KR101812018B1

KR101812018B1 - 단당류 생산 방법

Info

Publication number: KR101812018B1
Application number: KR1020157011590A
Authority: KR
Inventors: 슈테판 젠와인 닥터; 카챠 파르샷 닥터
Original assignee: 젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2018-01-25
Also published as: US9938549B2; CN104822839A; EP2728009B1; KR20150097466A; US20150240277A1; CN104822839B; EP2728009A1; JP2015532832A; DK2728009T3; IN2015DN03341A; WO2014067696A1; ES2640978T3; JP6165872B2

Abstract

본 발명은 미생물을 사용하여 단당류를 생산하는 방법과 관련된 것이다. 미생물은 내인성으로 제공된 뉴클레오티드 활성 단당류를 사용하여 원하는 유리형 단당류를 합성하고, 적합한 수용체 기질을 글리코실화하며, 가수분해 반응에 의해 원하는 단당류를 방출하기 위해 함께 작동하는 글리코실전달효소와 글리코시다아제를 가지고 있다. 반응을 위해 요구되는 수용체 기질은 재가공되며 단지 촉매량 만이 필요하다. 단당류는 유리형으로 생산되며 배양된 미생물의 상층액으로부터 회수된다.

Description

단당류 생산 방법{Process for producing monosaccharides}

본 발명은 미생물이 사용되는 단당류의 생산을 위한 방법으로, 특히 L-푸코오스(L-fucose) 또는 예를 들어 N-아세틸 뉴라민산(N-acetyl neuraminic acid)과 같은 다른 희소한 단당류의 생산 방법에 관한 것이다.

탄수화물은 에너지 저장, 구조적 기능, 신호 표시, 정보 저장 등에서 생체 기능을 수행함으로 모든 형태의 생명체에서 필수적이다. 이 작업을 위해 자연은 글루코오스(glucose), 만노오스(mannose), 프룩토오스(fructose), 푸코오스(fucose), 리보오스(ribose), 시알산(sialic acid) 등과 같은 주류 단당류와 예를 들어 D-알로오스(D-allose)와 같은 더 특화된 적용을 위한 여러 비주류 단당류를 합성한다.

몇몇 단당류는 많은 양과 합리적인 가격으로 자연에서 얻을 수 있는 반면(예를 들어 글루코오스와 프룩토오스), 예를 들어 L-푸코오스(6-디옥시-L-갈락토오스(6-deoxy-L-galactose))와 같이, 대다수의 단당류는 상당히 희소하며 자연에서 단지 소량만이 발견될 수 있다.

단당류의 상업적인 생산을 위해, 거의 독점적으로 자연에서 얻어진 올리고당(oligosaccharides)이 원료로 사용된다. 이러한 올리고당은 산 가수분해(acid hydrolyzed)된 것이며 방출된 단당류로부터 개별적인 당은 정제된다. 단당류의 높은 화학적 유사성 때문에(대부분 서로 개별 수산기의 배향에만 오직 차이가 있다) 정제된 형태로 개별 단당류의 분리는 다소 힘들고 많은 비용이 든다.

L-푸코오스는 조류(algae)나 박테리아로부터 복잡한 올리고당의 가수분해를 통해 현재 얻어지는 그러한 희귀한 당에 해당한다. 복잡한 가수분해물로부터 개별 단당류를 정제하기 위해, 예를 들어 아세트산납과 과도한 양의 유기용제 같은 유해 화학 물질이 자주 사용되어야 한다. 그러므로, 올리고당의 복잡한 가수분해물로부터 개별 단당류를 분리하는 것은 (방출된 개별 단당류의 높은 화학적 유사성때문에) 도전적이며 (탄산납과 같은, 독성 화학물질의 과도한 사용때문에) 환경적으로 유해하다. 또한 특정 당 안에서 풍부한 올리고당의 가용성은 자연에서 상당히 제한될 수 있으며 또한 계절적 변화 때문에 매우 가변적이다. L-푸코오스는 푸코오스를 함유하고 있는 다당류의 산 가수분해로부터 일반적으로 얻어지는 그러한 희소한 단당류에 해당한다. 푸코오스는 주로 뜸부기과(Fucaceae)와 미역과(Laminariaceae)를 포함하는 모든 일반적인 갈조류(brown seaweed)에 존재하는 푸칸 황산염(fucan monosulfate)인, 다당류 후코이단(fucoidan)으로부터 얻어진다. 오늘날, L-푸코오스는 전세계적으로 발견될 수 있으나 대서양의 유럽 해안에서 다량이 발견될 수 있는 주로 뜸부기과에 속하는 갈조류의 수집으로부터 다량이 얻어질 수 있다. 바다 해안으로부터 갈조류의 대규모 수확은 환경적인 문제를 일으키며 특정 환경보전법에 의해 제한된다.

예를 들어 JP 2000351790은 후코이단 추출 방법과 추출된 후코이단으로부터 푸코오스를 함유하는 올리고당을 얻고 분리하는 방법을 공개한다.

갈조류로부터 후코이단을 가수분해하는 것 외에 최근 특허공보는 L-푸코오스는 또한 자연적으로 발생하는 L-푸코오스를 함유하고 있는 박테리아성 다당류의 가수분해를 통해 얻어질 수 있다는 것을 보여주었다: WO 2012-034997 A1은 L-푸코오스를 함유하는 세포외성 다당류(extracellular polysaccharides)를 생산할 수 있는 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 균주를 공개한다. L-푸코오스의 생산을 위해, 상기 균주에 의해 생산되는 다당류는 회수되며 예를 들어 황산 또는 염산으로 처리함으로써 가수분해된다.

다당류 또는 올리고당 가수분해물로부터의 L-푸코오스의 추출 외에, L-푸코오스를 위한 여러 합성경로가 L-아라비노오스(L-arabinose), D-갈락토오스(D-galactose), L-람노오스(L-rhamnose), D-만노오스(D-mannose)와 D-글루코오스(D-glucose)와 같은, 다른 단당류로부터 시작되면서 발전되어 왔다. 일반적으로 이러한 화학합성의 수율은 자주 다소 형편없으며 여러 단계를 수반한다. 여러 합성 단계를 수반하는 것뿐만 아니라, L-푸코오스의 화학적 합성을 위해 광범위한 보호그룹화학(protection group chemistry)이 사용되어야 한다. 전반적으로, 단당류의 대규모 화학적 합성이 자연으로부터의 추출과 비교하여 경제적으로 실현 가능한지에 대해서는 증명하지 못해왔다.

그러므로, 현재, 정제된 형태의 임의의 단당류의 준비과정은 목표한 단당류에서 다른 단당류들을 정제하는데 상당한 노력을 요구하며, 다량의 유기용매와 다른 유해 화학물질을 자주 수반한다. 결과적으로, 예를 들어 L-푸코오스와 같은 단일의 희망하는 단당류의 독점적인 축적은 대단한 도움이 될 것이다. 대부분의 미생물들은 그것들이 이용할 수 있는 단당류의 종류가 제한된다. 게다가, 상기 미생물들은 여러 단당류가 동시에 탄소원으로 이용가능한 경우에는 특정 단당류를 향해 강한 선호도를 발휘한다.

위의 관점에서, 본 발명의 목적은 단당류가 빠르고 효율적으로 회수될 수 있는, 즉 대규모이며 비용 효과적이며 환경에 부정적인 영향 없는, 단일의 희망하는 유리형(free form) 단당류를 생산하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다.

이러한 그리고 다른 목적은 단당류의 생산을 위한 방법, 즉 대규모와, 미생물을 이용한 유리형 단당류의 생산을 위한 방법에 의해 달성되며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: a)단당류의 합성을 위한 다음의 효소 활성을 갖는 미생물을 제공하는 단계: ⅰ) 수용체-단당류-기질을 형성하기 위해 활성 뉴클레오티드 단당류로부터, 상기 단당류를 수용체-기질로 특별히 운송할 수 있는 글리코실전달효소(glicosyltransferase)와, ⅱ)수용체-기질로부터 단당류를 방출할 수 있는 글리코시다아제(glicosydase); 상기 미생물은 단당류를 대사할 수 없는 것을 특징으로 하며 b) 상기 단당류가 유리형으로 생산되도록 상기 미생물을 성장시키는데 적합한 배지에서 상기 미생물을 배양하는 단계 c) 상기 배지에서 유리형 단당류를 회수하는 단계

또한, 이 목적은 미생물, 바람직하게는 재조합 숙주 미생물과 유리형 단당류 생산에 상기 미생물의 사용에 의하여 해결되는데, 상기 미생물은 ⅰ) 수용체-단당류-기질을 형성하기 위해 활성 뉴클레오티드 단당류로부터 상기 단당류를 수용체-기질로 전달하는 것이 특히 가능하게 하는 글리코실전달효소와, ⅱ) 수용체-기질로부터 단당류를 방출하는 것이 가능하게 하는 글리코시다아제를 포함하며, 상기 미생물은 단당류를 대사할 수 없다.

