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압 건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 상기 분획물은
1) 상기 구릿대를 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 가하여 구릿대 추출물을 수득하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 수득한 n-헥산 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
구체적으로, 상기 분획물은 상기 단계 1)에서 얻은 구릿대 추출물을 메탄올에 현탁시킨 후, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올을 순차적으로 첨가하여 각각의 층을 분리한 다음 n-헥산 층을 감압 농축 및 건조시켜 n-헥산 분획물을 수득하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이때, 상기 감압 농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 상기 건조는 감압 건조, 진공 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결 건조를 하는 것이 바람직하고 동결 건조를 하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 당뇨병은 제 2형 당뇨인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 당뇨 합병증은 비만, 관상 동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 간헐성 파행증, 심근경색증, 식후 지질혈증, 내당능 손상의 증상, 공복 혈당 손상의 증상, 대사성 산증, 케톤증, 관절염, 골다공증, 고혈압, 울혈성 심부전, 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 백내장, 당뇨병성 신증, 사구체경화증, 만성 신부전, 당뇨병성 신경병증, 협심증, 혈전증, 아테롬성동맥경화증, 심근경색증, 일과성 허혈성 발작, 뇌졸중, 혈관재협착, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증, 인슐린 내성, 족부 궤양, 궤양성 결장염 및 심내막 기능부전으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 항진 활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여 방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물 실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 mg/ml 이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 mg/ml이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.
비 경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비 수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비 수성용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 구릿대의 추출물을 제조하기 위하여 구릿대의 마른 뿌리를 초음파 장치(ultrasonic apparatus)를 이용해 상온에서 메탄올(500 mL x 3)로 추출한 후 진공에서 27.5 g의 농축된 조추출액을 얻었으며 농축시킨 잔여물을 1000 mL 물에 재부유(resuspend)시키고 1000 mL의 n-헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 또는 n-부탄올(n-butanol)을 순차적으로 이용하여 각각 n-헥산 분획물 4.7 g, 에틸아세테이트 분획물 1.4 g, n-부탄올 분획물 4.8 g 및 물 분획물 16 g을 얻었다.
본 발명자들은 GPR119-CRE-bla CHO-K1 리포터 세포주를 사용하여 구릿대 추출물에서 GPR119 활성자를 측정한 결과, 리포터 활성은 구릿대 추출물 처리 용량에 따라 증가하였으며 이를 통해 구릿대 추출물 처리에 의해 세포 내 cAMP 생성이 촉진됨을 확인하였다(도 1a 참조).
또한, 본 발명자들은 GPR119가 발현(express)된다고 알려진 장내분비기관세포주(enteroendocrine cell line (GLUTag cells))와 이자 베타 세포주(pancreatic β-cell line (INS-1 cells))에서 직접적으로 cAMP가 축적된 정도를 측정하였다. GPR119는 Gαs 단백질이 결합되어 있으며 cAMP 생성을 유도한다. 그 결과, 100 μg/mL의 구릿대 추출물을 처리한 후 GLUTag 세포와 INS-1 세포 모두에서 cAMP 양이 상당히 증가한 것을 확인하였다(도 1b 참조). 이러한 결과들과 유사하게, 활성 GLP-1 양은 GLUTag 세포에서 구릿대 추출물을 처리했을 때 상당히 증가하였다(도 1c 참조).
또한 본 발명자들은 GPR119 활성자(agonist)들은 이자 베타 세포의 인슐린 분비를 증가시키므로 구릿대 추출물의 이자 베타 세포에 대한 효능을 보기 위해 INS-1 세포에서 글루코스에 의해 활성화되는 인슐린 분비를 측정하였다. 그 결과, 3 mM의 글루코스를 처리한 경우에는 인슐린 분비가 약간 증가하였으며 17.5 mM의 글루코스를 처리한 경우에는 인슐린 분비가 더 증가하였고 100 μg/mL의 구릿대 추출물 및 17.5 mM의 글루코스를 같이 처리한 경우에는 인슐린 분비가 상당히 많이 증가한 것을 확인하였다(도 1d 참조). 따라서, 구릿대 추출물은 GPR119의 활성자(agonist)로서의 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
본 발명자들은 구릿대 추출물이 글루코스 조절에 관여하는지 알아보기 위해 8주된 수컷 야생형 C57BL6 마우스와 당뇨병 db/db 마우스(C57BL/KsJ background)를 이용하여 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다. 그 결과, 구릿대 추출물을 처리한 정상 C57BL6 마우스에서 혈액 내 존재하는 글루코스 양은 30분 및 60분에서 PBS를 처리한 대조군에 비해 상당히 적은 것을 확인하였고, PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 추출물을 처리한 C57BL6 마우스는 11.5% 정도 글루코스의 양이 감소함을 확인하였다(도 2a 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 확인한 바와 같이 구릿대 추출물을 처리한 정상 마우스에서 향상된 글루코스 내성(tolerance)이 인슐린 분비의 증가 때문인지 알아보기 위하여 경구 포도당 투여 후 혈청(serum) 인슐린의 양을 측정해보았다. 그 결과, 구릿대 추출물을 투여한 정상 마우스에서 혈청 인슐린의 양이 PBS를 투여한 대조군보다 더 많이 증가함을 확인하였다(도 2b 참조). 이러한 실험을 통해 증가된 인슐린 분비가 구릿대 추출물을 처리한 마우스에서 혈액 내의 글루코스 양을 낮추는데 기여함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 구릿대 추출물 처리에 따른 비만 마우스의 혈 중 글루코스 감소 효과를 확인하기 위하여 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다. 그 결과, 구릿대 추출물을 처리한 비만 모델 마우스는 PBS를 처리한 대조군에 비해 포도당용액 투여 후 각 시간점에서 혈액 내에 존재하는 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였고, PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 추출물을 처리한 마우스는 24.6% 정도 글루코스 양이 감소함을 확인하였다(도 2c 참조).
