KR101813586B1 - Protein nanoparticle linked with multiple disease specific marker epitope and ultra-sensitive method for detecting disease specific marker using it - Google Patents

Protein nanoparticle linked with multiple disease specific marker epitope and ultra-sensitive method for detecting disease specific marker using it Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 질병마커 인지 에피토프가 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00015
발현된 단백질 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 고민감도 질병마커 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Strong 또는 Weak 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1벡터;와 Strong 또는 Weak 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프 를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2벡터(단, 제1벡터와 제2벡터의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)가 도입되어 있는 재조합 미생물, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 서로 상이한 비율로 융합
Figure 112016128837369-pat00016
발현되어 있는 단백질 나노입자와 이의 제조방법, 상기 단백질 나노입자를 포함하는 하이드로젤 및 이를 활용한 질병마커 검출방법에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 단백질 나노입자는 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프들이 다양한 비율로 올바른 배향성을 갖고, 고집적으로 표출이 가능하며, 이를 이용한 질병마커의 검출방법은 다양한 질병마커 특이적 에피토프가 단백질 나노입자의 표면에 표출되어 있어, 민감도와 정확성이 매우 뛰어나다.The present invention is based on the finding that various disease marker-
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The present invention relates to a protein nanoparticle, a method for producing the protein nanoparticle, a method for producing the protein nanoparticle, and a method for detecting a disease susceptibility marker using the same. More particularly, A second vector operatively linked to a gene encoding a Strong or Weak promoter, a gene encoding a human ferritin heavy chain protein, and a disease marker specific epitope, provided that the first vector and the second vector's promoter And the disease marker specific epitope are different) is introduced into the surface of the human ferritin heavy chain protein, the recombinant microorganism to which the fusion marker specific epitope of two or more disease marker specific proteins is fused
Figure 112016128837369-pat00016
The protein nanoparticles according to the present invention are characterized in that two or more disease marker specific epitopes are present on the surface of the protein nanoparticles according to the present invention, The present invention provides a method for detecting a disease marker using the method of the present invention. The method of detecting a disease marker using the protein marker nanoparticle according to the present invention has excellent sensitivity and accuracy because various disease marker specific epitopes are expressed on the surface of protein nanoparticles.

Description

다양한 질병마커 인지 에피토프와 연결된 단백질 나노입자 및 이를 이용한 고민감도 질병마커 검출방법{Protein nanoparticle linked with multiple disease specific marker epitope and ultra-sensitive method for detecting disease specific marker using it}Protein nanoparticle linked with multiple disease specific marker epitope and ultra-sensitive method for detecting disease specific marker using it}

본 발명은 다양한 질병마커 인지 에피토프와 연결된 단백질 나노입자 및 이를 이용한 고민감도 질병마커 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Strong 또는 Weak 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1벡터;와 Strong 또는 Weak 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프 를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2벡터(단, 제1벡터와 제2벡터의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)가 도입되어 있는 재조합 미생물, 인간 훼리틴 중쇄 단백질에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표면에 융합

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발현되어 있는 단백질 나노입자와 제조방법 및 이를 포함하는 질병마커 검출방법에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 단백질 나노입자를 이용한 질병마커의 검출방법은 둘 이상의 에피토프를 단백질 나노입자의 표면에 다양한 비율로 표출 시킨 단백질 나노입자를 사용함으로서, 민감도와 정확성이 매우 뛰어나다.The present invention relates to protein nanoparticles linked to various disease marker recognition epitopes and a method for detecting highly sensitive disease markers using the same, and more specifically, to a Strong or Weak promoter, a gene of a human ferritin heavy chain protein, and a disease marker-specific epitope. A first vector to which the gene is operably linked; and a second vector to which a strong or weak promoter, a gene of a human ferritin heavy chain protein, and a gene encoding a disease marker-specific epitope are operably linked (however, the first vector and the first vector (2) The promoter of the vector and the gene encoding the disease marker-specific epitope are different), and two or more disease marker-specific epitopes are fused to the surface of a recombinant microorganism and human ferritin heavy chain protein.
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It relates to the expressed protein nanoparticles, a manufacturing method, and a disease marker detection method including the same.The method for detecting disease markers using protein nanoparticles according to the present invention expresses two or more epitopes on the surface of the protein nanoparticles in various ratios. By using the prepared protein nanoparticles, the sensitivity and accuracy are very excellent.

훼리틴(Ferritin)은 무거운 사슬과 가벼운 사슬로 구성된 24개의 동일한 단백질 서브유닛(subunit)으로 구성되며 생체내에서 중공 외피(hollow shell)를 형성한다. 철분과 결합하는 상기 단백질은 철 저장 기능을 가지며, 철 해독(iron detoxification) 기능을 한다(Harrison et al., Biochim Biophys Acta., 1275(3): 161-163, 1996). 상기 단백질은 대부분의 조직의 성장과 생존을 위해 세포 내의 철 균형을 유지하고, 세포 내의 철의 결합으로 인한 산소-자유 라디칼 형성을 최소화시키는 세포 보호 단백질로서 기능을 한다(Lawson et al., Nature, 349: 541-544, 1991). 훼리틴의 분자량은 약 500.000Da으로, 무거운 사슬(Heavy chain)과 가벼운 사슬(Light chain)로 구성되어 있고, 자가 조립 능력이 있어 구형 입자를 형성하는 독특한 특성을 나타낸다. Ferritin is composed of 24 identical protein subunits composed of heavy and light chains and forms a hollow shell in vivo. The protein, which binds to iron, has an iron storage function and an iron detoxification function (Harrison et al., Biochim Biophys Acta., 1275(3): 161-163, 1996). This protein maintains the iron balance in cells for the growth and survival of most tissues, and functions as a cytoprotective protein that minimizes the formation of oxygen-free radicals due to the binding of iron in the cells (Lawson et al., Nature, 349: 541-544, 1991). Ferritin has a molecular weight of about 500.000 Da, which is composed of a heavy chain and a light chain, and exhibits a unique characteristic of forming spherical particles due to its self-assembly ability.

ibpfxs 프로모터는 RNA중합효소를 이루는 시그마 32(sigma 32)가 인지하는 스트레스 반응성 프로모터 ibpAB 와 fxsA가 일렬로 연결된 것으로써 이 프로모터는 각각 작은 열충격 단백질 IbpA, IbpB와 세포내막단백질 FxsA의 전사에 관여한다(Kraft, M. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 75: 397-406, 2007). ibpfxs 프로모터는 스트레스에 반응하여 전사가 활성 되기 때문에 T7에 비해 상대적으로 Weak 세기를 나타내는 프로모터이다. 기존 연구 문헌에 따르면 재조합 단백질이 세포 내에서 과생산(overproduction) 될 경우 세포는 열충격과 유사한 스트레스 반응을 나타내고 시그마32 생산이 증가하여 스트레스 반응성 단백질의 합성을 유도한다. 따라서 T7 프로모터와 ibpfxs 프로모터가 있는 벡터를 동시에 발현할 경우, T7 프로모터에 의한 재조합 단백질의 생산량은 ibpfxs 프로모터에 의한 재조합 단백질의 생산량 보다 항상 많게 된다(Lee JW. et al, ACS Nano, 7(12): 10879-10886, 2013). The ibpfxs promoter is a stress-responsive promoter recognized by sigma 32, which is an RNA polymerase. Since ibpAB and fxsA are connected in series, this promoter is involved in the transcription of the small heat shock proteins IbpA and IbpB and the intracellular membrane protein FxsA, respectively (Kraft, M. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 75: 397-406, and 2007). The ibpfxs promoter is a promoter that exhibits relatively weak strength compared to T7 because transcription is activated in response to stress. According to the existing research literature, when the recombinant protein is overproduced within the cell, the cell exhibits a stress response similar to heat shock, and the production of sigma 32 increases, inducing the synthesis of the stress-responsive protein. Therefore, when a vector having the T7 promoter and the ibpfxs promoter are simultaneously expressed, the amount of recombinant protein produced by the T7 promoter is always higher than that of the recombinant protein produced by the ibpfxs promoter (Lee JW. et al, ACS Nano, 7(12)). : 10879-10886, 2013).

C형 간염은 C형 간염 바이러스(HCV)에 감염된 환자의 혈액이나 체액을 통해 전염되는 일종의 감염병으로, 감염 시 70~80%의 환자가 만성 간염으로 진행하고 이 가운데 30~40%는 간경변증, 간암으로 진행하며, 특히 B형 간염과 달리 백신이 개발되어 있지 않고 면역글로불린도 없다. 때문에 조기에 간염여부를 정확하게 진단하는 것이 매우 중요시 되고 있다. 또한 조기에 C형 간염 진단을 받고 치료 시 완치 확률이 현저히 증가하는 것으로 알려져 있기 때문에 조기진단의 중요성에 따른 조기진단 시스템의 개발이 중요시되고 있다. Hepatitis C is a type of infectious disease that is transmitted through the blood or body fluids of patients infected with the hepatitis C virus (HCV).When infected, 70 to 80% of patients develop chronic hepatitis, of which 30 to 40% are cirrhosis and liver cancer. In particular, unlike hepatitis B, a vaccine has not been developed and there is no immunoglobulin. Therefore, it is very important to accurately diagnose hepatitis early. In addition, since it is known that hepatitis C is diagnosed at an early stage and the probability of cure is significantly increased during treatment, the development of an early diagnosis system according to the importance of early diagnosis is becoming important.

C형 간염의 진단은 혈액 검사를 통해 C형 간염 바이러스 항체(anti-HCV)를 검출하거나, 혹은 C형 간염 바이러스를 직접 확인 하는 검사(HCV RNA 검사)를 통해 진행되고 있다. 또한 염증 수치나, 간손상을 나타내는 대표적인 CRP(C-reactive protein)농도 측정 및 간기능 검사(ALT, alanine aminotransferase)는 대부분의 환자의 일반화학 검사에 포함되어 있다. 이 또한 ALT의 경우 채혈 검사를 통해 진행되며 혈액 내에 존재하는 효소(ALT)와 기질(alanine, alpha-ketoglutaric acid)의 반응에 의한 부산물을 통한 발색반응을 거쳐 정량하고 있다. CRP는 anti-CRP antibodies가 고정된 latex particles의 응집을 이용하는 라텍스 응집법이나, 적혈구 침강법, 모세관 면역침전법 등으로 측정되고 있다. 상기 상용화 된 방법은 모두 혈액 시료 대상, 광학적 측정밥법을 통해 이루어지고 있으며 전문장비를 통해서만 측정이 가능하다. Diagnosis of hepatitis C is being carried out through a blood test to detect hepatitis C virus antibodies (anti-HCV), or through a test that directly confirms the hepatitis C virus (HCV RNA test). In addition, measurement of inflammation level, C-reactive protein (CRP) concentration and liver function test (ALT, alanine aminotransferase), which are representative of liver damage, are included in the general chemistry tests of most patients. In the case of ALT, it is also carried out through a blood sampling test, and is quantified through a color development reaction through a by-product of the reaction between an enzyme (ALT) present in the blood and a substrate (alanine, alpha-ketoglutaric acid). CRP is measured by latex agglutination method, erythrocyte sedimentation method, capillary immunoprecipitation method, etc. using the aggregation of latex particles to which anti-CRP antibodies are fixed. All of the above commercialized methods are performed through a blood sample target and an optical measurement method, and can be measured only through specialized equipment.

C형 간염 바이러스는 크게 3종류의 구조 단백질 (core, envelope protein 1, envelope protein 2)과 5종류의 비구조 단백질(NS1, NS2, NS3, NS4, NS5)로 구성되어 있으며, 현재까지 다양한 연구들로부터 core 부분의 c22p(K10~S53), NS3 부분의 c33c(A1192~C1457), NS4 부분의 5-1-1p(I1694~L1735)와 c100p(I1920~V1935) 부위가 anti-HCV 항체가 결합하는 4종류의 HCV 중요 항원성 에피토프로 알려져 있다. Hepatitis C virus is largely composed of three structural proteins (core, envelope protein 1, envelope protein 2) and five non-structural proteins (NS1, NS2, NS3, NS4, NS5), and various studies to date. From c22p (K10~S53) of the core part, c33c (A1192~C1457) of the NS3 part, 5-1-1p (I1694~L1735) of the NS4 part and c100p (I1920~V1935) of the core part are combined with anti-HCV antibodies It is known as four types of HCV important antigenic epitopes.

감염질병에 대한 고감도 진단을 위해 나노소재 기반 생체분자검지 기술이 주목받고 있으나, 기존 인공 합성 유/무기 나노소재의 경우 나노독성, 합성과정의 복잡성, 크기 및 입도분포의 불균일성, 추가적 화학적 개질의 필요성, 배향성 및 집적도 제어 등의 많은 한계를 나타내고 있다. 반면 단백질 나노입자는 여러 개의 단량체가 생명체의 세포 내에서 단백질 고유의 자가조립(salf-assembly)특성에 의해 자연 생합성되는 생체 나노 소재로서, 안정성이 탁월하며 간단한 유전자 조작으로 입자의 표면 기능/특성을 용도에 따라 자유자재로 변화시킬 수 있다. 따라서 각기 다른 외래 단백질을 단량체에 융합한 후 동시에 세포내에서 발현하면 이종 외래 단백질을 포함하는 하나의 단백질 나노입자의 제조가 가능하며 단백질 나노입자를 이루는 단량체의 구조에 따라 단백질 아미노 말단, 카르복실 말단 등 입자표면 표출이 가능한 다양한 위치에 외래 단백질의 융합이 가능할 뿐 아니라, 외래 단백질이 융합되어도 단백질 나노입자 본래의 구조적 특성을 유지할 수 있다. 또한 항생마커가 다른 두 종류의 발현벡터를 이용하여 한 세포 안에서 동시발현 했을 경우 두 종류 이상의 외래단백질이 표줄되는 단백질 나노입자를 합성할 수 있으며 강도가 다른 프로모터를 지니는 다른 두 개의 발현벡터를 이용할 경우 한 세포 안에서 이종 융합 단백질의 발현 및 발현 효율을 조절 할 수 있기 때문에 단백질 나노입자 표면에 표출되는 두 종류 이상의 외래단백질의 상대적인 비율을 조절할 수 있다. Nanomaterial-based biomolecule detection technology is attracting attention for high-sensitivity diagnosis of infectious diseases, but in the case of existing artificial synthetic organic/inorganic nanomaterials, nanotoxicity, complexity of the synthesis process, non-uniformity in size and particle size distribution, and the need for additional chemical modification , It shows many limitations such as control of orientation and degree of integration. On the other hand, protein nanoparticles are biological nanomaterials in which several monomers are naturally biosynthesized by the unique salf-assembly property of proteins in the cells of living organisms. It can be changed freely according to the use. Therefore, if different foreign proteins are fused to a monomer and then expressed in a cell at the same time, it is possible to produce a single protein nanoparticle containing a heterogeneous foreign protein. Depending on the structure of the monomer constituting the protein nanoparticle, the amino terminal and carboxyl terminal of the protein The foreign protein can be fused to various locations where the surface of the particles can be expressed, and even if the foreign protein is fused, the original structural characteristics of the protein nanoparticles can be maintained. In addition, when co-expression in one cell using two different kinds of expression vectors with different antibiotic markers, protein nanoparticles expressing two or more kinds of foreign proteins can be synthesized, and if two different expression vectors with different strength promoters are used. Since it is possible to control the expression and expression efficiency of heterologous fusion proteins in one cell, it is possible to control the relative ratio of two or more foreign proteins expressed on the surface of protein nanoparticles.

조기진단이 중요한 만성 질병 및 바이러스 감염 질병은 동일한 질병이라 하더라도 다양한 질병 표지 인자를 포함하고 있으며 환자 개별 간 체내 질병 표지 인자의 분포 정도가 상이하여 정확한 진단의 어려움이 있다. 또한 대다수의 질병자에 존재하는 민감도와 특이도가 높은 질병 표지 인자가 발견되지 않은 경우 여러 질병 관련 표지 인자의 발견 빈도에 따라 질병을 진단한기도 한다. 따라서 정확한 조기 진단을 위해서는 체내의 다양한 질병 표지 인자를 동시에 검출할 수 있는 multi-epitope을 동시에 갖으며, 그 비율 또한 중요도에 따라 조절 가능한 동시 다중 질병 표지 인자 검출 시스템의 개발이 요구된다. Chronic and viral infections where early diagnosis is important, even if they are the same disease, contain various disease markers, and the degree of distribution of disease markers in the body is different between individual patients, making accurate diagnosis difficult. In addition, when disease markers with high sensitivity and specificity, which are present in the majority of patients, were not found, diseases were diagnosed according to the frequency of discovery of various disease-related markers. Therefore, for accurate early diagnosis, it is required to develop a simultaneous multi-epitope detection system capable of simultaneously detecting various disease markers in the body and controlling the ratio according to importance.

