KR101828681B1 - 페리오스틴 압타머를 포함하는 섬유증 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

페리오스틴 압타머를 포함하는 섬유증 진단 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페리오스틴(periostin) 압타머를 포함하는 섬유증 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하는 신장 섬유증 또는 복막 섬유증의 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 페리오스틴-결합 DNA 압타머는 복막 조직에서 TGF-β1에 의해 유발되는 EMT 및 EMT 관련 인자의 발현을 억제함으로써 복막 섬유증을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 당뇨병성 신장증에 의해 매개되는 신장 섬유증을 효과적으로 완화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 섬유화증에 대한 진단에도 효과적으로 사용가능하다.
따라서, 본 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 포함하는 조성물을 사용하여 복막 섬유증 또는 신장 섬유증을 효과적으로 진단, 치료 또는 개선할 수 있다.

Description

페리오스틴 압타머를 포함하는 섬유증 진단 또는 치료용 조성물{Diagnostic or therapeutic composition with periostin aptamer for fibrosis}
본 발명은 페리오스틴 압타머를 포함하는 섬유증 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하는 신장 섬유증 또는 복막 섬유증의 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
복막섬유증(PF, Peritoneal fibrosis)은 지속성 외래 복막 투석(CAPD, Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis) 환자의 복막 구조 변화 및 한외 여과(ultrafiltration) 장애의 주요 원인이 되고 있다. 복막 중피 세포(PMC, Peritoneal Mesothelial Cell)의 상피-중간엽 전이(EMT, Epithelial-mesenchymal transition) 및 세포외 기질(ECM, ExtraCellular Matrix) 단백질의 복막 축적이 복막 섬유증의 주요한 특징이며 형질전환 성장 인자(TGF, Transforming Growth Factor)-β1이 복막섬유증 발달에서 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
당뇨병성 신장증은 만성 신장 질환을 유발할 수 있는 미세혈관 합병증으로서 급성 신장 섬유증에 관련되어 있고, 당뇨 환자의 말기 신장 질환의 주요 원인이다. 당뇨병성 신장증에 의한 ECM 단백질 축적은 신장 뇨세관간질성 섬유증(Renal Tubilointerstitial Fibrosis)을 일으켜서 신장의 회복불능의 기능 손실을 유발한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2, 및 비특허문헌 3). 다양한 인자 중에서, TGF-β1이 당뇨병성 신장증 내 높은 글루코스에 의한 효과에서의 주요한 매개체로 간주되고 있다(비특허문헌 4). 특히, 당뇨병성 신장증에서 확인되는 신장 뇨세관간질성 섬유증은 TGF-β1 경로의 활성화가 주요한 원인이다.
한편, 페리오스틴(periostin)은 다양한 세포 내에서 TGF-β1 경로의 활성화에 의해 증가되는 ECM 단백질로서, 인테그린(integrin)에 관련된 세포내 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 콜라겐(collagen) 및 피브로넥틴(fibronectin) 같은 ECM 유전자들의 발현을 증가시킨다(비특허문헌 5, 비특허문헌 6). 특히, 페리오스틴의 발현은 암세포 내 EMT 촉진을 통한 세포 성장 및 전이에 관련되어 있음이 밝혀졌다(비특허문헌 7). 축적된 검증자료들은 페리오스틴 발현이 다양한 종류의 섬유화 질환의 발달에 관련되어 있음을 제시하고 있다. 최근 자료는 CAPD에 관련된 복막 섬유증에서 비정상적인 페리오스틴 발현이 관찰되고 있음을 제시하였고, 또한, 페리오스틴(Periostin) 단백질의 축적이 신장 섬유증에 관련되어 있음이 검증된 바 있다. 따라서, 인간 복막 중피 세포(HPMC, Human Peritoneal Mesothelial Cell) 내 페리오스틴의 발현 및 기능 조절이 CAPD 환자 내 복막 섬유증의 발달 및 진행에 영향을 줄 것으로 예측되고 있다. 또한, 페리오스틴이 당뇨 조건 하에서 TGF-β1에 의한 신장 섬유증 유발에서도 주요한 역할을 수행하고, 신장 세관 세포 내 페리오스틴 억제에 의해 신장 섬유화가 억제될 수 있음이 예측되고 있다.
하지만, 복막 섬유증 또는 신장 섬유증에서 페리오스틴 조절에 의한 섬유증 진단 또는 치료 효과에 대하여 정확하게 입증되지 않은 상태이다.
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본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 포함하는 복막 섬유증 치료용 또는 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 포함하는 신장 섬유증 치료용 또는 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 페리오스틴-결합 DNA 압타머의 복막 섬유증 및 신장 섬유증에 대한 억제 효과를 확인하였다.
본 발명의 목적은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 포함하는 복막 섬유증 또는 신장 섬유증 예방용 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 이용하여 페리오스틴 발현 수준을 측정함으로써 복막 조직 또는 신장 조직 내 섬유화의 진행을 판단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 포함하는 복막 섬유증 또는 신장 섬유증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하는 복막 섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 압타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하고, 상기 복막 섬유증은 지속적 외래 복막 투석에 의해 유발되며, 상기 조성물은 복막 조직 내 EMT 및 EMT 관련 인자의 발현을 억제시키는, 복막 섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하는 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 압타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하고, 상기 신장 섬유증은 당뇨병성 신장증에 의해 유발되는, 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 정상 신장 조직의 페리오스틴 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 신장 조직 유래 후보 시료의 페리오스틴 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) (a) 단계에서의 발현 수준보다 (b) 단계에서의 발현 수준이 높은 경우 상기 시료에서 섬유증이 진행되는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 신장 조직 내 섬유증의 진단 및 예측에 관한 정보 제공 방법에 있어서, 상기 발현 수준은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 신장 조직 내 섬유증의 진단 및 예측에 관한 정보 제공 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 압타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 신장 조직 내 섬유증의 진단 및 예측에 관한 정보 제공 방법을 제공하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 정상 복막 조직의 페리오스틴 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 복막 조직 유래 후보 시료의 페리오스틴 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) (a) 단계에서의 발현 수준보다 (b) 단계에서의 발현 수준이 높은 경우 상기 시료에서 섬유증이 진행되는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 복막 조직 내 섬유증의 진단 및 예측에 관한 정보 제공 방법에 있어서, 상기 발현 수준은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 복막 조직 내 섬유증의 진단 및 예측에 관한 정보 제공 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 압타머는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 복막 조직 내 섬유증의 진단 및 예측에 관한 정보 제공 방법을 제공하였다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 페리오스틴-결합 DNA 압타머(서열번호 1)를 포함하는 복막 섬유증 진단용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 페리오스틴-결합 DNA 압타머(서열번호 1)를 포함하는 신장 섬유증 진단용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부 외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부 외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제에 사용되는 성분, 예를 들어 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 중점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 잇다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산 인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.