본 발명자들은 구릿대 추출물의 다양한 분획의 GPR119 활성에 대한 효능을 평가하기 위해서 GPR119-CRE-bla CHO-K1 리포터 세포에 다양한 농도의 구릿대 추출물과 구릿대 추출물의 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, 물 분획물을 처리하였다. 그 결과, 구릿대 추출물의 n-hexane 분획물 처리 세포에서 리포터 활성이 가장 높은 것을 확인하였다(도 3a 참조). GLUTag 세포에서 활성 GLP-1 양(도 3b) 및 INS-1 세포에서 인슐린 분비 양(도 3c)은 구릿대 추출물의 n-hexane 분획에서 상당히 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 구릿대 추출물의 n-hexane 분획물에 GPR119를 활성화시키는 활성 화합물이 존재함을 알 수 있었다.
본 발명자들은 구릿대 추출물로부터 분획한 n-hexane 분획물의 글루코스 조절에 대한 효능을 알아보기 위해서 정상 C57BL6 마우스에 n-hexane 분획물을 투여한 후 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다. 그 결과, 글루코스를 투여한 후 30분과 60분이 지났을 때 PBS만을 투여한 대조군에 비해 n-hexane 분획물을 투여한 마우스는 혈액 내에 있는 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였다(도 4a 참조). 또한 구릿대 추출물의 n-hexane 분획물을 단독 투여한 경우 인슐린의 분비가 상당히 증가함을 확인하였다(도 4b 참조).
또한, 본 발명자들은 비만 db/db 마우스에 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였으며 그 결과, 글루코스를 투여한 후 30과 60분이 지났을 때 n-hexane 분획물을 투여한 db/db 마우스의 혈액 내에 있는 글루코스의 양은 PBS를 처리한 db/db 대조군 쥐에 비해 상당히 감소함을 확인하였으며, PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 n-hexane 분획물을 처리한 마우스는 12.7% 정도 글루코스 양이 감소함을 확인하였다(도 4c 참조).
따라서, 본 발명의 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물은 인비트로 및 인 비보 실험에서 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 활성자 활성(agonistic activity)을 나타내고 마우스 혈액 내 글루코스를 감소시키는 것을 확인함으로써, 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 펠로프테린(phellopterin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112016090805508-pat00001
.
상기 펠로프테린 화합물은 구릿대(Angelica dahurica)의 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 것일 수 있으나, 다른 동물체, 식물체, 또는 미생물로부터 분리된 화합물, 또는 당 업계에 알려진 모든 방법을 통하여 인위적으로 합성된 것을 포함한다.
상기 당뇨병은 제 2형 당뇨인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 당뇨 합병증은 비만, 관상 동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 간헐성 파행증, 심근경색증, 식후 지질혈증, 내당능 손상의 증상, 공복 혈당 손상의 증상, 대사성 산증, 케톤증, 관절염, 골다공증, 고혈압, 울혈성 심부전, 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 백내장, 당뇨병성 신증, 사구체경화증, 만성 신부전, 당뇨병성 신경병증, 협심증, 혈전증, 아테롬성동맥경화증, 심근경색증, 일과성 허혈성 발작, 뇌졸중, 혈관재협착, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고지혈증, 고중성지방혈증, 인슐린 내성, 족부 궤양, 궤양성 결장염 및 심내막 기능부전으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 항진 활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물을 모두 포함한다.
본 발명의 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화 수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 본 발명의 상기 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수 혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
동량의 화학식 1로 표시되는 상기 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과 시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기에서 추출한 구릿대 추출액 및 n-헥산 분획물을 Agilent 1200 HPLC로 분석하였으며 총 세 개의 화합물을 분리하였고 이렇게 분리된 화합물 1은 임페라토린(imperatorin)이며 화합물 2는 펠로프테린(phellopterin), 화합물 3은 이소임페라토린(isoimperatorin)으로 확인되었다(도 5 참조).