이에, 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 질병마커의 검출방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 서로 다른 에피토프를 융합한 인간 훼리틴 단백질 단량체를 암호화 하는 발현벡터를 각각 설계, 제작하여 대장균 내에서 동시발현 할 경우, 질병마커 측정에 유용한 민감도 높은 여러 중요 항원성 에피토프를 하나의 단백질 나노입자 표면에 동시에 표출하는 동시 다중 질병마커 검출이 가능한 고기능성 단백질 나노입자의 합성이 가능할 뿐만 아니라, 유전자 조작을 통해 세기가 다른 두 종류의 프로모터를 포함하는 각각의 발현벡터를 제작하고 이 발현벡터의 동시발현을 통하여 단백질 나노입자 표면에 각각 중요 항원성 에피토프의 표면 표출 빈도 조절이 가능해진 단백질 나노입자를 개발하였다. 또한 본 발명의 동시 다중 질병마커 검출이 가능한 고기능성 단백질 나노입자를 이용하여 C형 간염 마커의 검출에 이용한 결과, 민감도와 정확도가 매우 뛰어남을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop a method for detecting disease markers with high sensitivity and accuracy, and as a result of designing and producing expression vectors encoding human ferritin protein monomers fused with different epitopes, they are co-expressed in E. coli. In this case, it is possible to synthesize high-functional protein nanoparticles capable of simultaneous detection of multiple disease markers by simultaneously expressing several important antigenic epitopes with high sensitivity useful for measuring disease markers on the surface of one protein nanoparticle. Each expression vector containing two different types of promoters was prepared, and through co-expression of these expression vectors, protein nanoparticles were developed that enable control of the frequency of surface expression of each important antigenic epitope on the surface of the protein nanoparticles. In addition, the present invention was completed by confirming that the high-functionality protein nanoparticles capable of simultaneously detecting multiple disease markers of the present invention were used for the detection of hepatitis C markers, and the sensitivity and accuracy were very excellent.

본 발명의 목적은 발현강도가 상이한 자기조립 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a recombinant microorganism into which a vector in which a gene encoding a disease marker-specific epitope and a gene of a self-assembled protein having different expression intensities are operably linked is introduced.

본 발명의 다른 목적은 인간 훼리틴 중쇄 단백질에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00002
발현되어 있는 단백질 나노입자 및 상기 단백질 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is the fusion of two or more disease marker-specific epitopes to the human ferritin heavy chain protein on the surface.
Figure 112016128837369-pat00002
It is to provide a protein nanoparticles expressed and a method of preparing the protein nanoparticles.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 단백질 나노입자를 포함하는 하이드로젤 및 이를 이용한 질병마커의 검출방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a hydrogel including protein nanoparticles prepared by the above manufacturing method and a method for detecting disease markers using the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1벡터;와 Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2벡터(단, 제1벡터와 제2벡터의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a strong or weak promoter, a self-assembly protein gene, and a first vector in which a gene encoding a disease marker-specific epitope is operably linked; and a strong or weak promoter, A second vector to which a gene of a self-assembly protein and a gene encoding a disease marker-specific epitope are operably linked (however, a promoter of the first vector and the second vector and a gene encoding a disease marker-specific epitope Is different) to provide a recombinant microorganism has been introduced.

본 발명은 또한, Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1구역;과 Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2구역(단, 제1구역과 제2구역의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)을 포함하는 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.The present invention also provides a strong or weak promoter, a first region to which a gene of a self-assembly protein and a gene encoding a disease marker-specific epitope are operably linked; and a strong or weak promoter, self-assembly (self-assembly) assembly) a second region to which the gene of the protein and the gene encoding the disease marker-specific epitope are operably linked (however, the promoters of the first and second regions and the gene encoding the disease marker-specific epitope are different) A recombinant microorganism into which the containing vector has been introduced is provided.

본 발명은 또한, 자가조립(self-assembly) 단백질에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00003
발현되어 있는 단백질 나노입자를 제공한다.In the present invention, two or more disease marker-specific epitopes are fused to the surface of a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00003
It provides the expressed protein nanoparticles.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 자가조립(self-assembly) 단백질 나노입자의 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표현되어 있는 단백질 나노입자를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 단백질 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 자가조립(self-assembly) 단백질 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00004
발현되어 있는 단백질 나노입자의 제조방법을 제공한다.The present invention also includes the steps of culturing the recombinant microorganism to generate protein nanoparticles in which two or more disease marker-specific epitopes are expressed on the surface of self-assembly protein nanoparticles; And two or more disease marker-specific epitopes comprising the step of recovering the generated protein nanoparticles are fused to the surface of a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00004
It provides a method for producing expressed protein nanoparticles.

본 발명은 또한, 자가조립(self-assembly) 단백질에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00005
발현되어 있는 단백질 나노입자를 포함하는 하이드로젤을 제공한다.In the present invention, two or more disease marker-specific epitopes are fused to the surface of a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00005
It provides a hydrogel containing the expressed protein nanoparticles.

본 발명은 또한, (a)자가조립(self-assembly) 단백질에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00006
발현되어 있는 단백질 나노입자가 고정된 하이드로젤과 검출 대상 시료를 반응시킨 다음, 이차항체를 처리하는 단계; 및 (b)형광을 측정하는 단계를 포함하는 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 융합
Figure 112016128837369-pat00007
발현되어 있는 단백질 나노입자를 이용한 질병마커 검출방법을 제공한다.In the present invention, (a) two or more disease marker-specific epitopes are fused to the surface to a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00006
Reacting the hydrogel to which the expressed protein nanoparticles are immobilized with the sample to be detected, and then treating the secondary antibody; And (b) fusion of two or more disease marker-specific epitopes on the surface comprising the step of measuring fluorescence.
Figure 112016128837369-pat00007
It provides a method for detecting disease markers using expressed protein nanoparticles.

본 발명에 따른 단백질 나노입자는 세포 내에서 자연 생합성되는 3차원 나노구조체로서 항상 정확한 4차 구조와 입자 topology를 유지하며 합성되고, 표면에 표출되는 항원성 에피토프의 방향성을 일정하게 유지시킬 수 있으며, 프로모터 세기가 다른 두 종류의 발현벡터의 동시발현을 통하여 발현 시간차에 따라 단백질 나노입자의 표면에 표출되는 항원성 에피토프의 비율 조절이 가능하고, 나노독성 문제가 없는 안전한 3차원 생체 나노입자로서 하이드로젤에 고정하였을 경우 온전한 3차원형태를 유지하여 고민감도, 고특이도를 구현할 수 있는 장점이 있다.Protein nanoparticles according to the present invention are three-dimensional nanostructures naturally biosynthesized within cells, and are synthesized while always maintaining an accurate quaternary structure and particle topology, and can maintain a constant orientation of antigenic epitopes expressed on the surface, It is possible to control the ratio of antigenic epitopes expressed on the surface of protein nanoparticles according to the difference in expression time through simultaneous expression of two types of expression vectors with different promoter strengths. When it is fixed to, it has the advantage of realizing high sensitivity and high specificity by maintaining an intact three-dimensional shape.

본 발명에 따른 단백질 나노입자를 이용한 질병마커 검출방법은 질병마커 검출의 민감도 및 특이도가 현격하게 향상되어, 감염질병에 대한 고감도 진단을 위한 기능성이 향상된 나노소재로서 감염질병의 조기진단을 위해 널리 활용 가능한 신소재로 유용하다.The method for detecting disease markers using protein nanoparticles according to the present invention is a nanomaterial with improved sensitivity and specificity for detection of disease markers, and has improved functionality for highly sensitive diagnosis of infectious diseases, and is widely used for early diagnosis of infectious diseases. It is useful as a new material that can be used.

도 1은 대장균내에서 각각 다른 종류의 에피토프를 동시에 복합적으로 단백질 나노입자 표면에 표출시키며 각각의 에피토프의 표면 표출 빈도를 조절한 단백질 나노입자를 합성하기 위해 사용된 두 개의 발현벡터를 기본으로 하는 동시발현 시스템의 모식도이다(발현벡터에 표시된 L 은 링커 시퀀스(G3SG3TG3SG3를 나타냄).
도 2는 인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자 제조를 위한 발현벡터의 모식도이다.
도 3의 (A)는 (A) 한 종류의 항워성 에피토프(mono-epitope)만 표출된 단백질 나노입자의 SDS-PAGE 분석을 통한 수용성 발현을 확인 한 것이고, (B)는 3가지 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출되며 표면 표출 빈도를 조절한 단백질 나노입자의 SDS-PAGE 분석을 통한 수용성 발현을 확인 한 것이다(S는 Soluble(수용성), IS는 Insoluble(불수용성), M은 단백질 크기 마커를 나타냄).
도 4는 단일- 또는 복합적-항원성 에피토프가 표출된 인간 훼리틴 중쇄 유래의 단백질 나노입자를 합성하기 위해 사용된 대장균 유전자 발현 시스템 그리고 한 종류의 항워성 에피토프(mono-epitope)만 표출된 단백질 나노입자, 3가지 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출되며 표면 표출 빈도를 조절한 단백질 나노입자의 대장균에서 발현/정제 후 SDS-PAGE 분석결과이다.
도 5의 (A)는 한 종류의 항워성 에피토프(mono-epitope)만 표출된 단백질 나노입자의 투과전자현미경 촬영 결과이고, (B)는 3가지 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출되며 표면 표출 빈도를 조절한 단백질 나노입자의 투과전자현미경 촬영 결과이며, (C)는 동적광산란법 분석 결과이다.
도 6은 대장균 내에서 동시발현시스템에 의해서 합성된 단백질 나노입자의 시간에 따른 발현 양상 SDS-PAGE 분석 결과이다(막대그래프는 각각 단백질 구성-단백질 나노입자를 이루는 (hFTN-H)-EB 또는 (hFTN-H)-EC-EA-의 시간에 따른 변화를 나타냄).
도 7은 하이드로젤의 주사전자현미경 (SEM, Scanning Electron Microscope) 촬영사진이다.
도 8은 인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자를 이용한 C형 간염 질병 진단 및 민감도 분석 결과이다(P: 환자(patients), H: 건Strong(healthy) 사람 대조군임).
도 9는 인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자를 이용한 C형 간염질병 진단의 분석 성능을 나타내는 수신자 동작 특성 곡선(ROC(Receiver operating characteristic) curve)이다.
도 10의 (A)는 96-well plate의 2차원 표면에 고정화한 합성한 단일 항원성 에피토프 펩타이드의 혼합물(에피토프 B와 에피토프 C-A가 80% : 20%되도록 섞은)을 이용한 C형 간염 질병 환자의 진단 및 민감도 분석 결과이고, (B)는 수신자 동작 특성 곡선이다.Figure 1 is a simultaneous expression vector based on two expression vectors used to synthesize protein nanoparticles in which different types of epitopes are simultaneously expressed on the surface of protein nanoparticles in E. coli and the frequency of surface expression of each epitope is controlled. It is a schematic diagram of the expression system (L indicated in the expression vector represents a linker sequence (G 3 SG 3 TG 3 SG 3 ).
2 is a schematic diagram of an expression vector for preparing protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chains.
Figure 3 (A) is (A) confirmed the water-soluble expression through SDS-PAGE analysis of the protein nanoparticles expressing only one type of anti-war epitope (mono-epitope), (B) is three antigenic epitopes Is expressed in a multi-epitope, and water-soluble expression was confirmed through SDS-PAGE analysis of the protein nanoparticles whose surface expression frequency was controlled (S is Soluble, IS is Insoluble, M is Protein size marker).
FIG. 4 is an E. coli gene expression system used to synthesize protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chains in which a single- or complex-antigenic epitope is expressed, and a protein nano-epitope in which only one type of antiwarm epitope is expressed. This is the result of SDS-PAGE analysis after expression/purification in E. coli of protein nanoparticles whose particle, three antigenic epitopes are expressed in a multi-epitope, and the frequency of surface expression is controlled.
Figure 5 (A) is a transmission electron microscopy results of protein nanoparticles in which only one type of anti-war epitope is expressed, and (B) is a multi-epitope of three antigenic epitopes. It is the result of transmission electron microscopy of protein nanoparticles with controlled surface expression frequency, and (C) is the result of dynamic light scattering analysis.
6 is a result of SDS-PAGE analysis of the expression pattern over time of protein nanoparticles synthesized by the co-expression system in E. coli (bar graphs are (hFTN-H)-EB or ((hFTN-H)-EB or ( hFTN-H)-EC-EA- shows the change over time).
7 is a scanning electron microscope (SEM, Scanning Electron Microscope) photograph of the hydrogel.
8 is a result of diagnosis and sensitivity analysis of hepatitis C disease using protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chains (P: patients, H: strong (healthy) human control).
9 is a receiver operating characteristic (ROC) curve showing the analytical performance of diagnosis of hepatitis C disease using protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chains.
Figure 10 (A) is a hepatitis C disease patient using a mixture of synthesized single antigenic epitope peptides immobilized on a two-dimensional surface of a 96-well plate (epitope B and epitope CA are 80%: 20%). It is the result of diagnosis and sensitivity analysis, and (B) is the receiver operation characteristic curve.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by an expert skilled in the art to which the present invention belongs. In general, the nomenclature used in this specification is well known and commonly used in the art.

인간 훼리틴은 중쇄(heavy chain, 21kDa) 및 경쇄(light chain, 19kDa) 훼리틴 단량체 24개가 세포 내에서 4-3-2 symmetry 위상으로 자가조립(self-assembly)되어 만들어지는 단백질 나노입자인데, 인간 중쇄 훼리틴 단량체는 대장균 세포 내에서도 높은 발현율과 수용도로 생합성 되면서도 자가조립 특성에 의해 약 12nm 직경의 나노입자를 형성한다. 나노입자를 형성하고 있는 활성형의 인간 중쇄 훼리틴은 아미노 말단(N-term.)이 입자 외부로 표출되어 있고, 카르복실 말단(C-term.)은 외래 단백질 또는 펩타이드를 융합시킬 경우 입자 외부로 쉽게 표출될 수 있는 구조적 flexibility를 가지고 있기 때문에 검출 프로브 기능의 펩타이드 또는 단백질을 아미노- 또는 카르복실 말단에 유전자 재조합 기술을 이용하여 융합시키면 훼리틴 나노입자의 표면특성 개질을 수행할 수 있다. Human ferritin is a protein nanoparticle made by self-assembly of 24 heavy chain (21kDa) and light chain (19kDa) ferritin monomers in a 4-3-2 symmetry phase in a cell. The human heavy chain ferritin monomer is biosynthesized with high expression rate and water solubility even in E. coli cells, and forms nanoparticles with a diameter of about 12 nm due to self-assembly characteristics. Active human heavy chain ferritin forming nanoparticles has an amino terminus (N-term.) exposed to the outside of the particle, and the carboxyl terminus (C-term.) is outside the particle when foreign proteins or peptides are fused. Since it has structural flexibility that can be easily expressed by using a gene recombination technique, a peptide or protein with a detection probe function can be fused to an amino- or carboxyl terminal to modify the surface characteristics of ferritin nanoparticles.

본 발명에서는 인간 중쇄 훼리틴의 카르복실 말단에 HCV의 항원 결정부위(immunodominant epitope)를 포함하는 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드를 융합ㅇ발현시킴으로써 C형 간염 특이적 에피토프가 나노입자 표면에 융합ㅇ발현되는 단백질 나노입자의 대량생산의 용이성, 균일한 입도 분포, 에피토프 밀도/구조/방향성 제어의 용이성 및 안정성을 확인하고자 하였다.In the present invention, the hepatitis C-specific epitope is fused to the nanoparticle surface by fusion-expressing a synthetic peptide for a specific amino acid sequence including an immunoodominant epitope of HCV at the carboxyl terminal of human heavy chain ferritin. The purpose of this study was to confirm the ease of mass production of protein nanoparticles, uniform particle size distribution, ease of epitope density/structure/direction control, and stability.