본 발명의 근본적인 목적은 이러한 방법으로 완벽하게 해결된다.

출원인의 방법은 이전에 서술되지 않았으며, 상기 방법은 두 개의 특별한 효소 활성을 갖는 미생물을 활용하는 것이며, 즉 글리코실전달효소와 글리코시다아제로, 글리코실전달효소는 활성화된 뉴클레오티드 단당류(내부에서 발생하거나 외부에서 공급되는)로부터, 단당류를 수용체-기질로 이동시킬 수 있어서, 수용체-단당류-기질이 형성되도록 한다. 그 다음 단계로, 글리코시다아제는 단당류를 수용체-기질로부터 방출시켜 유리형 단당류가 제공되도록 한다.

비록 전술된 효소 특성을 갖는 변형되지 않은 미생물이 본 발명 내에서 사용될 수 있으나, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 미생물은 재조합 미생물이며, 상기 재조합 미생물은 ⅰ) 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열 및/또는 ⅱ) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 변형된 것이다. 즉, 재조합 미생물은 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하거나, 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하도록 변형될 수 있거나, 둘 다, 즉, 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열과 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하는 것으로 변형될 수 있다.

새롭게 제공되는 방법과 새롭게 제공되는 미생물-재조합이든 아니든- 과 함께, -처음으로- 필연적인 화학물질 또는 정교한 공정 단계 없이 희망하는 단당류를 유리형이며 다량으로 제공하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 방법은 희귀 또는 다른 단당류를 산업적으로 대규모 생산하기 위해 사용하는데 적합한 미생물 발효 방법에 해당하며, 상기 단당류는 미생물이 배양된 배지로부터 쉽게 회수될 수 있다.

본 발명에 따른 미생물을 사용함으로써, 즉 글리코실전달효소를 발현하는 미생물을 사용함으로써, 내인성의 또는 외부에서 공급되는 수용체-기질의 효율적인 푸코실화(fucosylation)가 영향받을 수 있으며, 글리코시다아제의 동시 발현으로 배지에서 전례 없는 다량의 유리 단당류의 축적이 생산될 수 있다. 수용체 기질의 존재 하에서 글리코실전달효소와 글리코시다아제는 그러므로 적합한 수용체의 단지 촉매량을 요구하며 유리 단당류의 합성에 상승작용을 하게 된다. 그러므로 공급된 수용체 기질은 글리코실전달효소에 의해 푸코실화되며 발생된 글리코실화된 생성물은 글리코실전달효소 반응의 글리코실화된 생성물을 수용하는 글리코시다아제에 의해 다시 가공된다.

여기에서 사용되고 본 발명의 분야에서 일반적으로 이해되는 "단당류"라는 표현은, 탄수화물의 가장 기본적인 단위를 의미한다. 단당류는 당의 가장 단순한 형태이며 보통 무색, 수용성, 결정질 고체이다. 단당류의 예는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 크실로오스(xylose)와, 리보오스(ribose)를 포함한다. 단당류는 수크로오스와 같은 이당류와 셀룰로오스(cellulose)와 녹말(starch)과 같은 다당류의 빌딩 블록(building block)이다. 여기에서 사용되고 기술에서 일반적으로 이해되는 용어 "올리고당"은, 두 개 이상의 단당류를 포함하는 당 중합체를 의미한다.

"...를 암호화하는 핵산 염기 서열" 이라는 용어는 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드(polyribonucleotide) 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드(polydeoxynucleotide)를 의미하며, 상기 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA일수도 있거나 변형된 RNA 또는 DNA일수도 있는 것을 의미하고, 일반적으로 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 나타낸다. 상기 용어는, 제한 없이, 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥과 이중 가닥 부위가 혼합되거나, 단일 가닥, 이중 가닥과 삼중 가닥 부위가 혼합된 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 단일 가닥과 이중 가닥 부위가 혼합된 RNA, 단일 가닥으로 또는 전형적으로, 이중가닥 또는, 삼중 가닥 부위일 수 있거나, 단일 가닥 이중 가닥 부위의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 암호화 서열 및/또는 비암호화 서열을 포함할 수 있는 추가적인 영역과 함께 폴리펩티드(예를 들어, 통합된 파지(phage) 또는 삽입서열 또는 편집에 의해 가로채어진)를 암호화하는 하나의 연속 또는 불연속 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이러한 맥락에서, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 두 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 의미한다. "폴리펩티드(들)"은 펩티드, 올리고펩티드(oligopeptides)와 올리고머(oligomers)로 일반적으로 지칭되는 짧은 사슬(short chains)과, 단백질이라고 지칭되는 보다 긴 사슬(longer chains)을 모두 의미한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자가 암호화된 아미노산 외의 아미노산을 포함할 수 있다. "폴리펩티드(들)"는 가공과 다른 전사 후 변형(post-translational modifications)과 같은 자연적인 과정뿐만 아니라, 화학적 변형 기술에 의해 변형된 것들도 포함한다. 같은 유형의 변형이 폴리펩티드의 활성을 본질적으로 변형시키지 않으면서, 주어진 폴리펩티드 내에 여러 부위에 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 다양한 유형의 변형을 포함하고 있을 수 있다. 변형은 펩티드의 골격, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복시기 말단을 포함하여, 폴리펩티드의 어디에서든지 일어날 수 있다.

현재, 그리고 본 발명에 걸쳐, "글리코실전달효소"라는 용어는 이당류(dissccharides), 올리고당과 다당류(polysaccharides)의 생합성을 담당하는 효소를 지칭하고 망라하는 것이며, 상기 글리코실전달효소는 단당류의 일부분을 활성화된 뉴클레오티드 단당류/당("글리코실 공여체")에서 글리코실 수용체 분자로의 이동을 촉진시킨다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 글리코실전달효소가 박테리아성 푸코실전달효소(bacterial fucosyltransferase)이며, 바람직하게 대장균:O126(젠뱅크(genbank) 등록번호 ADN43847)의 wbgL 유전자에 의해 암호화된 알파-1,2-푸코실전달효소(alpha-1,2-fusocyltransferase)인 것이 특히 바람직하다.

그에 따라, "알파-1,2-푸코실전달효소" 또는 "푸코실전달효소" 또는 "알파-1,2-푸코실전달효소" 또는 "푸코실전달효소"를 암호화하는 핵산/폴리뉴클레오티드라는 용어는 공여기질, 예를 들어 GDP-푸코오스로부터 알파-1,2-결합(alpha-1,2-linkage)으로 수용체 분자로의 푸코오스의 이송을 촉진시키는 글리코실전달효소를 의미한다. 상기 수용체 분자는 탄수화물, 올리고당, 단백질이나 당단백질, 또는 지질이나 당지질이 될 수 있으며, 예를 들어, N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), N-아세틸락토사민(N-acetyllactosamine), 갈락토오스, 푸코오스, 시알산(sialic acid), 글루코오스, 락토오스 또는 그것의 임의의 조합이 될 수 있다.

본 발명을 통하여 사용되며 관련 분야에서 이해되는 "글리코시다아제" 또는 "수용체-기질로부터 단당류를 방출할 수 있는 글리코시다아제"는, 단당류와 같은 더 작은 당을 방출하기 위해 글리코시드 결합의 가수 분해를 촉진하는 임의의 글리코시드(또는 글리코실) 가수 분해 효소를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 글리코시다아제가 박테리아성 글리코시다아제, 바람직하게 박테리아성 알파-L-푸코시다아제인 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장균 내에서 발현의 최적화를 위한 코돈인, 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)(젠뱅크(genbabk) 등록번호:AY303700)의 1,2-알파-L-푸코시다아제(1,2-alpha-L-fucosidase) 유전자 afcA가 사용된다.

