KR101828696B1

KR101828696B1 - Composition for insulin secreting cell transplantation and method for preparing the same

Info

Publication number: KR101828696B1
Application number: KR1020160109311A
Authority: KR
Inventors: 김송철; 심인경
Original assignee: 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2018-02-12
Also published as: KR20170026254A

Abstract

본 발명은 지방유래 줄기세포와 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지방유래 줄기세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 지방유래 줄기세포 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계; 및 상기 접종된 인슐린분비세포를 지방유래 줄기세포와 적층구조로 공동배양하는 단계를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법에 따른 인슐린분비세포 이식용 조성물은 생체 내 인슐린분비세포의 생착률을 증가시키고 안정적으로 인슐린 분비를 유지시킬 수 있으므로, 효과적인 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다. The present invention relates to a composition for transplanting insulin-secreting cells comprising adipose-derived stem cells and insulin-secreting cells, and a method for preparing the same. More particularly, the present invention relates to a composition for culturing adipose-derived stem cells; Inoculating insulin secretory cells on the cultured adipose-derived stem cells; And co-culturing the inoculated insulin-secreting cells with a fat-derived stem cell in a laminated structure, wherein the composition for insulin-secreting cell grafting according to the method of the present invention comprises insulin- It can increase the engraftment rate of secretory cells and stably maintain insulin secretion, and thus can be effectively used as a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes.

Description

인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for insulin secreting cell transplantation and method for preparing the same}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for insulin secreting cell transplantation and a method for preparing the same,

본 발명은 지방유래 줄기세포 시트와 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for insulin-secreting cell transplantation comprising a fat-derived stem cell sheet and an insulin-secreting cell, and a method for producing the same.

한국인의 10명 가운데 3명이 고혈당 위협에 노출된 것으로 나타났으며 나이가 들수록 유병률이 증가함에 따라 국내 당뇨병 인구가 가파르게 증가함에 따라, 치료비용의 급등으로 인한 막대한 경제적 손실이 나타나고 있다. 우리나라의 경우 2003년 동안 당뇨병 환자가 사용한 진료비가 건강보험의 5분의 1을 차지하는 것으로 나타났으며 당뇨 환자의 1인당 평균 진료비는 일반인의 4.63배에 달하는 것으로 확인되었다.Three out of 10 Koreans were exposed to hyperglycemia. As the prevalence of diabetes increased with age, the domestic diabetic population increased sharply, resulting in a huge economic loss due to the surge in treatment costs. In Korea, the cost of medical care for diabetics accounted for one-fifth of the health insurance in 2003, and the average cost per person for diabetic patients was 4.63 times that of the general population.

현재 인슐린 의존성 당뇨의 주 치료법인 인슐린 주사는 매번 혈당을 측정해야 하며 저혈당 발생의 위험성 및 만성 합병증 위험을 근본적으로 막을 수 없다는 문제가 있고, 췌장 이식은 침습적이다.Currently, insulin injections, which are the main treatment for insulin-dependent diabetes mellitus, have to measure blood glucose every time, and there is a problem that the risk of hypoglycemia and the risk of chronic complications can not be fundamentally prevented, and pancreas transplantation is invasive.

췌장도세포 이식은 췌장이식과 달리 비교적 간단한 수술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하며 무엇보다도 체외에서의 배양 가능성 및 면역조절(immuno-modulation)등의 조작을 시행할 수 있고 췌장도세포의 장기간 냉동보관 및 장거리 이송이 가능하다는 장점이 있어 가장 이상적인 치료방법으로 부각되고 있으나, 현재까지는 이식 세포원의 부족, 면역반응과 같은 문제가 발생하고 있어 10% 정도의 낮은 치료 성과를 나타내고 있다.Pancreatic cell transplantation is a relatively simple procedure, unlike pancreas transplantation, which can be easily transplanted without complications. In addition, it is possible to carry out operations such as in vitro culture and immuno-modulation, And long-distance transfer. However, until now, problems such as lack of transplanted cell source and immune response have occurred, showing a therapeutic result as low as about 10%.

특히, 췌장도세포 공급원의 학보가 가장 중요한 임상적 난제이며, 성공적인 췌장도세포 이식을 위해서는 해결해야할 가장 중요한 문제이다.Particularly, the pancreas is the most important clinical difficulty of the cell source, and successful pancreas is the most important problem to be solved for cell transplantation.

일반적인 췌장도세포의 이식은 간문맥을 통하여 주입되며, 이 경우 혈액을 통한 염증 반응, 급성 허혈손상, 혈전생성 유도 등의 위험성이 있다. 또한 이식된 세포의 섬유화, 고혈당 및 이상지질혈증으로 인한 독성(glucolipotoxicity), 혈관생성과 같은 문제로 이식된 췌장도세포의 50-75%가 생착되지 못함에 따라, 수년 안에 대부분 당뇨가 재발하는 경우가 많다. In normal pancreas, transplantation of cells is injected through the portal vein. In this case, there is a risk of inflammation through blood, acute ischemic injury, and induction of thrombogenesis. In addition, 50-75% of the transplanted pancreas does not engraft in transplantation due to fibrosis, hyperglycemia and dyslipidemia (glucolipotoxicity) and angiogenesis, and most of the cases of diabetes return within a few years There are many.

이러한 세포치료제의 문제를 해결하기 위해 다양한 종류의 지지체를 이용하거나 캡슐화와 같은 조직공학 기술을 이용한 세포치료제에 관한 연구가 수행되고 있다. In order to solve the problem of such a cell therapy agent, studies on cell therapy agents using various kinds of scaffolds or tissue engineering techniques such as encapsulation have been conducted.

세포치료제의 효과적인 이식을 위하여 다양한 종류의 지지체가 시도되고 있으나, 심장, 간, 췌장과 같이 대부분의 세포로 이루어진 구조를 갖는 장기의 경우 지지체로 인하여 세포간의 긴밀한 상호작용을 이루기 어렵고, 지지체의 분해가 완전하지 않을 경우 이차적인 부작용으로 인하여 기능성이 저하됨에 따라, 지지체와 같은 이물질을 사용하지 않고 세포로 이루어진 삼차원 형태의 생체모방형 장기의 개발이 필요하다.Various types of scaffolds have been tried for effective transplantation of cell therapy agents. However, in the case of organs having a structure composed of most cells such as heart, liver and pancreas, it is difficult to achieve intimate interaction between cells due to scaffold, In the case of incompleteness, the secondary side effect causes a decrease in functionality, and thus it is necessary to develop a three-dimensional biomimetic organs composed of cells without using a foreign substance such as a support.

한국공개특허 제2009-0110738호Korea Patent Publication No. 2009-0110738

본 발명은 기존의 간문맥을 통하여 이식되는 췌장도세포의 낮은 생착률을 해결하기 위한 방법으로 지방유래 줄기세포를 이용한 세포 시트에 인슐린분비세포를 적층시킨 후 공동배양하여 제작한 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제공하여 인슐린분비세포의 생체 내 이식율 및 안전성을 증가시키고 효과적인 인슐린분비를 통하여 당뇨병을 예방하거나 치료하고자 한다.The present invention relates to a composition for insulin secretory cell transplantation prepared by laminating insulin-secreting cells on a cell sheet using adipose derived stem cells and co-culturing pancreas transplantation through a conventional portal vein, To increase the in vivo transplantation rate and safety of insulin-secreting cells and to prevent or treat diabetes through effective insulin secretion.