본 발명에서는 4종류의 HCV 중요 항원성 에피토프인 core 부분의 c22p(K10~S53), NS3 부분의 c33c(A1192~C1457), NS4 부분의 5-1-1p(I1694~L1735)및 c100p(I1920~V1935) 부위 유래의 펩타이드/단백질의 크기 및 구조를 고려하여, 에프토프 A [c22p(K10~S53), EA], 에피토프 B[c3-3c(A1192~C1457), EB], 에피토프 C[5-1-1p(I1694~L1735)-c100p(I1920~V1935), EC] 3가지로 분류하였으며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 발현강도가 서로 다른 프로모터를 가지고, 에피토프 B가 훼리틴 단백질과 융합되어 발현되는 벡터와 에피토프 A 및 C가 훼리틴 단백질과 융합되어 발현되는 벡터를 이용한 대장균에서의 동시발현 시스템을 구축하였다(도 1, 2). 이를 이용하여 단백질 나노입자의 표면에 anti-HCV 항체가 결합하는 총 4종류의 중요 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출된 단백질 나노입자를 제조하였다. 그 결과, 상기 단백질 나노입자가 대장균에서 수용성으로 발현되는 것을 확인하였고(도 3), Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과, 수용성 상태로 존재하는 것을 확인하였다(도 4). 또한 정제된 단백질 나노입자를 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 이용하여 촬영한 결과, 구형의 단백질 나노입자가 형성됨을 확인하였고(도 5), 동적광산란법(Dynamic Light Scattering, DLS)을 이용하여 분석한 결과, 일정한 단백질 나노입자의 크기분포를 확인하였다(도 5). 또한 발현 강도가 다른 프로모터를 조합함으로서 단백질 나노입자의 표면에 에피토프 B와 에피토프A 및 C가 서로 다른 비율로 융합

Figure 112016128837369-pat00008
발현 될 수 있음을 확인하였다(도 6).In the present invention, c22p (K10-S53) of the core portion, which is an important antigenic epitope of four types of HCV, c33c (A1192 to C1457) of the NS3 portion, 5-1-1p (I1694-L1735) and c100p (I1920-) of the NS4 portion. V1935) Considering the size and structure of the peptide/protein derived from the site, epitope A [c22p(K10~S53), EA], epitope B[c3-3c(A1192~C1457), EB], epitope C[5- 1-1p(I1694~L1735)-c100p(I1920~V1935), EC] are classified into 3 types, and have promoters with different expression strengths using gene recombination technology, and epitope B is expressed by fusion with ferritin protein. A co-expression system in E. coli was constructed using a vector in which the vector and epitopes A and C are expressed by fusion with a ferritin protein (Figs. 1 and 2). Using this, protein nanoparticles were prepared in which a total of four important antigenic epitopes bound by anti-HCV antibodies to the surface of the protein nanoparticles were expressed in a multi-epitope. As a result, it was confirmed that the protein nanoparticles were expressed as water-soluble in E. coli (FIG. 3), and as a result of purification using Ni2+-NTA affinity chromatography, it was confirmed that they exist in a water-soluble state (FIG. 4). In addition, as a result of photographing the purified protein nanoparticles using a transmission electron microscope (TEM), it was confirmed that spherical protein nanoparticles were formed (FIG. 5), and dynamic light scattering (DLS) was performed. As a result of using the analysis, a constant size distribution of the protein nanoparticles was confirmed (FIG. 5). In addition, by combining promoters with different expression strengths, epitopes B and epitopes A and C are fused to the surface of protein nanoparticles at different ratios.
Figure 112016128837369-pat00008
It was confirmed that it can be expressed (Fig. 6).

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 동시발현 시스템에서 C형 간염 특이적 에피토프가 나노입자 표면에 융합ㅇ발현되는 단백질 나노입자의 대량생산의 용이성, 균일한 입도 분포, 에피토프 밀도/구조/방향성 제어의 용이성 및 안정성을 확인할 수 있었다.That is, in one embodiment of the present invention, the ease of mass production of protein nanoparticles in which hepatitis C-specific epitopes are fused to the surface of the nanoparticles in the co-expression system, uniform particle size distribution, and control of epitope density/structure/direction Ease and stability could be confirmed.

따라서 본 발명은 일 관점에서, Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1벡터;와 Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프 를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2벡터(단, 제1벡터와 제2벡터의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.Therefore, in one aspect, the present invention is a strong or weak promoter, a first vector operably linked to a gene encoding a gene of a self-assembly protein and a disease marker-specific epitope; and a strong or weak promoter, self-assembly (self-assembly) A second vector in which the gene of the protein and the gene encoding the disease marker-specific epitope are operably linked (however, the promoter of the first vector and the second vector and the gene encoding the disease marker-specific epitope are different. Ha) relates to a recombinant microorganism into which is introduced.

본 발명은 또한, Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1구역;과 Strong 또는 Weak 프로모터, 자가조립(self-assembly) 단백질의 유전자 및 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2구역(단, 제1구역과 제2구역의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자는 상이함)을 포함하는 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.The present invention also provides a strong or weak promoter, a first region to which a gene of a self-assembly protein and a gene encoding a disease marker-specific epitope are operably linked; and a strong or weak promoter, self-assembly (self-assembly) assembly) a second region to which the gene of the protein and the gene encoding the disease marker-specific epitope are operably linked (however, the promoters of the first and second regions and the gene encoding the disease marker-specific epitope are different) It relates to a recombinant microorganism into which the containing vector has been introduced.

본 발명에 있어서, 제1벡터와 제2벡터의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 상이하다는 것은, 제1벡터의 프로모터가 Strong 프로모터일 경우, 제2벡터의 프로모터는 Weak 프로모터이고, 제1벡터의 프로모터가 Weak 프로모터일 경우, 제2벡터의 프로모터는 Strong 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the fact that the promoters of the first vector and the second vector and the gene encoding the disease marker-specific epitope are different. When the promoter of the first vector is a Strong promoter, the promoter of the second vector is a Weak promoter, When the promoter of the first vector is a Weak promoter, the promoter of the second vector may be characterized in that it is a Strong promoter.

본 발명에 있어서, 제1구역과 제2구역의 프로모터와 질병마커 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 상이하다는 것은, 제1구역의 프로모터가 Strong 프로모터일 경우, 제2구역의 프로모터는 Weak 프로모터이고, 제1구역의 프로모터가 Weak 프로모터일 경우, 제2구역의 프로모터는 Strong 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the fact that the promoters of the first region and the second region and the gene encoding the disease marker-specific epitope are different. When the promoter of the first region is a Strong promoter, the promoter of the second region is a Weak promoter, When the promoter of the first region is a Weak promoter, the promoter of the second region may be characterized as a Strong promoter.

본 발명에 있어서, 상기 Strong 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, PL(λ) 프로모터, PR(λ) 프로모터, lac(TS) 프로모터 및 PSPA 프로모터, recA 프로모터, lacUV5 프로모터, TRE 프로모터, argC 프로모터, ermE 프로모터, SF14 프로모터, tcp830 프로모터, tipA 프로모터, amyP 프로모터, pilA 프로모터, Ras2 프로모터, Tor1 프로모터, Sch9 프로모터, HXT7 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the Strong promoter is trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, P L (λ) promoter, P R (λ) promoter, lac (TS) promoter and P SPA Promoter, recA promoter, lacUV5 promoter, TRE promoter, argC promoter, ermE promoter, SF14 promoter, tcp830 promoter, tipA promoter, amyP promoter, pilA promoter, Ras2 promoter, Tor1 promoter, Sch9 promoter, HXT7 promoter It can be characterized.

본 발명에 있어서, 상기 Weak 프로모터는 시그마 32(sigma 32)가 인지하는 스트레스 반응성 프로모터이면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 ibpfxs 프로모터, groES 프로모터, groEL 프로모터, clpB 프로모터, dnaK 프로모터 및 dnaJ 프로모터, tetR 프로모터, PSE 프로모터, pPRM2 프로모터, araBAD 프로모터, liaG 프로모터, ade6 프로모터, rtTA 프로모터, AtZFP1 프로모터, vWF 프로모터, PRM(λ) 프로모터, SI 프로모터, IS10 프로모터, ftsA 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the Weak promoter may be used without limitation as long as it is a stress-responsive promoter recognized by sigma 32, preferably ibpfxs promoter, groES promoter, groEL promoter, clpB promoter, dnaK promoter and dnaJ Selected from the group consisting of promoter, tetR promoter, PSE promoter, pPRM2 promoter, araBAD promoter, liaG promoter, ade6 promoter, rtTA promoter, AtZFP1 promoter, vWF promoter, P RM (λ) promoter, SI promoter, IS10 promoter, ftsA promoter It can be characterized by that.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 속(Bacillus sp .), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp .), 에스케리치아 속(Escherichia sp .), 피치아 속(Pichia sp .), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp .)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the microorganism is Escherichia coli ), Bacillus sp . , Corynebacterium sp . ), Escherichia sp . ), Pichia sp . ), Pseudomonas sp . ) And Saccharomyces sp . ) It may be characterized in that it is selected from the group consisting of.

본 발명에 있어서, 상기 자가조립(self-assembly) 단백질은 세포 내에서 자가조립(self-assembly) 할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용가능하나, 바람직하게는 인간 훼리틴 중쇄 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the self-assembly protein can be used without limitation as long as it is a protein capable of self-assembly in cells, but it may be characterized in that it is preferably a human ferritin heavy chain protein. have.

본 발명에 있어서, 상기 벡터는 자가조립(self-assembly) 단백질과 질병마커 특이적 에피토프 사이에 링커 서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 한다.In the present invention, the vector is characterized in that a linker sequence is additionally operably linked between a self-assembly protein and a disease marker-specific epitope.

본 발명에 있어서, 상기 링커 서열은 에피토프에 유연성을 부여하여 단백질 나노입자 표면 표출성을 높이기 위한 서열이면 제한이 없으나, 바람직하게는 G3SG3TG3SG3인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the linker sequence is not limited as long as it is a sequence for enhancing protein nanoparticle surface expression by imparting flexibility to the epitope, but is preferably G 3 SG 3 TG 3 SG 3 .

본 발명에 있어서, 상기 질병마커 특이적 에피토프는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the disease marker-specific epitope is characterized in that the hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope.

본 발명에 있어서, 상기 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프는 c22p, c33c, 5-1-1p, c100p, 및 이들이 2이상 융합된 에피토프로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope is characterized in that it is selected from the group consisting of c22p, c33c, 5-1-1p, c100p, and epitopes in which two or more of them are fused.

본 발명에 있어서, 상기 2이상 융합된 에피토프는 c22p-c33c, c22p-5-1-1p, c22p-c100p, c33c-5-5-1p, c33c-c100p, 5-1-1p-c100p 및 c22p-5-1-1p-c100p 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the two or more fused epitopes are c22p-c33c, c22p-5-1-1p, c22p-c100p, c33c-5-5-1p, c33c-c100p, 5-1-1p-c100p and c22p- It is characterized in that it is selected from the group consisting of 5-1-1p-c100p.

본 발명은 또한, 자가조립(self-assembly) 단백질의 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 서로 상이한 비율로 융합

Figure 112016128837369-pat00009
발현되어 있는 단백질 나노입자에 대한 것이다.In the present invention, two or more disease marker-specific epitopes are fused to each other at different ratios on the surface of a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00009
It is for the expressed protein nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 자가조립(self-assembly) 단백질은 세포 내에서 자가조립(self-assembly) 할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용가능하나, 바람직하게는 인간 훼리틴 중쇄 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the self-assembly protein can be used without limitation as long as it is a protein capable of self-assembly in cells, but it may be characterized in that it is preferably a human ferritin heavy chain protein. have.

본 발명에 있어서, 상기 기능성 단백질 나노입자는 직경이 1-20nm인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the functional protein nanoparticles are characterized in that the diameter is 1-20nm.

본 발명에 있어서, 상기 질병마커 특이적 에피토프는 c22p, c33c, 5-1-1p, c100p, 및 이들이 2이상 융합된 에피토프로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the disease marker-specific epitope is characterized in that it is selected from the group consisting of c22p, c33c, 5-1-1p, c100p, and epitopes in which two or more thereof are fused.

본 발명에 있어서, 상기 2이상 융합된 에피토프는 c22p-c33c, c22p-5-1-1p, c22p-c100p, c33c-5-5-1p, c33c-c100p, 5-1-1p-c100p 및 c22p-5-1-1p-c100p 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the two or more fused epitopes are c22p-c33c, c22p-5-1-1p, c22p-c100p, c33c-5-5-1p, c33c-c100p, 5-1-1p-c100p and c22p- It is characterized in that it is selected from the group consisting of 5-1-1p-c100p.

본 발명에 있어서, 상기 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프는 상기 당백질 나노입자의 표면에 2:8~8:2의 비율로 융합

Figure 112016128837369-pat00010
발현되어 있는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the two or more disease marker-specific epitopes are fused to the surface of the glycoprotein nanoparticles in a ratio of 2:8 to 8:2.
Figure 112016128837369-pat00010
It is characterized by being expressed.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 자가조립(self-assembly) 단백질 나노입자의 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 표현되어 있는 단백질 나노입자를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 단백질 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 자가조립(self-assembly) 단백질 표면에 융합

Figure 112016128837369-pat00011
발현되어 있는 단백질 나노입자의 제조방법에 대한 것이다. 상기 생산 방법은 미생물을 이용함으로 비용 면에서 효율적이며, 단백질 나노입자의 대량생산이 가능하게 한다. The present invention also includes the steps of culturing the recombinant microorganism to generate protein nanoparticles in which two or more disease marker-specific epitopes are expressed on the surface of self-assembly protein nanoparticles; And two or more disease marker-specific epitopes comprising the step of recovering the generated protein nanoparticles are fused to the surface of a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00011
The present invention relates to a method for preparing expressed protein nanoparticles. The production method is cost-effective by using microorganisms, and enables mass production of protein nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 자가조립(self-assembly) 단백질은 세포 내에서 자가조립(self-assembly) 할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용가능하나, 바람직하게는 인간 훼리틴 중쇄 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the self-assembly protein can be used without limitation as long as it is a protein capable of self-assembly in cells, but it may be characterized in that it is preferably a human ferritin heavy chain protein. have.

본 발명에 있어서, 상기 질병마커 특이적 에피토프는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the disease marker-specific epitope is characterized in that the hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope.

본 발명에 있어서, 상기 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프는 C형 간염바이러스의 c22p, c33c, 5-1-1p, c100p 및 이들이 2이상 융합된 에피토프로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope is selected from the group consisting of c22p, c33c, 5-1-1p, c100p of hepatitis C virus, and epitopes in which two or more fused epitopes thereof are fused. do.

본 발명에 있어서, 상기 2이상 융합된 에피토프는 c22p-c33c, c22p-5-1-1p, c22p-c100p, c33c-5-5-1p, c33c-c100p, 5-1-1p-c100p 및 c22p-5-1-1p-c100p 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the two or more fused epitopes are c22p-c33c, c22p-5-1-1p, c22p-c100p, c33c-5-5-1p, c33c-c100p, 5-1-1p-c100p and c22p- It is characterized in that it is selected from the group consisting of 5-1-1p-c100p.

한편, 본 발명에서 제작한 단백질 나노입자를 하이드로젤에 고정할 경우, 온전한 3차원형태를 유지하고, 표면에 다양한 질병마커 특이적 에피토프가 발현되어 있으므로, 질병마커 검출의 고민감도 및 고특이도를 구현할 수 있을 것으로 예측하였다. On the other hand, when the protein nanoparticles produced in the present invention are fixed to a hydrogel, it maintains an intact three-dimensional shape and various disease marker-specific epitopes are expressed on the surface, so that high sensitivity and high specificity of disease marker detection are achieved. It was predicted that it could be implemented.