본 발명에서 "복막 섬유증"은 복막이 섬유화된 상태를 의미하는 것으로 복막에 섬유세포가 비정상적으로 형성된 것을 말한다. 복막의 섬유화는 예를 들어, 투석에 의해서 발생할 수 있다. 본 발명에서 "복막 섬유증 예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 복막 섬유증 또는 섬유화의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "복막 섬유증 치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 복막 섬유증 또는 섬유화의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 복막증피세포(HPMC)는 TGF-β에 의해 EMT가 유도되어 복막 섬유증이 진행되는 것으로 알려져 있다. 복막 섬유증이 진행된 복막은 복막투석 치료를 더 이상 할 수 없게 된다. 따라서 지속적인 복막투석을 위하여 복막기능을 보호할 필요성이 있다.
본 발명에서 "신장 섬유증"은 신장조직에서 발생하는 과대한 염증반응, 산화적 스트레스, 상피세포의 섬유세포화와 같은 다양한 원인들의 결과로서 신장조직이 섬유화되어 신장의 기능을 상실하게 되는 증상을 의미한다. 신장 섬유화는 그 자체로서도 세뇨관 세포의 손상, 상피 중배엽 세포 전이, 염증반응의 증가, 대식세포의 유입, 간질 섬유화세포의 증식, 신장 기능의 저하 등의 다양한 증상을 나타내는 병변일 뿐만 아니라, 신부전 등의 다양한 신장질환의 중요한 표지자로서 알려져 있다.
본 발명에서 "압타머(aptamer)"는 타겟에 대하여 높은 친화성과 특이성을 가지고 결합되도록 특이적인 3차원 구조로 접힐 수 있는 단일가닥 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 압타머에 대한 타겟은 작은 물질, 펩타이드, 단백질이 될 수 있으며, 세포 자체가 될 수도 있다. 일단 압타머가 표적에 결합하면 표적의 활성을 저해한다. 이러한 압타머는 항체에 비하여 더 작은 사이즈, 더 우수한 조직 침투성, 화학적 조작의 용이성 및 면역반응을 야기하지 않는 등의 장점을 갖는다. 또한, 생체 내(in vivo) 이미징 적용시, 압타머는 그 작은 크기 덕분에 항체에 비하여 더 빠른 반응속도와 더 우수한 신호-노이즈 비율을 갖는다, 압타머는 또한 이미지 특이성을 향상시키기 위하여 자기나노입자 표면에 부착되어 자기공명영상(MRI)에 사용될 수 있다. 널리 알려진 바와 같이 핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로서 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)으로 이루어져 있다. 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 페리오스틴-결합 DNA 압타머는 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 DNA 단편으로서, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 DNA 단편이나, 페리오스틴에 특이적으로 결합하여 페리오스틴의 기능을 조절하는 압타머라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "혼성화(hybridization)"는 이중가닥, 삼중가닥, 또는 기타 고차 구조의 형태를 초래하는, 핵산과 또 다른 핵산의 염기쌍 상호작용을 의미한다. 특정한 구체예에서, 일차적 상호작용은 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴형 수소 결합(Hoogsteen-type hydrogen bonding)에 의한, 염기 특이적 상호작용, 예를 들면 A/T 및 G/C이다.
본 발명에서 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 갖는 핵산서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 "중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)"은 아주 적은 양의 DNA 만으로도 특정 부위의 DNA 염기서열을 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하여 고온에서도 안정한 Taq DNA 중합효소를 사용하여 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 연장(extension)의 과정을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭시키게 된다. PCR을 이용한 목적 유전자의 검출은 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 이를 증폭 및 확인하는 것이다.
본 발명에서 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로, 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 real-time PCR을 이용한 정량은 일반적으로 증폭반응 개시 시의주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함된다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서 "정량"이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준 시료를 이용하여 제작할 수 있다. 이러한 real-time PCR 분석은 시판되고 있는 real-time PCR 기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, real-time 기기는, SLAN real time PCR detectionsystem(LG 생명과학, 한국), LightCycler 96/480(Roche, Germany), ABI 7500 fast/7500/PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM/CFX96TM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 페리오스틴-결합 DNA 압타머는 복막 조직에서 TGF-β1에 의해 유발되는 EMT(Epithelial-mesenchymal transition) 및 EMT 관련 인자의 발현을 억제함으로써 복막 섬유증을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 당뇨병성 신장증에 의해 매개되는 신장 섬유증을 효과적으로 완화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 섬유화증에 대한 진단에도 효과적으로 사용가능하다.
따라서, 본 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 포함하는 조성물을 사용하여 복막 섬유증 또는 신장 섬유증을 효과적으로 진단, 치료 또는 개선할 수 있다.
도 1은 TGF- β1 처리한 HPMC에서 페리오스틴 및 EMT 마커의 발현 증가에 관한 것으로, 도 1a는 mRNA 수준(n=12)에 관한 것이고 도 1b는 단백질 수준(n=12, **; p <0.01) 에 관한 것이다.
도 2는 페리오스틴 siRNA 형질감염에 의한 세포 형태(2a,×100), mRNA(2b, n=12) 및 단백질(2c, n=12, *;P<0.05, **;P<0.01)의 발현 변화에 관한 것이다.
도 3은 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 HPMC 내 발현되는 페리오스틴에 선택적으로 결합하는 것을 나타낸 것으로 3a는 대조군, 3b는 압타머 처리, 3c는 압타머 및 TGF-β1 처리, 3d는 압타머, TGF-β1 및 페리오스틴 siRNA를 처리한 결과에 관한 것이다.
도 4는 HPMC에서 TGF-β1에 의해 유발되는 EMT가 페리오스틴-결합 DNA 압타머에 의해 완화되는 것을 나타낸 것으로, 4a는 형태학적 특징(×100)에 관한 것이고, 4b는 mRNA 발현 수준(n=12)에 관한 것이며, 4c는 단백질 발현 수준(n=12, *; P <0.05, **; P<0.01)에 관한 것이다.