본 발명의 범위 내에서, 또한 핵산/폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 다형성 변이, 대립 유전자, 돌연변이체, 기능적으로 동등한 절편과, 본 발명을 통해 언급되는 글리코실전달효소와 글리코시다아제의 이종간 상동체는, 특히, 그리고 예를 들어 대장균:O126(등록번호 ADN43847)의 wbgl 유전자에 의해 암호화된 알파-1,2-푸코실전달효소 또는 비피도박테리움 비피둠으로부터의 1,2-알파-L-푸코시다아제 유전자 afcA의 아미노산 서열의 바람직하게 적어도 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 또는 그 이상의 아미노산 부위에서 60% 이상의 아미노산 서열 동질성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 특히 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동질성을 가지는 아미노산 서열을 갖고 있고 있는 텀(term)에 포함된다. 당업자는 글리코실전달효소 또는 글리코시다아제가 미생물 내에서 그들의 효소 활성을 성취하는 한, 임의의 다른 글리코실전달효소 또는 글리코시다아제가 사용될 수 있다는 것을 본 발명을 읽으면 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 결국, 글리코실전달효소 및/또는 글리코시다아제의 서열은 그들이 삽입될 미생물에 대해 최적화된 코돈이어야 할 것이다.

본 발명의 맥락 내에서, 여기에 사용되는 "기능적으로 동등한"이라는 것은, 효소 활성뿐만 아니라, 항원성, 즉 안티-알파-1,2-푸코실전달효소(anti-alpha-1,2-fucosyltransferase) 또는 1,2-α-L-푸코시다아제(1,2-α-L-fucosidase) 항체와 결합할 수 있는 능력, 면역원성, 즉 알파-1,2-푸코실전달효소 또는 푸코시다아제 단백질 또는 폴리펩티드를 결합할 수 있는 항체를 발생시키는 능력을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 많은 기준 중 어느 하나로 판단했을 때, 상술한 알파-1,2-푸코실전달효소 유전자 서열에 의해 암호화되는 알파-1,2-푸코실전달효소 유전자 생산물 또는 상술한 푸코시다아제 유전자 생산물과 같은 실질적으로 유사한 생체 내 활성을 보여줄 수 있는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명을 통하여 언급되는 글리코실전달효소 폴리펩티드 및/또는 글리코시다아제 폴리펩티드는 공지된 기술을 사용한 재조합 DNA 기법으로 제공될 수도 있다. 예를 들어 알파-1,2-푸코실전달효소 및/또는 1,2-알파-L-푸코시다아제, 코딩 서열과 적절한 전사 번역 제어 신호(transcriptional translational control signals)를 포함하는 발현 벡터를 구축하는데에 당업자에게 널리 알려진 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들어, 생체 외 재조합 DNA 기술,합성 기술과 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 샘브룩 외, 몰레큘러 클로닝: 어 레버러토리 메뉴얼, 세컨드 에디션, 콜드 스프링 하버 레버러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1989)(Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))에서 기술된 기법을 참조한다.

현재, 그리고 본 발명을 통하여, "재조합"은 한 종에서 이종의 숙주 미생물의 세포 내로 유전자를 이식 또는 스플라이싱함에 의하여 유전적으로 조작된 DNA를 의미한다. 그러한 DNA는 숙주 유전자 구성의 일부가 되며 복제된다.

"미생물"은 본 발명에 따른 방법에 이용되는 것에 적합한 단일 세포, 세포 클러스터, 또는 다세포성의 상대적으로 복잡한 유기체를 포함하는 임의의 미생물 유기체를 지칭하고 망라하며, 특히 박테리아와 효모를 포함한다. 본 발명에 따라 이용되는 미생물은 액체 배지에서 배양할 수 있으며, 생장하고 복제되는 데에 있어 배지 내에 탄소원을 일반적으로 필요로 한다.

따라서, "재조합 숙주 미생물"은 글리코실전달효소 또는 글리코시다아제에 대해 암호화(coding)하는 핵산 염기 서열, 또는 글리코실전달효소와 글리코시다아제에 대해 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하는 임의의 미생물을 의미하는 것으로 지정되며, 상기 효소들을 암호화하는 핵산 염기 서열은 재조합(숙주) 세포에 이질적인/자연적으로 발생하지 않는 핵산 염기 서열이며 상기 미생물 내에서 이질적이며 자연적으로 발생하지 않는 핵산 염기 서열은 숙주 미생물 세포의 게놈에 통합된다. 그에 따라, "자연적으로 발생하지 않는"은 핵산 염기 서열이 상기 숙주 미생물 세포에 이질적인 것을 의미하며, 즉, 핵산 염기 서열은 미생물 숙주 세포에 대하여 이종인 것을 의미한다. 상기 이종 서열은, 예를 들어 서열이 도입될 숙주 세포에 의존하는 기법인 형질 주입, 형질 전환, 형질 도입으로 숙주 미생물 세포의 게놈 안으로 안정되게 도입될 수 있다. 다양한 기법이 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 전술한 샘브룩 외, 1989(Sambrook et al. 1989)에 공개되어 있다. 그러므로, 이종 서열이 도입된 숙주 세포는 본 발명의 핵산 염기 서열이 암호화하는 것에 따른 이종 단백질을 생산할 것이다.

재조합 생산을 위해, 숙주 세포는 본 발명의 발현계 또는 그 일부와 핵산 염기 서열을 포함하도록 유전자 변형될 수 있다. 숙주 미생물 세포 내로 핵산 염기 서열을 도입하는 것은 데이비스 외, 베이직 메쏘즈 인 몰레큘러 바이올로지,(1986) (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology,(1986))와 전술한 샘브룩 외, 1989(Sambrook et al., 1989)와 같은 많은 스탠다드 레버러터리 메뉴얼즈(standard laboratory manuals)에 설명되어 있는 방법에 의해 영향을 받을 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 핵산 염기 서열은 아마도, 예를 들어, 안정적으로 전환/주입되거나 다른 방식으로, 숙주 미생물 세포 내로 도입되는 벡터 내에 포함될 것이다.

매우 다양한 발현계는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 것에 사용될 수 있다. 그러한 벡터는, 다른 것들 중에서, 염색체, 에피솜과 바이러스로부터 유래된 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드(bacterial plasmids)로부터, 박테리오파지(bacteriophage)로부터, 트란스포존(transposon)으로부터, 효모 에피솜(yeast episome)으로부터, 삽입 인자(insertion elements)로부터, 효모 염색체 요소(yeast chromosomal elements)로부터, 바이러스로부터 유래된 벡터와, 코스미드(cosmids)와 파지플라스미드복합체(phagemids)와 같은 플라스미드와 박테리오파지 유전적 요소로부터 유래된 그것의 조합으로부터 유래된 벡터를 포함한다. 상기 발현계 구조는 발현을 발생시킬 뿐만 아니라 조절하는 제어 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지, 전파 또는 발현하고 숙주 안에서 폴리펩티드를 합성하는 것에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터가 이 점에서 발현을 위해 이용될 수 있다. 상기 적절한 DNA 서열은, 예를 들어 전술한 샘브룩 외(Sambrook et al.)에서 제시한 방법과 같은, 임의의 널리 알려지고 일반적인 다양한 기법에 의해 상기 발현계로 도입될 수 있다.

여기서 사용되는 "회수"라는 용어는 본 발명에 따른 미생물에 의해 제조된 단당류를 미생물 배양으로부터 격리, 수확, 정제, 수집, 또는 그렇지 않다면 분리하는 것을 의미한다.

본 발명을 통하여, 제조될 유리형의 단당류가 L-푸코오스 또는 뉴라민산(neuraminic acid)인 것이 특히 바람직하다.

L-푸코오스는 6탄당 디옥시당(hexose deoxy sugar)이며 -다른 푸코실화된 올리고당 뿐만 아니라- 화학품, 제약품, 화장품과 영양 제품의 주요 관심사인 것이 발견되었다. 그것들의 항알레르기성 및 유화성으로 알려진 푸코실유도체의 생산을 위한 사용 뿐만 아니라, L-푸코오스는 또한 2'-푸코실-락토오스(2'-fucosyl-lactose)와 같은 모유 올리고당(HMO's)의 일반적인 성분이다.