본 발명은 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트 및 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for insulin-secreting cell transplantation comprising a cell sheet comprising adipose-derived stem cells and an insulin-secreting cell.

본 발명은 상기 인슐린분비세포 이식용 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes comprising the composition for insulin secretory cell transplantation.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 상기 세포시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b); 및 상기 접종된 인슐린분비세포를 지방유래 줄기세포 시트와 적층구조로 공동배양하는 단계(c)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공한다.(A) preparing a cell sheet by culturing adipose derived stem cells; (B) inoculating insulin secretory cells onto the cell sheet; And (c) co-culturing the inoculated insulin secreting cells with a fat-derived stem cell sheet in a laminated structure. The present invention also provides a method for preparing a composition for insulin secretory cell transplantation.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 및 상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공한다.(A) preparing a cell sheet by culturing adipose derived stem cells; And (b) inoculating an insulin-secreting cell on the cell sheet. The present invention also provides a method for preparing a composition for insulin-secreting cell transplantation.

본 발명에 따르면, 인슐린분비세포 이식용 조성물은 같은 용량의 췌장도세포가 이식된 동물군보다 향상된 혈당조절 효과를 나타내었고, 혈중 글루코즈 농도가 정상 대조군과 유사하게 조절되는 것이 확인되었으며, 이식 2개월 후에도 이식부위에서 인슐린분비세포가 인슐린을 안정적으로 분비하는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 인슐린분비세포 이식용 조성물은 생체 내 인슐린분비세포의 생착률을 증가시키고 안정적인 인슐린 분비를 유지시킬 수 있으므로, 효과적인 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다. According to the present invention, it was confirmed that the composition for insulin-secreting cell transplantation showed an improved glucose control effect on the pancreas of the same dose compared to the animal group to which the cells were transplanted, and the blood glucose concentration was regulated similarly to the normal control group, Since it is confirmed that insulin secretory cells stably secrete insulin at the transplantation site, the composition for insulin secretory cell transplantation of the present invention can increase the engraftment rate of insulin-secreting cells in vivo and maintain stable insulin secretion, For example, as a pharmaceutical composition for prevention or treatment.

도 1은 지방유래 줄기세포 세포 시트 제작 및 상기 세포 시트 위에 췌장도세포를 적층형으로 공동배양하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 세포 시트 성능을 평가하여 최적의 세포 시트 제조방법을 확인하기 위한 실험군을 나타낸 도면이다.
도 3은 지방유래 줄기세포 시트와 췌장도세포의 공동배양 방법에 따른 세포 생리활성을 비교한 결과로, 도 3A는 췌장도세포 실험군, 세포부유액 상태로 공동배양된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 실험군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 적층 공동배양 실험군의 배양 6시간 후 및 배양 4일 후 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3B는 지방유래 줄기세포 시트 실험군, 췌장도세포 실험군, 세포부유액 상태로 공동배양된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 실험군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 적층 공동배양 실험군의 배양 6시간 후 및 배양 4일 후 인슐린분비능을 확인한 결과이다.
도 4는 지방유래 줄기세포 시트 위에 췌장도세포를 적층시키고 공동배양하여 인슐린분비 세포 이식용 조성물을 제조하는 과정 및 당뇨가 유도된 마우스 피하에 상기 이식용 조성물을 이식하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 췌장도세포, 지방유래 줄기세포, 췌장도세포/지방유래 줄기세포 혼합물 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 주입된 각각의 췌장부전 마우스 동물모델의 혈당 및 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 정상대조군, 당뇨 마우스군 및 지방유래 줄기세포 시트로 췌장도세포가 이식된 당뇨 마우스군의 혈중 글루코즈 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 이식 1 및 2 개월 후 이식부위에 췌장도세포의 생착률을 확인한 조직학적 분석결과이다.
도 8은 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트를 마우스 동물 피하, 복막 및 간 표면에 이식하고, 이식 직후 및 이식 2개월 후 이식된 세포 시트를 확인한 결과이다.
도 9는 피하, 복막 및 간 표면에 1500IEQ 및 3000IEQ 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스군의 혈중 글루코즈 및 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 피하에 3000IEQ 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스, 간 표면에 1500IEQ 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스, 정상군 및 당뇨 마우스를 6시간 이상 금식시키고, 생리식염수에 녹인 포도당(2g/kg)을 복강으로 주입한 후 5, 15, 30, 60 및 120분에 각각의 마우스에서 혈중 글루코스를 확인한 내당능시험(IPGTT) 결과이다.
도 11 및 도 12는 간문맥을 통한 단일세포 주입 및 간 표면 세포이식 방법의 세포 전달 효율을 비교하기 위해 수행된 실험과정 및 결과이다.
도 13은 세포 시트 부착 효율성을 증가시키기 위해 개발된 콜라겐/L-도파 프레임과 상기 프레임을 이용하여 마우스 복막 표면에 세포 시트를 부착한 모습 및 세포 시트 부착 1일 후 세포 잔류 정도를 확인한 결과이다. FIG. 1 is a schematic view showing a method for producing a cell sheet of adipose-derived stem cells and co-culturing pancreatic islet cells on the cell sheet in a laminated form.
FIG. 2 is a view showing an experimental group for evaluating the cell sheet performance to confirm an optimal cell sheet production method.
FIG. 3 shows the result of comparing the cell physiological activities according to the co-culturing method of the fat-derived stem cell sheet and the pancreatic duct cell, and FIG. 3A shows the pancreatic cell- FIG. 3B is a graph showing cell cytotoxicity after 6 hours of incubation and 4 days after culturing in the cell / fat-derived stem cell lamination co-cultured experimental group, and FIG. And the result of insulin secretion ability after 6 hours of incubation and 4 days after incubation of the cell / fat-derived stem cell test group and the pancreatic cell / adipose stem cell sheet lamination co-culture test group co-cultured with each other.
FIG. 4 is a schematic view showing a process of preparing a composition for insulin secretory cell transplantation by laminating and co-culturing pancreatic islet cells on a fat-derived stem cell sheet, and a process of transplanting the composition for transplantation under a diabetic-induced mouse.
FIG. 5 shows blood glucose and body weight changes of pancreatic adenocarcinoma mouse models injected with pancreatic cell, adipose-derived stem cell, pancreatic cell / adipose-derived stem cell mixture, and pancreatic cell / adipose-derived stem cell sheet .
FIG. 6 is a graph showing blood glucose changes of a normal control group, a diabetic mouse group, and a diabetic mouse group into which a pancreatic islet cell was transplanted into a fat-derived stem cell sheet.
FIG. 7 is a histological analysis of pancreatic cell-to-adrenal stem cell sheet transplantation at 1 and 2 months after transplantation.
Fig. 8 shows the result of confirming the cell sheet transplanted immediately after the transplantation and 2 months after transplantation, in which the pancreas cell / adipose-derived stem cell sheet was transplanted into the mouse animal subcutaneously, peritoneum and liver surface.
FIG. 9 shows blood glucose and body weight changes of pancreatic insufficiency mice group transplanted with 1500 IQ and 3000 IEQ pancreatic cell / adipose stem cell sheet on subcutaneous, peritoneal and liver surfaces.
Fig. 10 is a graph showing the results of a pancreatic insufficiency mouse injected with 3000 IEQ pancreatic cell / adipose stem cell sheet, a pancreatic insufficiency mouse injected with 1500 IEQ pancreatic cell / adipose stem cell sheet, (IPGTT) results obtained by inserting glucose (2 g / kg) dissolved in physiological saline into the abdominal cavity and confirming blood glucose levels at 5, 15, 30, 60 and 120 minutes in each mouse.
FIGS. 11 and 12 show experimental procedures and results for comparing the cell transfer efficiency of the single cell injection and hepatic surface cell transplantation through the portal vein.
FIG. 13 is a result of confirming the degree of cell retention after 1 day of attachment of the cell sheet and the appearance of attaching the cell sheet to the surface of mouse peritoneal membrane using the collagen / L-dopa frame developed to increase the cell sheet attachment efficiency.