본 발명자들은 구릿대 추출물로부터 분획한 n-hexane 분획물에서 얻은 화합물인 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin), 이소임페라토린(isoimperatorin)이 GPR119 활성자인지 확인하였으며 그 결과, GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포에 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin)을 처리한 경우 농도가 증가함에 따라 리포터 활성이 증가하였으나, 이소임페라토린(isoimperatorin)을 처리한 경우에는 증가하지 않았다(도 6a 참조). 또한 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin)을 GLUTag 세포에 처리한 경우 HLP-1 분비가 상당히 증가하였으며(도 6b 참조), INS-1 세포에서 글루코스에 의해 활성화되는 인슐린 분비도 증가하는 것을 확인하였다(도 6c 참조).
본 발명자들은 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin)이 글루코스 내성을 향상시키는지 확인해 보기 위해 C57BL6 마우스에 임페라토린(imperatorin) 및 펠로프테린(phellopterin)을 먼저 처리한 후 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다. 그 결과, 임페라토린(imperatorin)을 투여한 경우에는 혈액 내의 글루코스 양이 PBS를 투여한 대조군과 비슷하였지만 펠로프테린(phellopterin)을 투여한 경우에는 혈액 내의 글루코스 양이 대조군에 비해 상당히 감소한 것을 확인하였다(도 7a 및 b 참조). 이러한 실험 결과를 통해 구릿대 추출물에서 얻은 펠로프테린(phellopterin)은 GPR119의 활성자로서의 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 비만 db/db 마우스에서 펠로프테린(phellopterin)이 글루코스 내성을 향상시키는지 확인하였으며 그 결과, 펠로프테린(phellopterin)을 투여한 쥐는 PBS를 투여한 대조군에 비해 혈액 내의 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였다(도 7c 참조).
본 발명자들은 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 장기간 투여했을 때 혈액 내의 글루코스 양이 감소하는지 알아보기 위하여 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 비만 db/db 마우스에 3주 동안 투여한 후 혈액 내의 글루코스 양을 측정하였다. 그 결과, PBS를 투여한 대조군에 비해 n-hexane 분획물을 처리한 마우스에서 혈액 내의 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였으나, 구릿대 추출물을 투여한 마우스에서는 글루코스 감소효과를 볼 수 없었다(도 8a 참조).
또한 본 발명자들은 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 처리한 후 3주 후에 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행한 결과, PBS를 투여한 대조군에 비해 n-hexane 분획을 처리한 마우스는 글루코스를 투여하고 15분, 30분이 지났을 때 혈액 내의 글루코스 양이 상당히 감소하였으며, PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 추출물을 처리한 마우스는 8% 정도 글루코스 양이 감소하였고 n-hexane 분획물을 처리한 마우스는 13% 정도 글루코스양이 감소하는 것을 확인하였다(도 8b 참조).
또한 본 발명자들은 마우스가 하루에 동일한 양의 음식물을 섭취하는 조건(도 8d 참조)에서 몸무게를 비교한 결과, 구릿대 추출물을 처리한 마우스는 구릿대 추출물을 투여하기 전 43.7g ± 0.7에서 구릿대 추출물 투여 3주 후 44.8 g ± 1.0으로 몸무게가 변하였고 n-hexane 분획물을 투여한 마우스는 n-hexane 분획을 투여하기 전 42.8g ± 0.7에서 n-hexane 분획 투여 3주 후 43.3 g ± 0.6으로 몸무게가 변하였으며, PBS를 투여한 쥐는 PBS를 투여하기 전 43.7g ± 0.7에서 PBS 투여 3주 후 47.3g ± 1.0으로 몸무게가 변하는 것을 확인하였다(도 8c 참조). 이를 통해 PBS를 투여한 대조군 쥐에 비해 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 투여한 쥐는 몸무게가 더 조금 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 구릿대(Angelica dahurica) 추출물로부터 분리한 펠로프테린(phellopterin) 화합물은 인비트로 및 인 비보 실험에서 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 활성자 활성(agonistic activity)을 나타내고 마우스 혈액 내 글루코스를 감소시키는 것을 확인함으로써, 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 구릿대(Angelica dahurica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증 개선용 건강기능식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 펠로프테린(phellopterin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 구릿대의 추출물, 이의 분획물, 펠로프테린 화합물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 기능성 음료용 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수 화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 ~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 구릿대의 추출물, 이의 분획물, 펠로프테린 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 구릿대의 추출물, 이의 분획물, 펠로프테린 화합물은 천연 과일 주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
따라서, 본 발명의 구릿대(Angelica dahurica) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 펠로프테린(phellopterin) 화합물은 인비트로 및 인 비보 실험에서 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 활성자 활성(agonistic activity)을 나타내고 마우스 혈액 내 글루코스를 감소시키는 것을 확인함으로써, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 개선용 건강기능식품에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<1-1> 구릿대 ( Angelica dahurica ; AD) 조추출액 (crude extract) 및 분획물의 제조
본 발명자들은 구릿대의 추출물을 제조하기 위하여 구릿대 뿌리는 경동시장(서울, 한국)에서 구매하였고, 대조 표본(voucher specimen)은 한양대학교 약학대학 식물표본실에 보관(HYU-AD-001)하였으며, 구릿대 조추출액 제조를 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 구릿대의 마른 뿌리를 초음파 장치(ultrasonic apparatus)를 이용해 상온에서 메탄올(500 mL x 3)로 추출한 후 진공에서 27.5 g의 농축된 조추출액을 얻었다. 농축시킨 잔여물을 1000 mL 물에 재부유(resuspend)시키고 1000 mL의 n-헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 또는 n-부탄올(n-butanol)을 순차적으로 이용하여 각각 n-헥산 분획물 4.7 g, 에틸아세테이트 분획물 1.4 g, n-부탄올 분획물 4.8 g 및 물 분획물 16 g을 얻었다.