도 5는 마우스 복막 조직 내 페리오스틴, 피브로넥틴, E-캐드헤린(cadherin), α-SMA, 및 스네일(snail)에 대한 마손 3색 염색 및 면역조직화학 염색 결과에 관한 것이다(× 200).
도 6은 PD 마우스 모델에서 복막 섬유화에 대한 페리오스틴-결합 DNA 압타머의 효과에 관한 것으로, 6a는 mRNA 발현 수준(n=12)에 관한 것이고 6b는 단백질 수준(n=12, *;P <0.05, **;P<0.01)에 관한 것이다.
도 7은 TGF-β1 처리한 IMCD 세포에서 페리오스틴, 피브로넥틴 및 콜라겐 제 I형 발현이 상향-조절되는 것을 나타낸 것이다(**; p < 0.01 vs. C, †; p < 0.001 vs. C).
도 8은 IMCD 세포에서 TGF-β1에 의한 페리오스틴, 피브로넥틴 및 콜라겐 제 I형 발현이 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 감쇄되는 것을 나타낸 것으로, 도 8a는 mRNA 수준에 관한 것이고 도 8b는 단백질 수준에 관한 것이다(*; p < 0.05, **; p < 0.01, †; p < 0.001).
도 9는 당뇨병 모델 마우스에서 증가된 신장 피브로넥틴 및 콜라겐 제 I형 발현이 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 감쇄되는 것을 나타낸 것으로, 도 3a는 mRNA 수준에 관한 것이고 도 3b는 단백질 수준에 관한 것이다(*; p < 0.05, **; p < 0.01).
도 10은 당뇨병 모델 마우스에서 유발된 섬유증이 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 감쇄되는 것을 나타낸 것이다(×40).
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1-1. 페리오스틴-결합 DNA 압타머
페리오스틴-결합 DNA 압타머는 서열번호 1의 DNA 압타머를 사용하였다. 생체 외(in vitro) 연구에서, 페리오스틴-결합 DNA 압타머에 Cy3를 표지하여 사용하였고 세포 내에서 압타머의 페리오스틴에 대한 특이적인 부착을 측정하였다. 생체 내(in vivo) 연구에서, 바이오-안정성을 증가시키기 위해 페리오스틴-결합 DNA 압타머에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 접합시켜 사용하였고 동물 연구에 적용하였다.
페리오스틴-결합 DNA 압타머 서열
구분 서열
페리오스틴-결합 DNA 압타머 ACG AG TTG TCG CAT GTG CGG TTC AGT CTG GTC CTT CAG CAC CGT A CAA CA(서열번호 1)
페리오스틴-결합 DNA 압타머의 세포 표면 부착 특이성을 측정하기 위해, 형광-활성화 세포 분류(FACS, Flourescence-Activated Cell Sorting) 분석을 실시하였다. HPMC는 5분간 500g에서 원심분리하였고, 배지 내 잔여 성장인자를 제거하기 위해 등장성이고 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS 완충액에서 2회 세척하였다. HPMC는 최종 농도 1×107 세포/㎖로 맞추어 재부유시켰고, 결합 완충액(5mM MgCl2를 포함하는 PBS)을 포함하는 200nmol/ℓ의 Cy3-표지된 페리오스틴 DNA 압타머를 사용하여 배양하였다. 100㎕ 시료는 염색을 위해 1.5㎖ 튜브로 실험당 1×106 세포를 사용하였다. 표면 염색 강도의 유세포 분석은 FACSVERSE(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 실시하였고, 결과의 분석은 FACSuite 소프트웨어(BD Sciences)를 사용하여 실시하였다.
1-2. 인간 복막 중피세포(HPMC)의 1차 배양
1차 HPMC는 선행문헌(비특허문헌 8)에 기재된 방법에 따라 분리하였다. 복부 수술을 경험하고 제공에 동의한 환자로부터 인간 장막 조직의 표본을 획득하였다. 표본은 멸균된 인간-완충 식염수(PBS)를 사용하여 3회 세척하였고 0.05% 트립신 및 0.02% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 포함하는 용액 내에서 37℃에서 20분간 배양하면서 지속적으로 교반을 실시하였다. 배양 후에, 자유 HPMC를 포함하는 부유액은 4℃에서 10분간 100g로 원심분리하였다. 상층액은 버리고 세포가 모인 펠릿은 1회 세척하였다. 이후에, 세포 펠릿은 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum), 100U/㎖ 페니실린, 100㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 26mM 탄산수소나트륨(NaHCO3)를 포함하는 M199 배지에서 재부유시켰고 세포 배양 디쉬 상에 씨딩하였다. 세포는 대기 중 가습된 5% CO2 내 37℃에서 동일한 배지에서 배양하였다. 배지는 접종 후 24시간 후에 교환하였고, 이후에는 3일마다 배지를 교환하며 배양하였다.
1-3. HPMC 세포 처리
우선, 서브컨플루언트(subconfluent) HPMC는 24시간 동안 FBS를 첨가하지 않은 배양액을 사용하여 배양하였다. 이후에, 대조군 배지는 FBS-없는 M199 배지로 교환하였고, 실험군 배지는 TGF-β1(2ng/㎖, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 포함하는 배지로 교환하였다. 배지 교환 72시간 후에, HPMC는 RNA 및 단백질 분석을 위해 회수하였다. 페리오스틴 녹다운(knockdown) 실험을 위해, 페리오스틴 siRNA는 Dharmacon(Lafayette, CO, USA)로부터 구입하였다. 페리오스틴 siRNA는 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000,Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 형질감염을 실시하였다. 간략하게는, 6㎕ 리포펙타민 2000은 1 ㎖ Opti-MEM I 환원 혈청 배지(Invitrogen)을 사용하여 희석하였고, 상온에서 15분간 배양하였으며, 페리오스틴 siRNA와 혼합하였다. 배양한 후, 혼합물은 HPMC 각각의 웰에 첨가하였는데, HPMC는 하루 전에 6-웰 플레이트로 5×105세포/웰 밀도로 분주하였고 24시간 후에 배지를 교환하였다.