본 발명은 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트 및 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제공할 수 있다.The present invention can provide a composition for insulin-secreting cell transplantation comprising a cell sheet composed of adipose-derived stem cells and an insulin-secreting cell.

상기 조성물은 인슐린분비세포가 접종된 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트를 포함할 수 있다.The composition may comprise a cell sheet consisting of adipose-derived stem cells inoculated with insulin secreting cells.

상기 세포 시트는 콜라겐과 L-도파를 더 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 것일 수 있다.The cell sheet may further include collagen and L-dopa, and more specifically, may surround the outer periphery of the cell sheet with a frame made of collagen and L-waveguide.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 5와 같이 본 발명의 인슐린분비세포 이식용 세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스군의 혈당 조절효과를 확인한 결과, 같은 용량의 췌장도세포만 이식된 마우스군보다 향상된 혈당 조절 능력을 나타내었으며, 세포 시트가 제거될 때까지 혈당조절 능력이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. According to one embodiment of the present invention, as shown in FIG. 5, when the cell sheet for insulin secreting cell transplantation of the present invention was transplanted, the blood glucose control effect of the transplanted pancreatic insufficiency mouse group was examined. As a result, Showed improved blood glucose control ability, and blood glucose control ability was maintained until the cell sheet was removed.

또한, 도 6을 참고하면 세포 시트가 이식된 당뇨병 마우스군의 혈중 글루코즈 농도가 정상대조군의 혈중 글루코즈 농도와 유사한 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.6, it was confirmed that the glucose concentration in the blood of the diabetic mouse group to which the cell sheet was transplanted was similar to the blood glucose concentration in the normal control group.

따라서, 본 발명의 인슐린분비세포 이식용 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물로 제공될 수 있다.Accordingly, the composition for insulin secretory cell transplantation of the present invention can be provided as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물 100 중량부에 대하여 인슐린분비세포 이식용 조성물을 0.01 내지 90 중량부, 0.1 내지 90 중량부, 1 내지 90 중량부 또는 10 내지 90 중량부로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달라질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition comprises 0.01 to 90 parts by weight, 0.1 to 90 parts by weight, 1 to 90 parts by weight, or 10 to 90 parts by weight of a composition for insulin secretory cell transplantation with respect to 100 parts by weight of the pharmaceutical composition But the present invention is not limited thereto, and may vary depending on the condition of the patient, the type of disease, and the progress of the disease.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내,근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여될 수 있으며, 각 장기의 표면에 부착될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition may be administered orally, intraarterally, intraperitoneally, intramuscularly, intraarterally, intraperitoneally, intrasternally, transdermally, nasally, inhaled, topically, rectally, Can be administered to a subject in a conventional manner via the intradermal route and can be attached to the surface of each organ.

상기 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 1,000 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 1,000 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.The preferred dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the condition and body weight of the patient, the type and degree of disease, the type of drug, the route of administration, and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. According to one embodiment of the present invention, the daily dose may be 0.01 to 1,000 mg / kg, specifically 0.1 to 1,000 mg / kg, more specifically 0.1 to 100 mg / kg, though it is not limited thereto. The administration may be performed once a day or divided into several times, and thus the scope of the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b); 및 상기 접종된 인슐린분비세포를 지방유래 줄기세포 시트와 적층구조로 공동배양하는 단계(c)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공한다.(A) preparing a cell sheet by culturing adipose derived stem cells; (B) inoculating insulin secretory cells onto the cell sheet; And (c) co-culturing the inoculated insulin secreting cells with a fat-derived stem cell sheet in a laminated structure. The present invention also provides a method for preparing a composition for insulin secretory cell transplantation.

상기 이식용 조성물 제조방법은 (c) 단계의 공동배양된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계(d)를 추가로 더 포함할 수 있다.The method for preparing a graft composition may further include the step (d) of enclosing the periphery of the co-cultured cell sheet of step (c) with a frame made of collagen and L-waveguide.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 고리형태로 제작된 콜라겐/L-도파 프레임에 세포 시트를 부착하고 마우스 동물모델 복막 좌측 표면에 이식하고, 우측 표면에는 세포 시트를 단독으로 이식한 후, 이식 1일 후 세포 잔류를 확인한 결과, 도 12와 같이 콜라겐/L-도파 프레임을 이용하여 세포 시트를 이식한 좌측 복막에서는 세포 잔류가 확인된 반면, 세포 시트를 단독으로 이식한 우측 복막에서는 잔류세포가 확인되지 않았다.According to another embodiment of the present invention, a cell sheet is attached to a collagen / L-dopa frame produced in the form of a ring, and the cell sheet is implanted on the left surface of the mouse animal model peritoneum. As a result of confirming the cell remaining after 1 day, cell residence was observed in the left peritoneum where the cell sheet was transplanted using the collagen / L-dopa frame as shown in FIG. 12, whereas in the right peritoneum where the cell sheet alone was transplanted, Not confirmed.

상기 결과로부터 콜라겐/L-도파 프레임을 이용할 경우 세포 시트 부착이 어려운 부위에서도 세포 시트 부착능을 향상시킬 수 있음이 확인됨에 따라, 콜라겐/L-도파 프레임은 다양한 부위에 세포 시트 부착을 가능하게 하여 인슐린 분비세포를 안정적으로 전달함으로써, 세포 부착능 저하에 따른 혈당조절 효과 감소 문제점을 해결할 수 있다. From the above results, it was confirmed that when the collagen / L-dopa frame is used, the ability to adhere the cell sheet can be improved even in areas where cell sheet adhesion is difficult. Therefore, collagen / L- By stably transferring insulin secretory cells, it is possible to solve the problem of decreasing the blood glucose control effect due to a decrease in cell adhesion ability.

상기 (a) 단계의 지방유래 줄기세포는 포유동물 유래일 수 있으며, 상기 (b) 단계의 인슐린분비세포는 포유동물 유래 췌장도세포일 수 있다.The adipose-derived stem cell of step (a) may be derived from a mammal, and the insulin-secreting cell of step (b) may be a mammalian-derived pancreatic cell.

상기 포유동물은 인간, 소, 말, 돼지, 염소, 개, 고양이, 닭, 마우스, 랫트 또는 래빗일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간 또는 랫트일 수 있다.The mammal may be a human, a bovine, a horse, a pig, a goat, a dog, a cat, a chicken, a mouse, a rat or a rabbit, and more preferably a human or a rat.