<1-2> 구릿대 조추출액 및 n- 헥산 분획물의 고성능 액체 크로마토 그래프(HPLC) 분석
본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 추출한 구릿대 추출액 및 n-헥산 분획물을 Agilent 1200 HPLC로 분석하였다.
구체적으로, INNO C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm, 영진바이오크롬, 한국)을 사용하여 40℃에서 1 mL/min의 속도로 이동상을 흘려주었다. 이동상은 A (0.1%의 포름산(formic acid)을 넣은 아세토나이트릴(acetonitrile)), B(0.1%의 포름산(formic acid)을 넣은 물)를 0-20분 동안에는 47-50% A로 20-35분 동안에는 50-70% A로 35-40분 동안에는 75-100% A로 이동상을 흘려주었다. 전체 조추출액과 n-hexane 분획물은 10 ul로 주입시켜주었으며 크로마토그램은 254 nm에서 관찰하였다. 세가지의 주요 피크는 19.1분, 22.3분, 26.2분에 나타났다.
<1-3> 구릿대 추출물의 n-hexane 분획으로부터 얻은 화합물의 정제
본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 구릿대 추출물의 n-헥산 분획물을 분취용 HPLC (preparative HPLC)를 이용하여 더 정제하였다.
구체적으로, Inno C18 column (20 x 250 mm, 5 μm, YoungJin Biochrom, Korea)을 사용하였으며 500 μL의 n-hexane 분획을 주입하여 정제를 수행하였다. 이동상으로 0.1%의 포름산(formic acid)을 포함한 메탄올과 0.1%의 포름산(formic acid)을 포함한 물을 사용하여 10 mL/min의 속도로 0-40분 동안에는 40-100% A로 40-50분 동안에는 100% A로 이동상을 흘려주었다. 크로마토그램은 254 nm에서 관찰하였으며 분리된 화합물은 ESI-MS, 1H 및 13C NMR을 통해 구조를 확인하였다. 화합물 1은 30.45-32.46분에 나오는 분획, 화합물 2는 32.20-33.15분에 나오는 분획, 화합물 3은 35.05-36.05분에 나오는 분획을 모았다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 총 세 개의 화합물을 분리하였으며 이렇게 분리된 화합물 1은 임페라토린(imperatorin)이며 화합물 2는 펠로프테린(phellopterin), 화합물 3은 이소임페라토린(isoimperatorin)으로 확인되었다(도 5).
생체 외(인비트로)에서 구릿대 추출물 처리에 따른 GPR119 활성자 활성(agonistic activity) 확인
<2-1> 구릿대 추출물 처리에 따른 β- lactamase 루시페라아제 리포터 발현 (luciferase reporter expression)의 활성 확인
본 발명자들은 GPR119-CRE-bla CHO-K1 리포터 세포주를 사용하여 구릿대 추출물에서 GPR119 활성자를 측정하였다.