바람직한 실시예에 따르면, 수용체-기질은 상기 미생물에 내인성이거나 미생물이 배양되는 배지 내로 첨가된다. 내인성의 수용체-기질은, 예를 들어, 미생물 내에 존재하는 임의의 이당류 또는 단당류, 미생물 내에 존재하는 글리코실화 단백질 또는 지질 다당류(lipopolysaccharide)가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 수용체-기질은 외부적으로 상기 미생물에 첨가되거나 배지에서 배양된 미생물에 첨가되며, 바람직하게 락토오스 또는 락툴로오스가 첨가된다.

바람직한 실시예에서, 미생물은 글리세롤, 수크로오스, 글루코오스, 프룩토오스, 당밀(molasses), 락토오스, 크실로오스, 셀룰로오스, 합성가스(syngas) 또는 일산화탄소로부터 선택된 탄소원을 포함하는 배지에서 배양된 것이다. 이러한 맥락에서, 또 다른 -바람직하게 낮은 비용의- 발효 기질은 탄소원으로 이용될 수 있으며, 당업자는 대규모의 원하는 단당류를 생산하기 위한 미생물을 생장시키기 위해 본 발명에 적합한 탄소원을 쉽게 이용할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 방법은 배치(batch) 또는 연속적인 발효 방법이다.

그러므로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 즉 연속적인 방법에서, 탄소원은 미생물, 예를 들어 재조합 미생물의 배양단계에서 배지에 끊임없이 첨가된다.

배양 단계에서 탄소원을 끊임없이 첨가함으로, 단당류의 지속적이고 효과적인 제조가 달성된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 즉 배치 단계에서, 발효공정 중 물질을 외부적으로 첨가하는 단계는 포함하지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 단당류는 배양된 재조합 숙주 미생물의 상층액(supernatant)으로부터 회수되며, 상기 상층액은, 상층액과 숙주 미생물 소균구(pellet)를 얻기 위하여 배양된 숙주 미생물을 원심분리함으로써 얻을 수 있다.

새롭게 제공된 방법과 함께, 미생물 세포 안에서 생산되는 단당류가 배지 내로 이동되기 때문에 숙주 미생물이 배양되는 배지에서 생산된 단당류를 회수하는 것이 가능하며, 그러므로 미생물의 세포가 배양 배지로부터 분리되는 순간, 상층액으로부터 단당류를 회수하는 것이 쉽게 가능하도록 한다.

본 발명에 따른 방법에 의한 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계 c)에서 단당류를 격리하는 것에 앞서, 베타-갈락토시다아제가 숙주 미생물이 배양되는 배지에 첨가되고 및/또는 베타-갈락토시다아제의 베타-글리코시다아제의 내인성의 생산물이 미생물 안에서 유도된다.

이러한 특징을 이용하여, -희망하는 단당류 외에- 희망하는 단당류를 합성하는 동안 미생물 내에서 생산되며, 희망하는 단당류의 정제 단계를 방해하는 다른 단당류가 대사 될 수 있으며, 그러므로 원하는 단당류의 회수단계가 더욱 향상되고 촉진되는 것이 달성될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이것은 본 방법의 마지막 단계에 다른 비조정된(deregulated) 베타-갈락토시다아제를 유도함으로써 달성될 수 있다; 이것은 희망하는 단당류의 합성하는 중에, 상기 베타-갈락토시다아제가 예를 들어 온도 또는 발효공정의 마지막에 예를 들어 테트라사이클(tetracyclin)같은 인덕터(inductor)를 첨가하는 것 중 하나에 의해 비조정되며 유도되는 것을 의미한다. 그 대신에 또는 그와 덧붙여, 효소 베타-갈락토시다아제(또는 임의의 다른 올리고당 또는 단당류 신진 대사 효소(들))이 본 발명의 공정의 마지막에 외부에서 배지로 첨가될 수 있으며, 이는 베타-갈락토시다아제를 암호화하는 내인성의 유전자가 비활성화되거나 제거되었을 경우 특히 바람직하다. 그렇게 함으로, 희망하지 않는 올리고당 및/또는 단당류는 축적할 수 없으며 희망하는 단당류의 회수를 방해하지 않는다. 이러한 맥락에서, 베타-갈락토시다아제 외에, 정제를 방해하지 않으며 희망하지 않는 올리고당과 단당류를 대사하기 위해 또 다른 대사 효소가 미생물 내에서 전술한 방법으로 조정될 수 있으며, 당업자는 -본 발명을 읽고- 다른 적합한 경로 또는 조정/활성화 또는 제공될 효소를 쉽게 인식할 수 있으며, 이는 분해될 수용체로부터 의존할 것이다.

여기에서 사용되며 본 발명의 분야 내에서 일반적으로 이해되고 있는 "베타-갈락토시다아제"는 베타-갈락토시드를 단당류로 가수분해하는 것을 촉진하는 가수 분해 효소이다.

유전자와 관련된 본 발명의 맥락 내에서 "조정된"은, 유전자의 발현이 제어 방식으로 예를 들어 하향조정 또는 상향조정될 수 있는 것이며, 즉 조정된 유전자에 의한 합성된 단백질의 양이 다른, 예를 들어 다른 조정되지 않은 유전자로부터 비조정/하향조정 또는 상향조정되는 유전자로서 이해된다.

효소 베타-갈락토시다아제를 배지 및/또는 상층액에 첨가함으로써, 배지에 여전히 존재하는 수용체-기질은 갈라지며 -락툴로오스를 사용하는 경우: 락툴로오스 글리코시드 결합은 갈라지며 갈락토오스와 프룩토오스가 방출된다- 결과물인 단당류는 사용된 대장균 균주에 의하여 효과적으로 대사될 수 있다. 그러므로, 제공된 이당류, 바람직하게 락툴로오스 또는 락토오스는 배양 배지로부터 효과적으로 제거될 수 있다. 이러한 경우에, 결국 예를 들어 대장균과 같은 미생물 내에 자연적으로 존재하는 베타-갈락토시다아제는 유전자 녹아웃(gene knockout) 또는 유사 유전자 불활성화로 불활성화될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상층액으로부터 단당류를 회수하기에 앞서, 상층액에 베타-갈락토시다아제를 처리하며 그리고 배양된 숙주 미생물과 접촉한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 미생물이 성장하는데 적합한 배지 내에서, 생산될 단당류를 대사할 수 없는 미생물에서 i) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 서열 및/또는 ii) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 미생물을 제공하는 단계 b) 재조합 미생물이 배양되는 배지에 이당류이며, 바람직하게 락토오스 또는 락툴로오스인 수용체-기질을 첨가하는 단계 c) 단당류가 유리형으로 제조되는 상기 배지 안에서 재조합 숙주 미생물을 배양하는 단계 d) 배지에서 유리형 단당류를 회수하는 단계

위에서 언급한 바와 같이, 그리고 본 발명에 따른 방법과 관련하여 이미 설명했듯이, 본 발명은 또한 하나의 탄소원 위에서 성장할 수 있고 a) 상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 염기 서열과, b) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 미생물에 관한 것이다.

본 방법과 관련하여 특정 용어를 위해 위에서 사용되고 상술된 정의는 그 안에 존재하는 재조합 미생물에도 또한 적용된다.

바람직한 실시예에 따르면, -본 발명과 그 안에 청구된 것과 관련된 방법에서 사용되는- 상기 미생물은 박테리아 또는 효모로부터 선택되며, 더욱 바람직하게 숙주 미생물은 대장균 균주(Escherichia coli strain) 또는 효모균류 균주(Saccharomyces sp. strain)이다.

박테리아 대장균과 효모균류는, 이러한 미생물들이 실험실 환경에서 쉽고 저렴하게 생장할 수 있으며, 상기 박테리아와 효모는 60년 이상 집중적으로 조사되어 왔다는 것에 이점이 있다.

그에 맞춰, 바람직한 실시예에서, 본 발명과 그 안의 다른 청구된 것에 따른 방법에서 사용되는 숙주 미생물은 박테리아와 효모로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게 대장균 균주이다.

본 발명의 실시예에서, 재조합 숙주 미생물이 또한 베타-갈락토시다아제를 암호화하는 유전자를 결여하거나 또는 비조정된 베타-갈락토시다아제를 암호화하는 유전자와, L-푸코오스 이성질화효소(L-fucose isomerase), L-푸쿨로오스 인산화효소(L-fuculose kinase)와, UDP-글루코오스:운디카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트랜스퍼라아제(undecaprenyl phosphate glucose-1-phosphate transferase)-를 포함하도록 변형되는 것이 바람직하다.