상기 (b) 단계는 지방유래 줄기세포가 70 내지 100 % 합류된 세포 시트에 인슐린분비세포를 10 IEQ 내지 4000 IEQ로 접종될 수 있으며, 상기 (c) 단계의 접종된 인슐린분비세포는 지방유래 줄기세포 위에서 6시간 내지 7일간 공동배양될 수 있다.In step (b), insulin secretory cells may be inoculated at 10 IEQ to 4000 IEQ on a cell sheet in which 70-100% of adipose derived stem cells are joined, and the inoculated insulin secretory cells of step (c) Lt; RTI ID = 0.0 > 6-7 < / RTI > days.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 및 상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공할 수 있다.(A) preparing a cell sheet by culturing adipose derived stem cells; And (b) inoculating an insulin-secreting cell on the cell sheet.

상기 이식용 조성물 제조방법은 (b) 단계의 인슐린분비세포가 접종된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계 또는 (b) 단계의 인슐린분비세포가 접종된 세포 시트를 랩핑(wrapping)하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.The method for preparing a composition for grafting comprises the steps of enclosing the outer periphery of the cell sheet in which the insulin secreting cells of step (b) are inoculated with a frame made of collagen and L-waveguide, or wrapping the cell sheet on which the insulin secreting cells of step (b) the method further comprising the step of wrapping.

상기 지방유래 줄기세포는 온도에 따라 친수성이 변하는 표면에 배양될 수 있으며, 상기 방법으로 배양된 세포는 세포외 기질의 손상이 없고, 세포와 세포외 기질의 생체 내 상호 작용을 갖는 형태로 이식됨으로 세포 전달 효율이 높고 향상된 기능을 나타낼 수 있다.The adipose-derived stem cells can be cultured on a surface of which the hydrophilicity varies depending on the temperature, and the cells cultured by the above method are free from damage to the extracellular matrix and are transplanted into a form having in vivo interactions between the cell and the extracellular matrix The cell delivery efficiency is high and the function can be improved.

췌장도세포 이식의 체내 적용의 가장 큰 문제점은 췌장도세포의 특성상 분리 및 이식과정 중 심각한 세포사멸 및 인슐린 분비 기능저하가 나타나고 이식 후 충분한 산소공급이 이루어지지 않을 경우 허혈성 손상이 나타날 수 있다. 또한 이식 방법에 따라서 일반적인 주입 방법의 경우, 이식부위에서 세포가 매우 낮은 생착률을 나타내어 실제 이식한 세포의 효능이 거의 나타나지 않는 문제가 있다.The most serious problem of pancreatic cell transplantation in the body is pancreatic ischemia due to the nature of the cells, which may result in severe apoptosis and insulin secretion during transplantation and insufficient oxygen supply after transplantation. In addition, according to the transplantation method, in the case of a general injection method, the cells have a very low engraftment rate at the transplantation site, and the effect of the actually transplanted cells hardly occurs.

그러나 췌장도세포를 지방유래 줄기세포를 함께 이식할 경우, 지방유래 줄기세포가 분비하는 다양한 성장인자 및 호르몬으로 인하여 췌장도세포의 아팝토시스를 억제될 수 있으며, 인슐린 분비 효과가 유지되거나 향상되는 것이 확인되었다. 또한, 지방유래 줄기세포가 분비하는 성장호르몬인 VEGF로 인하여 이식 초기부터 이식부위에 많은 신생혈관 생성이 유도되어 이식된 세포에 충분한 산소를 공급할 수 있다.However, when the pancreatic cells are transplanted with adipose-derived stem cells, the pancreatic cells can be inhibited from apoptosis of the cells due to various growth factors and hormones secreted from adipose-derived stem cells, and the insulin secretory effect is maintained or improved . In addition, VEGF, a growth hormone secreted by adipose-derived stem cells, induces a large number of neovascularization at the transplantation site from the early stage of transplantation, thereby supplying sufficient oxygen to the transplanted cells.

또한, 본 발명의 지방유래 줄기세포를 세포시트 형태로 이식할 경우 도 7과 같이 췌장도세포의 체내 생착률이 향상되는 것이 확인되었는데, 이는 췌장도세포가 지방유래 줄기세포 시트 내부에 머물러 있게 됨으로써 이식되는 췌장도세포의 체내 생착률을 향상시키는 것으로 확인되었다.In addition, when the adipose-derived stem cells of the present invention are transplanted into the cell sheet form, the pancreatic cell engraftment rate is improved as shown in FIG. 7 because the pancreas cells remain in the fat-derived stem cell sheet, The pancreas was also found to enhance the engraftment of cells in the body.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

<< 실시예Example 1> 지방유래 줄기세포 시트를 이용한 인슐린분비세포 이식용 조성물 제작 1> Preparation of composition for insulin-secreting cell transplantation using fat-derived stem cell sheet

도 1과 같은 과정으로 지방유래 줄기세포를 이용하여 세포시트를 제작하고 인슐린분비세포와 공동배양하여 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제작하였다.1, a cell sheet was prepared using adipose-derived stem cells and co-cultured with insulin-secreting cells to prepare a composition for insulin-secreting cell transplantation.

먼저, 환자의 지방으로부터 콜라겐분해효소를 이용하여 지방유래 줄기세포 를 분리하여 배양하였다. 이렇게 획득된 지방유래 줄기세포의 특성을 확인한 후, 충분한 양의 지방유래 줄기세포를 일반 세포배양 접시에 배양하였다.First, adipose derived stem cells were isolated and cultured from the fat of the patient using collagenase. After confirming the characteristics of the obtained fat-derived stem cells, a sufficient amount of adipose-derived stem cells was cultured in a general cell culture dish.

그 후, 트립신-EDTA 방법을 이용하여 지방유래 줄기세포(3 계대부터 5 계대까지 사용)를 단일세포로 획득하고, 상기 단일세포를 온도감응성 배양접시(UpCell)에 2×10⁴ 내지 2×10⁵ /cm²의 밀도로 분주하고 2일에서 5일간 배양하여 지방유래 줄기세포가 완전히 합류(confluence)되도록하여 세포 시트를 제작하였다.Thereafter, using a trypsin -EDTA method obtains the adipose derived stem cells (using from 3 to 5 passages passaged) in a single cell, and the temperature of the single cell responsive culture dish (UpCell) 2 × 10 ⁴ to 2 × 10 ⁵ / cm < ² > and cultured for 2 to 5 days to make confluence of the fat-derived stem cells. Thus, a cell sheet was prepared.

SD(Sprague Dawley) 래트의 췌장에서 콜라겐분해효소와 밀도차이를 이용하여 췌장도세포를 분리 정제하였다. 상기 방법으로 분리된 췌장도세포 3000 IEQ를 상기 온도감응성 배양접시에서 배양된 지방유래 줄기세포 시트에 접종하고 6시간에서 24시간 방치하여 췌장도세포와 지방유래 줄기세포의 부착을 유도하여 췌장도세포와 지방유래줄기세포 시트 공동배양 구조체를 제작하였다.Pancreatic islet cells were isolated and purified using the difference in collagenase and density in the pancreas of SD (Sprague Dawley) rats. The isolated pancreatic cell 3000 IEQ was inoculated onto the fat-derived stem cell sheet cultured in the temperature-sensitive culture dish and left for 6 to 24 hours to induce adherence of pancreatic cell and adipose-derived stem cells, And stem cell culture co - cultured with adipocyte were prepared.