구체적으로, 구릿대 추출물은 dimethylsulfoxide (DMSO)에 용해시켜 사용하였다. GeneBLAzer® T-REx™ GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)는 DMEM high glucose 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, NY, USA), 100 U/mL 페니실린(penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin), 비필수아미노산(non-essential amino acids) 0.1 mM, HEPES (pH 7.3) 25 mM, Zeocin™ 100 μg/mL, hygromycin 600 μg/mL를 넣고 배양하였다. INS-1 쥐 인슐린종 세포 (INS-1 rat insulinoma cell)는 RPMI-1640 (Gibco BRL, NY, USA) 배지에 11 mM glucose, 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 50 μM beta-mercaptoethanol과 1 mM sodium pyruvate를 넣고 배양하였다. GLUTag mouse enteroendocrine L 세포는 DMEM (Gibco BRL, NY, USA) 배지에 5.5 mM glucose, 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin을 넣고 배양하였다. 상기 GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포에 서로 다른 농도(1, 10, 100 ㎍/ml)의 구릿대 추출물을 처리한 후 베타-락타마아제 루시페라아제(β-lactamase luciferase) 활성을 측정하였다.
GPR119 리포터 어세이(reporter assay)를 위하여, human G-protein receptor 119 (GPR119)를 포함하는 GeneBLAzer® T-REx™ GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포는 CRE-bla CHO-K1 세포주에서 안전하게 삽입(integration) 하였다. CHO-K1 세포는 cAMP 반응요소(cAMP response element)의 조절을 받는 β-lactamase 리포터 유전자를 포함한다. GeneBLAzer® T-REx™ GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포를 96웰 배양 플레이트에 80 μL 당 2 × 104 세포수가 되도록 분주하였다. 다음날, 다양한 농도의 AD 추출물 또는 화합물(compound)을 포함한 20 μL의 assay media(Cat No. 10569)를 처리하고 5시간 동안 배양하였다. 5시간 후 LiveBLAzer™-FRET B/G Substrate (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가해주고 상온에서 2시간 동안 빛이 들어오지 않는 어두운 곳에서 배양하였다. 2시간 후 VICTOR3 microplate reader (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA)를 이용하여 460 nm (파란색)와 530 nm (녹색)에서 방출되는 형광 값을 측정하여 파란색/녹색 방출 비를 각 웰마다 계산하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 리포터 활성은 구릿대 추출물 처리 용량에 따라 증가하였으며 이를 통해 구릿대 추출물 처리에 의해 세포 내 cAMP 생성이 촉진됨을 확인하였다(도 1a).
<2-2> 구릿대 추출물 처리에 따른 cAMP 생성 유도 확인
GPR119는 Gαs 단백질이 결합되어 있으며 cAMP 생성을 유도한다. 이에 본 발명자들은 GPR119가 발현(express)된다고 알려진 장내분비기관세포주(enteroendocrine cell line (GLUTag cells))와 이자 베타 세포주(pancreatic β-cell line (INS-1 cells))에서 직접적으로 cAMP가 축적된 정도를 측정하였다.
구체적으로, GLUTag 및 INS-1 세포를 12웰 배양 플레이트에 웰 당 1 × 105 세포수의 농도를 가지도록 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 PBS로 세포를 씻어준 후 AD 추출물(100 μg/mL)을 포함한 Krebs-Ringer bicarbonate (KRB) buffer(116 mM NaCl, 1.8 mM CaCl2·2(H2O), 0.8 mM MgSO4·7(H2O), 5.4 mM KCl, 1 mM NaH2PO4·2(H2O), 26 mM NaCHO3, 및 0.5% BSA, pH 7.4)에서 30분 동안 배양하였다. 30분 후 세포를 수확하고 0.1N HCl을 사용해 세포 용해물(lysate)을 얻었다. cAMP의 농도는 제조사의 실험방법(protocol)에 따라 cAMP ELISA kit(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)을 사용해 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 100 μg/mL의 구릿대 추출물을 처리한 후 GLUTag 세포와 INS-1 세포 모두에서 cAMP 양이 상당히 증가한 것을 확인하였다(도 1b). 이러한 결과들과 유사하게, 활성 GLP-1 양은 GLUTag 세포에서 구릿대 추출물을 처리했을 때 상당히 증가하였다(도 1c).
<2-3> 구릿대 추출물 처리에 따른 인슐린 분비 확인
GPR119 활성자(agonist)들은 이자 베타 세포의 인슐린 분비를 증가시킨다. 본 발명자들은 구릿대 추출물의 이자 베타 세포에 대한 효능을 보기 위해 INS-1 세포에서 글루코스에 의해 활성화되는 인슐린 분비를 측정하였다.
구체적으로, 글루코스에 의해 활성화되는 인슐린 분비 양을 측정하기 위해, INS-1 세포를 KRB buffer에서 씻어 준 후 구릿대 추출물을 포함한 KRB buffer (0.1 mM glucose)에서 두 시간 동안 먼저 배양하였다. 2시간 후 KRB buffer에 3 또는 17.5 mM 글루코스를 함께 넣어 37℃, 5% CO2 조건에서 90분 동안 더 배양하였다. 인슐린의 양은 제조사의 실험방법에 따라 rat ultrasensitive ELISA kit (Alpco Diagnostics, NH, USA)를 사용하여 측정하였다. 인슐린 양은 세포 용해물(lysate)의 단백질 양으로 표준화(normalize)하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 3 mM의 글루코스를 처리한 경우에는 인슐린 분비가 약간 증가하였으며 17.5 mM의 글루코스를 처리한 경우에는 인슐린 분비가 더 증가하였고 100 μg/mL의 구릿대 추출물 및 17.5 mM의 글루코스를 같이 처리한 경우에는 인슐린 분비가 상당히 많이 증가한 것을 확인하였다(도 1d).