이 실시예는 생산된 단당류 L-푸코오스의 세포 내 분해와 콜라닌산(colonic acid) 생산이 방지되며 베타-갈락토시다아제의 경우 수용체 분자가 분해되지 않는다는 것에 이점이 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 재조합 숙주 미생물은 재조합 숙주 미생물이 단독 탄소원으로서 수크로오스 또는 글리세롤 위에서 성장하는 것이 가능하게 하는 유전자를 포함하도록 추가적으로 변형되며, 대장균 W(등록번호 CP0021851)의 csc-유전자군이 숙주 미생물의 게놈 안으로 통합되는 것이 특히 바람직하며, 상기 유전자군은 변형된 미생물이 단독 탄소원으로서 수크로오스 위에서 성장하는 것을 가능하게 하는 유전자로 수크로오스 투과효소(sucrose permase), 프룩토키나아제(fructokinase), 수크로오스 가수분해효소(sucrose hydrolase)와, 전사억제자(transcriptional repressor)(유전자 cscB,cscK,cscA와, cscR 각각)를 포함한다.

본 발명의 방법 또는 미생물의 바람직한 실시예와, 위에서 언급한 바에 따르면, 글리코실전달효소 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 2-푸코실전달효소이며, 1,2-알파-L-푸코오시다아제이다. 상기 효소의 정의는 위를 참조한다.

이와 관련하여 본 발명에 따른 방법에 바람직한 것으로 기재된 실시예는 모두 청구된 미생물에 적용될 수 있는 경우, 적용되는 것에 주의해야 한다.

따라서, 본 발명은 또한 단당류의 합성을 위해 다음의 효소 활성을 가지는 미생물의 사용에 관한 것이다: ⅰ)특히 활성 뉴클레오티드 단당류 기질로부터 단당류를 수용체-단당류-기질을 형성하기 위해 수용체로 전달하는 것을 가능하게 하는 글리코실전달효소와, ⅱ) 단당류를 수용체로부터 방출할 수 있는 글리코시다아제; 상기 미생물은 단당류를 대사할 수 없으며, 본 발명은 또한 단당류, 특히 L-푸코오스 생산을 위한 본 발명에 따른 재조합 미생물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 특정 용어를 설명하기 위한 위에서 서술된 정의는 여기에서 청구되고 설명된 재조합 또는 변형되지 않은 미생물에 적용되어야 함을 주의해야 한다.

선택적으로 단당류를 생산하기 위한 방법은 무세포계에 적용될 수 있으며 이로써 본 발명에 따른 효소, 수용체 기질(들)과, 경우에 따라 다른 글리코실전달효소와 악세서리 효소(accessory enzymes)를 포함하는 다른 반응 혼합물 성분은 수성 반응 매질(aqueous reaction medium) 내에서 혼합에 의해 결합된다. 상기 효소는 용해되어서 이용될 수 있으며, 또는 중합체와 기질이 운반체(support)에 첨가되는 것과 같이 상기 효소는 운반체에 바운드되거나 고정될 수 있다. 상기 운반체는 예를 들어 칼럼(column) 내에 충진될 수 있다.

특히, 본 발명은 재조합 대장균 균주가 재조합 숙주 미생물로 사용되는 방법에 관한 것이며, 상기 재조합 대장균 균주 내에서 L-푸코오스 이성질화 효소 유전자와 L-푸코오스 인산화효소 유전자는 결손되었으며(deleted), 상기 재조합 대장균 균주는 a) 상기 대장균 균주를 단독 탄소원인 수크로오스 또는 글리세롤 상에서 성장시킬 수 있으며, 수크로오스 투과효소, 프룩토키나아제(fructokinase), 수크로오스 가수분해효소와 전자 억세자를 각각 암호화하는 유전자 b) 2-푸코실전달효소를 암호화하는 유전자와 c)1,2-알파-푸코오시다아제를 암호화하는 유전자를 포함하도록 변형된다.

또 다른 장점은 실시예 및 첨부된 도면의 설명에 따른다.

위에서 언급한 특성과 아래에서 설명될 특성은 각각의 명시된 조합 뿐만 아니라 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다른 조합 또는 그들 스스로 사용될 수 있음은 언급할 필요도 없다.

본 발명의 목적은 단당류가 빠르고 효율적으로 회수될 수 있는, 즉 대규모이며 비용 효과적이며 환경에 부정적인 영향 없는, 단일의 희망하는 유리형(free form) 단당류를 생산할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 여러 실시예는 도면에 도시되어 있으며 다음의 설명에 더욱 상세히 설명되어 있다. 도면에서:
도1은 (a)본 발명에서 이용되는 경로/방법의 개략도와 (b)본 발명에 따른 L-푸코오스의 예시적인 생산을 위한 경로의 필수적인 개략적인 부분을 보여준다.
도2는 본 발명에 다른 미생물을 만들기 위한 DNA 절편을 만드는 것에 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나열하는 표이다.
도3은 본 발명에 따른 미생물의 상층액 안의 수크로오스(A) 또는 글리세롤(B) 상에서 성장한, 예시적인 실시예 L-푸코오스의 존재를 보여주는 크로마토그램(박층크로마토그래피)이다.
도4는 글리세롤(a) 또는 수크로오스(b) 상에서 성장한 본 발명에 따른 재조합 미생물에 의한 L-푸코오스의 생산을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 보존 시간(retention time) 2.2분, 4.6분, 9.8분의 피크는 각각의 L-푸코오스, 락툴로오스와 말토트리오스(내부표준)에 해당한다.
도5는 발효 배지에 베타-갈락토시다아제 첨가 효과를, 도5a는 베타-갈락토시다아제 첨가 전의 발효 배지의 HPLC-크로마토그램과 도5b는 베타-갈락토시다아제 첨가 이후의 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도6은 박테리아 발효로부터 얻어지는 정제된 L-푸코오스의 1H-NMR 스펙트럼을 보여준다.

도1a에서 개략적으로 보여주듯이, 본 발명에 따른 방법 -그리고 방법에 사용되는 미생물- 은 미생물 내에 존재하는 뉴클레오티드 활성 단당류를 활용하며, 수용체 단당류 기질 또는 복합체를 형성하기 위해- 글리코실전달효소의 효소 활성을 통해- 단당류의 일부를 -미생물 내부에 존재할 수 있으며 또는 외부적으로 공급될 수 있는- 수용체로 운송한다. 글리코시다아제의 효소활성에 의해(가수분해) 상기 단당류가 수용체 단당류 기질로부터 방출되며 유리형으로 회수될 수 있다(도1a 참조).

예시적인 단당류로, L-푸코오스가 재조합 대장균 균주 안에 있는 수크로오스 또는 글리세롤로부터 생산되었다. 도1b는 L-푸코오스 생산을 위한 개략적인 경로의 일부분을 보여준다. 미생물 내에서, GDP-푸코오스가 디노보 경로(de novo pathway)를 통해 합성되었으며, 락툴로오스는 2-푸코실전달효소 촉매 반응에서 예시적인 수용체 기질의 역할을 하였다. 1,2-α-L-푸코시다아제에 의한 글리코시드 결합의 가수분해는 L-푸코오스를 방출한다(도1b 참조).