<< 실시예Example 2> 세포 시트의 체외 생리활성 확인 2> Confirmation of in vitro bioactivity of cell sheet

상기 실시예 1에서 제작된 세포 시트의 체외 생리활성을 확인하였다.The extracellular bioactivity of the cell sheet prepared in Example 1 was confirmed.

실시예 1과 같은 방법으로 제작된 지방유래 줄기세포 시트에 췌장도세포 50개를 접종하여 공동배양하였다. 또한, 도 2와 같이 지방유래 줄기세포로만 이루어진 실험군, 동량의 췌장도세포로 이루어진 실험군, 동량의 췌장도세포와 지방유래 줄기세포를 세포부유액 상태로 공동배양한 실험군을 대조군으로 선정하였다.50 pancreatic duct cells were inoculated into the fat-derived stem cell sheet prepared in the same manner as in Example 1 and co-cultured. In addition, as shown in Fig. 2, an experimental group consisting of only fat-derived stem cells, an experimental group consisting of the same amount of pancreatic duct cells, and an experimental group co-cultured with the same amount of pancreatic duct cells and adipose stem cells in a cell suspension state were selected as a control group.

상기 실험군들과 같이 췌장도세포를 단독 또는 지방유래 줄기세포와 함께 6시간 또는 4일간 배양한 후 Live/dead viability/cytotoxicity assay kit (Invitrogen)을 이용하여 각 실험군에서 췌장도세포의 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험방법을 통하여 살아있는 세포는 calcein AM에 의하여 녹색 형광을 띄고, 죽은 세포는 ethidium homodiber-1에 의하여 적색 형광을 띄게 된다.As with the experimental groups, pancreatic cells were incubated for 6 hours or 4 days with single or adipogenic stem cells, and the cell death rate of pancreatic islet cells was measured using Live / dead viability / cytotoxicity assay kit (Invitrogen) Respectively. Through this experiment, live cells are shown to be green fluorescence by calcein AM, and dead cells are red fluorescence by ethidium homodiber-1.

그 결과, 도 3A와 같이 췌장도세포가 지방유래 줄기세포 시트에서 공동배양된 실험군 및 지방유래 줄기세포와 세포부유액 상태로 공동배양된 실험군보다 췌장도세포를 단독으로 배양한 실험군에서 죽은 세포가 많이 관찰되었다.As a result, as shown in FIG. 3A, in the experimental group in which the pancreatic cells were co-cultured in the adipose-derived stem cell sheet and in the experimental group in which the pancreatic duct cell alone was cultured in comparison with the experimental group in which the adipose stem cells and the cell suspension- Respectively.

상기 결과로부터 지방유래 줄기세포가 췌장도세포를 보호효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that adipose derived stem cells protect the pancreatic duct cell.

또한, 췌장도세포의 인슐린 분비기능을 체외에서 평가하기 위하여 포도당 자극 인슐린 분비(Glucose stimulated insulin secretion: GSIS)에 관한 실험(A Practical Guide to Rodent Islet Isolation and Assessment. Biological Procedures Online, Volume 11, Number 1, 2009)을 수행하였다.In addition, in order to evaluate the insulin secretion function of the pancreatic duct cell in vitro, an experiment on glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) was carried out (A Practical Guide to Rodent Islet Isolation and Assessment. Biological Procedures Online, Volume 11, Number 1 , 2009) were performed.

상기 방법으로 모든 실험군을 1일 또는 4일간 배양하고 췌장도세포가 분비하는 인슐린양을 확인하여 저농도의 포도당(3.3mM)에서 췌장도세포가 분비하는 인슐린과 고농도의 포도당(16.7mM)에서 췌장도세포가 분비하는 인슐린양의 비율을 stimulation index(SI)로 표현하였다.All of the experimental groups were cultured for 1 day or 4 days and the amount of insulin secreted by the pancreas was confirmed. As a result, insulin and high glucose (16.7 mM) secreted from the pancreas by low glucose (3.3 mM) The ratio of the amount of insulin secreted by the cells is expressed as a stimulation index (SI).

그 결과, 도 3B와 같이 췌장도세포를 단독 배양한 실험군은 배양 4일 후 SI 수치가 2.5에서 1.5로 급격히 감소하였으나, 지방유래 줄기세포와 공동배양한 실험군은 4일간 배양하여도 SI 수치가 1일과 변함없이 유지되는 것이 확인되었다. As a result, as shown in FIG. 3B, the SI value decreased rapidly from 2.5 to 1.5 after 4 days of culture in the test group in which the cells were cultured alone. However, even when the test group co-cultured with adipose derived stem cells, It was confirmed that the work was kept unchanged.

상기 결과로부터 지방유래 줄기세포는 췌장도세포의 인슐린 분비기능을 유지하는 효과가 있음이 확인되었으며, 상기 결과들로부터 지방유래 줄기세포 또는 지방유래 줄기세포로 구성된 세포 시트는 공동배양된 췌장도세포의 생존 및 인슐린 분비 기능을 잘 유지하는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.Based on the above results, it was confirmed that the fat-derived stem cells maintain the insulin secretion function of the pancreatic islet cells. From the above results, the cell sheet composed of the fat-derived stem cells or the fat-derived stem cells, Survival and insulin secretion function.

<< 실시예Example 3> 세포 시트의 in 3> in the cell sheet vivovivo 활성 확인 Verify Active

1. One. 췌장부전Pancreatic insufficiency 마우스 동물모델에 세 Three animals on mouse model 포시트Foam sheet 이식 transplantation

상기 실시예 1에서 제작된 각 이식용 조성물을 도 4와 같이 췌장부전에 의해 당뇨가 유도된 마우스 동물 모델의 피하에 이식하였다.Each of the grafting compositions prepared in Example 1 was transplanted under the hypothalamus-induced mouse animal model by pancreatic insufficiency as shown in Fig.

먼저, 누드마우스에 스트렙토조토신(Streptozotocin) 180mg/kg을 투여하여 췌장부전 마우스를 제작하고 상기 췌장부전마우스의 혈당이 3일 이상 300 mg/dl로 일정하게 유지되어 당뇨가 유도된 것을 확인하였다.First, 180 mg / kg of streptozotocin was administered to a nude mouse to prepare a pancreatic insufficiency mouse, and the blood glucose level of the pancreatic insufficiency mouse was maintained at 300 mg / dl for 3 days or more to confirm that diabetes was induced.

실시예 1과 같이 제작된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 공동배양 구조체의 배양온도를 20℃ 이하로 낮추어 세포 시트를 온도감응성 배양접시로부터 부유시켰다. 이렇게 얻어진 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 공동배양 구조체를 cell shifter를 이용하여 상기 제작된 췌장부전 마우스 피하에 이식하여 세포 시트를 피하에 부착시킨 후 cell shifter를 제거하고 피부를 봉합하였다. 또한, 이식시 췌장세포가 탈락되지 않도록 지방유래 줄기세포 시트의 모양을 봉입 형태가 되도록 랩핑(wrapping)할 수 있다.The cell sheet was suspended from the temperature-sensitive culture dish by lowering the culture temperature of the pancreatic cell / fat-derived stem cell sheet co-cultured construct prepared as in Example 1 to 20 ° C or lower. The pancreatic cell / adipose stem cell sheet co-cultured structure thus obtained was transplanted into the prepared pancreatic insufflated mouse subcutaneously using a cell shifter to adhere the cell sheet to the subcutaneous tissue, the cell shifter was removed, and the skin was sutured. In addition, the shape of the fat-derived stem cell sheet may be wrapped so as to prevent the pancreatic cells from being detached at the time of transplantation.