즉, 본 발명의 다른 실시예에서는 다공성 3차원 구조체로, 내부에 수분이 많아 물질이 쉽게 퍼지고, 고정된 나노입자의 검지활성을 장기간 안정적으로 유지할 수 있으며(상온에서 10일간 활성을 100% 유지), 2차원 평면소재에 비해 표면적이 크게 확장되어 많은 양의 나노입자를 고정시킬 수 있는 것으로 확인된(도 7), 하이드로젤에 상기 단백질 나노입자를 융합하여, C형 간염 질환 환자와 대조군으로서 건강한 사람을 대상으로 C형 간염 마커의 검출을 실시하여, 상기 단백질 나노입자를 이용한 C형 간염 마커의 검출 민감도가 획기적으로 증가하는 것을 확인하였으며(도 8), 이것을 수신자 동작 특성 곡선 분석(Receiver Operating Characteristic, ROC curve)을 통하여 명확하게 확인하였다(도 9). 또한, 하이드로젤이 아닌 96-well plate의 2차원 표면에 상기 단백질 나노입자를 고정화하여 C형 간염 마커의 검출을 실시한 결과, 그 민감도가 상기의 방법의 63% 밖에 되지 않는 것을 확인하였다(도 10).That is, in another embodiment of the present invention, it is a porous three-dimensional structure, which has a large amount of moisture inside, so that the material easily spreads, and the detection activity of the fixed nanoparticles can be stably maintained for a long period of time (100% of the activity is maintained at room temperature for 10 days). , Compared to the two-dimensional planar material, it has been confirmed that the surface area can be significantly expanded to fix a large amount of nanoparticles (Fig. 7), and by fusion of the protein nanoparticles to a hydrogel, a healthy hepatitis C disease patient and a control group By detecting the hepatitis C marker in humans, it was confirmed that the detection sensitivity of the hepatitis C marker using the protein nanoparticles was significantly increased (FIG. 8), which was analyzed by receiver operating characteristic curve (Receiver Operating Characteristic). , ROC curve) was clearly confirmed through (Fig. 9). In addition, as a result of detecting the hepatitis C marker by immobilizing the protein nanoparticles on the two-dimensional surface of a 96-well plate rather than a hydrogel, it was confirmed that the sensitivity was only 63% of the above method (FIG. 10 ).

따라서 본 발명은 다른 관점에서, 자가조립(self-assembly) 단백질의 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 서로 상이한 비율로 융합

Figure 112016128837369-pat00012
발현되어 있는 단백질 나노입자를 포함하는 하이드로젤에 대한 것이다.Therefore, in another aspect, the present invention is a fusion of two or more disease marker-specific epitopes on the surface of a self-assembly protein at different ratios.
Figure 112016128837369-pat00012
It relates to a hydrogel containing expressed protein nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 자가조립(self-assembly) 단백질은 세포 내에서 자가조립(self-assembly) 할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용가능하나, 바람직하게는 인간 훼리틴 중쇄 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the self-assembly protein can be used without limitation as long as it is a protein capable of self-assembly in cells, but it may be characterized in that it is preferably a human ferritin heavy chain protein. have.

본 발명은 또한, (a) 인자가조립(self-assembly) 단백질의 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 서로 상이한 비율로 융합

Figure 112016128837369-pat00013
발현되어 있는 단백질 나노입자를 포함하는 하이드로젤과 검출 대상 시료를 반응시킨 다음, 이차항체를 처리하는 단계 및; (b) 형광을 측정하는 단계를 포함하는 표면에 둘 이상의 질병마커 특이적 에피토프가 융합
Figure 112016128837369-pat00014
발현되어 있는 단백질 나노입자를 이용한 질병마커 검출방법에 관한 것이다. In the present invention, (a) two or more disease marker-specific epitopes are fused to each other at different ratios on the surface of a self-assembly protein.
Figure 112016128837369-pat00013
Reacting a hydrogel containing the expressed protein nanoparticles with a sample to be detected, and then treating a secondary antibody; (b) fusion of two or more disease marker-specific epitopes to the surface comprising the step of measuring fluorescence
Figure 112016128837369-pat00014
It relates to a method for detecting disease markers using expressed protein nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 자가조립(self-assembly) 단백질은 세포 내에서 자가조립(self-assembly) 할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용가능하나, 바람직하게는 인간 훼리틴 중쇄 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the self-assembly protein can be used without limitation as long as it is a protein capable of self-assembly in cells, but it may be characterized in that it is preferably a human ferritin heavy chain protein. have.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)의 질병마커 특이적 에피토프는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the disease marker-specific epitope in step (a) is a hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope.

본 발명에 있어서, 상기 이차항체는 퀀텀 닷과 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the secondary antibody is characterized in that it is connected to the quantum dot.

*위와 같이 본 발명에서는 인간 훼리틴 중쇄를 기초한 하나의 단백질 나노입자 표면에 C형 간염 바이러스 항체 측정에 유용한 민감도 높은 여러 중요 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 동시에 표출된 단백질 나노입자를 제조하였고 단순히 여러 종류의 항원성 에피토프를 동시에 표출시키는 것으로 끝나는 것이 아니라, 전사 유도 세기가 다른 두 종류의 프로모터가 삽입된 각각의 발현벡터를 이용한 동시발현 시스템을 구축하여 항원성의 중요도에 따라서 표면 표출 빈도 또한 효과적으로 조절할 수 있는 시스템을 구축하였다. 본 발명에서 개발한 동시 다중 질환 표지 인자 검출이 가능한 고기능성 단백질 나노입자를 미생물 내에서 효과적으로 합성하였으며 이를 이용하여 C형 간염 마커의 검출에 활용하여 초고감도 C형 간염 마커의 검출방법을 개발하였다.* As described above, in the present invention, protein nanoparticles in which several important antigenic epitopes with high sensitivity useful for measuring hepatitis C virus antibodies are simultaneously expressed on the surface of one protein nanoparticle based on a human ferritin heavy chain in a multi-epitope are prepared. It does not end with simply expressing several types of antigenic epitopes at the same time, but constructing a co-expression system using each expression vector inserted with two types of promoters with different levels of transcription induction, and depending on the importance of antigenicity, the frequency of surface expression is also increased. We have built a system that can be effectively controlled. The highly functional protein nanoparticles capable of simultaneous detection of multiple disease markers developed in the present invention were effectively synthesized in microorganisms and used to detect hepatitis C markers to develop an ultra-sensitive hepatitis C marker detection method.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예Example 1. One. 시그마 32 의존성 프로모터 Sigma 32 dependent promoter ibpfxsibpfxs 가end 삽입된 발현벡터 제작 Construction of the inserted expression vector

기존 문헌을 참고하여 시그마 32 의존성 프로모터 ' ibpfxs 프로모터'의 염기서열(5'-TTCGAAGACCATAAACTGCAAAAAAAAGTCCGCTGATAAGGCTTGAAAAGTTCATTTCCAGACCCATTTTTACATCGTAGCCGATGAGGACGCGCCTGATGGGTGTTCTGGCTACCTGACCTGTCCATTGTGGAAGGTCTTACATTCTCGCTGATTTGTCGACAAATTCTGGGGATTACTACCAAAAATAGTTGCGCAAACATCTTGAAATTTTGCTAATGACCACAATATAAGCTAAACGCGATTCGCAACCCATTCAGGTAGCCGGGGTTAACCGGCTGCTATTAATAAAGGAGATATACATATG-3': 서열번호 1)을 pUC57((주)COSMO Genetech, Korea)을 도입하여 pUC57-시그마32 벡터를 제작하였다. pUC57-시그마 32 벡터에서 ibpfxs 유전자의 5' 부위에 BstBI 제한효소 인식서열을, 3' 부위에 NdeI 제한효소 인식서열 포함하도록 하였다. pT7-7(Novagen, USA) 발현벡터의 T7 프로모터 앞쪽부위(upstream)에 BstBI 제한효소 부위와 라이보솜 결합 부위 뒤쪽부위(downstream)의 NdeI 제한효소 부위를 절단한 후에 pUC57-시그마 32 벡터에 동일한 제한효소를 처리하여 ibpfxs 부위를 절단하고, 절단된 BstBI-ibpfxs-NdeI를 pT7-7 발현벡터의 BstBI/NdeI 자리에 삽입하여 p32벡터를 제작하였다. Nucleotide sequence (5'-TTCGAAGACCATAAACTGCAAAAAAAAGTCCGCTGATAAGG CTTGAAA AGTTCATTTCCAGA CCCATTT TTACATCGTAGCCGATGAGGACGCGCCTGATGGGTGTTCTGGCTACCTGACCTGTCCATTGTGGAAGGTCTTACATTCTCGCTGATTTGTCGACAAATTCTGGGGATTACTACCAAAAATAGTTGCGCAAACATC TTGAAA TTTTGCTAATGACCACAA TATAAG CTAAACGCGATTCGCAACCCATTCAGGTAGCCGGGGTTAACCGGCTGCTATTAATA AAGGAGA TATACATATG-3 ': SEQ ID NO: 1) of the sigma-32-dependent promoter "ibpfxs promoter" refer to the literature for pUC57 ((Note) COSMO Genetech, Korea) Was introduced to construct a pUC57-Sigma 32 vector. In the pUC57-Sigma 32 vector, a BstBI restriction enzyme recognition sequence was included in the 5'site of the ibpfxs gene and an NdeI restriction enzyme recognition sequence was included in the 3'site. The same restriction on the pUC57-Sigma 32 vector after cutting the BstBI restriction enzyme site and the NdeI restriction enzyme site downstream of the ribosome binding site at the T7 promoter upstream of the pT7-7 (Novagen, USA) expression vector. The enzyme was treated to cut the ibpfxs site, and the cut BstBI- ibpfxs- NdeI was inserted into the BstBI/NdeI site of the pT7-7 expression vector to construct a p32 vector.

실시예Example 2. 항원성 2. Antigenicity 에피토프가Epitope 표출된 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현벡터 제작 Construction of expression vector for biosynthesis of expressed protein nanoparticles

하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용한 PCR 또는 assembly PCR 후에, After PCR or assembly PCR using the primers shown in Table 1 below,

N-NdeI-(hFTN-H)-G3SG3TG3SG3(linker)-XhoI-C, N-NdeI-(hFTN-H)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 (linker)-XhoI-C,

N-XhoI-(K10-S53)2-H6-HindIII-C, N-XhoI-(K10-S53) 2 -H 6 -HindIII-C,

N-XhoI-(A1192-C1457)-H6-HindIII-C, N-XhoI-(A1192-C1457)-H 6 -HindIII-C,

N-XhoI-[(I1694-L1735)-G3SG3TG3SG3-(I1920-V1935)]2-H6-HindIII-CN-XhoI-[(I1694-L1735)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 -(I1920-V1935)] 2 -H 6 -HindIII-C

N-XhoI-(I1694-L1735)-G3SG3TG3SG3-(I1920-V1935)-(K10-S53)-HindIII-C N-XhoI-(I1694-L1735)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 -(I1920-V1935)-(K10-S53)-HindIII-C

의 합성을 코드하는 5개의 유전자 클론을 얻었다. 플라즈미드 pT7-7, pET28a(+), p32에 상기 유전자 클론의 일련의 라이게이션을 통하여, A) N-(hFTN-H)-linker-(EA)2-H6-C, B) N-(hFTN-H)-linker-EB-H6-C, C) N-(hFTN-H)-linker-(EC)2-H6-C, 및 D) N-(hFTN-H)-linker-EC-EA-C 의 합성을 코딩하는 7개의 플라즈미드 발현벡터 pT7-FTN-EA, pT7-FTN-EB, pT7-FTN-EC, pET-FTN-EB, pET-FTN-ECA, p32-FTN-EB, p32-FTN-ECA를 구축하였다 (도 2). 제작된 모든 플라즈미드 발현벡터는 젤- 정제 후 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다. Five gene clones encoding the synthesis of were obtained. Through a series of ligation of the gene clones to plasmids pT7-7, pET28a(+), p32, A) N-(hFTN-H)-linker-(EA) 2 -H 6 -C, B) N-( hFTN-H)-linker-EB-H 6 -C, C) N-(hFTN-H)-linker-(EC) 2 -H 6 -C, and D) N-(hFTN-H)-linker-EC -7 plasmid expression vectors pT7-FTN-EA, pT7-FTN-EB, pT7-FTN-EC, pET-FTN-EB, pET-FTN-ECA, p32-FTN-EB, encoding the synthesis of -EA-C p32-FTN-ECA was constructed (Fig. 2). All the prepared plasmid expression vectors were gel-purified and then sequenced through complete DNA sequencing.

인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자 합성을 위한 발현벡터 제조와 이와 관련된 프라이머 서열 및 주형에 대한 정보 및 이에 대한 좀 더 상세한 기재는 아래와 같다.Preparation of an expression vector for synthesis of protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chains, information on primer sequences and templates related thereto, and a more detailed description thereof are as follows.

1) 인간 훼리틴 중쇄 유전자 서열 (NCBI Nucleotide accession number: M97164 서열 중 130-681 서열)을 주형으로 하여 제한효소 NdeI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 1과 XhoI과 링커서열 (아미노산 서열 G3SG3TG3SG3)을 포함하고 있는 프라이머 서열 2, 3을 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-NdeI-(hFTN-H)-G3SG3TG3SG3(linker)-XhoI-3' 으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 처리하여 pT7-7(Novagen, USA), pET28a(+)(Novagen, USA), p32의 제한효소 NdeI과 XhoI자리에 삽입하여 pT7-FTN-H, pET-FTN-H 및 p32-FTN-H를 각각 제작하였다.1) Human ferritin heavy chain gene sequence (NCBI Nucleotide accession number: 130-681 of the M97164 sequence) as a template, and primer sequence portion 1 containing the restriction enzyme NdeI, XhoI, and a linker sequence (amino acid sequence G3SG3TG3SG3), and PCR was carried out using the existing primer sequences 2 and 3. As a result, a PCR product consisting of 5'-NdeI-(hFTN-H)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 (linker)-XhoI-3' was obtained. The amplified PCR product was treated with restriction enzymes NdeI and XhoI and inserted into pT7-7(Novagen, USA), pET28a(+)(Novagen, USA), restriction enzymes NdeI and XhoI of p32, and inserted into pT7-FTN-H, pET -FTN-H and p32-FTN-H were prepared, respectively.

2) 4종류의 프라이머(프라이머 서열 4~7)를 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/1분30초(변성), 54℃/2분(어닐링), 72℃/3분(신장)로 총 8회 assembly PCR을 수행 하였다. 상기 PCR 증폭 산물을 주형으로 하여 프라이머쌍(프라이머 서열 8, 9)을 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 25회 PCR을 수행하여 최종 표2의 5'-(K10-S53)2-3'로 이루어진 PCR 산물을 얻었다. 2) Buffer solution for DNA polymerase reaction (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20 mM Tris-HCl) containing 50 pmol each of 4 types of primers (primer sequences 4 to 7) (pH8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100) using Taq DNA polymerase at 94°C/1 minute 30 seconds (denaturation), 54°C/2 minutes (annealing), 72°C/3 Assembly PCR was performed 8 times in minutes (height). Using the PCR amplification product as a template, a buffer solution for DNA polymerase reaction (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20) each containing 50 pmol of each primer pair (primer sequences 8 and 9). Using Taq DNA polymerase in mM Tris-HCl (pH8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100) at 94°C/30 seconds (denaturation), 52°C/30 seconds (annealing), 72°C A total of 25 PCR was performed at /30 seconds (height) to obtain a PCR product consisting of 5'-(K10-S53) 2 -3' in Table 2.

① 상기 최종 PCR 산물을 주형으로 하여 제한효소 XhoI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 10과 EcoRI을 포함하고 있는 프라이머 서열 11를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-XhoI-K10-S53-EcoRI-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.① Using the final PCR product as a template, PCR was performed using primer sequence portion 10 containing restriction enzyme XhoI and primer sequence 11 containing EcoRI. As a result, a PCR product consisting of 5'-XhoI-K10-S53-EcoRI-3' was obtained.

② 상기 최종 PCR 산물을 주형으로 하여 제한효소 EcoRI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 12과 HindIII 와 hexahistidine을 포함하고 있는 프라이머 서열 13를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-EcoRI-K10-S53-H6-HindIII-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.② Using the final PCR product as a template, PCR was performed using primer sequence part 12 containing the restriction enzyme EcoRI and primer sequence 13 containing HindIII and hexahistidine. As a result, a PCR product consisting of 5'-EcoRI-K10-S53-H6-HindIII-3' was obtained.

③ 상기 최종 PCR 산물을 주형으로 하여 제한효소 EcoRI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 14과 HindIII 을 포함하고 있는 프라이머 서열 15를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-EcoRI-K10-S53-HindIII-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.(3) Using the final PCR product as a template, PCR was carried out using primer sequence portion 14 containing the restriction enzyme EcoRI and primer sequence 15 containing HindIII. As a result, a PCR product consisting of 5'-EcoRI-K10-S53-HindIII-3' was obtained.