따라서, 구릿대 추출물은 GPR119의 활성자(agonist)로서의 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
마우스 모델에서 구릿대 추출물 처리에 따른 글루코스 내성(tolerance) 및 인슐린 분비 효능 확인
<3-1> 구릿대 추출물 처리에 따른 정상 마우스의 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 구릿대 추출물이 글루코스 조절에 관여하는지 알아보기 위해 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
구체적으로, 8주된 수컷 야생형 C57BL6 마우스와 당뇨병 db/db 마우스(C57BL/KsJ background)를 오리엔트바이오 회사 (Gyeonggi-do, Korea)와 한국생명공학연구원에서 각각 얻었다. 상기 마우스는 12시간씩 밝음과 어두움이 바뀌며 (12-h light/dark cycle) 온도가 22-24℃ (23 ± 1℃)로 조절되는 특별한 병원균이 없는 환경에서 사육했으며 가천대학교 이길여 암당뇨 연구원의 실험동물 센터에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 가천대학교 이길여 암당뇨 연구원의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다. 상기 마우스들의 글루코스 경구부하시험을 위해 마우스들을 14시간 동안 단식시킨 후 구릿대 추출물(300 mg/kg body weight in PBS) 또는 대조군으로 PBS를 경구 기관삽관을 통해 투여하였다. 30분 후, 글루코스 용액을 PBS에 마우스의 몸무게 1 kg당 2 g의 농도로 녹여서 구강으로 투여하였다. 혈액은 꼬리 정맥에서 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120분 간격으로 뽑아서 얻었다. 혈액 내의 글루코스 양은 glucometer (LifeScan, Inc. One Touch Ultra)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 구릿대 추출물을 처리한 정상 C57BL6 마우스에서 혈액 내 존재하는 글루코스 양은 30분 및 60분에서 PBS를 처리한 대조군에 비해 상당히 적은 것을 확인하였고, 그래프의 아래 면적 (120분 동안 얻은 혈액 내에 있는 전체 글루코스의 양)을 비교해 본 결과 PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 추출물을 처리한 C57BL6 마우스는 11.5% 정도 글루코스의 양이 감소함을 확인하였다(도 2a).
<3-2> 구릿대 추출물의 처리에 따른 정상 마우스의 혈청 인슐린 증가 효과 확인
본 발명자들은 상기 실시예 <3-1>에서 확인한 바와 같이 구릿대 추출물을 처리한 정상 마우스에서 향상된 글루코스 내성(tolerance)이 인슐린 분비의 증가 때문인지 알아보기 위하여 경구 포도당 투여 후 5, 10, 15분 간격으로 혈청(serum) 인슐린의 양을 측정해보았다. 혈청의 인슐린 양은 mouse insulin ultrasensitive ELSIA kit (Alpco Diagnostics, NH, USA)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 구릿대 추출물을 투여한 정상 마우스에서 혈청 인슐린의 양이 PBS를 투여한 대조군보다 더 많이 증가함을 확인하였다(도 2b). 이러한 실험을 통해 증가된 인슐린 분비가 구릿대 추출물을 처리한 마우스에서 혈액 내의 글루코스 양을 낮추는데 기여함을 알 수 있었다.
<3-3> 구릿대 추출물의 처리에 따른 비만 마우스의 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 글루코스 감소 효과를 보기 위하여 상기 실시예 <3-1>과 같이 랩틴수용체유전자가 망가져 랩틴 수용체 활성을 띄지 못하는 비만 모델인 db/db 마우스에 구릿대 추출물을 먼저 투여한 후 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 구릿대 추출물을 처리한 비만 모델 마우스는 PBS를 처리한 대조군에 비해 혈액 내에 존재하는 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였고, 그래프의 아래 면적을 비교해 본 결과 PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 추출물을 처리한 마우스는 24.6% 정도 글루코스 양이 감소함을 확인하였다(도 2c).
생체 외(인비트로)에서 구릿대 n-hexane 분획물 처리에 따른 GLP-1 활성 및 인슐린 분비 효능 확인
본 발명자들은 구릿대 추출물의 다양한 분획의 GPR119 활성에 대한 효능을 평가하기 위해서 GPR119-CRE-bla CHO-K1 리포터 세포에 다양한 농도의 구릿대 추출물과 구릿대 추출물의 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, 물 분획물을 처리하였다.