또한, 대조군으로 지방유래 줄기세포 시트를 상기 동일한 방법으로 췌장부전 마우스 피하에 이식하였으며, 췌장도세포 실험군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 공동배양 실험군은 피하에 주사기를 이용하여 주입하였다. In addition, as a control group, adipose-derived stem cell sheets were transplanted into the pancreas hypodermic mouse subcutaneously in the same manner as above, and pancreatic cell adenocarcinoma and pancreatic cell / adipose-derived stem cell co-culture experimental group were injected subcutaneously using a syringe.

2. 혈당 조절 및 체중변화 확인2. Control of blood sugar and change of weight

상기 실시예 3-1에서 췌장도세포, 지방유래 줄기세포 시트, 췌장도세포/지방유래 줄기세포 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 주입 또는 이식된 각 췌장부전 마우스 동물모델 실험군의 혈당 및 체중 변화를 확인하였다.In Example 3-1, the pancreatic duct, fat-derived stem cell sheet, pancreatic duct / fat-derived stem cell, and pancreatic duct / fat derived stem cell sheet were injected or implanted, Weight change was confirmed.

매일 일정한 시간마다 실험군 및 대조군 마우스의 체중을 측정하였으며, 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.The body weight of the experimental group and the control mice was measured at regular intervals every day, and blood glucose was measured by collecting blood from the tail.

그 결과, 도 5와 같이 같은 양의 췌장도세포가 이식되었을 때, 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 실험군에서 매우 효과적인 혈당조절능이 확인되었으며, 몸무게가 증가하였다. 반면, 이식물 제거 후 혈당조절능이 사라진 것을 확인할 수 있었다.As a result, when the cells of the same amount of pancreas were transplanted as shown in FIG. 5, the pancreatic cell / adipose-derived stem cell sheet was transplanted with a very effective blood glucose control ability, and the body weight was increased. On the other hand, it was confirmed that glucose control ability disappeared after removal of the graft.

또한, 정상군, 당뇨가 유도된 마우스군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 동물 실험군의 혈중 글루코스 농도를 확인하였다.In addition, blood glucose levels of normal group, diabetes induced mouse group, and pancreatic cell / fat derived stem cell sheet transplanted animal test group were determined.

이식된 췌장도세포의 당반응성을 확인하기 위해, 내당능시험(IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test)을 수행하였다. 정상마우스, 당뇨마우스 및 췌장도세포/지방유래줄기세포 시트가 이식된 마우스를 6시간 이상 금식시키고, 생리식염수에 녹인 포도당(2g/kg)를 복강으로 주입하였다. Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was also performed to confirm the glucose responsiveness of transplanted pancreatic cells. Mice transplanted with normal / mouse / diabetic mouse / pancreatic cell / adipose derived stem cell sheets were fasted for 6 hours or more, and glucose (2 g / kg) dissolved in physiological saline was injected into the abdominal cavity.

주입 후 5, 15, 30, 60 및 120분에 각각의 마우스에서 혈당을 측정하였다.Blood glucose was measured in each mouse at 5, 15, 30, 60 and 120 minutes after injection.

그 결과, 도 6과 같이 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 당뇨 마우스 동물모델의 혈중 글루코스 농도가 정상군과 유사한 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that blood glucose concentration in the diabetic mouse animal model transplanted with the pancreas cell / adipose stem cell sheet was recovered to a level similar to that of the normal group, as shown in FIG.

상기 결과로부터 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트의 혈당 조절능력이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the pancreatic cell / fat-derived stem cell sheet has a very excellent blood glucose controlling ability.

<< 실시예Example 4> 이식된 인슐린분비세포의 4> Transplanted insulin-secreting cells 생착능Viability 확인 Confirm

조직학적 평가를 통하여 마우스에 지방유래 줄기세포 시트를 이용하여 이식된 췌장도세포의 생착 정도를 확인하였다.Histologic evaluation showed that the transplantation of the transplanted pancreatic cells with the adipose - derived stem cell sheet of the mouse was confirmed.

췌장도세포/지방유래줄기세포 시트를 당뇨병 모델 마우스 피하에 이식한 후 이식된 췌장도세포의 생착 및 인슐린 분비능을 확인하기 위해, 면역조직학적 염색을 수행하였다. 이식 후 1 및 2개월 후 이식부위에서 이식물을 확인하고 조직을 확보하였다. 이렇게 확보된 피하조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 4시간 고정한 후 30% 수크로스(sucrose)로 3일간 치환하고 O.C.T compound를 이용하여 동결블럭을 제작하였다. 제작된 동결블럭을 6um 두께의 슬라이드로 제작하고 사람 인슐린(insulin) 일차 항체와 형광을 나타내는 이차 항체(적색 형광)를 차례로 붙이고 핵은 DAPI로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.Pancreatic cell / adipose - derived stem cell sheets were transplanted subcutaneously into diabetic model mice, and immunohistochemical staining was performed to confirm transplanted pancreatic cell engraftment and insulin secretion. One and two months after the transplantation, the grafts were identified at the graft site and the tissue was secured. The subcutaneous tissue thus obtained was fixed in 4% paraformaldehyde for 4 hours, then replaced with 30% sucrose for 3 days, and frozen blocks were prepared using O.C.T compound. The prepared frozen blocks were made into slides with a thickness of 6 urn, and the human insulin primary antibody and secondary antibody (red fluorescence) indicating fluorescence were attached in order. The nuclei were stained with DAPI and observed with a fluorescence microscope.

그 결과, 도 7과 같이 세포 시트 이식 후 1 및 2개월 이후에도 이식부위의 췌장도세포에서 인슐린이 분비되고 있는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 7, it was confirmed that insulin was secreted from the pancreatic cell in the transplantation site even after 1 and 2 months after the cell sheet transplantation.

상기 결과로부터 본 발명의 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 동물 모델의 췌장도세포 생착률이 향상된 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the pancreatic cell adhesion rate of the animal model transplanted with the pancreatic cell / adipose-derived stem cell sheet of the present invention was improved.

<< 실시예Example 5> 다양한 장기 표면에서 세포 시트 이식효과 확인 5> Identification of cell sheet transplantation effect on various organ surfaces

1. 세포 시트의 1. Cell sheet 부착능Attachment 확인 Confirm

세포 시트를 다양한 조직에 이식하기 위해, 피하, 간 표면 및 복막에서 세포 시트의 부착능을 확인하였다.In order to transplant the cell sheet into various tissues, the adherence of the cell sheet to the subcutaneous, hepatic surface and peritoneum was confirmed.

실시예 3-1과 같이 준비된 췌장부전에 의해 당뇨가 유도된 마우스 동물 모델의 피하, 복막 및 간 표면에 도 8과 같이 세포 시트를 이식하였다.The cell sheet was transplanted onto the hypodermic, peritoneal, and liver surfaces of a mouse animal model in which diabetes was induced by pancreatic insufficiency prepared as in Example 3-1, as shown in Fig.