증폭된 ①의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 EcoRI으로 처리하여 상기 제조한 pT7-FTN-H 의 제한효소 XhoI과 EcoRI자리에 삽입하였다. 증폭된 ②의 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 HindIII으로 처리하여 상기 제작된 벡터의 제한효소 EcoRI과 HindIII자리에 삽입하여 pT7-FTN-EA를 제작하였다.The amplified PCR product of ① was treated with restriction enzymes XhoI and EcoRI, and inserted into the restriction enzymes XhoI and EcoRI sites of pT7-FTN-H prepared above. The amplified PCR product of ② was treated with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and inserted into the restriction enzymes EcoRI and HindIII sites of the prepared vector to prepare pT7-FTN-EA.

3) 16종류의 프라이머(프라이머 서열 16~31)를 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/1분30초(변성), 54℃/2분(어닐링), 72℃/3분(신장)로 총 8회 assembly PCR을 수행 하였다. 상기 PCR 증폭 산물을 주형으로 하여 프라이머쌍(프라이머 서열 32, 33)을 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 25회 PCR을 수행하여 최종 표2의 5'-(A1192-C1457)-3'로 이루어진 PCR 산물을 얻었다. 3) A buffer solution for DNA polymerase reaction containing 50 pmol each of 16 types of primers (primer sequences 16 to 31) (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20 mM Tris-HCl) (pH8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100) using Taq DNA polymerase at 94°C/1 minute 30 seconds (denaturation), 54°C/2 minutes (annealing), 72°C/3 Assembly PCR was performed 8 times in minutes (height). Using the PCR amplification product as a template, a buffer solution for DNA polymerase reaction (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20) each containing 50 pmol of each primer pair (primer sequences 32 and 33). Using Taq DNA polymerase in mM Tris-HCl (pH8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100) at 94°C/30 seconds (denaturation), 52°C/30 seconds (annealing), 72°C A total of 25 PCR was performed at /30 seconds (height) to obtain a PCR product consisting of 5'-(A1192-C1457)-3' in Table 2.

상기 최종 PCR 산물을 주형으로 하여 제한효소 XhoI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 34과 HindIII 와 hexahistidine을 포함하고 있는 프라이머 서열 35를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-XhoI-(A1192-C1457)-H6-HindIII-3' 으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.Using the final PCR product as a template, PCR was performed using primer sequence portion 34 containing the restriction enzyme XhoI and primer sequence 35 containing HindIII and hexahistidine. As a result, a PCR product consisting of 5'-XhoI-(A1192-C1457)-H 6 -HindIII-3' was obtained.

증폭된 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 HindIII으로 처리하여 상기 제작된 pT7-FTN-H, pET-FTN-H 및 p32-FTN-H의 제한효소 XhoI과 HindIII자리에 삽입하여, pT7-FTN-EB, pET-FTN-EB 및 p32-FTN-EB를 각각 제작하였다.The amplified PCR product was treated with restriction enzymes XhoI and HindIII, and inserted into the restriction enzymes XhoI and HindIII sites of pT7-FTN-H, pET-FTN-H and p32-FTN-H prepared above, pT7-FTN-EB, pET-FTN-EB and p32-FTN-EB were prepared, respectively.

4) 6종류의 프라이머(프라이머 서열 36~41)를 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/1분30초(변성), 54℃/2분(어닐링), 72℃/3분(신장)로 총 8회 assembly PCR을 수행하였다. 상기 PCR 증폭 산물을 주형으로 하여 프라이머쌍(프라이머 서열 42, 43)을 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 25회 PCR을 수행하여 최종 5'-(I1694-L1735)-G3SG3TG3SG3-(I1920-V1935)-3'로 이루어진 PCR 산물을 얻었다. 4) Buffer solution for DNA polymerase reaction containing 50 pmol each of 6 types of primers (primer sequences 36 to 41) (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20 mM Tris-HCl) (pH8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100) using Taq DNA polymerase at 94°C/1 minute 30 seconds (denaturation), 54°C/2 minutes (annealing), 72°C/3 Assembly PCR was performed 8 times in minutes (kidney). Using the PCR amplification product as a template, a buffer solution for DNA polymerase reaction (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20) each containing 50 pmol of each primer pair (primer sequences 42 and 43). Using Taq DNA polymerase in mM Tris-HCl (pH8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100) at 94°C/30 seconds (denaturation), 52°C/30 seconds (annealing), 72°C A total of 25 PCR was performed at /30 sec (height) to obtain a PCR product consisting of 5'-(I1694-L1735)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 -(I1920-V1935)-3'.

① 상기 최종 PCR 산물을 주형으로 하여 제한효소 XhoI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 44과 EcoRI을 포함하고 있는 프라이머 서열 45를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-XhoI-(I1694-L1735)-G3SG3TG3SG3-(I1920-V1935)-EcoRI-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.① Using the final PCR product as a template, PCR was performed using the primer sequence 44 containing the restriction enzyme XhoI and the primer sequence 45 containing the EcoRI. As a result, a PCR product consisting of 5'-XhoI-(I1694-L1735)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 -(I1920-V1935)-EcoRI-3' was obtained.

② 상기 최종 PCR 산물을 주형으로 하여 제한효소 EcoRI이 포함되어 있는 프라이머 서열부분 46과 HindIII 와 hexahistidine을 포함하고 있는 프라이머 서열 47를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5'-EcoRI-(I1694-L1735)-G3SG3TG3SG3-(I1920-V1935)-H6-HindIII-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.② Using the final PCR product as a template, PCR was performed using primer sequence part 46 containing the restriction enzyme EcoRI and primer sequence 47 containing HindIII and hexahistidine. As a result, a PCR product consisting of 5'-EcoRI-(I1694-L1735)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3 -(I1920-V1935)-H6-HindIII-3' was obtained.

증폭된 ①의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 EcoRI으로 처리하여 상기 제조한 pT7-FTN-H 의 제한효소 XhoI과 EcoRI자리에 삽입하였다. 증폭된 ②의 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 HindIII으로 처리하여 상기 제작된 벡터의 제한효소 EcoRI과 HindIII자리에 삽입하여 pT7-FTN-EC를 제작하였다.The amplified PCR product of ① was treated with restriction enzymes XhoI and EcoRI, and inserted into the restriction enzymes XhoI and EcoRI sites of pT7-FTN-H prepared above. The amplified PCR product of ② was treated with restriction enzymes EcoRI and HindIII and inserted into the restriction enzymes EcoRI and HindIII sites of the prepared vector to prepare pT7-FTN-EC.

5) 상기 2)-③에서 제작한 5'-EcoRI-K10-S53-HindIII-3'으로 이루어진 PCR 증폭 산물을 EcoRI/HindIII 제한효소로 처리한 후 상기 제작한 발현벡터 pT7-FTN-EC의 제한효소 EcoRI/HindIII 자리에 삽입하여 pT7-FTN-ECA를 구축하고 이 발현벡터를 제한효소 XhoI/HindIII를 처리하여 절단된 5'-XhoI-(I1694-L1735)-G3SG3TG3SG3-(I1920-V1935)-(K10-S53)-HindIII-3'를 상기 제작된 pET-FTN-H 및 p32-FTN-H의 XhoI과 HindIII 자리에 삽입하여, pET-FTN-ECA 및 p32-FTN-ECA를 각각 제작하였다.5) Restriction of the prepared expression vector pT7-FTN-EC after treating the PCR amplification product consisting of 5'-EcoRI-K10-S53-HindIII-3' prepared in 2)-③ above with EcoRI/HindIII restriction enzyme Inserted into the enzyme EcoRI/HindIII site to construct pT7-FTN-ECA, and the expression vector was digested with restriction enzyme XhoI/HindIII, digested 5'-XhoI-(I1694-L1735)-G 3 SG 3 TG 3 SG 3- (I1920-V1935)-(K10-S53)-HindIII-3' was inserted into the XhoI and HindIII sites of pET-FTN-H and p32-FTN-H prepared above, and pET-FTN-ECA and p32-FTN- Each ECA was produced.

프라이머 서열Primer sequence 서열번호Sequence number 서열order 서열번호 1SEQ ID NO: 1 TTCGAAGACCATAAACTGCAAAAAAAAGTCCGCTGATAAGGCTTGAAAAGTTCATTTCCAGACCCATTTTTACATCGTAGCCGATGAGGACGCGCCTGATGGGTGTTCTGGCTACCTGACCTGTCCATTGTGGAAGGTCTTACATTCTCGCTGATTTGTCGACAAATTCTGGGGATTACTACCAAAAATAGTTGCGCAAACATCTTGAAATTTTGCTAATGACCACAATATAAGCTAAACGCGATTCGCAACCCATTCAGGTAGCCGGGGTTAACCGGCTGCTATTAATAAAGGAGATATACATATG TTCGAAGACCATAAACTGCAAAAAAAAGTCCGCTGATAAGG CTTGAAA AGTTCATTTCCAGA CCCATTT TTACATCGTAGCCGATGAGGACGCGCCTGATGGGTGTTCTGGCTACCTGACCTGTCCATTGTGGAAGGTCTTACATTCTCGCTGATTTGTCGACAAATTCTGGGGATTACTACCAAAAATAGTTGCGCAAACATC TTGAAA TTTTGCTAATGACCACAA TATAAG CTAAACGCGATTCGCAACCCATTCAGGTAGCCGGGGTTAACCGGCTGCTATTAATA AAGGAGA TATACATATG 서열번호 2SEQ ID NO: 2 cat atg acg acc gcg tcc acc tcgcat atg acg acc gcg tcc acc tcg 서열번호 3SEQ ID NO: 3 ctc gag agt gcc tcc ccc act tcc gcc acc gct ttc att atc ctc gag agt gcc tcc ccc act tcc gcc acc gct ttc att atc 서열번호 4SEQ ID NO: 4 ctc gag ccc acc gcc gct gcc acc tcc agt gcc tcc ccc act ctc gag ccc acc gcc gct gcc acc tcc agt gcc tcc ccc act 서열번호 5SEQ ID NO: 5 aaa aac aaa cgt aac acc aac cgc cgc cca cag gat att aag ttaaa aac aaa cgt aac acc aac cgc cgc cca cag gat att aag tt 서열번호 6SEQ ID NO: 6 taa act cca cca acg atc tga cca ccg ccc ggg aac tta ata tcc tgt ggg cgg c taa act cca cca acg atc tga cca ccg ccc ggg aac tta ata tcc tgt ggg cgg c 서열번호 7SEQ ID NO: 7 gtc aga tcg ttg gtg gag ttt act tgt tgc cgc gca ggg gcc cca ggt tgg gtc aga tcg ttg gtg gag ttt act tgt tgc cgc gca ggg gcc cca ggt tgg 서열번호 8SEQ ID NO: 8 gga agt ctt cct agt cgc gcg cac acc caa cct ggg gcc c gga agt ctt cct agt cgc gcg cac acc caa cct ggg gcc c 서열번호 9SEQ ID NO: 9 aaa aac aaa cgt aac acc aac cg aaa aac aaa cgt aac acc aac cg 서열번호 10SEQ ID NO: 10 gga agt ctt cct agt cgc g gga agt ctt cct agt cgc g 서열번호 11SEQ ID NO: 11 ctc gag aaa aac aaa cgt aacctc gag aaa aac aaa cgt aac 서열번호 12SEQ ID NO: 12 gaa ttc gga agt ctt cct agtgaa ttc gga agt ctt cct agt 서열번호 13SEQ ID NO: 13 gaa ttc aaa aac aaa cgt aacgaa ttc aaa aac aaa cgt aac 서열번호 14SEQ ID NO: 14 aag ctt tta gtg atg gtg atg gtg atg gga agt ctt cct agt cgc gcgaag ctt tta gtg atg gtg atg gtg atg gga agt ctt cct agt cgc gcg 서열번호 15SEQ ID NO: 15 gaa ttc aaa aac aaa cgt aacgaa ttc aaa aac aaa cgt aac 서열번호 16SEQ ID NO: 16 aag ctt tta gga agt ctt cct agtaag ctt tta gga agt ctt cct agt 서열번호 17SEQ ID NO: 17 gcg gtg gac ttt atc cct gtg gag aac cta gag aca acc atg agg tcc ccg gtg ttc a gcg gtg gac ttt atc cct gtg gag aac cta gag aca acc atg agg tcc ccg gtg ttc a 서열번호 18SEQ ID NO: 18 tga gcc acc tgg aag ctc tgg ggc act act ggt gga gag gag tta tcc gtg aac acc ggg gac ctc a tga gcc acc tgg aag ctc tgg ggc act act ggt gga gag gag tta tcc gtg aac acc ggg gac ctc a 서열번호 19SEQ ID NO: 19 gag ctt cca ggt ggc tca cct cca tgc tcc cac agg cag cgg caa aag cac caa ggt ccc ggc tgc gag ctt cca ggt ggc tca cct cca tgc tcc cac agg cag cgg caa aag cac caa ggt ccc ggc tgc 서열번호 20SEQ ID NO: 20 gca gca aca gag ggg ttg agt act agc acc tta tag ccc tga gct gca tat gca gcc ggg acc ttg gca gca aca gag ggg ttg agt act agc acc tta tag ccc tga gct gca tat gca gcc ggg acc ttg 서열번호 21SEQ ID NO: 21 tca acc cct ctg ttg ctg caa cac tgg gct ttg gtg ctt aca tgt cca agg ctc atg gga tcg atc cta a tca acc cct ctg ttg ctg caa cac tgg gct ttg gtg ctt aca tgt cca agg ctc atg gga tcg atc cta a 서열번호 22SEQ ID NO: 22 gtg atg ggg ctg cca gtg gta att gtt ctc acc ccg gtc ctg atg tta gga tcg atc cca tga gcc ttggtg atg ggg ctg cca gtg gta att gtt ctc acc ccg gtc ctg atg tta gga tcg atc cca tga gcc ttg 서열번호 23SEQ ID NO: 23 ctg gca gcc cca tca cgt act cca cct acg gca agt tcc ttg ccg acg gcg ggt gct cgg ggg g ctg gca gcc cca tca cgt act cca cct acg gca agt tcc ttg ccg acg gcg ggt gct cgg ggg g 서열번호 24SEQ ID NO: 24 gat gtg gca tcc gtg gag tgg cac tcg tca caa att att atg tca taa gcg ccc ccc gag cac c gat gtg gca tcc gtg gag tgg cac tcg tca caa att att atg tca taa gcg ccc ccc gag cac c 서열번호 25SEQ ID NO: 25 ctc cac gga tgc cac atc cat ctt ggg cat cgg cac tgt cct tga cca agc aga gac tgc ggg ggcctc cac gga tgc cac atc cat ctt ggg cat cgg cac tgt cct tga cca agc aga gac tgc ggg ggc 서열번호 26SEQ ID NO: 26 cac agt gac gga gcc cgg agg ggt ggc ggt ggc gag cac aac cag tct cgc ccc cgc agt ctc t cac agt gac gga gcc cgg agg ggt ggc ggt ggc gag cac aac cag tct cgc ccc cgc agt ctc t 서열번호 27SEQ ID NO: 27 ggg ctc cgt cac tgt gcc cca tcc caa cat cga gga ggt tgc tct gtc cac cac cgg aga gat ccc ggg ctc cgt cac tgt gcc cca tcc caa cat cga gga ggt tgc tct gtc cac cac cgg aga gat ccc 서열번호 28SEQ ID NO: 28 gag atg tct ccc ccc ctt gat tac ttc gag ggg gat agc ctt gcc gta aaa agg gat ctc tcc ggt ggtgag atg tct ccc ccc ctt gat tac ttc gag ggg gat agc ctt gcc gta aaa agg gat ctc tcc ggt ggt 서열번호 29SEQ ID NO: 29 taa tca agg ggg gga gac atc tca tct tct gtc att caa aga aga agt gcg acg aac tcg ccg caa agctaa tca agg ggg gga gac atc tca tct tct gtc att caa aga aga agt gcg acg aac tcg ccg caa agc 서열번호 30SEQ ID NO: 30 cgt caa gac cgc ggt agt agg cca cgg cat tga tgc cca atg cga cca gct ttg cgg cga gtt cgcgt caa gac cgc ggt agt agg cca cgg cat tga tgc cca atg cga cca gct ttg cgg cga gtt cg 서열번호 31SEQ ID NO: 31 acc gcg gtc ttg acg tgt ccg tca tcc cga cca gcg gcg atg ttg tcg tcg tgg caa ccg atg c acc gcg gtc ttg acg tgt ccg tca tcc cga cca gcg gcg atg ttg tcg tcg tgg caa ccg atg c 서열번호 32SEQ ID NO: 32 aca cgt att gca gtc tat cac cga gtc gaa gtc gcc ggt ata gcc ggt cat gag ggc atc ggt tgc cac g aca cgt att gca gtc tat cac cga gtc gaa gtc gcc ggt ata gcc ggt cat gag ggc atc ggt tgc cac g 서열번호 33SEQ ID NO: 33 gcg gtg gac ttt atc cct g gcg gtg gac ttt atc cct g 서열번호 34SEQ ID NO: 34 aca cgt att gca gtc tat cac c aca cgt att gca gtc tat cac c 서열번호 35SEQ ID NO: 35 ctc gag gcg gtg gac ttt atc cctctc gag gcg gtg gac ttt atc cct 서열번호 36SEQ ID NO: 36 aag ctt tta gtg atg gtg atg gtg atg aca cgt att gca gtc tat cac cga gtcaag ctt tta gtg atg gtg atg gtg atg aca cgt att gca gtc tat cac cga gtc 서열번호 37SEQ ID NO: 37 atc atc ccc gat agg gaa gtt ctc tac cag gag ttc gac gag atg g atc atc ccc gat agg gaa gtt ctc tac cag gag ttc gac gag atg g 서열번호 38SEQ ID NO: 38 cct gtt cga tgt aag gga ggt gtt ggg aac act cct cca tct cgt cga act cct gg cct gtt cga tgt aag gga ggt gtt ggg aac act cct cca tct cgt cga act cct gg 서열번호 39SEQ ID NO: 39 cct ccc tta cat cga aca ggg aat gat gct cgc cga gca att caa aca gaa ggc gc cct ccc tta cat cga aca ggg aat gat gct cgc cga gca att caa aca gaa ggc gc 서열번호 40SEQ ID NO: 40 cca gtg cct ccc cca ctt ccg cca ccc aac ccg agc gcc ttc tgt ttg aat tgc cca gtg cct ccc cca ctt ccg cca ccc aac ccg agc gcc ttc tgt ttg aat tgc 서열번호 41SEQ ID NO: 41 tgg ggg agg cac tgg agg tgg cag cgg cgg tgg gat agc gtt cgc ctc gcg tgg ggg agg cac tgg agg tgg cag cgg cgg tgg gat agc gtt cgc ctc gcg 서열번호 42SEQ ID NO: 42 cac ata gtg cgt ggg gga gac gtg gtt acc ccg cga ggc gaa cgc t cac ata gtg cgt ggg gga gac gtg gtt acc ccg cga ggc gaa cgc t 서열번호 43SEQ ID NO: 43 atc atc ccc gat agg gaa gtt atc atc ccc gat agg gaa gtt 서열번호 44SEQ ID NO: 44 cac ata gtg cgt ggg gg cac ata gtg cgt ggg gg 서열번호 45SEQ ID NO: 45 ctc gag atc atc ccc gatctc gag atc atc ccc gat 서열번호 46SEQ ID NO: 46 gaa ttc cac ata gtg cgt ggggaa ttc cac ata gtg cgt ggg 서열번호 47SEQ ID NO: 47 gaa ttc atc atc ccc gatgaa ttc atc atc ccc gat 서열번호 48SEQ ID NO: 48 aag ctt tta gtg atg gtg atg gtg atg cac ata gtg cgt gggaag ctt tta gtg atg gtg atg gtg atg cac ata gtg cgt ggg

