KR101820264B1

KR101820264B1 - 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101820264B1
Application number: KR1020170008390A
Authority: KR
Inventors: 김진회; 최윤정
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2017-01-18
Publication date: 2018-01-18

Abstract

본 발명은 줄기세포에서 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 엑소좀은 줄기세포를 배양한 배양액(conditioned medium, CM)에서 추출되었고, 암세포 내로 유입되어 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 사멸을 활성화시킴으로서, 특히 난소암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising exosome derived from stem cells}

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있으며, 세포학적 유래에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. 배아 줄기세포는 착상 전 수정란이나 발생중인 태아 생식기 조직 등에서 유래하는 반면, 성체 줄기세포는 성체 내에서 존재하는 각 기관, 예를 들면 골수, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다.

엑소좀은 지름이 30 내지 200 nm의 막-결합 마이크로 소포체로서, RNA, 단백질, DNA 및 지질을 포함하는 중용한 구성요소를 포함하고 있는 것으로 알려져있다. 엑소좀은 이웃 세포로 포함될 수 있는 능력에도 불구하고 모든 세포에서 분비되는 것으로 보고되고 있으며, 특히, 세포-분비의 microRNA(miRNA: 18~22 뉴클레오타이드)는 엑소좀에 의해 주로 옮겨지고, mRNA 사이런싱을 통해 유전자 발현의 전사 후 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 연구되었다.

1. 한국등록특허 제10-1662405호

본 발명의 목적은 줄기세포에서 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포에서 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포에서 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀은 줄기세포를 배양한 배양액(conditioned medium, CM)에서 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀은 50 내지 150 nm의 지름을 가진 것일 수 있고, 바람직하게는 70 내지 100 nm의 지름을 가진 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 조직에서 유래된 줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 난소암인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀은 암세포 내로 유입(내재화)되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀은 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 사멸을 활성화하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포에서 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포에서 추출된 엑소좀은 줄기세포를 배양한 배양액(conditioned medium, CM)에서 추출되었고, 암세포 내로 유입되어 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 사멸을 활성화시킴으로서, 특히 난소암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 hAMSC-CM가 in vitro에서 A2780 난소암 세포의 증식을 억제하는 효과에 대한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 hAMSC-CM으로 처리한 후 A2780 세포의 생존율의 퍼센트를 보여주는 결과이고(*p < 0.05 및 **p < 0.01), (b)는 hAMSC-CM로 처리한 후 72시간에 JC-1 (monomer/aggregate) 비율을 MMP 어세이로 측정한 결과를 나타낸 것이며(**p < 0.01), (c)는 hAMSC-CM로 처리한 후 72시간에 ROS 형성을 측정한 결과를 나타낸 것이고(*p < 0.05), (d)는 25% CM을 처리한 후 세포주ㄱ 분석에 대한 결과를 나타낸 것이며, (e)는 hAMSC-CM으로 처리한 후 72시간에 A2790에서 세포사멸 비율을 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end-labelling) 어세이로 측정한 결과를 나타낸 것이고, (f)는 내재적 세포사멸 관련 신호 분자인 BAX, cytosolic cytochrome-c, CAS9, CAS3, 및 BCL2에 대한 면역블럿에 대한 결과를 나타낸 것이다(*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001).
도 2는 hAMSC-CM 유래의 엑소좀에 의한 A2780 암세포의 억제에 대한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 hAMSC-CM에서 분리된 구형 엑소좀을 TEM으로 이미지화한 것이고, (b)는 엑소좀의 지름 크기의 분포도를 나타내는 결과이며, (c)는 엑소좀 및 세포분해물에서 단백질 크기에 따른 분포를 나타내는 SDS-PAGE의 Coommassie Blue 염색에 대한 결과를 나타낸 것이고, (d)는 엑소좀 유래 단백질에서 엑소좀-특이적 마커(α-CD63)의 발현 여부를 웨스턴 블럿팅으로 측정한 결과를 나타낸 것이며, (e)는 A2780 세포로의 엑소좀의 내재화를 나타내는 결과이고, (f)는 엑소좀 처리 후 상처-치료 어세이 결과를 나타내는 것이며, (g) 엑소좀 처리 후 콜로니 형성능에 대한 결과를 나타낸 것이고, (h)는 엑소좀 처리 후 플레이팅 효율에 대한 퍼센트를 나타낸 결과이며, (i)는 엑소좀 처리 후 생존율(survival fraction)의 퍼센트를 나타낸 결과이고, (j)는 엑소좀 처리 후 세포생존율(cell viability)을 나타낸 결과이며, (k)는 프로테아제-분해의 엑소좀 분해물로 처리한 후 세포생존율(cell viability)를 나타낸 결과이고, (l)은 RNase-분해의 엑소좀 분해물로 처리한 후 세포생존율(cell viability)를 나타낸 결과이다(*p < 0.05 및 **p < 0.01).
도 3은 엑소좀을 처리한 A2780 암세포에서 세포사멸 활성에 대한 메커니즘을 나타낸 것이다. (a)는 전-세포사멸인자의 상향조절 및 항-세포사멸인자 BCL2의 하향조절에 대한 웨스턴블럿팅 결과를 나타낸 것이고, (b)는 hAMSC-CM 유래의 엑소좀에 의한 A2780 세포의 증식 억제를 나타내며, 상기 엑소좀은 MSC-분비의 miRNA의 전달체로서 기능하는 것이며, 엑소좀에서 방출되는 miRNA에 의하여 암세포의 증식이 억제되고 암전이를 억제할 수 있다는 개요도를 나타낸 것이다.