먼저, 누드마우스에 스트렙토조토신(Streptozotocin) 180mg/kg을 투여하여 췌장부전 마우스를 제작하고 상기 췌장부전 마우스의 혈당이 3일 이상 300 mg/dl로 일정하게 유지되어 당뇨가 유도된 것을 확인하였다.First, 180 mg / kg of streptozotocin was administered to a nude mouse to prepare a pancreatic insufficiency mouse, and the blood glucose level of the pancreatic insufficiency mouse was maintained at 300 mg / dl for 3 days or more to confirm that diabetes was induced.

실시예 1과 같이 제작된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 공동배양 구조체의 배양온도를 20℃ 이하로 낮추어 세포 시트를 온도감응성 배양접시로부터 부유시키고, 부유된 세포 시트를 cell shifter를 이용하여 상기 췌장부전 마우스의 피하, 복막 및 간 표면에 각각 부착시킨 후 cell shifter를 제거하고 피부를 봉합하였다. 세포 시트는 피하 및 간 표면에서 손쉽게 부착된 반면, 복막 부위에서는 세포 시트 부착에 오랜 시간이 소요되었다.The cell sheet was suspended from the temperature-sensitive culture dish by lowering the culture temperature of the pancreatic cell / fat-derived stem cell sheet co-cultured construct prepared as in Example 1 to 20 ° C or lower, and the suspended cell sheet was cultured in a cell shifter After attaching to the subcutaneous, peritoneal, and liver surfaces of pancreatic insufficiency mice, the cell shifters were removed and the skin was sutured. The cell sheet was easily adhered to the subcutaneous and liver surfaces, whereas the peritoneal space required a long time to attach the cell sheet.

세포 시트 이식 2개월 후 췌장부전 마우스 동물모델의 피하, 복막 및 간 표면에서 세포 시트의 부착 여부를 확인한 결과, 도 8과 같이 세포 시트 이식 2개월 후에도 피하, 복막 및 간 표면에 세포 시트가 안정적으로 부착되어 있었다.After 2 months from the cell sheet transplantation, it was confirmed whether or not the cell sheet was adhered to the subcutaneous, peritoneal, and hepatic surface of the mouse animal model of pancreatic insufficiency. As a result, the cell sheet was stable on subcutaneous, Respectively.

상기 결과들로부터 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트는 다양한 조직에서 안정적으로 적용될 수 있음이 확인되었다. From the above results, it was confirmed that the pancreatic cell / adipose stem cell sheet can be stably applied in various tissues.

2. 세포 시트의 혈당 조절능력 확인2. Check the ability of the cell sheet to regulate blood sugar

상기 방법으로 췌장부전 마우스 동물모델의 피하, 복막 및 간 표면에 1500IEQ 또는 3000IEQ 세포 시트를 부착시킨 후 각 췌장부전 동물모델의 혈당 및 체중 변화를 확인하였다. In the above method, a 1500 IQ or 3000 IQ cell sheet was attached to the subcutaneous, peritoneal, and liver surfaces of pancreatic insufficiency mouse animal models, and blood glucose and body weight changes of each pancreatic insufficiency animal model were confirmed.

매일 일정한 시간마다 각각의 췌장부전 마우스의 체중을 측정하였으며, 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.The body weight of each pancreatic insufficiency mouse was measured at regular intervals every day, and blood glucose was measured by collecting blood from the tail.

그 결과, 도 9와 같이 간 표면에 1500IEQ가 투여된 실험군에서는 혈당이 장기간 조절되는 것으로 나타났으며, 간 절제시에도 세포 시트 이식으로 인하여 혈당 조절이 가능한 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 9, in the experimental group in which 1500 IEQ was administered to the liver surface, blood glucose was regulated for a long period of time, and it was confirmed that blood glucose control was possible due to cell sheet transplantation even in liver resection.

피하에 이식된 마우스 실험군에서는 1500IEQ이 투여된 경우 혈당 조절이 완벽하게 나타나지는 않았으나, 3000IEQ로 이식된 실험군에서는 장기간 혈당조절이 가능한 것을 확인할 수 있었다.In the subcutaneously transplanted mice, glucose control was not fully observed when 1500 IEQ was administered, but long-term blood glucose control was possible in the experimental group transplanted with 3000 IEQ.

한편, 피하 및 간 표면에 이식된 췌장도세포의 당반응성을 확인하기 위해, 피하 또는 간 표면에 세포 시트가 이식된 마우스에서 내당능시험(IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test)을 수행하였다. On the other hand, in order to confirm the sugar reactivity of the pancreas transplanted into the subcutaneous and liver surfaces, an intragroup glucose tolerance test (IPGTT) was performed in a mouse in which a cell sheet was implanted subcutaneously or on the liver surface.

정상마우스, 당뇨마우스, 피하 또는 간 표면에 췌장도세포/지방유래줄기세포 시트가 이식된 마우스를 6시간 이상 금식시키고, 생리식염수에 녹인 포도당(2g/kg)을 복강으로 주입하였다. A mouse transplanted with a pancreatic cell / adipose-derived stem cell sheet on a normal mouse, diabetic mouse, subcutaneous or liver surface was fasted for 6 hours or longer, and glucose (2 g / kg) dissolved in physiological saline was injected into the abdominal cavity.

주입 후 5, 15, 30, 60 및 120분 마다 각각의 마우스에서 혈당을 측정하였다.Blood glucose was measured in each mouse at 5, 15, 30, 60 and 120 minutes after injection.

그 결과, 도 10과 같이 간 표면에 세포 시트가 이식된 당뇨 마우스 동물모델의 혈중 글루코스 농도가 정상군과 가장 유사한 수준으로 회복되는 것이 확인된 반면, 당뇨병 마우스는 포도당 주입 2시간 후에도 정상 혈당으로 회복되지 못하였다.As a result, as shown in FIG. 10, blood glucose concentration in the animal model of a mouse in which a cell sheet was transplanted to the liver surface was recovered to the level most similar to that in the normal group, while diabetic mice recovered to normal blood glucose .

또한, 피하에 세포 시트가 이식된 당뇨 마우스 동물모델의 혈중 글루코스 농도는 포도당 주입 2시간 후에 정상군과 유사한 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있었다.In addition, blood glucose concentration in the animal model of diabetic mouse implanted subcutaneously with the cell sheet was recovered to a level similar to that of the normal group 2 hours after glucose injection.

상기 결과로부터 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트는 다양한 조직에 이식되어도 우수한 혈당 조절능력을 나타내는 것이 확인되었다. From the above results, it was confirmed that the pancreatic cell / fat-derived stem cell sheet exhibits excellent blood glucose control ability even when transplanted into various tissues.

<< 실시예Example 6> 간문맥을 통한 단일세포 주입 및 간 표면 세포이식 방법의 세포 전달 효율 비교 6> Comparison of cell delivery efficiency of single cell infusion and hepatic surface cell transplantation through portal vein

췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 이식에 따른 인슐린 분비세포 전달 효율성을 확인하기 위해, 도 11과 같이 간 표면에 세포 시트를 이식한 마우스 동물모델실험군과 세포분화를 통하여 준비된 인슐린 분비세포를 단일세포로 간문맥에 직접 주입한 비교군에서 세포 절단 효율성을 확인하였다.In order to confirm insulin secretory cell transfer efficiency by pancreatic cell / fat-derived stem cell sheet transplantation, insulin secretory cells prepared by cell differentiation and mouse animal model test group transplanted with a cell sheet on the liver surface as shown in Fig. And the cell division efficiency was confirmed in the comparative group directly injected into the portal vein.