실시예 3. 인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자의 생합성 Example 3. Biosynthesis of protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chain

한 종류의 항원성 에피토프(mono-epitope)만 표출된 단백질 나노입자를 제조하기 위하여, 대장균 BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]에 실시예 2에서 제작된 발현벡터 pT7-FTN-EA, pT7-FTN-EB 및 pT7-FTN-EC를 각각 도입하였다(Hanahan D, DNA Cloning vol.1:109-135, 1985). 구체적으로 CaCl2로 처리한 대장균 BL21(DE3)((주) iNtRON biotechnology, Korea)에 상기 벡터들을 각각 열충격 방법으로 형질전환시킨 후, 앰피실린(ampicillin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 앰피실린 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 100㎎/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 배지에 접종한 다음 37℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 배양액의 배지탁도(OD600)가 0.5~0.6에 이르렀을 때 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 첨가(1 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. Expression vector pT7-FTN prepared in Example 2 in E. coli BL21 (DE3) [F-ompThsdSB (rB-mB-)] in order to prepare protein nanoparticles expressing only one type of antigenic epitope (mono-epitope) -EA, pT7-FTN-EB and pT7-FTN-EC were respectively introduced (Hanahan D, DNA Cloning vol. 1:109-135, 1985). Specifically, the vectors were transformed in E. coli BL21 (DE3) (iNtRON biotechnology, Korea) treated with CaCl 2 by a heat shock method, respectively, and then cultured in a medium containing ampicillin to obtain the expression vector. Colonies that were transformed and exhibiting ampicillin resistance were selected. The colony was inoculated into LB (Luria-Bertani) medium containing 100 mg/ml ampicillin, and then cultured at 37° C. at 130 rpm. When the medium turbidity (OD 600 ) of the culture medium reached 0.5 to 0.6, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) was added (1 mM) to induce expression of the recombinant gene.

3가지 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출된 단백질 나노입자를 제조하기 위하여 대장균 균주 BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]를 상기 제조된 발현벡터 쌍 pT7-FTN-EB/pET-FTN-ECA, p32-FTN-EB/ pET-FTN-ECA, pET-FTN-EB/p32-FTN-ECA로 동일한 방법으로 형질전환시킨 후, 앰피실린과 카나마이신(Kanamycin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 앰피실린과 카나마이신 저항성을 동시에 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 앰피실린(100㎎/㎖)과 카나마이신(50㎎/㎖)을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 37℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 배양액의 배지탁도(OD600)가 0.5~0.6에 이르렀을 때 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 첨가(1 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. To prepare protein nanoparticles in which three antigenic epitopes are expressed in a multi-epitope, E. coli strain BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)] was used as the prepared expression vector pair pT7-FTN- After transformation with EB/pET-FTN-ECA, p32-FTN-EB/ pET-FTN-ECA, pET-FTN-EB/p32-FTN-ECA in the same way, ampicillin and kanamycin were included. Cultured in a medium, the expression vector was transformed to select colonies exhibiting resistance to ampicillin and kanamycin at the same time. The colony was inoculated into an LB medium containing ampicillin (100 mg/ml) and kanamycin (50 mg/ml), and then cultured at 37°C at 130 rpm. When the medium turbidity (OD 600 ) of the culture medium reached 0.5 to 0.6, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) was added (1 mM) to induce expression of the recombinant gene.

한 종류의 항원성 에피토프(mono-epitope)만 표출된 단백질 나노입자를 제조할 경우 20 ℃에서 16~18 시간 더 배양, 3가지 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출된 단백질 나노입자를 제조할 경우 37 ℃에서 8 시간 더 배양 후 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수한 후, 7 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 이용하여 정제를 진행하였다. 또한, 상등액과 불용성 응집체를 각각 5xSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량 및 수용도를 농도계(Densitometer, Bio-Rad, USA)로 확인하였다(도 3). In the case of producing protein nanoparticles with only one type of antigenic epitope expressed, incubate for 16 to 18 hours at 20°C. Protein nanoparticles with three antigenic epitopes expressed in a multi-epitope are prepared. In the case of manufacturing, the cultured E. coli was centrifuged at 4,500 rpm for 10 minutes after culturing at 37° C. for 8 hours to recover the cell precipitate, and then 7 ml of crushing solution (10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 10 mM EDTA) Suspended in and crushed using an ultrasonic crusher (Branson Ultrasonics Corp., USA). After crushing, centrifugation was performed at 13,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant and insoluble aggregates were separated. Purification was performed using the separated supernatant. In addition, the supernatant and the insoluble aggregate were mixed with 5xSDS (0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% glycerol, 37.5 mM DTT) and 1:4, respectively, and boiled at 100° C. for 10 minutes. The boiled sample was loaded into a well of a 12% SDS-PAGE gel, and the sample was developed at 125 V for 2 hours, and the gel was stained with the Coomassie staining method and bleached to measure the expression level and water solubility of each recombinant protein. Densitometer, Bio-Rad, USA) was confirmed (Fig. 3).

실시예 4. 인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자의 정제Example 4. Purification of protein nanoparticles derived from human ferritin heavy chain

실시예 3에서 발현된 자가조립된 항원성 에피토프 융합 단백질 나노입자를 정제하기 위하여, 2단계의 정제 과정을 거쳐 진행하였다. 먼저 1) 재조합 단백질에 융합 발현된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni2 +-NTA affinity 크로마토그래피를 진행한 후, 2) 재조합 단백질의 자가 조립 시 구조유지 안정성을 향상 시키기 위하여 Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) 를 이용하여 재조합 단백질이 포함된 수용액을 조성이 다른 PBS 버퍼 (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4) 로 변경해 줌과 동시에 재조합 단백질을 농축 하였다. 각 단계별 상세한 기재는 아래와 같다.In order to purify the self-assembled antigenic epitope fusion protein nanoparticles expressed in Example 3, it was carried out through a two-step purification process. First, 1) Ni 2 + -NTA affinity chromatography using the binding of histidine and nickel fused to the recombinant protein was performed, and then 2) Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K) to improve the stability of structure maintenance during self-assembly of the recombinant protein. , Millipore, Billerica, MA) to change the aqueous solution containing the recombinant protein to a PBS buffer with a different composition (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na 2 HPO 4 , 2mM KH 2 PO 4 , pH 7.4). The recombinant protein was concentrated. Detailed description of each step is as follows.

1) Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피1) Ni 2+ -NTA affinity chromatography

재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 7 mL 라이시스 버퍼(pH 8.0, 50 mMsodium phosphate,300 mM NaCl, 20 mM imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2 +-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다 (세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate,300 mM NaCl, 80 mM imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300mM NaCl, 200 mM imidazole). In order to purify the recombinant protein, the cultured E. coli was recovered in the same manner as specified above, and the cell pellet was resuspended in 7 mL Lysis buffer (pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) and used an ultrasonic disruptor. The cells were disrupted. The crushed cell solution was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to separate only the supernatant, and then each recombinant protein was separated using a Ni 2 + -NTA column (Qiagen, Hilden, Germany) (wash buffer: pH 8.0, 50 mM). sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / elution buffer: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole).

2) 자가 조립 촉진을 위한 버퍼 변경 및 농축2) Buffer change and concentration to promote self-assembly

Ni2 +-NTA affinity 크로마토그래피를 거쳐 용출된 3ml의 재조합 단백질을 Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) 에 담아 5,000 g로 10분간 원심 분리 한 후 column 상부를 단백질 구조유지 안정용 PBS 버퍼 (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4)로 가득 채운 후 column 안에 500μl 의 용액이 남을 때까지 5,000 g 로 원심 분리를 진행하였다. 이를 3회 반복한 후 최종 부피를 1ml로 맞춘 후 아래 단계를 진행하였다. 농축된 용액 일부를 5ㅧSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 정제되고 농축된 단백질 나노입자를 확인하였다(도 4).Put 3 ml of recombinant protein eluted through Ni 2 + -NTA affinity chromatography in an Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA), centrifuge at 5,000 g for 10 minutes, and place the upper column in PBS buffer for protein structure maintenance (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na 2 HPO 4 , 2mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) After filling, centrifugation was performed at 5,000 g until 500 μl of solution remained in the column. After repeating this three times, the final volume was adjusted to 1 ml, and the following steps were performed. A portion of the concentrated solution was mixed with 5ㅧSDS (0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% glycerol, 37.5 mM DTT) 1:4 and boiled at 100° C. for 10 minutes. The boiled sample was loaded into a well of a 12% SDS-PAGE gel, the sample was developed at 125 V for 2 hours, and then the gel was stained by the Coomassie staining method, and then bleached to confirm the purified and concentrated protein nanoparticles (Fig. 4). ).

실시예 5. 제조된 인간 훼리틴 중쇄 유래 단백질 나노입자의 구조 분석Example 5. Structural analysis of protein nanoparticles derived from the prepared human ferritin heavy chain

실시예 4에서 정제된 재조합 단백질 나노입자의 구조 분석을 위하여 투과전자현미경 (TEM)을 이용하여 재조합 단백질을 촬영하였다. 먼저 염색하지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids) 올린 후 자연 건조하였다. 단백질 나노입자의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 배양하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 단백질 나노입자 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과 15-20nm 의 구형 나노입자가 형성된 것을 확인하였으며(도 5A, B), 또한 동적광산란법(Dynamic Light Scattering, DLS)을 이용하여 분석한 결과 일정한 단백질 나노입자의 크기분포를 확인하였다(도 5C). In order to analyze the structure of the recombinant protein nanoparticles purified in Example 4, the recombinant protein was photographed using a transmission electron microscope (TEM). First, the undyed purified protein sample was placed on a carbon-coated copper electron microscope grid and then naturally dried. To obtain stained images of protein nanoparticles, electron microscopy grids containing naturally dried samples were incubated with 2% (w/v) aqueous uranyl acetate solution for 10 minutes at room temperature and 3-4 times with distilled water. Washed. As a result of observing the protein nanoparticle image using a Philips Technai 120 kV electron microscope, it was confirmed that spherical nanoparticles of 15-20 nm were formed (Figs. 5A, B), and also using a dynamic light scattering (DLS) method. As a result of the analysis, a constant size distribution of the protein nanoparticles was confirmed (FIG. 5C).

실시예Example 6. 동시발현 시스템에 의해서 발현된 단백질 나노입자의 시간에 따른 발현양상 및 항원 에피토프의 표출 빈도 비율 확인을 위한 SDS-PAGE 분석 6. SDS-PAGE analysis to confirm the expression pattern of protein nanoparticles expressed by the co-expression system over time and the rate of expression of antigen epitopes

본 발명에서 두 개의 발현벡터를 기초한 동시발현 시스템을 이용하여 3가지 항원성 에피토프가 복합적(multi-epitope)으로 표출된 단백질 나노입자의 경우를 포함하여 실시예 1에서 설명한 시그마 32 의존성 프로모터 ibpfxs를 활용하여 항원성 에피토프의 비율 조절이 가능해진 단백질 나노입자는 총 3종류이며 이를 위한 발현벡터 쌍은 다음과 같다. Sigma 32-dependent promoter described in Example 1 including the case of protein nanoparticles in which three antigenic epitopes are expressed in a multi-epitope using a co-expression system based on two expression vectors in the present invention There are a total of 3 types of protein nanoparticles for which the ratio of antigenic epitopes can be adjusted using ibpfxs, and expression vector pairs for this are as follows.

1) pT7-FTN-EB +pET-FTN-ECA, 1) pT7-FTN-EB +pET-FTN-ECA,

2) p32-FTN-EB + pET-FTN-ECA, 2) p32-FTN-EB + pET-FTN-ECA,

3) pET-FTN-EB + p32-FTN-ECA3) pET-FTN-EB + p32-FTN-ECA

실시예 3의 과정을 통해 각각 형질전환시킨 후 배양한 다음 배양액의 배지탁도(OD600)가 0.5~0.6에 이르렀을 때 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 첨가하지 않은 배양액을 0h로 하여 IPTG첨가(1mM) 후 1시간 단위로 배양액을 회수하여 실시예 4의 방법으로 모두 동일한 조건에서 정제하였다. After each transformation through the process of Example 3 and culture, when the medium turbidity (OD 600 ) of the culture medium reached 0.5 to 0.6, the culture medium without the addition of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) was set to 0 h. After the addition of IPTG (1 mM), the culture solution was recovered every hour, and all were purified under the same conditions by the method of Example 4.