본 발명의 용어, "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어, "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀의 지름은 50 내지 150 nm의 지름을 가진 것일 수 있고, 바람직하게는 70 내지 100 nm의 지름을 가진 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 개체의 직접 생착 또는 이식하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 암 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

1.1. 시약

ExoQuick-TC exosome-isolation reagent (EXOTC50A-1), SeraMir exosome RNA-isolation kit (RA808A-1), exosome-specific marker anti-α CD63 antibody (EXOABCD63A-1), 및 florescence exosome-preparation reagent (EXDC300A-1)은 System Biosciences (SBI, Palo Alto, CA, USA)으로부터 구입하였다. Penicillin-streptomycin (PS) solution, trypsin-EDTA solution, RPMI medium, 및 α -MEM media는 Life Technologies GIBCO (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. FBS(Fetal bovine serum)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 면역블럿에 사용된 항체의 경우 phosphorylated p53 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), BAX, BCL2, CASP9, CASP3, β -actin (Abcam, Cambridge, MA), 및 cytochrome c (ENZO Diagnostics Inc., Farmingdale, NY, USA)가 사용되었다.

1.2. CM(Conditioned medium) 준비

hAMSCs(human adipose-derived mesenchymal stem cells)은 주식회사 마리아바이오텍(서울, 한국)에서 기부된 것을 사용하였고, 10% FBS와 100 U/ml PS가 포함된 α-MEM 배지를 사용하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다. hAMSC-CM은 6번째 및 7번째 사이의 계대배양의 세포에서 획득되었다. 간단하게, 2x10⁶ 세포가 10-cm 배양 디쉬에 접종되고, 적당한 부착을 위하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 오버나잇되었다. 배지는 새롭게 갈아주었고, 세포는 추가로 48시간 동안 배양되었을 때, 이에 따른 배지를 hAMSC-CM으로 간주하였다. pH 안정성은 전기적 pH 미터 및 pH 페이퍼를 사용하여 확인하였다. 전체 1L의 CM을 모으고, 필터하여, 혼합시킨 후, 15ml 및 50 ml의 튜브에 나누어 20℃에 보관하였다.

1.3. CM 정량 결정 및 세포-생존율 어세이

A2780 세포 증식에서 hAMSC-CM 의 효과를 확인하기 위하여, 새로운 배지에 1 내지 30%의 CM 추가제를 사용하여 세포생존율 어세이가 수행되었다. A2780 세포는 96-well flat-bottomed culture plates에 접종되었고, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다. 배지는 대조군(fresh) 또는 실험군(0 내지 30% CM) 배지로 교환되었고, 세포 생존율은 cell counting kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)을 사용하여 확인되었다. 흡광도는 microtiter plate reader (Multiskan FC; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정되었다. 상기로부터 얻어진 결과를 근거로, 새로운 배지에 25% CM의 추가하는 것으로 모든 실험에 적용되었다.

1.4. ROS (reactive oxygen speices ) 확인

ROS 형성은 H2-DCFDA(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate; Sigma-Aldrich)을 사용하여 정량하였다. 세포는 10 μM H2-DCFDA 를 처리하고 30분 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다. 이후, 세포는 PBS(phosphate-buffered saline)으로 씻어지고, 재부양되었고, Gemini EM (SpectraMAX; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 각각 515 nm 및 488 nm에서 fluorescence emission 및 excitation이 측정되었다.