구체적으로, 활성화된 GLP-1 분비의 측정하기 위하여 GLUTag 세포를 24웰 배양플레이트에 웰 당 1 × 105 세포수의 농도를 가지도록 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 Krebs-Ringer bicarbonate (KRB) buffer(116 mM NaCl, 1.8 mM CaCl2·2(H2O), 0.8 mM MgSO4·7(H2O), 5.4 mM KCl, 1 mM NaH2PO4·2(H2O), 26 mM NaCHO3, 및 0.5% BSA, pH 7.4)를 사용하여 세포를 두 번 씻어주었고 10 mM glucose, 0.2 μM dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, 구릿대 추출물(20, 50 또는 100 ㎍/ml)을 포함한 KRB buffer에서 30분 동안 배양하였다. 30분 후 상등액을 모았고 GLP-1 (Active 7-36) ELISA kit (Alpco Diagnostics, NH, USA)를 사용하여 GLP-1 분비를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 구릿대 추출물의 n-hexane 분획물 처리 세포에서 리포터 활성이 가장 높은 것을 확인하였다(도 3a). GLUTag 세포에서 활성 GLP-1 양(도 3b) 및 INS-1 세포에서 인슐린 분비 양(도 3c)은 구릿대 추출물의 n-hexane 분획에서 상당히 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 구릿대 추출물의 n-hexane 분획물에 GPR119를 활성화시키는 활성 화합물이 존재함을 알 수 있었다.
마우스 모델에서 구릿대 n-hexane 분획물의 글루코스 조절 효과 확인
<5-1> 구릿대 n-hexane 분획물 처리에 따른 정상 마우스 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 구릿대 추출물로부터 분획한 n-hexane 분획물의 글루코스 조절에 대한 효능을 알아보기 위해서 상기 실시예 <3-1>과 같이 정상 C57BL6 마우스에 n-hexane 분획물을 몸무게 1 kg당 300 mg의 용량으로 단독 투여한 후 30분 뒤에 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 글루코스를 투여한 후 30분과 60분이 지났을 때 PBS만을 투여한 대조군에 비해 n-hexane 분획물을 투여한 마우스는 혈액 내에 있는 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였다(도 4a). 또한 구릿대 추출물의 n-hexane 분획물을 단독 투여한 경우 인슐린의 분비가 상당히 증가함을 확인하였다(도 4b).
<5-2> 구릿대 n-hexane 분획물 처리에 따른 비만 마우스 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 3>과 같이 비만 db/db 마우스에 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 글루코스를 투여한 후 30과 60분이 지났을 때 n-hexane 분획물을 투여한 db/db 마우스의 혈액 내에 있는 글루코스의 양은 PBS를 처리한 db/db 대조군 쥐에 비해 상당히 감소함을 확인하였다(도 4c 왼쪽). 또한 그래프의 아래 면적을 비교해 본 결과 PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 n-hexane 분획물을 처리한 마우스는 12.7% 정도 글루코스 양이 감소함을 확인하였다(도 4c 오른쪽).
n-hexane 분획으로부터 분리한 화합물의 GPR119 활성자 효과 확인
본 발명자들은 상기 실시예 <1-3>에서 구릿대 추출물로부터 분획한 n-hexane 분획물에서 얻은 화합물인 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin), 이소임페라토린(isoimperatorin)이 GPR119 활성자인지 알아보기 위하여 상기 <실시예 2>와 같은 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 GPR119-CRE-bla CHO-K1 세포에 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin)을 처리한 경우 농도가 증가함에 따라 리포터 활성이 증가하였으나, 이소임페라토린(isoimperatorin)을 처리한 경우에는 증가하지 않았다(도 6a). 또한 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin)을 GLUTag 세포에 처리한 경우 GLP-1 분비가 상당히 증가하였으며(도 6b), INS-1 세포에서 글루코스에 의해 활성화되는 인슐린 분비도 증가하는 것을 확인하였다(도 6c).
마우스 모델에서 펠로프테린 ( phellopterin ) 처리에 따른 글루코스 내성(tolerance) 확인
<7-1> 펠로프테린 처리에 따른 정상 마우스 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin)이 글루코스 내성을 향상시키는지 확인해 보기 위해 C57BL6 마우스에 임페라토린(imperatorin) 및 펠로프테린(phellopterin)을 먼저 처리한 후 <실시예 3>과 같이 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다. 마우스는 14시간 금식시킨 후, 임페라토린(imperatorin; 30 mg/kg, in PBS, n=9) 또는 펠로프테린(phellopterin; 30 mg/kg in PBS, n=7-8)을 경구 투여 하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 임페라토린(imperatorin)을 투여한 경우에는 혈액 내의 글루코스 양이 PBS를 투여한 대조군과 비슷하였지만 펠로프테린(phellopterin)을 투여한 경우에는 혈액 내의 글루코스 양이 대조군에 비해 상당히 감소한 것을 확인하였다(도 7a 및 b). 이러한 실험 결과를 통해 구릿대 추출물에서 얻은 펠로프테린(phellopterin)은 GPR119의 활성자로서의 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.