대장균 L- 푸코오스 생산 균주의 성장

첫 번째 젖당 오페론 lacZ는 대장균 BL21(DE3)(노바겐사)(도2A 표1 참조) 내에서 엘리스 외(Ellis et al.) 2001에 설명되어 있는 대로 미스매치-올리고뉴클레오티드(missmatch oligonucleotide)를 사용한 돌연변이 유발로 불활성화되었다. 갈락토오스 오페론(galETKM)은 대장균 K12 TG1으로부터 프라이머 605와 606(사용된 모든 프라이머는 도2B의 표2에 실려있다)를 사용하여 증폭되었으며 레드 리콤비네이즈 헬퍼(red recombinase hepler) 플라스미드 pKD46(닷센코 앤드 워너, "원-스텝 인액티베이션 오브 크로모소멀 진스 인 에서러키에 콜리 케이-12 유징 피씨알 프로덕츠", 미국국립학술원회보 97:6640-6645(2000) (Datsenko and Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)))을 사용하여 가능하게 된 상동재조합에 의하여 대장균 BL21(DE3) lacZ의 galM ybhJ 안으로 삽입된다. 다음으로, araA가 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발에 의해 불활성화되었다. 대장균 BL21(DE3) lacZ Gal+ araA 균주 내에서 유전자 wcaJ가 결손되었다(deleted). 유전자 결손은 닷센코 앤드 워너(Datsenko and Warner)(2000, 위 참조)의 방법에 따라 수행되었다. WcaJ는 아마도 UDP-글루코오스를 암호화한다: 콜라닌산 합성에서 첫 번째 단계를 촉진하는 운디카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트랜스퍼라아제(undecaprenyl phosphate glucose-1-phosphate transferase)(스티븐슨 외, "오가니제이션 오브 더 에서러키에 콜리 케이-12 진 클러스터 리스폰서블 포 프로덕션 오브 더 엑스트라셀룰러 폴리사카라이드 콜라닉 애씨드", 제이. 박테리올. 178:4885-4893;(1996)(Stevenson et al., "Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colanic acid", J.Bacteriol. 178:4885-4893:(1996)); 콜라닌산의 생산은 GDP-푸코오스를 위해 푸코실전달효소 반응과 경쟁할 것이다. L-푸코오스의 세포 내 분해를 방지하기 위하여, L-푸코오스 이소머라아제(fucl)과 L-푸쿨로오스 키나아제(fucK)를 암호화하는 유전자가 대장균 균주 BL21(DE3) lacZ Gal+ araA ΔwcaJ로부터 결손되었다.

플라스미드 plNT2-lacY-aadA(연속 서열 1)을 주형(template)으로 사용하여, 대장균 K12 TG1(등록번호 ABN72583)으로부터 기원한 락토오스 이송 유전자 lacY는 프리시딩 프로모터 P_tet(preceding promoter P_tet)와 FRT-사이트 플랭크드 스트렙토마이신 저항성 유전자(FRT-site flanked streptomycine resistence gene)와 함께 프라이머 1119와 1120를 통해 증폭된다. 결과물인 PCR 생성물은 EZ-Tn5 트랜스포사제(transposase)를 위한 19-bp 모자이크 엔드 인식 부위(19-bp Mosaic End recognition sites) 양쪽으로 나아갔다. 상기 EZTn5<P_tet-lacY-FRT-aadA-FRT> 트란스포존(transposon)은 EZ-Tn5^TM트랜스포사제(transposase)((Epicentre사, 미국))를 가진 EZ-Tn5 트란스포솜(transposome)을 생산하기 위해 사용되었고, 이와 함께 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal⁺araAΔwcaJΔfuclΔfucK의 일렉트로컴피턴트 셀(electrocompetent cell)이 변형되었다. 상기 저항성 유전자는 플라스미스 pCP 20(닷센코 앤드 워너(Datsenko and Warner), 위 참조)에 암호화된 FLP 재조합효소(recombinase)에 의해 스트렙토마이신 저항성 클론(resistant clone)으로부터 제거되었다. 대장균 W(등록번호 CP002185.1)의 상기 csc-유전자군은 수크로오스 투과효소, 프룩토키나아제, 수크로오스 가수분해효소와, 전사 억제제(transcriptional repressor)를 위한 네 개의 유전자(유전자 cscB,cscK,cscA와, cscR 각각)를 포함하며, 상기 유전자는 균주가 단독 탄소원으로서 수크로오스 위에서 성장하는 것을 가능하게 한다. 상기 csc-유전자군은 플라스미드 pEcomar-cscABKR(연속 서열 2)를 사용하여 대장균 BL21(DE3) lacY에 정착하는 균주의 게놈(lacY-harbouring strain) 안으로 전이(transposition)에 의하여 통합된다. 상기 csc-유전자는 pEcomar에 암호화되며 P_araB의 제어 하에서 전사되는 유사전이인자(mariner-like element) Himar1 트랜스포사제(transposase)(비고 외, "컨저베이션 오브 팔린드로믹 앤드 미러 모티프스 위드인 인버티드 터미널 리피츠 오브 매리너-라이크 엘리멘츠", 저널 오브 몰레큘러 바이올로지 351:108-116 (2005) (Bigot et al., "Conservation of Palindromic and Mirror Motifs within Inverted Terminal Repeats of mariner-like Elements", J. Mol. Biol. 351:108-116 (2005)))에 구체적으로 인식되는 역말단반복순서(inverted terminal repeats)에 의하여 인접된다. 매리너 트랜스포사제(mariner transposase)에 의해 영향을 받는 전위(transposition)를 위해 각각의 플라스미드에 정착하는 세포는 100㎍/ml 암피실린(ampicillin)을 함유하는 2' YT 배지내에서 성장하며(샘브룩 앤드 러셀, 2001, 몰레큘러 클로닝: 어 레버러터리 매뉴얼(Sambrook and Russel, 2001, Molecular Cloning:a laboratory manual)) 섭씨 30도에서 적어도 16시간동안 100mM L-아라비노오스(L-arabinose)로 유도되었다. 트란스포존 카셋(transposon cassettes)을 함유하는 클론은 csc 유전자군을 삽입하는 경우 1% 수크로오스를 함유하는 M9-agar(샘브룩 앤드 러셀, 위 참조) 플레이트 또는, 각각의 항생물질을 함유하는 2' YT Agar(2' YT agar) 위에 선택되었다. 대장균 BL21 (DE3)::(P_tet-lacY)(cscBKAR)lacZ Gal⁺araAΔwcaJΔfuclΔfucK는 단독 탄소원으로 수크로오스 상에 성장할 수 있었다. 단독 탄소원으로서 수크로오스 위에서 성장할 수 있었다. 대장균:O126(등록번호 ADN43847)로부터 상기 2-푸코실전달효소 유전자 wbgL은 대장균 내에서 발현을 위한 코돈 최적화되었으며 젠스크립트사(GenScript Cooperation)(USA)에 의해 종합적으로 준비되었다. 플라스미드 plNT2-wgbLco-neo(연속 서열 3)을 주형으로 사용하여, 상기 wbgLco 유전자는 프리시딩 프로모터 P_tet와 FRT-사이트 플랭크드 카나마이신 저항성 유전자와 함께 프라이머 1119와 1120과 함께 증폭되었다; 결과적인 EZ-Tn5<P_tet-wbgLco-FRT-neo-FRT> 트란스포존은 EZ-Tn5^TM 트랜스포사제(transposase)에 영향을 받으며 통합되었다.

GDP-푸코오스의 디 노보 합성(de novo synthesis)을 강화하기 위해, 포스포마노뮤타아제(phosphomannomutase)(manB)를 암호화하는 유전자, 만노오스-1-인산염 구아노실전달효소(mannose-1-phosphate guanosyltransferase)(manC), GDP-만노오스-4,6-디히드라타아제(GDP-mannose-4,6-dehydratase)(gmd)와, 대장균 K12 DH5α로부터의 GDP-L-푸코오스 생성효소(GDP-L-fucose synthase)(wcaG)가 대장균 BL21(DE3) 균주 내에서 과발현된다; 오페론 manCB는 P_tet의 제어 하에 있으며, 오페론 gmd, wcaG는 P_T5 프로모터로부터 전사된다. 트란스포존 카셋(transposon cassette) <Ptet-manCB-P_T5-gmd, wcaG-FRT-dhfr-FRT>가 매리너 트랜스포사제(Mariner transposase) Himar1(램프 외,"하이퍼액티브 트랜스포제이스 뮤턴츠 오브 더 Himar1 매리너 트랜스포존",미국국립학술원회보 96:11428-11433)(1999)(Lampe et al. "Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon",Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433(1999)))의 하이퍼액티브 C9-돌연변이(Hyperactive C9-mutant)에 의해 영향을 받은 pEcomar C9-manCB-gmd, wcaG-dhfr(연속 서열 4)로부터 삽입된다. 마지막으로 비피도박테리움 비피둠으로부터 1,2-알파-L-푸코오시다아제(1,2-α-L-fucosidase) 유전자 afcA (코돈은 대장균에서 발현을 최적화하고 젠스크립트(GeneScript)사에 의해 합성된다)가 pEcomar-afcAco-tet(연속 서열 5)와 매리너 트랜스포사제를 사용하여 <P_tet-acfAco-FRT-tet-FRT> 트란스포존으로서 전이에 의해 균주 내로 삽입되었다.