1.5. MMP ( mitochondrial membrane potential) 확인

MMP는 cationic fluorescent indicator JC-1 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 확인되었다. 세포는 10 μM JC-1가 처리된 후 15분 동안 37℃에서 배양되었고, PBS로 씻어지고 재부양되었으며, 형광강도(fluorescence intensity)가 측정되었다. MMP는 JC-1 모노머와 JC-1 집합체에 대한 형광강도의 비율로서 표현되었다. JC1 집합체는 583 nm emssion에서 온전한 미토콘드리아에 대하여 red fluorescence으로 나타나고, JC1 모노머는 525 nm emission과 488 nm excitation에서 세포질에 대하여 green fluorescence로 나타났다.

1.6. 세포주기

A2780 세포는 6-well plates (30,000 cells/cm2)에 접종되고, 오버나잇시킨 후, 배지는 대조군(fresh) 또는 실험군(25% CM) 배지로 24시간 마다 교환하였다. 세포는 세포주기 분석을 위하여 48시간 및 72시간에 모아지고, PBS로 씻었고, 70% 에탄올로 고정하였으며, 20℃에 저장하였다. 고정된 세포는 PBS로 씻어지고, RNaseA 용액으로 처리된 후, PI(propidium iodide)로 염색되었다. 세포주기 분석은 BD FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 기초 데이터는 ModFit software trial version (http://www.vsh.com/products/mflt/index.asp)을 사용하여 분석되었다.

1.7. TMR ( tetramethylrhodamine )- 레드 어세이 .

A2780 세포는 6-well plates (30,000 cells/cm2)에 접종되고, 오버나잇시킨 후, 배지는 대조군(fresh) 또는 실험군(25% CM) 배지로 24시간 마다 교환하였다. 72시간에, 세포는 모아지고, 세포자멸 비율은 제조사의 지시에 따라 in situ cell-death detection kit (TMR red; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)을 사용하여 확인하였다.

1.8. 면역블롯팅

세포를 분해하기 위해 방사능 면역침전(radio-immunoprecipitation) 버퍼가 사용되었고, 단백질 양은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)로 측정되었다. 단백질은 12% SDS-PAGE를 사용하여 전기영동을 진행하였고, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 블럿팅하였다. 멤브레인은 5% 스킴 밀크에서 RT(room temperature)에서 2시간 동안 처리하고, 1차 항체를 넣은 후 4℃에서 오버나잇시킨 후, horseradish peroxidase-conjugated 1차 항체를 넣은 후 RT에서 1시간 동안 처리하였다. 면역-반응은 enhanced chemiluminescence reagents로 확인되었다.

1.9. 엑소좀 분리 및 특성

엑소좀은 제조사(ExoQuick-TC kit)의 지시에 따라 분리되었다. 간단하게, ExoQuick-TC reagent가 hAMSC-CM에 1:5 비율로 더해지고, 튜브를 거꾸로 하여 여러 번 혼합시켰다. 혼합물은 4℃에서 오버나잇시키고, RT에서 30분 동안 1500 g 에서 원심분리하였다. TEM(transmission electron microscope)을 위해, 엑소좀-TEM grid가 제조사(Exosome-TEM-easy kit; 101Bio, Palo Alto, CA, USA)의 지시대로 준비되었고, 엑소좀 입자는 Hitachi H7600 electron microscope (Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하여 100 kV 가속 전압에서 확인하였다.

1.10. 세포생존율 어세이

CM의 1 ml에서 유래한 엑소좀은 1 U 엑소좀으로 정의하였다. 생존율 어세이를 위하여 세포는 1 U/ml의 엑소좀으로 처리되었다. 프로테아제 또는 RNase-분해의 엑소좀을 사용할 때, 대조군 배지는 실험적 에러를 피하기 위하여 동일양의 프로테아제 또는 RNase 용액을 추가하였다. 프로테아제-분해의 엑소좀은 37℃에서 30분 동안 100 μl의 트립신(0.25%)으로 5 U 엑소좀을 분해함으로써 준비되었다. RNase-분해의 엑소좀은 37℃에서 30분 동안 100 μl의 RNaseA solution (100 μg/ml)으로 5 U 엑소좀을 분해함으로써 준비되었다.

1.11. 상처 치료 어세이

상처 치료 능력을 확인하기 위하여, 세포(30,000 cells/cm²)는 12-well plate에서 접종되었고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 오버나잇으로 배양되었다. 상처는 10-μl 파이펫 팁(pipette tips)으로 만들었고, 대조군(fresh) 또는 다른 실험군(25% CM, 1 U/ml 엑소좀, 또는 1 U/ml 엑소좀+25% CM)으로 실험이 진행되었다.