상기 실험군 및 비교군 마우스에 각각 세포 시트 및 인슐인 분비세포를 주입하고 주입 후 2일 및 7일에 in vivo 라이브 이미지 및 ex vivo 장기 이미지로 이식된 세포의 생존 여부를 확인하였다.Cells and insulin secretory cells were injected into the experimental group and the control group mice, respectively. At 2 and 7 days after the injection, live images in vivo and ex vivo images of the transplanted cells were examined.

그 결과, 도 11과 같이 간 표면에 세포 시트를 통하여 이식된 세포의 경우, 이식된 부위인 간 표면에서 장기간 생존하는 것으로 나타났다.As a result, the cells transplanted through the cell sheet on the liver surface as shown in Fig. 11 showed long-term survival on the transplanted liver surface.

상기 결과를 확인하기 위해, 실제로 각 장기의 genomic DNA를 추출하여 이식된 세포의 잔량을 검사한 결과, 간 표면에 세포 시트가 이식된 실험군의 간 조직에서 세포가 2주일 이상 잔류하고 있음이 확인되었다.In order to confirm the above results, genomic DNA of each organ was actually extracted and the remaining amount of the transplanted cells was examined. As a result, it was confirmed that the cells remained in the liver tissue of the experimental group to which the cell sheet was transplanted for more than 2 weeks .

상기 결과로부터 인슐린 분비세포를 단일세포로 직접 주입하는 방법보다 세포 시트를 이용하여 이식할 경우 이식된 세포의 전달 효율 및 생존 효율이 매우 우수한 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the transplantation using the cell sheet was superior to the method of directly injecting insulin secreting cells into a single cell.

<< 실시예Example 7> 세포 시트 7> cell sheet 부착능Attachment 향상을 위한 For improvement 디바이스device

앞선 실험에서 확인된 복막 또는 장막과 같은 부위에 세포 시트의 부착력을 향상시키기 위해 부착능이 뛰어난 콜라겐/L-도파 멤브레인을 프레임으로 이용하였다.The collagen / L-dopa membrane, which has excellent adherence, was used as a frame to improve the adhesion of the cell sheet to sites such as the peritoneum or the membranes found in previous experiments.

먼저, 이온화 콜라겐 수용액과 L-도파 용액을 혼합하여 동결 건조하여 다공성 막을 제작하였다. 막의 두께에 따라 0.1 내지 3% 농도의 콜라겐 수용액에 L-도파를 0.01 내지 1%로 혼합하여 사용하였으며, 제작된 다공성 막을 적절한 형태로 잘라 고리형태의 콜라겐/L-도파 프레임을 제작하였다.First, an ionized collagen aqueous solution and an L-dopa solution were mixed and lyophilized to prepare a porous membrane. L-dopa was mixed at a concentration of 0.01 to 1% in an aqueous solution of collagen at a concentration of 0.1 to 3% depending on the thickness of the membrane. The prepared porous membrane was cut into a suitable shape to prepare a collagen / L-dopa frame in the form of a ring.

상기 고리형태로 제작된 콜라겐/L-도파 프레임에 세포 시트를 부착하고 마우스 동물모델 복막 좌측 표면에 이식하였으며, 우측 표면에는 세포 시트를 단독으로 이식하고, 이식 1일 후 세포 잔류를 확인하였다.The cell sheet was attached to the collagen / L-dopa frame prepared in the above-mentioned ring form, and transplanted onto the left surface of the mouse animal model peritoneum. Cell sheets were implanted on the right side surface alone and the cell remained after 1 day.

그 결과, 도 12와 같이 콜라겐/L-도파 프레임을 이용하여 세포 시트를 이식한 좌측 복막에서는 세포 잔류가 확인된 반면, 세포 시트를 단독으로 이식한 우측 복막에서는 잔류세포가 확인되지 않았다.As a result, as shown in FIG. 12, cell remnants were observed in the left peritoneum where the cell sheet was transplanted using collagen / L-dopa frame, but no residual cells were found in the right peritoneum transplanted with the cell sheet alone.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

Claims

지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트 및 상기 세포 시트 상에 적층 구조로 공동배양된 인슐린분비세포를 포함하며, 간 표면에 이식되는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물.A cell sheet comprising adipose stem cells, and an insulin secretory cell co-cultured in a laminated structure on the cell sheet, wherein the insulin secretory cell is transplanted into the liver surface.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 인슐린분비세포가 접종된 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물.The composition for insulin-secreting cell transplantation according to claim 1, wherein the composition comprises a cell sheet composed of adipose-derived stem cells inoculated with insulin-secreting cells.

제1항에 있어서, 상기 세포 시트는 콜라겐과 L-도파를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 분비세포 이식용 조성물. The composition for insulin-secreting cell transplantation according to claim 1, wherein the cell sheet further comprises collagen and L-dopa.

제1항에 있어서, 상기 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 인슐린 분비세포 이식용 조성물.The composition for insulin-secreting cell transplantation according to claim 1, wherein the outer periphery of the cell sheet is surrounded by a frame made of collagen and L-waveguide.

제1항에 따른 인슐린분비세포 이식용 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes comprising the composition for insulin secretory cell transplantation according to claim 1.

지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a);
상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b); 및
상기 접종된 인슐린분비세포와 지방유래 줄기세포 시트를 적층구조로 공동배양하는 단계(c)를 포함하는 제1항에 따른 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.(A) culturing adipose derived stem cells to prepare a cell sheet;
(B) inoculating insulin secretory cells onto the cell sheet; And
The method for preparing a composition for insulin-secreting cell transplantation according to claim 1, comprising the step (c) of co-culturing the inoculated insulin secretory cells and the fat-derived stem cell sheet in a laminated structure.

제6항에 있어서, 상기 이식용 조성물 제조방법은 (c)단계의 공동배양된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계(d)를 추가로 더 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법. [7] The method of claim 6, wherein the method for preparing a graft composition further comprises the step (d) of enclosing the periphery of the co-cultured cell sheet of step (c) with a frame made of collagen and L- &Lt; / RTI >

제6항에 있어서, 상기 (a)단계의 지방유래 줄기세포는 포유동물 유래인 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.[Claim 7] The method according to claim 6, wherein the adipose-derived stem cells of step (a) are derived from a mammal.

제6항에 있어서, 상기 (b)단계의 인슐린분비세포는 포유동물 유래 췌장도세포인 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.[Claim 7] The method according to claim 6, wherein the insulin-secreting cell in step (b) is a mammal-derived pancreatic islet cell.

제6항에 있어서, 상기 (b)단계는 지방유래 줄기세포가 70 내지 100% 합류(confluence)된 세포 시트에 인슐린분비세포를 10 IEQ 내지 4000 IEQ로 접종하는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.[7] The method according to claim 6, wherein the step (b) comprises inoculating insulin-secreting cells with 10 IEQ to 4000 IEQ in a cell sheet in which 70% to 100% confluence of adipose derived stem cells is inoculated &Lt; / RTI >

제6항에 있어서, 상기 (c)단계의 접종된 인슐린분비세포는 지방유래 줄기세포 시트 위에 적층되어 6시간 내지 7일간 공동배양되는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.[Claim 7] The method according to claim 6, wherein the inoculated insulin-secreting cells of step (c) are laminated on a fat-derived stem cell sheet and co-cultured for 6 to 7 days.

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