L- 푸코오스 생산을 위한 배양 환경

A : 탄소원으로서 수크로오스를 사용

대장균BL21(DE3)lacZGal⁺araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)는 탄소원으로서 3% 수크로오스와 항생제 테트라사이클린(antibiotics tetracycline) 7.5㎍/ml, 카나마이신(kanamycine) 15㎍/ml과, 트리메소프림(trimethoprim) 10㎍/ml을 포함하는 800 mL 무기염 배지(사만 외, "프로덕션 오브 오-아세틸레이티드 앤드 설페이티드 치토올리고사카라이즈 바이 리컴비넌트 에서리키에 콜리 스트레인스 하버링 디프런트 컴비네이션스 오브 노드 진스", 제이. 바이오텍. 72:33-47(1999)(Samain et al., "Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes", J. Biotech. 72:33-47(1999)))로 시작하는 3 L 발효기(new Brunswick, Edison, 미국)로 배양되었다. 배양은 2.5%(v/v) 접종물(inculum)과 함께 시작되었다. 푸코실전달효소 반응에서 수용체로서의 락툴로오스는 최종농도 33,75mM으로 여러 단계에 첨가되었다. 상기 배양에 수크로오스를 계속하여 제공하었다. 세포는 약 66 h 내에 141의 OD660nm으로 성장하였으며 366mM 푸코오스를 생산하였다(데이터 미도시).

B : 탄소원으로서 글리세롤을 사용

대장균BL21(DE3)lacZGal+araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet _-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)는 탄소원으로서 3%수크로오스와 항생제 테트라사이클린(antibiotics tetracycline) 7.5㎍/ml, 카나마이신(kanamycine) 15㎍/ml과, 트리메소프림(trimethoprim) 10㎍/ml을 함유하는 800 mL 무기염 배지(사이만 외, 위 참조)와 함께 시작하는 3 L 발효기(New Brunswick, Edison, 미국)로 배양되었다. 배양은 2.5%(v/v) 접종물(inculum)과 함께 시작되었다. 상기 푸코실전달효소 반응에서 수용체로서의 락툴로오스는 최종농도 31,5mM으로 여러 단계에 첨가되었다. 상기 배양은 글리세롤을 계속하여 제공하었다. 세포는 약 64 h 내에 212의 OD660nm으로 성장하였으며 78mM 푸코오스를 생산하였다(데이터 미도시).

L- 푸코오스의 검출

증식세포의 상층액은 실리카겔 TCL 판(silica gel TCL plates)(Silica gel 60)을 사용하여 박층크로마토그래피 TCL에 의해 분석되었다. 부탄올:아세톤:아세트산:물(35/35/7/23(v/v/v/v))의 혼합물은 이동상(mobile phase)으로 사용되었다. 분리된 물질의 검출을 위하여 TCL은 티몰 시약(95 ml 에탄올에 0.5g 티몰이 첨가되었으며, 5 ml 황산이 첨가되었다)에 의해 담궈졌으며 가열되었다.

HPLC 시스템(Shimadzu, 독일)에 연결된 시차굴절검출기(a refractive index detector)(RID-10A)(Shimadzu,독일)와 루나 NH₂ 칼럼(Luna NH₂ column)(10㎛, 250' 4.6mm)(Phenomenex,미국)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 분석이 수행되었다. 용리가 섭씨 35도와 유량 3ml/min에서 용리액으로 아세토니트릴(acetonitril):물(H₂O)(80/20(용량/용량))과 함께 등가적으로 수행되었다. 20 ㎕ 샘플이 상기 칼럼(column)에 적용되었다. L-푸코오스의 농도는 표준곡선에 의해 계산되었다. 그러므로 10% (v/v) 100mM 말토트리오스(maltotriose)가 그들이 이온교환 매트릭스(ion exchange matrix)(Strata ABW, Phenomenex) 위에 고상추출법(solid phase extraction)에 의하여 걸러지고(0,22 ㎛ 구멍 크기) 정리되기 전에 내부표준으로 HPLC 샘플에 상기 말토트리오스가 첨가되었다.

L-푸코오스는 TCL(도3)과 HPLC(도4와 도5)에 의해 보여지듯, 수용체로 락툴로오스를 사용하여 각각 수크로오스와, 글리세롤 위에서 성장한 대장균 BL21 (DE3) lacZGal+araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)의 상층액에서 검출되었다.

도3은 수용체 기질 락툴로오스의 존재 하에 글리세롤(A) 또는 수크로오스(B) 위에서 성장한 미생물을 위한 박층크로마토그래피(TLC)의 결과를 보여준다:레인 1(Lane 1)(도 3A와 3B): 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)의 상층액 내에서 L-푸코오스가 인증된 참조 물질(S:L-푸코오스(Glycom, 덴마크), 락툴로오스(Sigma, 독일))에 의해 입증된 TCL에 의하여 검출되었다.

레인2(Lane2)(도3A와 도3B): 락툴로오스는 효소로 가수분해되었으며 결과물 단당류는 섭씨 37도에서 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)에 의하여 분해되었다.

도4는 HPLC에 의해 밝혀진 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+ araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)에 의한 푸코오스 생산을 보여주며, 도4a는 글리세롤 위에서 성장한 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+ araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)의 상층액을 보여준다: 샘플은 64 h 후발효 시작(post fermentation start)에서 획득되었다. 보존시간 1.9, 2.1, 4.6과 9.8분의 피크는 각각의 글리세롤, L-푸코오스, 락툴로오스와, 말토트리오스와 상응한다(내부표준). HPLC 분석법은 위에서 설명되었다.

도4b는, 수크로오스 위에서 성장한 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+ araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)의 상층액에 대한 HPLC 분석의 결과를 보여준다: 샘플은 66.3 h 후발효 시작에서 획득되었다. 보존시간 2.2, 4.6과 9.8분 피크는 각각 L-푸코오스, 락툴로오스와 말토트리오스와 상응한다(내부 표준). HLPC 분석법은 위에서 설명되었다.

베타- 갈락토시다아제에 의한 락툴로오스의 가수분해와 대장균 BL21 ( DE3 ) lacZGal+araAΔ wcaJ Δ fucl Δ fucK ::( P _tet - lacY )( cscBKAR )( P _tet - wgbLco -neo)( P _tet - manCB -P _T5 -gmd,wcaG-dhfr)(P _tet -afcAco-tet)에 의한 단당류의 분해

각각의 수크로오스와 글리세롤로 성장한 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+araAΔwcaJΔfuclΔfucKΔnagBΔnagA::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)의 L-푸코오스 생산 배양으로부터의 살균된 상층액은 원심분리와 여과(0.22㎛ 구멍크기)에 의해 얻어진다. 상기 상층액은 신선한 무기염 배지 안에서 1:10으로 희석되었다. 베타-갈락토시다아제(Sigma Aldrich로부터 구매하였다) 10 유닛 mL^-1농도로 첨가되었으며 가수분해는 섭씨 37도에서 3 시간 동안 수행되었다. 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal+ araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)은 섭씨 37도에서 약 5의 OD660nm까지 각각의 항생제를 포함하는 2YT 리치 배지(2YT rich medium)에서 배양되었다. 10 mL 배양의 세포는 원심분리에 의해 살균된 상태에서 수확되었으며 상층액을 함유하는 β-갈락토시다아제(β-galacosidase)의 2 mL 내에서 재현탁되었다(resuspended). 살아있는 세포는 섭씨 37도에서 16h 내에 효소의 가수분해의 결과인 상기 단당류를 분해하였다.

도5는 락툴로오스의 체외 효소의 가수분해의 HPLC 분석과 대장균 BL21 (DE3) lacZ Gal⁺araAΔwcaJΔfuclΔfucK::(P_tet-lacY)(cscBKAR)(P_tet-wgbLco-neo)(P_tet-manCB-P_T5-gmd,wcaG-dhfr)(P_tet-afcAco-tet)에 의한 단당류의 분해를 보여주며, 도5a는 수크로오스 위에서 성장한 배양(66.3h에서 수확됨.)의 상층액의 결과를 보여준다; 베타-갈락토시다아제가 첨가되기 전과 베타-갈락토시다아제로 처리되고 분해된 이후 도5b. 보존시간 2.1과, 4.4분의 피크는 각각 L-푸코오스와 락툴로오스와 상응한다.

도6은 미생물 발효에 의해 얻어지는 정제된 L-푸코오스의 1-H NMR 스펙트럼을 보여준다. 측정을 위하여 물질의 20 mg 0.7 ml 중수소를 함유한 듀테로화된 DMSO(deuterated DMSO)에 용해되었다.