1.12. 콜로니 형성 어세이

콜로니 형성 어세이를 위하여, 1000 개의 세포가 60-cm cell-culture dishes에 접종되었고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 오버나잇으로 배양되었다. 배지는 대조군(fresh) 또는 다른 실험군(25% CM, 1 U/ml 엑소좀, 또는 1 U/ml 엑소좀+25% CM)으로 교환되었고, 세포는 2주 동안 배양되었다. 콜로니를 포함하는 디쉬는 1% 메탄올 및 1% 포르말린이 포함된 0.05% (w/v) crystal-violet solution으로 RT에서 20분 동안 염색되었다. 콜로니 사진은 ultraviolet table을 사용하여 찍었고, 콜리니는 OpenCFU software (http://opencfu.sourceforge.net/)를 사용하여 카운팅하였다. PE(cell-plating efficiency) 및 SF(survival fraction)은 하기의 공식으로 계산되었다.

Plating efficiency (PE) = (Number of colonies/Number of cells seeded) x 100

Surviving fraction(SF) = (PE of treated cells/PE of control cells) x 100

1.13. 형광- 엑소좀 준비 및 암세포로의 내재화(internalization)

제조사(EXDC300A-1, SBI, Palo Alto, CA, USA)의 프로토콜에 따라 형광 엑소좀이 준비되고, 암세포에 의한 hAMSC-CM 유래의 엑소좀의 내재화가 결정되었다. 간단하게, 50 μl의 10× Exo-Red가 500 μl의 엑소좀 서스펜션(in PBS)에 더해지고, 혼합되었다. 혼합물은 10분 동안 37℃에서 놓이고 반응을 멈추게 하기 위하여 100 μl의 ExoQuick-TC reagent가 더해졌으며, 30분 동안 얼음에 두었다. 혼합물은 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리되었고, 레이블된 엑소좀 펠릿은 재부양되고, 암세포로 전달되었다. 내재화는 형광 현미경으로 확인되었다.

1.14. 통계적 분석

실험은 세 번 수행되었고, 통계적 분석은 one-way analysis of variance를 사용하여 수행되었다. 대조군과 처리된 세포 사이의 유의성의 차이는 Student t test에 의하여 결정되었다. 유의성은 p < 0.05, p < 0.01 및 p < 0.001로서 결정되었다.

실시예 2. hAMSC -CM 처리에 의한 난소암 세포의 증식 억제 효과

hAMSC 유래의 CM은 향상된 산화적 스트레스를 통해 세포 증식을 변경하였고, MMP(mitochondrial membrane potential)을 감소시켰다. CM은 배양액의 pH를 변경시키지 않고, 25% CM 에서 가장 효과적으로 세포증식을 억제하였음을 확인하였는데, 특히, 25% CM을 처리한 후 48시간에서는 세포 생존율을 대조군에 비해 20% 감소시키고, 72시간에서는 40%로 감소시켰음을 확인하였다(도 1a). 또한, CM 처리에 따른 세포 사멸의 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 CM-처리된 A2780 세포에서 ROS 와 MMP를 측정하였고, 그 결과, 25% CM 처리에서 JC-1 모노머/집합체 비율이 대조군에 비해 65% 향상되었다(도 1b). 즉, 미토콘드리아 막 전위가 불안정하였음을 확인하였다. ROS의 생성에서도 대조군에 비해 30% 증가됨을 확인하였다(도 1c). 세포주기 분석에서도 CM 처리 후 48시간 후에는 S-phase 세포의 수가 증가하였고, G0/G1 phase 및 G2/M phase 세포는 감소됨을 확인하였다(도 1d). 그러나, CM 처리 후 72시간에서는 S phase 및 G2/M phase 세포가 증가하였고, GO/G1 phase 세포가 유의적으로 감소되었다.

따라서, hAMSC-CM은 암세포의 증식을 억제하고, 세포주기를 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 3. hAMSC -CM 처리에 의한 암세포에서 내재적 세포사멸 경로의 활성 효과

hAMSC- 유래의 CM 처리 후 세포사멸 유도를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 TMR(tetramethylrhodamine)-red 어세이를 수행하여, 사멸된 세포의 퍼센트를 측정하였다. FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석 결과, 대조군에 비하여 CM 처리 후 사멸된 세포의 퍼센트에서 유의하게 증가됨을 확인하였다(도 1e).