<7-2> 펠로프테린 ( phellopterin ) 처리에 따른 비만 마우스 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 비만 db/db 마우스에서 펠로프테린(phellopterin)이 글루코스 내성을 향상시키는지 확인해 보기 위해 <실시예 3>과 같이 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이 펠로프테린(phellopterin)을 투여한 쥐는 PBS를 투여한 대조군에 비해 혈액 내의 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였다(도 7c).
구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물 장기간 처리에 따른 글루코스 감소 효과 확인
<8-1> 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물 장기간 처리에 따른 비만 마우스 모델에서 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
본 발명자들은 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 장기간 투여했을 때 혈액 내의 글루코스 양이 감소하는지 알아보기 위하여 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 비만 db/db 마우스에 3주 동안 투여한 후 혈액 내의 글루코스 양을 측정하였다.
구체적으로, 9-10주 된 db/db 마우스를 무작위로 한 그룹당 10-11마리가 되도록 PBS(phosphate buffered saline)를 투여한 그룹, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 구릿대 메탄올 추출물을 투여한 그룹(methanol extract of AD (Total)), 구릿대 n-hexane 분획물을 투여한 그룹(n-hexane fraction of AD (n-hexane))으로 나누었다. 전체 추출물과 n-hexane 분획은 PBS에 쥐 몸무게 1 kg당 300 mg의 농도로 녹여서 3주 동안 매일 경구 기관 삽관을 통해 투여하였다. 혈액 내에 있는 글루코스 양과 몸무게, 음식을 먹는 정도는 매주 측정하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이 PBS를 투여한 대조군에 비해 n-hexane 분획물을 처리한 마우스에서 혈액 내의 글루코스 양이 상당히 감소함을 확인하였으나, 구릿대 추출물을 투여한 마우스에서는 글루코스 감소효과를 볼 수 없었다(도 8a).
<8-2> 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물 장기간 처리에 따른 비만 마우스 모델에서 혈액 내 글루코스 감소 효과 확인
또한 본 발명자들은 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 처리한 후 3주 후에 상기 <실시예 3>과 같이 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 PBS를 투여한 대조군에 비해 n-hexane 분획을 처리한 마우스는 글루코스를 투여하고 15분, 30분이 지났을 때 혈액 내의 글루코스 양이 상당히 감소하였으며, 그래프의 아래 면적을 비교해 본 결과 PBS를 투여한 대조군과 비교하여 구릿대 추출물을 처리한 마우스는 8% 정도 글루코스 양이 감소하였고 n-hexane 분획물을 처리한 마우스는 13% 정도 글루코스양이 감소하는 것을 확인하였다(도 8b).
<8-3> 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물 장기간 처리에 따른 비만 마우스 모델의 몸무게 증가 효과 확인
또한 본 발명자들은 마우스가 하루에 동일한 양의 음식물을 섭취하는 조건(도 8d)에서 몸무게를 비교하였다.
그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이 구릿대 추출물을 처리한 마우스는 구릿대 추출물을 투여하기 전 43.7g ± 0.7에서 구릿대 추출물 투여 3주 후 44.8 g ± 1.0으로 몸무게가 변하였고 n-hexane 분획물을 투여한 마우스는 n-hexane 분획을 투여하기 전 42.8g ± 0.7에서 n-hexane 분획 투여 3주 후 43.3 g ± 0.6으로 몸무게가 변하였으며, PBS를 투여한 쥐는 PBS를 투여하기 전 43.7g ± 0.7에서 PBS 투여 3주 후 47.3g ± 1.0으로 몸무게가 변하는 것을 확인하였다(도 8c).
이를 통해 PBS를 투여한 대조군 쥐에 비해 구릿대 추출물 또는 n-hexane 분획물을 투여한 쥐는 몸무게 증가가 감소함을 확인하였다.
통계학적 분석
데이터는 평균값±표준편차 (mean ± SE)로 나타내었다. 유의한 차이는 SPSS ver. 10.0 (SPSS Inc.)을 사용하여 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)과 던칸의 사후분석 (post-hoc Duncan procedure)을 통해 분석하였다. 또한 p<0.05이면 통계적으로 유의한 값을 갖는다는 것을 의미한다.

Claims (14)

  1. 구릿대(Angelica dahurica) 추출물의 n-헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 ~ C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 GPR119(G protein-coupled receptor 119) 항진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 구릿대(Angelica dahurica) 추출물의 n-헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병 개선용 건강기능식품.
  14. 삭제
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