1-4. IMCD 세포 배양 및 세포 처리
내부 수질 집합관(IMCD, Inner Medullary Collecting Duct) 세포는 10% 우태아 혈청(FBS), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 26 mM 탄산수소나트륨을 보충하고 17.5 mM 글루코스(NG)를 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 대기 중 가습된 5% CO2 내 37℃에서 배양하였다. 씨딩 후 48시간에, 배지는 5.6 mM 글루코스를 포함하는 DMEM/F12 배지로 교환하였다. 서브컨플루언트 IMCD 세포는 24시간 동안 FBS만을 사용하여 배양하였고, 이후에 대조군은 0.5% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지로 교환하였으며, 페리오스틴-결합 DNA 압타머(서열번호 1)를 처리하는 실험군 또는 처리하지 않는 실험군에 대하여 TGF-β1 2ng/㎖(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 포함하는 배지로 교환하였다. IMCD 세포는 배지 교환 48시간 후에 RNA 및 단백질 분석을 위해 회수하였다.
1-5. 동물실험
동물실험을 위한 프로토콜은 연세대학교 의과대학 내 실험동물 사용 위원회의 승인을 받았다. 모든 동물 실험은 실험동물 케어 기준(NIH Publication no.85-23, 1985 개정)에 따라 실시하였다.
가. 복막 섬유증
평균 체중은 20~25g인 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 복막 투석(PD, Peritoneal Dialysis)을 위해, PD 카테터 및 포트(Cat # MMP-4S-061108A, Access Technologis & Solomon Scientific, Skokie, IL, USA)는 7주차에 삽입하였고, 1주일간 상처를 관찰하였다. 카테터 삽입 1주일 후에, 대조군은 하루에 1회 2㎖의 염기성 점액주사(saline instillation)를 주입하였고, PD 그룹은 2㎖의 복막 투석 용액[4.25% 덱스트로스(pH 5.2, Baxter International, Deerfield, IL, USA)를 포함하는 Dianeal PD solution]을 4주 동안 매일 주입하였다. 압타머 실험군은 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 PD 용액과 혼합하여 최종 부피 2㎖을 500㎍/㎏/day로서 PD 카테터를 통해 매일 주입하였다. PD 처리 4주 후에, 모든 마우스를 희생시켰고, 벽측 복막을 획득하였다.
나. 신장 섬유증
평균 체중이 20~25g인 22두의 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 제 1형 당뇨군 마우스에 대하여 단방향성 신장 절제(UNX, Unilateral Nephrectomy)를 실시하였다. UNX 실시 1주일 후에, 마우스에 50㎎/㎏의 스트렙토조토신(STZ, Streptozotocin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 5일 연속으로 복강 내 주사하였고, 대조군 마우스에는 STZ 희석액을 주입하였다. 페리오스틴-결합 DNA 압타머(500㎍/㎏/day)는 각 군 내 마우스에 매일 복강 내 주사하였다. 마우스는 당뇨 유발 7주 후에 희생시켰다.
제 2형 당뇨 db/db 마우스 및 유전적 대조군 비-당뇨 db/+ 마우스(10-12주령, 각 군마다 16두)는 잭슨 연구소(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. 페리오스틴-결합 DNA 압타머(500㎍/㎏/day)는 각 군 내 8두 마우스에 매일 복강 내 주사하였다. 마우스는 당뇨 유발 9주 후에 희생시켰다.
체중, 혈청 글루코스 수준, 신장 무게, 및 24-시간 소변 알부민 분비는 희생 시점에 체크하였다. 혈액 글루코스는 글루코미터(glucometer)를 사용하여 측정하였고 24-시간 소변 알부민 분비는 효소-결합 면역 흡착 분석법(ELISA, Nephrat II, Exocell, Inc., Philadelphia, PA, USA)를 사용하여 측정하였다.
1-6. 전체 RNA 추출
HPMC 및 복막으로부터의 RNA 추출 및 마우스 신장으로부터의 RNA 추출은 선행문헌(비특허문헌 9)에 기재된 바에 따라 실시하였다. 전체 복막 시료 및 신장 시료로부터 RNA 추출에서, 액체 질소를 사용하여 조직을 급속 냉동시켰다. 이후에, 100㎕의 RNA STAT-60 제재(Tel-Test, Friendswood, TX, USA)를 사용하여 막자사발 및 막자에 의해 3회 균질화하여 부유물을 제조하였다. HPMC RNA 추출에서는, 700㎕의 RNA STAT-60을 세포-배양 디쉬에 추가하였고, 부유물을 회수하였다.
상온에서 5분간 부유물을 균질화시킨 후에, 160㎕ 클로로포름(chloroform)을 추가하였다. 이후에, 혼합물은 30초 동안 격렬하게 교반하였고, 상온에서 3분간 보관한 후 4℃, 12000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 3상 중 가장 윗부분에 위치한 액상은 다른 상과 오염되지 않도록 주의하여 신선한 튜브에 옮겨졌다. 추출된 RNA는 400㎕ 이소프로판올을 첨가하여 침전시켰고, 4℃, 12000g에서 30분 동안 원심분리하였다. RNS 펠릿은 70% 에탄올을 사용하여 세척하였고, 2분 동안 공기 중에서 건조시켰으며, 멸균된 DEPC-처리 증류수에 녹였다. RNA 추출의 양과 질은 260 내지 280nm의 파장에서 분광광도 측정에 의해 평가하였다.
IMCD 세포로부터의 전체 RNA도 유사한 방법으로 추출하였다.
1-7. 역전사
베링거 멘하임(Boehringer Mannheim) cDNA 합성 키트(Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 1차 가닥 cDNA를 획득하였다. 역 전사는 2㎍의 전체 RNA 추출물, 10 uM 무작위 헥사뉴클리오티드 프라이머, 1 mM NTP, 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 50 mM Tris-HCl(pH 8.5), 0.2 mM DTT(DiThioThreithol), 25U RNAse 저해제, 및 40 U AMV 역전사효소를 사용하여 실시하였다. 혼합물은 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간 동안 배양한 후, 효소의 비활성화를 위해 99℃에서 5분간 배양하였다.