또한, 본 발명자들은 CM-처리된 A2780 세포에서 내재적 세포사멸 경로-관련 항-세포사멸 분자 및 전-세포사멸 분자의 발현을 확인하는 실험을 수행하였다. CM-처리된 A2780 세포에서, 항-세포사멸 단백질인 BCL2의 발현은 대조군 세포에 비해 하향조절된 반면, 인산화된-p53, BAX, CASP9, CASP3, 및 세포질의 Cytochrome-c를 포함하는 몇 개의 전-세포사멸 분자의 발현은 상당히 상향조절되거나 활성화되었다. 추가적으로, BAX/BCL2 비율 및 활성-/전-CASP3 비율은 대조군에 배해 CM-처리된 세포에서 몇 배로 증가되었음을 확인하였다(도 1f).

따라서, CM의 처리는 암세포에서 세포사멸을 유도함을 확인하였다.

실시예 3. hAMSC -CM 유래의 엑소좀의 동정, 특성 및 A2780 세포 내로의 엑소 좀의 내재화

본 발명자들은 hAMSC-CM 유래의 엑소좀이 CM-처리된 A2780 세포에서 관찰된 세포사멸의 유도에 관련이 있는지를 확인하고자 하였다. 도 2a는 TEM(transmission electron microscopy)에서 확인한 hAMSC-CM 유래의 엑소좀을 보여주고 있다. 엑소좀은 50 내지 150 nm의 크기를 가진 구(sphere)로 나타났고, 다수는 70 내지 100 nm인 것으로 확인되었다(도 2b). 다음으로, 본 발명자들은 엑소좀으로부터 전체 단백질을 추출하였고, Coommassie Blue 염색으로 결과를 확인하였다(도 2c). 도 2d에서와 같이, 엑소좀 단백질 마커인 CD63이 엑소좀-유래의 분해물에서 확인되었다. 끝으로, 본 발명자들은 엑소좀이 A2780 암세포로 내재화될 수 있는지 조사하였다. 엑소좀은 엑소좀 RNA 에 결합을 확인할 수 있는 Exo-red 염색 키트를 사용하여 레이블되었다. 그 결과, CM-유래의 엑소좀은 A2780 암세포로 내재화되었음이 확인되었다(도 2e).

실시예 4. hAMSC -CM 유래의 엑소좀에 의한 세포생존율 , 상처-회복 능력 및 콜로니 형성 능력의 감소

난소암 세포에서 hAMSC-CM-유래의 엑소좀 내재화의 영향을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 A2780, SKOV-3 및 CAOV-3 난소암 세포에 hAMSC-CM 유래의 엑소좀을 처리하였다. 그 결과, A2780, SKOV-3 세포에서는 엑소좀 처리에 의한 억제 효과가 나타났으나, CAOV-3 세포에서는 특별한 변화가 없었다. 본 발명자들은 A2780 세포에서 상처-회복 능력(도 2f) 및 콜로니 형성능력(도 2g)을 실험하였다. 그 결과, 도 2h, 2i 및 2j에서와 같이, 대조군에 비해 암세포로 엑소좀의 내재화 후에 세포-플레이팅 효율, 세포-생존 부분 및 세포 생존율에서의 상당한 감소가 나타났다.

실시예 5. hAMSC -CM 유래의 엑소좀의 내재화에 의한 A2780 세포에서의 전-세포사멸 분자의 상향조절 효과

본 발명자들은 CM-유래의 엑소좀이 내재화된 A2780 세포에서 대조군에 비해 인산화된-p53, BAX, CASP9, CASP3, 및 세포질의 Cytochrome-c를 포함하는 몇 개의 전-세포사멸 신호전달 분자가 상향조절됨을 웨스턴 블럿팅 실험을 통해 확인하였다. 또한, 항-세포사멸 BCL2는 대조군에 비해 하향조절되었다(도 3).

따라서, CM-유래 엑소좀의 내재화는 A2780 세포에서 내재적 세포사멸 경로의 활성을 이끌 수 있음을 확인하였다.

Claims

인간 양막 중간엽 줄기세포(Human Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell, hAMSC)의 배양액(conditioned medium, CM)에서 추출한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 배양액은 총 조성물 부피 대비 1-50 부피%으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 엑소좀은 50 내지 150 nm의 지름을 가진 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 엑소좀은 난소암 세포 내로 유입(내재화)되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 엑소좀은 난소암 세포의 증식을 억제하고 난소암 세포의 사멸을 활성화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
인간 양막 중간엽 줄기세포(Human Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell, hAMSC)의 배양액(conditioned medium, CM)에서 추출한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 난소암 전이 억제용 조성물로서,
상기 배양액은 총 조성물 부피 대비 1-50 부피%으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 난소암 전이 억제용 조성물.
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제 8 항에 있어서,
상기 엑소좀은 50 내지 150 nm의 지름을 가진 것을 특징으로 하는 조성물.
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