시간에 따른 각각 정제한 용액은 5ㅧSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 정제된 단백질 나노입자의 시간에 따른 발현 양상 및 단백질 나노입자 표면 표출 빈도를 확인하였다. 농도계(Densitometer, Bio-Rad, USA)로 확인한 결과, pT7-FTN-EB 와 pET-FTN-ECA 발현벡터를 동시발현하여 합성하였을 경우 hFTN-H-에피토프 B : hFTN-H-에피토프 C-A가 40% : 60%, p32-FTN-EB 와 pET-FTN-ECA 경우 20% : 80%, pET-FTN-EB 와 p32-FTN-ECA 경우 80% : 20% 의 비율로 시간이 지나도 일정하게 발현이 유지됨을 확인하였다(도 6). 또한 세기가 Strong T7이 IPTG에 의해 먼저 발현 유도된 다음 시그마 32 의존성 프로모터 ibpfxs가 그 후에 발현 유도됨을 확인할 수 있다. Each purified solution over time was mixed with 5ㅧSDS (0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% glycerol, 37.5 mM DTT) and 1:4 and boiled at 100° C. for 10 minutes. The boiled sample was loaded into a well of a 12% SDS-PAGE gel, and the sample was developed at 125 V for 2 hours, and then the gel was stained with the Coomassie staining method and then bleached. The frequency of surface expression of nanoparticles was confirmed. As a result of checking with a densitometer (Bio-Rad, USA), when synthesizing by co-expressing pT7-FTN-EB and pET-FTN-ECA expression vectors, hFTN-H-epitope B: hFTN-H-epitope CA 40% : 60%, p32-FTN-EB and pET-FTN-ECA 20%: 80%, pET-FTN-EB and p32-FTN-ECA 80%: 20%. Was confirmed (Fig. 6). In addition, it can be seen that the intensity of Strong T7 was first induced by IPTG, and then the sigma 32-dependent promoter ibpfxs was then induced to be expressed.

각각의 용액 안에는 인간 훼리틴 중쇄의 단량체가 자가조립하여 나노입자를 이루고 있지만 이후 SDS-PAGE 분석 준비 과정에서 다시 단량체로 분리된 것이기 때문에 SDS-PAGE에서 확인된 발현 비율은 하나의 단백질 나노입자 표면에 분포되어 있는 항원성 에피토프의 비율과 동일하다. 즉, pT7-FTN-EB 와 pET-FTN-ECA의 동시발현을 통해 만들어진 단백질 나노입자 표면에는 에피토프 B : 에피토프 C-A가 40% : 60%의 비율로 표출되어 존재한다고 할 수 있다. p32-FTN-EB와 pET-FTN-ECA를 동시발현 할 경우 20% : 80%, pET-FTN-EB와 p32-FTN-ECA의 경우 80% : 20% 의 비율로 에피토프가 표면 분포되어 있으며 시그마 의존성 프로모터 ibpfxs를 발현 조절을 의도하는 벡터에 삽입함으로 인해 인위적으로 발현율을 조절할 수 있고 결론적으로 단백질 나노입자 표면의 항원 표출 빈도를 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하였다(도 6).In each solution, the monomers of the human ferritin heavy chain are self-assembled to form nanoparticles, but since they were separated into monomers again during the preparation for SDS-PAGE analysis, the expression ratio confirmed on the SDS-PAGE was found on the surface of one protein nanoparticle It is equal to the proportion of distributed antigenic epitopes. That is, it can be said that epitope B: epitope CA is expressed in a ratio of 40%: 60% on the surface of protein nanoparticles made through co-expression of pT7-FTN-EB and pET-FTN-ECA. In the case of simultaneous expression of p32-FTN-EB and pET-FTN-ECA, epitopes are surface distributed at a ratio of 20%: 80%, and in the case of pET-FTN-EB and p32-FTN-ECA 80%: 20%. By inserting the dependent promoter ibpfxs into a vector intended for expression control, it was confirmed that the expression rate could be artificially controlled, and consequently, the frequency of antigen expression on the surface of the protein nanoparticles could be effectively controlled (FIG. 6).

실시예Example 7. 제조된7. Manufactured 인간 human 훼리틴Ferritin 중쇄Heavy chain 유래 단백질 나노입자의 3차원 표출을 위한 하이드로젤 융합 Hydrogel fusion for three-dimensional expression of derived protein nanoparticles

상기 실시예 4에서 제조된 단백질 나노입자 10mg을 N-석신이미딜아크릴레이트(N-succinimidylacrylate, NSA) 0.01mg과 PBS버퍼 내에서 1시간 동안 37℃에서 배양하여 결합시켜준 후, 결합되지 않은 NSA는 ultrafiltration (Amicon Ultra100K)으로 제거하여, 최종 중합반응이 가능한 화학 구조를 가진 단백질 나노입자를 제조하였다. 문헌에 따르면, 폴리아크릴아마이드 기반 하이드로젤은 높은 안정성, 낮은 비특이적 결합, 낮은 형광 백그라운드(background)와 같은 장점이 있다. 따라서, 상기 합성된 단백질 나노입자 30㎍과 0.9% 폴리아크릴아마이드(29:1 W/W 아크릴아마이드:비스-아크릴아마이드)를 0.125% w/v 암모늄 퍼설페이트(amonium persulphate, APS)와 0.125%w/v 테트라메틸에틸렌디아민 (tetramethyl -ethylenediamine, TEMED) 존재 하에 혼합하여 96-well plate 속에 50㎕씩 위치시킨 후, 25℃에서 16시간 동안 중합 반응을 진행하여 단백질 나노입자가 융합된 하이드로젤을 제조하였다. 그 결과 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscope) 사진을 통해 단백질 나노입자 융합 하이드로젤이 매우 균일한 다공성의 3차원 구조를 가지는 것을 확인하였다 (도 7). 10 mg of the protein nanoparticles prepared in Example 4 were incubated with 0.01 mg of N-succinimidylacrylate (NSA) and incubated at 37° C. for 1 hour in a PBS buffer to bind, and then unbound NSA Was removed by ultrafiltration (Amicon Ultra100K) to prepare protein nanoparticles having a chemical structure capable of a final polymerization reaction. According to the literature, polyacrylamide-based hydrogels have advantages such as high stability, low nonspecific binding, and low fluorescence background. Therefore, 30 μg of the synthesized protein nanoparticles and 0.9% polyacrylamide (29:1 W/W acrylamide:bis-acrylamide) were 0.125% w/v ammonium persulphate (APS) and 0.125%w /v Mix in the presence of tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) and place 50 µl each in a 96-well plate, and then conduct a polymerization reaction at 25°C for 16 hours to prepare a hydrogel in which protein nanoparticles are fused. I did. As a result, it was confirmed that the protein nanoparticle fusion hydrogel had a very uniform porosity 3D structure through a scanning electron microscope (SEM) photograph (FIG. 7).

또한, 기판에 고정된 검출용 탐침의 양은 검출시스템의 민감도를 결정하는 핵심 요소이므로 신뢰도 높은 진단 시스템을 구축하기 위해서는 밀도 높은 검출용 탐침을 균일하게 고정하는 기술이 요구된다. 일반적으로 기판의 2차원 표면에 검출용 탐침을 단순 흡착 고정화할 경우 실제 기판에 고정된 검출용 탐침의 양을 정량화하는데 어려움이 있으나 단백질 나노입자 융합 하이드로젤은 제조 시 단백질 나노입자의 양 조절이 가능하고, 하이드로젤에 융합되어 고정화되므로 기판에 존재하는 검출용 탐침의 정확한 정량 측정이 가능하다는 장점이 있다. 따라서 단백질 나노입자가 하이드로젤에 고르게 분산되어 고정화 되어 있는지 확인하기 위하여 바이오틴이 표출된 단백질 나노입자 융합 하이드로젤에 금 나노입자(20 nm)가 결합된 항-바이오틴 항체와 반응 후 silver enhancement kit를 이용하여 금 나노입자를 증폭하였다. SEM 촬영 시 하이드로젤 내 단백질 나노입자의 위치를 금 나노입자를 통해 명확하게 확인할 수 있다. 하이드로젤에 금 나노입자가 고르게 분산되어 있는 것을 확인하였으며 이는 단백질 나노입자가 하이드로젤 전체 면적에 고르게 분산되어 고정되어 있음을 보여준다. 질환 진단 시스템 실용화를 위해서는 기판에 고정된 단백질 검출용 탐침의 장기 안정성 유지가 필수적이다. 일반적으로 2차원 평면에 고정된 단백질은 별도의 안정제 처리 없이는 공기에 노출되기 쉽고 수분 유지가 어려우므로 단백질의 장기보존이 어렵다. 2차원 평면에 비해 하이드로젤이 뛰어난 수분 유지 능력을 가지고 있기 때문에 단백질의 변성을 최소화 시키며, 앞으로 구축할 실용화 가능한 진단 시스템의 검출용 탐침 고정용 플랫폼으로써 하이드로젤이 매우 우수한 장점을 가지고 있다.In addition, since the amount of the detection probe fixed to the substrate is a key factor in determining the sensitivity of the detection system, a technique for uniformly fixing the high density detection probe is required to build a reliable diagnostic system. In general, it is difficult to quantify the amount of the detection probe fixed to the actual substrate when simple adsorption and immobilization of the detection probe on the two-dimensional surface of the substrate, but protein nanoparticle fusion hydrogel can control the amount of protein nanoparticles during manufacture. And, since it is fused to a hydrogel and immobilized, there is an advantage in that it is possible to accurately and quantitatively measure the detection probe present on the substrate. Therefore, to check whether the protein nanoparticles are evenly dispersed and immobilized on the hydrogel, use a silver enhancement kit after reacting with an anti-biotin antibody in which gold nanoparticles (20 nm) are bound to a protein nanoparticle fusion hydrogel expressing biotin. Thus, gold nanoparticles were amplified. When SEM photographing, the position of the protein nanoparticles in the hydrogel can be clearly identified through the gold nanoparticles. It was confirmed that gold nanoparticles were evenly dispersed in the hydrogel, indicating that the protein nanoparticles were evenly dispersed and fixed over the entire area of the hydrogel. For the practical use of a disease diagnosis system, it is essential to maintain long-term stability of a probe for detecting a protein fixed to a substrate. In general, proteins immobilized on a two-dimensional plane are easily exposed to air and difficult to retain moisture without a separate stabilizing agent treatment, so long-term storage of proteins is difficult. Compared to a two-dimensional plane, since hydrogel has excellent moisture retention ability, it minimizes protein denaturation, and as a platform for fixing probes for detection of a diagnostic system that can be put into practice in the future, hydrogel has very excellent advantages.

실시예Example 8. 제조된8. Manufactured 인간 human 훼리틴Ferritin 중쇄Heavy chain 유래 단백질 나노입자의 C형 간염 질환 진단 민감도 및 특이도 검증 Verification of the sensitivity and specificity of the derived protein nanoparticles for diagnosis of hepatitis C disease

단백질 나노입자 융합 하이드로젤 3차원 검출시스템의 효용성 및 우수성을 확인하고자 민감도 분석을 실행하였다. 민감도 분석은 단백질 나노입자 6종류 [hFTN-H-에피토프 B (100 %), hFTN-H-에피토프 A (100 %), hFTN-H-에피토프 C (100 %), hFTN-H-에피토프 B (20 %)+ hFTN-H-에피토프 CA (80 %), hFTN-H-에피토프 B (40 %) + hFTN-H-에피토프 CA (60 %), hFTN-H-에피토프 B (80 %)+ hFTN-H-에피토프 CA (20 %)] 와 펩타이드 모노머 1종류[에피토프 B 모노머 (80 %) + 에피토프 CA 모노머 (20 %)로 진행 되었다. C형 간염 환자 30명의 혈청 시료를 사용하여 수행하였다. 각각의 단백질 나노입자 검출용 탐침이 융합되어 있는 하이드로젤에 시료(C형 간염환자 혈액 샘플)를 반응 시킨 후 퀀텀 닷(이하 Q-dot)이 결합되어 있는 2차 항체를 사용하여 형광도를 측정하였다. Sensitivity analysis was performed to confirm the effectiveness and excellence of the protein nanoparticle fusion hydrogel 3D detection system. Sensitivity analysis includes 6 types of protein nanoparticles [hFTN-H-epitope B (100%), hFTN-H-epitope A (100%), hFTN-H-epitope C (100%), hFTN-H-epitope B (20). %)+ hFTN-H-Epitope CA (80%), hFTN-H-Epitope B (40%) + hFTN-H-Epitope CA (60%), hFTN-H-Epitope B (80%)+ hFTN-H -Epitope CA (20%)] and one type of peptide monomer [Epitope B monomer (80%) + Epitope CA monomer (20%). Serum samples from 30 hepatitis C patients were used. After reacting a sample (a hepatitis C patient blood sample) to a hydrogel in which each protein nanoparticle detection probe is fused, the fluorescence is measured using a secondary antibody to which a quantum dot (hereinafter referred to as Q-dot) is bound. I did.

또한, 나노입자화시키지 않은 에피토프의 펩타이드 모노머를 폴리스틸렌(PS) 2차원 평면에 고정화되어 있는 검출시스템과 비교 분석하였다. 이를 위해, 상기 실시예 3, 4에 의하여 제조된 단백질 나노입자를 함유하고 있는 하이드로젤을 PBS 버퍼를 사용하여 세척한 후, PBS 버퍼를 사용하여 C형 간염 환자 혈청을 1/100희석한 시료 100 ㎕를 첨가하고, 상온에서 2시간 교반시켜 배양하였다. PBS 버퍼를 사용하여 세척 후, 100 ㎕의 Q-dot 컨쥬케이트 시약을 각 웰에 첨가 후, 1시간 상온에서 교반시켜 배양한 후, PBS 버퍼로 세척하였다. 모든 실험은 3번씩 진행 되었으며, 그 평균값으로 그 값을 정했다. IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)의 정의에 따라 Limit of detection (이하 LOD)를 정하였다. 각각의 실험의 LOD 값은 정상인 혈청 30개 시료의 형광도 값의 평균 + 표준편차 값의 세배를 LOD로 정하였다. LOD 이상의 값을 양성(positive), 그 이하의 값을 음성(negative)으로 판정하였으며, 민감도는 number of true positive/total number of sample로 정의 되었다. In addition, the peptide monomer of the epitope that was not nanoparticleized was compared and analyzed with the detection system immobilized on a polystyrene (PS) two-dimensional plane. To this end, after washing the hydrogel containing the protein nanoparticles prepared in Examples 3 and 4 using a PBS buffer, sample 100 diluted 1/100 of the serum of a hepatitis C patient using a PBS buffer. Μl was added, and cultured by stirring at room temperature for 2 hours. After washing with PBS buffer, 100 µl of Q-dot conjugate reagent was added to each well, stirred at room temperature for 1 hour, incubated, and washed with PBS buffer. All experiments were conducted three times, and the value was determined as the average value. Limit of detection (hereinafter, LOD) was determined according to the definition of IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). The LOD value of each experiment was defined as the LOD by three times the mean + standard deviation value of the fluorescence values of 30 normal serum samples. Values above the LOD were determined as positive and values below the LOD were determined as negative, and the sensitivity was defined as the number of true positive/total number of samples.

나노입자화 된 단독 에피토프 실험의 민감도는 hFTN-H-에피토프 C, hFTN-H-에피토프 A, hFTN-H-에피토프 B 가 각각 33%, 87%, 90%가 나왔으며, 이 결과를 통해 C형 간염 질환 진단에 있어서, 에피토프 B의 중요도가 높으며 또한 다양한 종류의 C형 간염 특이적 항체의 다중진단이 중요함을 다시 한 번 확인 하였다(도 8). 나노입자화 된 멀티 에피토프 실험의 경우, hFTN-H-에피토프 C-A : hFTN-H-에피토프 B = 8 : 2, hFTN-H-에피토프 C-A : hFTN-H-에피토프 B = 6 : 4, hFTN-H-에피토프 C-A : hFTN-H-에피토프 B = 8 : 2로 실험이 수행 되었으며, 각각의 민감도는 77%, 93%, 100%로 나타남을 확인하였다(도 8). The sensitivity of the nanoparticleized epitope experiment was 33%, 87%, and 90% for hFTN-H-epitope C, hFTN-H-epitope A, and hFTN-H-epitope B, respectively. In diagnosing hepatitis disease, it was confirmed once again that the importance of epitope B is high and that multiple diagnosis of various types of hepatitis C-specific antibodies is important (FIG. 8). For nanoparticleized multi-epitope experiments, hFTN-H-epitope CA: hFTN-H-epitope B = 8: 2, hFTN-H-epitope CA: hFTN-H-epitope B = 6: 4, hFTN-H- The experiment was performed with epitope CA: hFTN-H-epitope B = 8: 2, and it was confirmed that the sensitivity of each was 77%, 93%, and 100% (FIG. 8).