1-8. 정량적 실시간 PCR(Quantatitive Real-time Polymerase Chain Reaction)
본 발명에 사용된 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다. 마우스 복막 유래 RNA 및 HPMC 세포 유래 RNA는 증폭을 위해 반응 튜브당 20ng을 사용하였다. 신장 유래 RNA 및 IMCD 세포 유래 RNA는 반응 튜브당 25ng을 사용하였다. ABI PRISM 7700 서열 탐지 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여, 10㎕의 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems), 5㎕ cDNA, 및 5 pmol 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 각 웰 내 전체 부피 20 ul의 혼합물을 사용하였다. 프라이머 농도는 각 프라이머의 최적 농도를 분석한 선행 실험에 의해 결정하였다. PCR 조건은 하기와 같다: 94.5℃에서 30분간 변성 35 사이클, 60℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장. 95℃에서의 9분간 초기 가열 및 72℃에서 7분간 최종 연장은 모든 PCR 반응에서 동일하게 실시하였다. 각각의 시료는 개별적인 튜브 내에서 3회 반복하여 실시하였고 cDNA가 없는 대조군 역시 각각의 실험에서 병행하여 실시하였다. 각각의 시료 내 cDNA 함량은 2-△△CT를 포함하는 비교 CT 방법을 사용하여 결정하였다. 결과는 18s rRNA의 발현에 대하여 표준화시킨 상대적 발현으로서 표시하였고 임의의 단위로 나타내었다.
프라이머 서열
명칭 방향 서열
Periostin
(mouse and human)		 Sense
Anti-sense		 5'-GGCACCAAAAAGAAATACT-3'
5'-GGAAGGTAAGAGTATAT-3'
Fibronectin
(mouse)		 Sense
Anti-sense		 5'-TGACAACTGCCGTAGACCTGG-3'
5'-TACTGGTTGTAGGTGTGGCCG-3'
Fibronectin
(human)		 Sense
Anti-sense		 5'-AACCTACGGATGACTCGTGC-3'
5'-TGAATCACATCTGAAATGACCAC-3'
Collagen type I
(mouse)		 Sense
Anti-sense		 5'- ACTGGTACATCAGCCCGAAC-3'
5'- TACTCGAACGGGAATCCATC-3'
E-cadherin
(mouse)		 Sense
Anti-sense		 5'-TTTCTACAGCATCACCGGC-3'
5'-CACTTTCAGCCAGCCTGTC-3'
E-cadherin
(human)		 Sense
Anti-sense		 5'-CACAGACGCGGACGATGAT-3'
5'-AGGATCTTGGCTGAGGATGGT-3'
α-SMA
(mouse)		 Sense
Anti-sense		 5'-CTGACAGAGGCACCACTGAA-3'
5'-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3'
α-SMA
(human)		 Sense
Anti-sense		 5'-GCCTTGGTGTGTGACAATGG-3'
5'-AAAACAGCCCTGGGAGCAT-3'
Snail
(mouse)		 Sense
Anti-sense		 5'-ATCCTCACCTCGGGAGCATAC-3'
5'-AGGCCACTGGGTAAAGGAGAGT-3'
Snail
(human)		 Sense
Anti-sense		 5'-ATCCTCACCTCGGGAGCATAC-3'
5'-AGGCCACTGGGTAAAGGAGAGT-3'
18s
(mouse)		 Sense
Anti-sense		 5'-AACTAAGAACGGCCATGCAC-3'
5'-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3'
18s
(human)		 Sense
Anti-sense		 5'-TGGTGCATGGCCGTTCT-3'
5'-CATGCCAGAGTCTCGTTCGTT-3'
1-9. 웨스턴 블롯 분석
HPMC 세포, 마우스 복막, IMCD 세포 및 마우스 신장을 회수하여 황산도데실나트륨(SDS, Sodium Dodecyl Sulfate) 샘플 완충액[2% SDS, 10 mM Tric-HCl(pH 6.8), 10% (vol/vol) 글라이콜] 을 사용하여 용해시켰다. 용해물은 4℃, 10000g에서 10분 동안 원심분리하였고 상층액은 -70℃에 보관하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad kit(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정하였다. 100℃에서 5분간 가열시킨 50㎍의 단백질 추출물의 분획에 라엠리 샘플 완충액(Laemmli sample buffer)을 추가하였고, 아크릴아마이드 변성 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 내에서 전기영동을 실시하였다. Hoeffer 반건조 블롯팅 기기(Hoeffer Instruments, San Francisco, CA, USA)를 사용하여 단백질을 Hybond-ECL 멤브레인으로 옮겼다. 단백질이 멤브레인으로 전달된 후에, 상온에서 1시간 동안 블로킹 완충액 A(1x PBS, 0.1% Tween-20, 및 5% 탈지분유)를 사용하여 배양하였고, 이후에 멤브레인은 페리오스틴(Abcam, Cambridge, UK), E-cadherin(BD Bioscience), α-SMA(Abcam), fibronectin(Dako, Glostrup, Denmark), 콜라겐 제 I형(SouthernBiotech, Birmingham, USA), snail(Abcam) 또는 β-actin(Sigma Chemical., Perth, Australia)에 대한 다클론성 항체의 1:500 희석액을 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 멤브레인은 0.1% Tween-20을 포함하는 1×PBS를 사용하여 15분간 1회 세척한 후, 5분간 2회 세척하였다. 멤브레인은 호스라디시 페록시다제(Horseradish peroxidase)-결합된 염소 항-토끼 또는 항-마우스 IgG(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)의 1:1000 희석액을 포함하는 완충액 A에서 배양하였다. 세척 과정은 3회 반복하였고, 멤브레인은 화학발광 제재(ECL; Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 현상(develop)하였다. TINA 이미지 소프트웨어(Raytest, Straubenhardt, Germany)를 사용하여 밴드 강도를 측정하였고, 대조군 조직 또는 세포에 상대적인 처리군으로부터의 밴드에 대한 광학적 강도 내 변화는 분석에 사용하였다.