본 결과는 예시적인 미생물 균주와 함께 예시적인 미생물 L-푸코오스가 대규모로 유리형으로 효율적으로 생산될 수 있음을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> Jennewein Biotechnologie GmbH <120> Process for producing monosaccharides <130> 2827P105EP <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 1 ttactcagca ataaactgat attccgtcag gctgg 35 <210> 2 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 ttgataatct cgcgctcttc agcagtcaga ctttccatat agagcgtaat ttccgttaac 60 gtcggtagtg ctgaccttgc cggagg 86 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 ctgtctctta tacacatctc ctgaaattgg ccagatgatt aattcctaat ttttgttg 58 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ctgtctctta tacacatctc agcattacac gtcttgagcg attgtgtagg 50

Claims

숙주 미생물을 사용하여 유리형 단당류를 생산하기 위한 방법으로 상기 방법은
a) 상기 단당류의 합성을 위한 다음의 효소활성을 갖는 숙주 미생물을 제공하는 단계: 단당류를 대사할 수 없는 숙주 미생물 내에서 ⅰ) 수용체-단당류-기질을 형성하기 위해 활성 뉴클레오티드 단당류로부터 상기 단당류를 수용체-기질로 운반할 수 있는 글리코실전달효소와, ⅱ)수용체-기질로부터 단당류를 방출할 수 있는 글리코시다아제,
b) 상기 단당류가 유리형으로 생산되며 상기 숙주 미생물이 성장하는데 적합한 배지에서 상기 숙주 미생물을 배양하는 단계,
c) 상기 배지에서 상기 유리형 단당류를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항에 있어서, 재조합 숙주 미생물이 사용되며, 상기 재조합 숙주 미생물은 ⅰ) 상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열 및/또는 ⅱ)상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열 중 적어도 하나를 포함하도록 변형되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 수용체-기질은 상기 숙주 미생물에 내인성이거나 상기 숙주 미생물이 배양되는 배지 내로 첨가되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체 기질이 이당류, 단당류, 다당류, 글리코실화된 단백질 또는, 지질다당류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제4항에 있어서, 상기 이당류는 락툴로오스이거나 락토오스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 글리세롤, 수크로오스, 당밀, 크실로오스, 셀룰로오스, 합성가스로부터 선택된 탄소원을 포함하는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제4항에 있어서,상기 숙주 미생물이 글리세롤, 수크로오스, 당밀, 크실로오스, 셀룰로오스, 합성가스로부터 선택된 탄소원을 포함하는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 배치이거나 연속적인 방법인 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 단당류는 배양된 상기 숙주 미생물의 상층액으로부터 회수되며, 그 상층액은 상층액과 미생물 소균구를 얻기 위하여 배양된 숙주 미생물을 원심분리함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항에 있어서, 단계 c)에서 단당류를 회수하기에 앞서, 베타-갈락토시다아제가 상기 숙주 미생물이 배양되는 배지 내로 첨가되고 또는 베타-갈락토시다아제의 내인성의 생산물이 상기 숙주 미생물 내에서 유도되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상층액으로부터 단당류를 회수하기에 앞서, 상기 상층액이 베타-갈락토시다아제로 처리되며 그 후 상기 배양된 숙주 미생물과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 상기 단당류는 L-푸코오스 또는 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 상기 숙주 미생물은 생산될 상기 단당류를 대사할 수 없으며, 상기 숙주 미생물 성장에 적합한 배지 내에서
i) 상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열과,
ii) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 미생물을 제공하는 단계,
b) 이당류인 수용체-기질을 상기 숙주 미생물이 배양되는 배지 내로 첨가하는 단계,
c) 재조합 숙주 미생물을 유리형 단당류가 생산되는 상기 배지에서 배양하는 단계,
d) 상기 배지로부터 유리형 단당류를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제11항에 있어서,
a) 상기 숙주 미생물은 생산될 상기 단당류를 대사할 수 없으며, 상기 숙주 미생물 성장에 적합한 배지 내에서
i) 상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열과,
ii) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 미생물을 제공하는 단계,
b) 이당류인 수용체-기질을 상기 숙주 미생물이 배양되는 배지 내로 첨가하는 단계,
c) 재조합 숙주 미생물을 유리형 단당류가 생산되는 상기 배지에서 배양하는 단계,
d) 상기 배지로부터 유리형 단당류를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제12항에 있어서,
a) 상기 숙주 미생물은 생산될 상기 단당류를 대사할 수 없으며, 상기 숙주 미생물 성장에 적합한 배지 내에서
i) 상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산 염기 서열과,
ii) 상기 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 미생물을 제공하는 단계,
b) 이당류인 수용체-기질을 상기 숙주 미생물이 배양되는 배지 내로 첨가하는 단계,
c) 재조합 숙주 미생물을 유리형 단당류가 생산되는 상기 배지에서 배양하는 단계,
d) 상기 배지로부터 유리형 단당류를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제13항에 있어서, 상기 이당류는 락토오스 또는 락툴로오스인 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
단독 탄소원 위에서 성장할 수 있고 a) 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코실전달효소 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 염기 서열과, b) 상기 숙주 미생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는 글리코시다아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 염기 서열을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 미생물.
제17항에 있어서, 상기 재조합 숙주 미생물은 L-푸코오스 이소머라아제, L-푸코오스 키나아제와, UDP-글루코오스:운데카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트랜스퍼라아제(undecaprenyl phosphate-1-phosphate glucose-1-phosphate transferase)를 암호화하는 유전자를 결여하도록 추가적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제17항에 있어서, 상기 재조합 숙주 미생물이 수크로오스 또는 글리세롤 위에서 성장하는 것을 가능하게 하는 유전자를 포함하도록 추가로 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 박테리아 및 효모로부터 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 대장균 균주 또는 효모균 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제17항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서, 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산은 박테리아성 푸코실전달효소인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시다아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 박테리아성 1,2-α-L-푸코시다아제인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 대장균 균주는 재조합 숙주 미생물로 사용되며, 상기 재조합 대장균 균주에서 베타-갈락토시다아제, L-푸코오스 이소머라아제, L-푸코오스 키나아제와, UDP-글루코오스:운디카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자가 결손되었거나 비조절되었으며, 상기 재조합 대장균 균주는 a) 대장균 균주를 단독 탄소원으로서 수크로오스 상에 성장하는 것을 가능하게 하며, 수크로오스 투과효소, 수크로오스 가수분해효소와, 전사 억제제를 각각 암호화하는 유전자, b) 2-푸코실전달효소를 암호화하는 유전자와, c) 1,2-알파-푸코시다아제를 암호화하는 유전자를 포함하도록 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 미생물.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 박테리아 및 효모로부터 선택된 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 대장균 균주 또는 효모균 균주인 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 어느 한 항에 있어서, 글리코실전달효소를 암호화하는 핵산은 박테리아성 푸코실전달효소인 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 어느 한 항에 있어서, 글리코시다아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 박테리아성 1,2-α-L-푸코시다아제인 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
제1항 내지 제3항과 제8항 내지 제10항 어느 한 항에 있어서, 재조합 대장균 균주는 재조합 숙주 미생물로 사용되며, 상기 재조합 대장균 균주에서 베타-갈락토시다아제, L-푸코오스 이소머라아제, L-푸코오스 키나아제와, UDP-글루코오스:운디카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자가 결손되었거나 비조절되었으며, 상기 재조합 대장균 균주는 a) 대장균 균주를 단독 탄소원으로서 수크로오스 상에 성장하는 것을 가능하게 하며, 수크로오스 투과효소, 수크로오스 가수분해효소와, 전사 억제제를 각각 암호화하는 유전자, b) 2-푸코실전달효소를 암호화하는 유전자와, c) 1,2-알파-푸코시다아제를 암호화하는 유전자를 포함하도록 변형된 것을 특징으로 하는 단당류 생산방법.
단당류의 합성을 위하여 상기 단당류를 대사할 수 없는 미생물 내에서 ⅰ) 수용체-단당류 기질을 형성하기 위해 활성 뉴클레오티드 단당류 기질로부터 단당류를 수용체로 운반할 수 있는 글리코실전달효소와, ⅱ) 수용체로부터 단당류를 방출할 수 있도록 하는 글리코시다아제의 효소 활성을 갖는 단당류를 생산하는 미생물.