수신자 동작 특성 곡선 분석(Receiver operating characteristic), ROC curve)을 통해 보다 명확하게 본 발명의 단백질 나노입자를 이용한 C형 간염 마커의 검출법의 획기적인 성능을 확인 할 수 있었다. ROC 곡선 분석은 주로 임상 화학, 약리학, 생리학 진단 검사에 사용되는 것으로서 true positive (= sensitivity, 민감도)와 true negative (= specificity, 특이도)를 동시에 나타내는 그래프이다. 이때, x축은 false positive rate (= 1 - true negative), y축은 true positive rate가 되며 ROC curve는 그래프가 왼쪽 꼭대기에 가깝게 그려질수록 분류 성능이 우수하다고 보는데, 이는 ROC 곡선 면적이 1에 가까울수록 성능이 좋다는 것을 의미하는데 도 9에서 나타난 바와 같이 hFTN-H-에피토프 C-A : hFTN-H-에피토프 B = 8 : 2의 경우에 ROC 곡선이 1에 가장 가깝다는 것을 확인할 수 있었다. Through the receiver operating characteristic (ROC curve) analysis, it was possible to more clearly confirm the breakthrough performance of the method for detecting hepatitis C markers using the protein nanoparticles of the present invention. ROC curve analysis is mainly used for clinical chemistry, pharmacology, and physiology diagnostic tests, and is a graph that simultaneously shows true positive (= sensitivity, sensitivity) and true negative (= specificity, specificity). At this time, the x-axis is a false positive rate (= 1-true negative), the y-axis is a true positive rate, and the ROC curve is considered to be superior to the classification performance as the graph is drawn closer to the top left. It means that the performance is good. As shown in FIG. 9, it was confirmed that the ROC curve was closest to 1 in the case of hFTN-H-epitope CA: hFTN-H-epitope B = 8: 2.

에피토프 펩타이드 모노머(나노입자화 된 멀티 에피토프 실험에서 민감도 100 %가 나온 에피토프의 비율을 사용하였음(에피토프 B : 에피토프 CA = 8 : 2))를 PS 2차원 평면에 고정화 시킨 후 민감도를 측정해본 결과, 민감도는 63 %에 그쳤다(도 10). 본 발명을 통한 단백질 나노입자는 세포 내에서 자연 생합성되는 3차원 나노구조체로서 항상 정확한 4차 구조와 입자 topology를 유지하고 있으며, 고정화 플랫폼인 하이드로젤의 경우, 다량의 수분을 함유하고 있으며, 부피대비 표면적 또한 매우 크기 때문에 단백질 나노입자의 3차원 구조를 적절히 유지하고, 높은 밀도로 고정화 하는 것을 가능하게 한다. 그 결과 C형 간염 특이적 마커의 고민감도, 고특이도 검출이 가능함을 확인하였다(도 8) After immobilizing the epitope peptide monomer (the ratio of the epitope with 100% sensitivity in the nanoparticleized multi-epitope experiment (epitope B: epitope CA = 8: 2)) on the PS 2D plane, the sensitivity was measured. The sensitivity was only 63% (Fig. 10). Protein nanoparticles according to the present invention are three-dimensional nanostructures that are naturally biosynthesized within cells, and always maintain an accurate quaternary structure and particle topology. In the case of a hydrogel, an immobilization platform, it contains a large amount of moisture, and Since the surface area is also very large, it is possible to properly maintain the three-dimensional structure of the protein nanoparticles and to immobilize them at a high density. As a result, it was confirmed that high sensitivity and high specificity of the hepatitis C-specific marker can be detected (Fig. 8).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that these specific techniques are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Accordingly, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Protein nanoparticle linked with multiple disease specific marker epitope and ultra-sensitive method for detecting disease specific marker using it <130> P14-B228 <160> 48 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ibpfxs promoter <400> 1 ttcgaagacc ataaactgca aaaaaaagtc cgctgataag gcttgaaaag ttcatttcca 60 gacccatttt tacatcgtag ccgatgagga cgcgcctgat gggtgttctg gctacctgac 120 ctgtccattg tggaaggtct tacattctcg ctgatttgtc gacaaattct ggggattact 180 accaaaaata gttgcgcaaa catcttgaaa ttttgctaat gaccacaata taagctaaac 240 gcgattcgca acccattcag gtagccgggg ttaaccggct gctattaata aaggagatat 300 acatatg 307 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 1 <400> 2 catatgacga ccgcgtccac ctcg 24 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 2 <400> 3 ctcgagagtg cctcccccac ttccgccacc gctttcatta tc 42 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial 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gtggcaaccg 60 atgc 64 <210> 32 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 31 <400> 32 acacgtattg cagtctatca ccgagtcgaa gtcgccggta tagccggtca tgagggcatc 60 ggttgccacg 70 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 33 <400> 33 gcggtggact ttatccctg 19 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 34 <400> 34 acacgtattg cagtctatca cc 22 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 35 <400> 35 ctcgaggcgg tggactttat ccct 24 <210> 36 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 36 <400> 36 aagcttttag tgatggtgat ggtgatgaca cgtattgcag tctatcaccg agtc 54 <210> 37 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 37 <400> 37 atcatccccg atagggaagt tctctaccag gagttcgacg agatgg 46 <210> 38 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 38 <400> 38 cctgttcgat gtaagggagg tgttgggaac actcctccat ctcgtcgaac tcctgg 56 <210> 39 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 39 <400> 39 cctcccttac atcgaacagg gaatgatgct cgccgagcaa ttcaaacaga aggcgc 56 <210> 40 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 40 <400> 40 ccagtgcctc ccccacttcc gccacccaac ccgagcgcct tctgtttgaa ttgc 54 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 41 <400> 41 tgggggaggc actggaggtg gcagcggcgg tgggatagcg ttcgcctcgc g 51 <210> 42 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 42 <400> 42 cacatagtgc gtgggggaga cgtggttacc ccgcgaggcg aacgct 46 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 43 <400> 43 atcatccccg atagggaagt t 21 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 44 <400> 44 cacatagtgc gtggggg 17 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 45 <400> 45 ctcgagatca tccccgat 18 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 46 <400> 46 gaattccaca tagtgcgtgg g 21 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 47 <400> 47 gaattcatca tccccgat 18 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 48 <400> 48 aagcttttag tgatggtgat ggtgatgcac atagtgcgtg gg 42 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> Protein nanoparticle linked with multiple disease specific marker epitope and ultra-sensitive method for detecting disease specific marker using it <130> P14-B228 <160> 48 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ibpfxs promoter <400> 1 ttcgaagacc ataaactgca aaaaaaagtc cgctgataag gcttgaaaag ttcatttcca 60 gacccatttt tacatcgtag ccgatgagga cgcgcctgat gggtgttctg gctacctgac 120 ctgtccattg tggaaggtct tacattctcg ctgatttgtc gacaaattct ggggattact 180 accaaaaata gttgcgcaaa catcttgaaa ttttgctaat gaccacaata taagctaaac 240 gcgattcgca acccattcag gtagccgggg ttaaccggct gctattaata aaggagatat 300 acatatg 307 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 1 <400> 2 catatgacga ccgcgtccac ctcg 24 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 2 <400> 3 ctcgagagtg cctcccccac ttccgccacc gctttcatta tc 42 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 3 <400> 4 ctcgagccca ccgccgctgc cacctccagt gcctccccca ct 42 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 4 <400> 5 aaaaacaaac gtaacaccaa ccgccgccca caggatatta agtt 44 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 5 <400> 6 taaactccac caacgatctg accaccgccc gggaacttaa tatcctgtgg gcggc 55 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 6 <400> 7 gtcagatcgt tggtggagtt tacttgttgc cgcgcagggg ccccaggttg g 51 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 8 <400> 8 ggaagtcttc ctagtcgcgc gcacacccaa cctggggccc 40 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 8 <400> 9 aaaaacaaac gtaacaccaa ccg 23 <210> 10 <211> 19 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<220> <223> Seq ID 17 <400> 18 tgagccacct ggaagctctg gggcactact ggtggagagg agttatccgt gaacaccggg 60 gacctca 67 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 18 <400> 19 gagcttccag gtggctcacc tccatgctcc cacaggcagc ggcaaaagca ccaaggtccc 60 ggctgc 66 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 19 <400> 20 gcagcaacag aggggttgag tactagcacc ttatagccct gagctgcata tgcagccggg 60 accttg 66 <210> 21 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 20 <400> 21 tcaacccctc tgttgctgca acactgggct ttggtgctta catgtccaag gctcatggga 60 tcgatcctaa 70 <210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 21 <400> 22 gtgatggggc tgccagtggt aattgttctc accccggtcc tgatgttagg atcgatccca 60 tgagccttg 69 <210> 23 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 22 <400> 23 ctggcagccc catcacgtac tccacctacg gcaagttcct tgccgacggc gggtgctcgg 60 gggg 64 <210> 24 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 23 <400> 24 gatgtggcat ccgtggagtg gcactcgtca caaattatta tgtcataagc gccccccgag 60 cacc 64 <210> 25 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 24 <400> 25 ctccacggat gccacatcca tcttgggcat cggcactgtc cttgaccaag cagagactgc 60 gggggc 66 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 25 <400> 26 cacagtgacg gagcccggag gggtggcggt ggcgagcaca accagtctcg cccccgcagt 60 ctct 64 <210> 27 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 26 <400> 27 gggctccgtc actgtgcccc atcccaacat cgaggaggtt gctctgtcca ccaccggaga 60 gatccc 66 <210> 28 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 27 <400> 28 gagatgtctc ccccccttga ttacttcgag ggggatagcc ttgccgtaaa aagggatctc 60 tccggtggt 69 <210> 29 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 28 <400> 29 taatcaaggg ggggagacat ctcatcttct gtcattcaaa gaagaagtgc gacgaactcg 60 ccgcaaagc 69 <210> 30 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 29 <400> 30 cgtcaagacc gcggtagtag gccacggcat tgatgcccaa tgcgaccagc tttgcggcga 60 gttcg 65 <210> 31 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 30 <400> 31 accgcggtct tgacgtgtcc gtcatcccga ccagcggcga tgttgtcgtc gtggcaaccg 60 atgc 64 <210> 32 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 31 <400> 32 acacgtattg cagtctatca ccgagtcgaa gtcgccggta tagccggtca tgagggcatc 60 ggttgccacg 70 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 33 <400> 33 gcggtggact ttatccctg 19 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 34 <400> 34 acacgtattg cagtctatca cc 22 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 35 <400> 35 ctcgaggcgg tggactttat ccct 24 <210> 36 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 36 <400> 36 aagcttttag tgatggtgat ggtgatgaca cgtattgcag tctatcaccg agtc 54 <210> 37 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 37 <400> 37 atcatccccg atagggaagt tctctaccag gagttcgacg agatgg 46 <210> 38 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 38 <400> 38 cctgttcgat gtaagggagg tgttgggaac actcctccat ctcgtcgaac tcctgg 56 <210> 39 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 39 <400> 39 cctcccttac atcgaacagg gaatgatgct cgccgagcaa ttcaaacaga aggcgc 56 <210> 40 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 40 <400> 40 ccagtgcctc ccccacttcc gccacccaac ccgagcgcct tctgtttgaa ttgc 54 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 41 <400> 41 tgggggaggc actggaggtg gcagcggcgg tgggatagcg ttcgcctcgc g 51 <210> 42 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 42 <400> 42 cacatagtgc gtgggggaga cgtggttacc ccgcgaggcg aacgct 46 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 43 <400> 43 atcatccccg atagggaagt t 21 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 44 <400> 44 cacatagtgc gtggggg 17 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 45 <400> 45 ctcgagatca tccccgat 18 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 46 <400> 46 gaattccaca tagtgcgtgg g 21 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 47 <400> 47 gaattcatca tccccgat 18 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq ID 48 <400> 48 aagcttttag tgatggtgat ggtgatgcac atagtgcgtg gg 42

Claims (16)

인간 훼리틴 중쇄 단백질 나노입자 표면에 5-1-1p, c100p 및 c22p가 연결된 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프 및 c33c로 표시되는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프가 표출되어, HCV 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 C형 간염 면역분석용 단백질 나노입자.
(HCV) antibody-specific epitope in which 5-1-1p, c100p and c22p are linked to the surface of human ferritin heavy chain protein nanoparticles and a hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope expressed by c33c are expressed , A protein nanoparticle for hepatitis C immunoassay in which an HCV antibody can specifically bind.
제1항에 있어서, 상기 단백질 나노입자의 직경이 1-20nm인 것을 특징으로 하는 C형 간염 면역분석용 단백질 나노입자.
The protein nanoparticle for hepatitis C immunoassay according to claim 1, wherein the protein nanoparticle has a diameter of 1-20 nm.
삭제delete 제1항에 있어서, 상기 5-1-1p, c100p 및 c22p가 연결된 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프 및 c33c로 표시되는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프는 상기 단백질 나노입자의 표면에 2:8~8:2의 비율로 융합 발현되어 있는 것을 특징으로 하는 C형 간염 면역분석용 단백질 나노입자.
2. The method of claim 1, wherein the hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope to which 5-1-1p, c100p and c22p are linked and the HCV antibody-specific epitope to be c33c comprise the protein nanoparticle Wherein the fusion protein is expressed at a ratio of 2: 8 to 8: 2 on the surface of the protein nanoparticle for hepatitis C immunoassay.
T7 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질의 유전자 및 c33c로 표시되는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제1벡터;와 ibpfxs 프로모터, 인간 훼리틴 중쇄 단백질 및 5-1-1p, c100p 및 c22p가 연결된 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 제2벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
A first vector operably linked to a gene encoding the T7 promoter, the gene of the human ferritin heavy chain protein, and the HCV antibody-specific epitope expressed by c33c; and an ibpfxs promoter, human ferritin heavy chain protein, and 5 -1-1p, c100p and c22p are linked to a second vector operably linked to a gene encoding a hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope.
제5항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
The recombinant microorganism of claim 5, wherein the recombinant microorganism is selected from the group consisting of Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Pichia sp. wherein the recombinant microorganism is selected from the group consisting of Pseudomonas sp. and Saccharomyces sp.
제5항에 있어서, 상기 벡터는 자가조립(self-assembly) 단백질과 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프 사이에 링커 서열이 추가적으로 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
6. The recombinant microorganism of claim 5, wherein said vector is further operably linked to a linker sequence between a self-assembly protein and an HCV antibody-specific epitope.
제7항에 있어서, 상기 링커 서열은 G3SG3TG3SG3인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
8. The recombinant microorganism of claim 7, wherein the linker sequence is G3SG3TG3SG3.
삭제delete 삭제delete 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 인간 훼리틴 중쇄 단백질 나노입자의 표면에 5-1-1p, c100p 및 c22p가 연결된 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프 및 c33c로 표시되는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프가 표현되어 있는 C형 간염 면역분석용 단백질 나노입자를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 단백질 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 5-1-1p, c100p 및 c22p가 연결된 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프 및 c33c로 표시되는 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프가 자가조립(self-assembly) 단백질 표면에 융합 발현되어 있는 C형 간염 면역분석용 단백질 나노입자의 제조방법.
The recombinant microorganism of claim 5 is cultured to produce a hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitope to which 5-1-1p, c100p and c22p are linked to the surface of human ferritin heavy chain protein nanoparticles, and hepatitis C virus HCV) antibody-specific epitope of the protein nanoparticle for hepatitis C virus immunoassay; (HCV) antibody-specific epitope to which 5-1-1p, c100p and c22p are linked and HCV antibody expressed by c33c, which comprises collecting the protein nanoparticles A method for producing protein nanoparticles for hepatitis C immunoassay in which a specific epitope is fused and expressed on the surface of a self-assembly protein.
삭제delete 삭제delete 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 C형 간염 면역분석용 단백질 나노입자를 포함하는 하이드로젤.
A hydrogel comprising protein nanoparticles for hepatitis C immunoassay according to any one of claims 1, 2 and 4.
다음의 단계를 포함하는 표면에 둘 이상의 C형 간염바이러스(HCV) 항체 특이적 에피토프가 발현되어 있는 단백질 나노입자를 이용한 C형 간염 마커 검출방법:
(a) 제14항의 하이드로젤과 검체로부터 분리된 검출 대상 시료를 반응시킨 다음, 이차항체를 처리하는 단계; 및
(b) 형광을 측정하는 단계.
A method for detecting a hepatitis C marker using protein nanoparticles in which two or more hepatitis C virus (HCV) antibody-specific epitopes are expressed on a surface comprising the steps of:
(a) reacting the hydrogel of claim 14 with a sample to be detected separated from the sample, and then treating the secondary antibody; And
(b) measuring fluorescence.
제15항에 있어서, 상기 이차항체는 퀀텀 닷과 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 C형 간염 마커의 검출방법.16. The method of claim 15, wherein the secondary antibody is linked to a quantum dot.
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