1-10. 면역조직화학 염색 및 마손 3색(Masson's trichrome) 염색
복막 시료 및 신장 시료의 고정을 위해, 중성으로 완충시킨 10% 포르말린을 사용하였다. 파라핀-포매된 조직은 면역조직화학 염색을 위해 5㎛-두께의 단편으로 가공하였다. 조직 단편은 파라핀을 제거하고, 에틸 알코올을 사용하여 다시 수화시켰으며, 수돗물을 사용하여 세척하였다. 항원 회수는 Black&Decker 야채 증기(vegetable steamer)를 사용하여 20분 동안 10mM 시트르산 나트륨 완충액 내에서 실시하였다. 조직 단편을 올린 슬라이드는 상온에서 30분 동안 10% 당나귀 혈청을 사용하여 블로킹하였고 이후에 PBS를 사용하여 세척하였다. 피브로넥틴(fibronectin), E-캐드헤린(cadherin), α-SMA 및 스네일(snail)에 대한 1차 항체는 소 혈청 알부민 내 2% 카제인을 사용하여 적절한 농도로 희석하였고, 슬라이드에 추가하였으며, 이후에 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세척한 후에, 2차 항체는 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 2분간 처리하였고, 헤마톡실린 (hematoxylin)을 사용하여 슬라이드를 대비염색(counterstain)하였다. 마손 3색 염색을 위해, 5㎛-두께 단편으로 가공된 파라핀-포매 조직은 파라핀을 제거하고, 에틸 알코올에서 재수화시키고, 수돗물에서 세척하고, 56℃에서 1시간 동안 Bouin 용액에서 재고정시켰다. 흐르는 수돗물에서 10분간 헹구고 Weigert’ 철 헤마톡실린 워킹 용액을 사용하여 10분간 염색한 후에, 슬라이드는 15분간 Biebrich scarlet-산 푹신액(fuchsin solution)을 사용하여 염색하고 수돗물에서 세척하였다. 단편은 포스포폴리브덴-포스포텅스텐 산 용액(phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution)에서 15분 동안 차별화시켰고, 아닐린 블루 용액으로 전달하여 10분간 염색하였다. 수돗물에서 짧게 헹군 후에, 슬라이드는 1% 아세트산 용액으로 5분간 반응시켰다. 염색 강도에 대한 반-정량 수치는 400배 확대 하에 각각 단편에서 최소한 5 영역을 시험하고 디지털 이미지 분석(MetaMorph version 4.6r5, Universal Imaging Corp., Downingtown, PA, USA)을 사용하여 측정하였다.
1-11. 통계 분석
통계 분석은 윈도우버전 21 SPSS(IBM Corporation, Armonk, NY, USA)를 사용하여 실시하였다. 결과 자료는 평균±표준 편차(S.E.)로서 표현하였다. 복수의 비교대상에 대하여 본페로니 교정(Bonferroni correction)을 이용한 포스트 호크 테스트(post hoc test)를 갖춘 일원변량분석(One way ANOVA)을 실시하였다. 결과는 복수의 비교대상에 대하여 Kruskal-Wallis 비모수적 검증을 이용하여 분석하였다. 0.05 미만의 A P 수치는 통계적 유의성을 갖는 것으로 판단하였다.
HPMC 내 TGF - β1에 의한 페리오스틴 발현 변화 측정
페리오스틴이 HPMC의 EMT 과정에서 발현되는지를 검증하기 위해, TGF-β1을 처리한 HPMC에서 페리오스틴의 발현 수준을 측정하였다. TGF-β1을 처리한 HPMC에서 페리오스틴 mRNA 및 단백질 수준의 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도 1). 이러한 페리오스틴의 발현 증가는 피브로넥틴, α-SMA, 스네일(snail)의 상향-조절, 및 E-캐드헤린(cadherin) mRNA 발현의 하향-조절을 동반하였다. 피브로넥틴, α-SMA, 스네일(snail) 및 E-캐드헤린의 단백질 수준은 HPMC 내 mRNA 수준과 유사한 발현 패턴을 나타내었다.
HPMC 내 TGF - β1에 의한 페리오스틴 발현의 상향-조절 및 EMT 조절
HPMC의 EMT 과정에서 페리오스틴의 역할을 검증하기 위해, TGF-β1으로 자극시킨 HPMC을 페리오스틴 siRNA 형질감염을 통해 페리오스틴 발현을 억제시켰다. TGF-β1(2 ng/㎖)을 처리하지 않은 HPMC의 입방 형태와는 대조적으로, TGF-β1 자극은 얇은 축 모양의 세포 형태가 특징인 섬유아세포와 유사한 세포 형태학적 변화를 유발하였다. 흥미롭게도, 페리오스틴 siRNA(100nM) 처리는 TGF-β1에 의해 유도되는 세포 형태의 변화를 크게 감쇄시켰다. 이러한 흥미로운 결과를 근거로, 페리오스틴 siRNA를 이용한 녹다운(knockdown)이 TGF-β1에 의해 유발되는 HPMC내 간엽성 (mesenchymal)에 관련된 마커의 발현을 회복시키는지 여부를 측정하였다. 예상대로, 페리오스틴 siRNA를 이용한 녹다운은 TGF-β1 처리 하에서 페리오스틴 발현을 효과적으로 감소시켰다. 피브로넥틴, α-SMA 및 스네일 mRNA 수준은 TGF-β1 만을 처리한 HPMC에 비해 TGF-β1 및 페리오스틴 siRNA이 처리된 HPMC에서 크게 감소하였고, TGF-β1을 처리한 HPMC에서 감소되었던 E-캐드헤린 mRNA 수준이 페리오스틴 siRNA 형질감염에 의해 본래 수준으로 회복되었다. 단백질 수준에서, TGF-β1 처리는 페리오스틴, 피브로넥틴, α-SMA, 및 스네일 수준을 증가시켰고, 페리오스틴 녹다운은 페리오스틴 및 피브로넥틴, α-SMA, 및 스네일 같은 간엽성 마커 수준을 감소시켰다. 유사하게, 페리오스틴 siRNA 형질감염에 의해 회복된 TGF-β1을 처리한 HPMC 내에서는 E-캐드헤린의 발현이 감소되었다(도 2). 이러한 결과는 페리오스틴 상향-조절이 TGF-β1에 의해 매개되는 HPMC의 EMT 과정에 관련되어 있고, 페리오스틴 저해는 HPMC의 병리학적 EMT 과정을 감쇄시킬 수 있음을 확인하였고, 이를 통하여 페리오스틴의 신호전달을 효과적으로 저해할 수 있다면 다양한 페리오스틴 관련 질환들을 치료하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
HPMC 내 페리오스틴에 대한 DNA 압타머의 결합
페리오스틴이 HPMC 내 EMT 유도에서 주요한 역할을 담당한다는 것을 검증한 후, 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 HPMC 내 EMT 진행에 영향을 줄 수 있는지를 시험하였다. 우선, FACS 분석을 실시하여 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 HPMC 내에서 페리오스틴에 특이적으로 결합하는지 입증하였다. Cy3가 표지된 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 사용하여, HPMC 내 발현된 페리오스틴에 결합한 페리오스틴-결합 DNA 압타머의 양을 체크하였다. 음성 대조군에 비해, Cy3가 표지된 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 처리한 세포는 전체 HPMC 중에서 증가된 Cy3-양성 분획(0.6%)을 나타내었다. 부가적으로, TGF-β1을 처리하지 않은 HPMC에 비해 TGF-β1을 처리한 HPMC에서 Cy3가 표지된-페리오스틴-결합 DNA 압타머(200nM)에 의해 Cy3-양성 분획(5.8%)이 증가하였다. 페리오스틴 siRNA(100nM)를 사용한 형질 감염은 TGF-β1을 처리한 HPMC에서 Cy3-양성 분획(1.0%)을 크게 감소시켰는데, 이는 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 HPMC 내에 발현되는 페리오스틴에 대하여 선택적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 본원 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 이용하여 페리오스틴의 발현량을 측정하여 페리오스틴 관련 질환을 진단하는데 사용가능하다는 것을 확인하였다(도 3).
페리오스틴 -결합 DNA 압타머에 의한 HPMC 내 TGF - β1 유발 EMT의 개선 효과
페리오스틴-결합 DNA 압타머를 이용한 페리오스틴에 관련된 신호전달의 억제가 EMT 유발에 영향을 주는지 검사하기 위해, TGF-β1을 처리한 HPMC에 대하여 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 처리한 후, HPMC의 형태 및 EMT 관련 분자의 변화를 체크하였다. TGF-β1(2ng/㎖)을 처리한 HPMC는 형태적으로 축 모양의 특징을 나타내었다. TGF-β1을 처리한 HPMC에 대한 페리오스틴-결합 DNA 압타머의 처리는 이러한 형태적 변화를 크게 완화시켰고, 이는 TGF-β1을 처리한 HPMC에 페리오스틴 siRNA를 처리하여 관찰된 결과와 유사하였다(도 4). 페리오스틴 발현에 대하여 세포를 검사하였을 때, TGF-β1 자극에 의해 페리오스틴 mRNA 및 단백질 수준이 증가했을지라도, 페리오스틴-결합 DNA 압타머의 처리는 페리오스틴 발현 수준에는 영향을 주지 않았다. EMT 관련 분자에 대하여 세포를 검사하였을 때, TGF-β1이 처리된 HPMC 내에서 상향-조절된 피브로넥틴, α-SMA, 및 스네일의 발현은 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 명백하게 감쇄하였다. 또한, TGF-β1이 처리된 HPMC 내에서 하향-조절된 E-캐드헤린 발현은 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 회복되었다. 이러한 결과들을 통하여 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 페리오스틴에 관련된 신호전달 활성화를 저해함으로써 HPMC 내 TGF-β1에 의해 유발되는 EMT 과정을 효과적으로 완화시킬 수도 있다는 것을 확인하였으며, 또한 본원 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 EMT 기작에 의하여 유도되는 질병들을 치료하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
페리오스틴 -결합 DNA 압타머에 의한 복막투석(PD) 마우스 모델 내 복막섬유화(PF) 저해 효과
복막 섬유증 발달에 대한 페리오스틴-결합 DNA 압타머의 생체 내(in vivo)효과를 검증하기 위해, 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 PD 마우스 모델에 처리하였다. PD 용액만을 4주간 주입한 마우스, 또는 PD 용액을 4주간 주입하고 복강 내 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 4주간 주입한 마우스(PD 용액 및 압타머의 동시 주입)에 대하여 복막 형태 및 EMT 마커를 검사하였다. 복막 조직에 대한 마손 3색 염색 및 면역조직화학 염색 결과는 대조군 마우스에 비해 PD 용액을 처리한 마우스에서 EMT 및 EMT-관련 단백질의 발현이 크게 증가하였고, 하부 중피 층이 크게 두터워졌으며, 페리오스틴-결합 DNA 압타머에 의해 PD 마우스 내 EMT 및 ECM 축적이 크게 저해되었음을 입증하였다(도 5). 부가적으로, 피브로넥틴, α-SMA, 및 스네일의 mRNA 및 단백질 발현이 크게 증가하였지만, E-캐드헤린 발현은 대조군 마우스에 비해 PD 용액을 처리한 마우스 내에서 크게 감소하였다. 그리고 이러한 변화는 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 크게 감쇄되었다(도 6). 상기 결과들을 통하여 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 CAPD에 의해 유발되는 복막 섬유증을 억제할 수 있다는 것을 확인하였고, 본원 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 사용하여 복막 섬유증을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인할 수 있었다.
IMCD 세포 내 TGF - β1에 의한 페리오스틴 발현 변화 측정
TGF-β1에 의해 유발되는 신장 관 섬유증에 페리오스틴이 관련되어 있는지 검증하기 위해, TGF-β1이 처리된 IMCD 세포 또는 미처리된 IMCD 세포에서 페리오스틴의 발현 수준을 측정하였다. 페리오스틴 mRNA 및 단백질 수준은 대조군 IMCD 세포에 비해 TGF-β1(10ng/㎖)을 처리한 IMCD 세포에서 크게 상향-조절되었다(p<0.01). 이러한 증가는 피브로넥틴 및 콜라겐 제I 형의 mRNA 및 단백질 발현 수준의 상향-조절과 동반되었다(p<0.01, 도 7). 이러한 결과는 페리오스틴 발현이 TGF-β1에 의해 유발되는 ECM 축적에 관련되어 있음을 암시하였고, 이를 통하여 페리오스틴 발현량을 본원 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 이용하여 측정하여 신장 섬유증을 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
IMCD 세포 내 TGF - β1에 의한 ECM 축적에서의 페리오스틴 억제 효과
페리오스틴-결합 DNA 압타머를 이용한 페리오스틴 발현 억제가 ECM 축적에 영향을 주는지 시험하기 위해, TGF-β1(10ng/㎖)이 처리된 IMCD 세포에 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 처리하였다. TGF-β1에 의한 페리오스틴, 피브로넥틴, 및 콜라겐 제 I 형 mRNA 발현의 증가는 IMCD 세포 내에서 페리오스틴-결합 DNA 압타머에 의해 크게 감쇄되었다. TGF-β1 자극에 의한 페리오스틴, 피브로넥틴 및 콜라겐 제 I형의 증가된 단백질 수준 역시 IMCD 세포 내에서 페리오스틴-결합 DNA 압타머에 의해 크게 감쇄되었다(도 8). 상기 결과들을 통하여, 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 IMCD 세포 내에서 TGF-β1에 의해 유발되는 ECM 축적을 효과적으로 완화할 수 있다는 것을 확인하였고, 이를 통하여 본원 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머가 신장 섬유증 치료에 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
당뇨병(DM) 마우스 모델에서 페리오스틴 효과
당뇨병성 신장증에 의한 발생하는 신장 섬유증에 대한 페리오스틴-결합 DNA 압타머(PA) 처리 효과를 시험하기 위해, 제 I 형 및 제 II형 마우스 모델의 복강 내 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 주사하였다.
제 I 형 당뇨병 마우스 모델은 단방향 신장절제된 마우스(UNXSTZ)에 스트렙토조토신(STZ, streptozotocin)을 주사하여 제조하였다. 대조군 마우스(C: 28.2±6.3g, p<0.05)에 비해 UNXSTZ 마우스(23.5±2.5g) 및 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 처리한 마우스(21.5±4.3g)에서 체중이 크게 감소하였다. 체중에 대한 신장 무게의 비율은 대조군 마우스(0.35%±0.04%, p<0.01)에 비해 UNXSTZ(0.96±0.13%) 및 UNXSTZ+PA 마우스(0.87±0.29%)에서 크게 증가하였다. 평균 글루코스 수준은 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리(587±8.1 ㎎/dL)에 영향을 받지 않은 대조군 마우스(264±4.9 ㎎/dL)에 비해 UNXSTZ 마우스(576±4.7 ㎎/dL)에서 크게 증가하였다. 24-시간 소변 알부민 분비 수준은 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리(0.19±0.05 ㎎/day)에 의해 영향을 받지 않는 대조군 마우스(0.041±0.006 ㎎/day)에 비해 UNXSTZ 마우스(0.21±0.08 mg/day)에서 크게 증가하였다(표 3 참조).
제 I형 당뇨병 모델 마우스의 체중, 신장무게 및 소변 알부민 분비
구분 C
(n=8)		 C+PA
(n=8)		 UNXSTZ
(n=6)		 UNXSTZ+PA
(n=7)
혈중 글루코스
(㎎/dL)		 264±4.9 267±6.2 576±4.7** 587±8.1**
체중 (g) 28.2± 6.3 26.9±7.5 23.5±2.5* 21.5±4.3*
신장무게/체중 (%) 0.35±0.04 0.37±0.06 0.96±0.13** 0.87±0.29**
소변 알부민 분비
(㎎/day)		 0.041±0.006 0.054±0.01 0.21±0.08† 0.19±0.05†
*; p < 0.05 vs. C, **; p < 0.01 vs. C, †; p < 0.001 vs. C.
제 II 형 당뇨병 마우스 모델로서 db/db 마우스를 사용하였다. 대조군 db/m 마우스에 비교하여 당뇨병성 db/db 마우스 내 혈중 글루코스 수준, 체중, 및 체중 대비 신장 무게의 비율은 제 I 형 마우스 모델에서 관찰된 결과와 유사하였다. 상기 변수에 대한 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리의 효과 역시 유사하였다. 하지만, 제 I 형 당뇨병 마우스 모델에 비해, db/db 마우스에서 관찰된 24-시간 소변 알부민 분비 수준(0.59±0.10 ㎎/day)은 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리(0.37±0.11 ㎎/day)에 의해 크게 감쇄되었다(표 4).
제 II형 당뇨병 모델 마우스의 체중, 신장 무게, 및 소변 알부민 분비
구분 db/m
(n=8)		 db/m+PA
(n=8)		 db/db
(n=8)		 db/db+PA
(n=7)
혈중 글루코스
(㎎/dL)		 264±5.8 248±4.8 555±8.6** 610±9.1**
체중 (g) 31±1.2 32±2.1 50±6.5** 49±4.2**
신장무게 0.20±0.02 0.21±0.06 0.26±0.05* 0.25±0.04*
소변 알부민 분비
(㎎/day)		 0.16±0.06 0.19±0.08 0.59±0.10** 0.37±0.11#
*; p < 0.05 vs. db/m **; p < 0.01 vs. db/m, #; p < 0.05 vs. db/db.
페리오스틴 -결합 DNA 압타머에 의한 당뇨병 마우스 모델 내 신장 섬유증 저해 효과
피브로넥틴 및 콜라겐 제 I 형 mRNA 발현 수준은 대조군 마우스에 비해 당뇨병 마우스의 신장 시료에서 크게 증가하였다(p<0.05). 이러한 피브로넥틴 및 콜라겐 제 I 형 mRNA 수준의 증가는 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 처리한 당뇨병 마우스 유래의 신장 시료에서 크게 감쇄되었다. 신장 시료의 웨스턴 블롯 실험에 의해 측정된 피브로넥틴 및 콜라겐 제 I형의 단백질 수준 역시 대조군에 비해 당뇨병 마우스에서 크게 증가하였고, 이러한 증가는 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 크게 감쇄되었다(도 9). 유사하게, 피브로넥틴의 염색 강도는 페리오스틴-결합 DNA 압타머 처리에 의해 명백하게 감쇄되는 당뇨병 마우스에서 크게 증가하였다. 마손 3색 염색 결과는 당뇨병 마우스의 신장 조직 내에서 관찰되는 신장 섬유증이 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 처리한 마우스 유래의 신장 조직에서 개선된다는 것을 입증하였다(도 10). 상기 실험결과들을 통하여, 본원 발명의 페리오스틴-결합 DNA 압타머는 당뇨병 환자에게서 발생 빈도가 높은 신장 섬유증의 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> YONSEI UNIVERSITY HEALTH SYSTEM <120> Diagnostic or therapeutic composition with periostin aptamer for fibrosis <130> DPB162348 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Periostin DNA aptamer <400> 1 accagttgtc gcatgtgcgg ttcagtctgg tccttcagca ccgtaccaca 50

Claims (13)

  1. 서열번호 1로 표시되는 페리오스틴(periostin)-결합 DNA 압타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 복막 섬유증 예방 또는 치료용 조성물로서,
    상기 조성물은 복막 조직 내 EMT(Epithelial-mesenchymal transition) 억제 또는 EMT 관련 인자의 발현을 억제시키는 것인, 복막 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 복막 섬유증은 지속적 외래 복막 투석에 의해 유발되는 것인, 복막 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 서열번호 1로 표시되는 페리오스틴-결합 DNA 압타머를 유효성분으로 포함하는 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 신장 섬유증은 당뇨병성 신장증에 의해 유발되는 것인, 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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Braun N, et al. Perit Dial Int. 2013 Sep-Oct;33(5):515-28 (2013.02.01. 공개)*
Mouna Mael-Ainin, et al. J Am Soc Nephrol. 2014 Aug;25(8):1724-36 (2014.02.27. 공개)*

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